NÖVÉNYI GMO-król ALAPFOKON Dudits Dénes 1. Tartalom

NÖVÉNYI GMO-król ALAPFOKON Dudits Dénes1

Tartalom 1. Összefoglalás 2. Bevezetés 3. A genetikai módosítás (GM) alapfogalmai, története 4. Növényi gének kémcsőben: genom programok 4.1. A termőképességet, a szemek méretét befolyásoló egyik rizs gén izolálása géntérképezéssel 4.2.Gének klónozása génkifejeződési mintázat alapján 4.3. Mutánsok gyűjteményei, mint a génizolálás alapanyagai 4.4 A gének filogenetikai konzerváltsága segítheti a növényi gének izolálását 5. GM növények születése génbeépítéssel: módszerek 5.1 A célgén működőképes változatának összeépítése transzformációs vektor molekulával 5.2 A célgén bejuttatása a gazdanövény sejtmagjaiba és integrációja a genomba valamint a transzformált sejtek, szövetek szelekciója 5.3 A transzformáns növények molekuláris jellemzése: a célgén kimutatása és kifejeződésének igazolása 6. A transzformáns, GM növények felhasználása a nemesítési programokban 6.1. Gének a heterózishatás hátterében 6.2. A CO2 megkötés, a fotoszintézis hatékonyságának növelése 6.3.GM növények jobb szárazságtűrése a szántóföldön 6.4. A növényi biomassza hozamának növelése génbeépítéssel 7. GM fajták termesztése a világon: gazdasági és környezetvédelmi szempontok 8. Egészségvédelmi garanciák

1. Összefoglalás A géntechnológia, mint kutatási eszközrendszer és egyben az innováció forrása alapjaiban szélesíti ki az élő szervezetek működésének molekuláris mechanizmusairól alkotott ismereteinket. Eközben biológiai gondolkodásmódunk is átprogramozódik. Nem kivétel a növények biológiája sem, hiszen a csúcstechnológiák, a rendszerszemlélet, vagy akár az informatika segítenek megérteni a növényi élet titkait. Gének ezreiről derült ki, hogy miként szabályozzák a növényi szervek kifejlődését, működését, milyen jelrendszerek biztosítják a környezeti hatások érzékelését, a 1

MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Növénybiológiai Intézet [email protected]

1

szélsőséges klimatikus tényezők elleni védekezést. A génművesség kínálta lehetőségek nem hagyták érintetlenül a növények nemesítését sem. Mind több géntechnológiával előállított ún. GM növény kerül köztermesztésbe a világon. Ezért jogos igény, hogy az emberek ismerjék a GMO-k előállításának főbb lépéseit, az új növényfajták értékeit, használatuk biztonsági garanciáit. A hasznos gének izolálását, új funkciók kialakítását a genomikai és a fenomikai programok segítik. A növényi GMO-król értekezve a hasznosítási lehetőségek ismertetése akkor lehet teljes, ha megismerjük, miként épülnek be a géntechnológiai módszerek a fajta-előállító nemesítés folyamatába. A növényi genomok DNS szekvenciájának ismeretében metodikai forradalom zajlik, ami szerepet kap a fenntartható fejlődés követelményeinek teljesítésében is, hiszen a sokféle gén-növény kombináció között több is sikeresebbé teszi a növények termőképességének optimalizálását. Kárt okozunk azzal, ha a GM növényeket nem tulajdonságaik alapján és nem tudományos alapon minősítjük, ehelyett tiltó törvényeket alkotunk egy valóban hatékonyabb nemesítési módszer magyarországi használatának korlátozására. A géntechnológiával történő nemesítés lényegének megismerése jelentősen segítheti a GMO kérdés tudományosan megalapozott kezelését annak érdekében, hogy ez a versenyképességet meghatározó agrárinnovációs irányzat a magyar gazdák érdekeit is szolgálja.

2. Bevezetés A tudományos megismerés újdonságai időről időre átformálják világképünket, ugyanakkor közvetlenül befolyásolhatják mindennapi életünket különösen, ha a felfedezések nyomán új technológiák és termékek születnek. Az újdonságok elfogadását gyakran kemény viták kísérik, és az ellentétes érvek - már a tudomány világától távol - politikai vagy gazdasági érdekek mentén ütközhetnek. A géntechnológia körüli történések a mezőgazdasági biotechnológia területén napjainkban jó példát szolgáltatnak arra, hogy a szakmai tények mennyire eltorzulhatnak. Különösen szélsőséges vélemények összecsapásait láthatjuk a géntechnológiával történő növénynemesítés kapcsán. A növényi GMO-k gyakori szereplők lettek a médiában és az emberek ilyen vagy olyan véleményt alkotnak, akár az előnyök, akár a kockázatok kerülnek terítékre. A tisztánlátás érdekében érdemes szakmai szigorral elemezni, mi is történik akkor, ha a gazdák, a fogyasztók vagy akár a környezet védelme érdekében új, laboratóriumban kialakított gének segítségével jobbítják a növények tulajdonságait. A géntechnológia teljesen új dimenziókat nyitott a növénybiológiai kutatásokban. Alapjaiban megváltozottak a növények életéről alkotott ismereteink. Erre számos példát mutat be a „ A növények csodálatos élete” című, a „Biológiai háttéranyag” program számára korábban készült cikk. A jelen tanulmány kísérletet tesz arra, hogy bemutassa a géntechnológia eszközeivel történő „genetikai módosítások” alapkoncepcióit, módszereit a molekuláris biológia, a növénynemesítés, vagy akár a fenntartható fejlődés iránt érdeklődőknek. Megismerhetjük, miként segítik a GMnövények a jobb fajták születését, melyek a biztonság garanciái, ha a géntechnológiával nemesített

2

növényeket termesztik és takarmányként vagy élelmiszerként hasznosítják, illetve mekkora a kockázatuk mértéke. 3.A genetikai módosítás (GM) alapfogalmai, története A GMO betűhármas elég gyakran feltűnik a hazai médiában, többnyire valami rosszat sugallva, amit ki kell átkozni. Ez a rövidítés az angol „Genetically Modified Organism” szavakból ered, amelynek a fordítása: „Genetikailag Módosított Élőlény”. Ha a szakmai meghatározáshoz precízen ragaszkodni akarunk, akkor a GMO-k alatt „Géntechnológiával módosított, nemesített élőlényt” kell értenünk. Még zavarosabb a kép, amikor a GMO-k mint biotechnológiai úton előállított élőlények jelennek meg. A fogalmak keveredése közepette a definíciók tisztázását segítheti, ha pontosítjuk azokat. Fári Miklós Gábor aktív kutatásainak köszönhetően ma már ismert, hogy a „biotechnológia” szó Ereky Károly gépészmérnöktől származik, aki 1918-ban megjelentetett dolgozatában adta az első megfogalmazást: a „munkaszervezés tudomány (technológia) új, az élő organizmusokkal, biológiai munkagépekkel foglalkozó ága”, amely hasznosítható termékeket állít elő. Az élelmezési miniszter maga is több biotechnológiai fejlesztést valósított meg. Így említhetjük a takarmányként használt „plazma-koncentrátumot”, amelyet a lucernalevelek rostmentesítésével állítottak elő. Napjaink biotechnológiai tevékenységének lényegét az OECD meghatározása egyértelműen leírja: „A biotechnológia a tudomány és technológia alkalmazása élő szervezeteken, azok részein, termékein vagy modelljein azzal a céllal, hogy megváltoztassunk élő vagy élettelen anyagokat tudás, termékek vagy szolgáltatások létrehozásáért”. Tekintettel a tudományos kutatás újabb és újabb eredményeire a biotechnológiai módszerek, technológiák köre folyamatosan bővül, de vitathatatlan, hogy az 1970-es évektől a géntechnológia központi szerepet játszik, akár a piros (orvosi), akár a zöld (agrár-élelmiszeripari) vagy a fehér (ipari-környezetvédelmi) biotechnológiáról beszélünk. A géntechnológia, mint a szóösszetétel is utal rá, az örökítő anyag, a DNS szerkezetének megismerését, működésének eltervezett átprogramozását szolgáló módszerek alkalmazását jelenti, elsősorban abból a célból, hogy tulajdonságaikban megváltoztatott sejteket, szerveket vagy szervezeteket lehessen előállítani. Míg a géntechnológia egyike a modern biotechnológiai technikáknak, addig hangsúlyoznunk kell, hogy ugyanakkor a „génmódosítási” eljárások közé tartozik, amelyeket a növények nemesítése során is használnak. Az 1. ábra világosan bemutatja, hogy a „génmódosítás” mennyire ősi tevékenység, évszázadokkal megelőzi a biotechnológia vagy akár a géntechnológia megjelenését. Termesztett növényeink esetében a génmódosítás elsődleges letéteményese a növénynemesítés, azzal a céllal, hogy a születő fajták megfeleljenek a gazdák elvárásainak. Ezért ne lepődjünk meg, de minden nemesített gazdasági növényünk génmódosított, „génpiszkált”. Ezt jó lenne a viták hevében is tudatosítani. Az 1. ábra időrendbe állítja, hogy miként jelentek meg a nemesítésben az újabb és újabb megközelítések a növények génösszetételének egyre tudatosabb javítására.

3

1. ábra. A búzagének módosításának módszerei az évszázadok során

A keresztezés és a szelekció ma is nélkülözhetetlen művelet a fajták előállítása során. A kromoszómák számának megduplázása, a poliploidizáció, vagy a kromoszómadarabok átépítése sokszor vezetett versenyképes tenyészanyagok kialakulásához, melyet a citogenetikai kutatások alapoztak meg. A DNS molekula vegyszerekkel, besugárzással véletlenszerűen megváltoztatható, és így mutáns egyedek új tulajdonságai alakulhatnak ki, amelyek öröklődnek és a nemesítési programokban alapanyagul szolgálhatnak. A géntechnológiával történő nemesítés feltételeit igen kiterjedt alapkutatások teremtették meg. Az 1980-as évektől kezdve lehetőség van a növényi gének izolálására, kémcsőben történő alakítására és

a

gének visszaépítésére,

a genetikai

transzformációra. Ez a géntechnológiára épülő műveletsor vezet el a növényi GMO-khoz. Napjainkban tanúi lehetünk annak, miként változik a nemesítés technológiai háttere, nő a beavatkozások precizitása. 4. Növényi gének kémcsőben: genom programok A növények nemesítését intuitív művészetnek tekinthetjük, hiszen a génekkel való műveleteket a nemesítő hagyományosan úgy végzi, hogy csak a felszíni tulajdonságokat ismeri, és abból kísérli meg a génhatásokat megbecsülni. Teljesen más helyzetet teremtett az a felismerés, hogy a genetikai információ, mint kód a DNS molekulák nukleotid bázisainak sorrendjében tárolódik. A gének misztikus világa kémiailag definiálható molekulák formájában jelenik meg. A növények össz-DNS tartalma, genomjának mérete igen széles határok között változik: a rizs 400 millió, a kukorica 2,5 milliárd, míg a búza 16 milliárd bázispárt tartalmazó DNS molekulái összetömörítve, fehérjékbe csomagolva alkotják a kromoszómákat. A sejtek osztódását megelőzően a DNS molekulákról hű – bár néha hibás - másolat szintetizálódik, ezzel a kromoszómák is megduplázódnak, majd a két kromoszómakészlet szétválik, az új leánysejtekbe kerül, ezzel lehetségessé válik a

4

génállomány sejtről sejtre történő átadása. Ez a konzervatív, a genetikai információt megőrző folyamat jellemzi az ivarsejtek kialakulását is, és a tulajdonságok ezen az úton öröklődnek az utódokban. Ha a genetikai információ a DNS molekulák nukleotid bázisainak sorrendjeként rögzítődik, akkor a sorrend megismerése DNS szekvenálással alapfeltétel ahhoz, hogy megértsük az örökítő anyag működését, illetve génsebészeti műveleteket végezhessünk. A teljes DNS állományra kiterjedő bázissorrendek meghatározását ún. genom programok keretében végzik. A DNS szekvenátorok új generációinak köszönhetően egyre több növény genomjának felépítését ismerhetjük meg. A kis genom méretű modellnövények, mint az Arabidopsis vagy a Brachipodium, mellett fontos termesztett növényeink esetében is rendelkezésre áll genom szekvenciájuk adatbázisa: rizs, cirok, kukorica, repce, nyár, szója, alma, eper és uborka. Az informatikai programok a szekvenciák elemzésével segítséget nyújtanak a fajra jellemző gének számának megbecsléséhez. Az egyes növény fajok genomjában a gének száma jelentősen eltérhet: Arabidopsis→25000; kukorica→32560; nyár→45555; rizs→41000. Míg a gének számát igyekszünk megbecsülni nem szabad megfeledkezni arról, hogy a növények esetében igen magas, 90% feletti az ismétlődő ún. repetitív szekvenciák aránya, amelyek nem kódolnak fehérjéket, vagy akár kis RNS molekulákat, ugyanakkor fontos szerepet töltenek be a genomok méretének meghatározásában, és a növényi evolúcióban. Ehhez a szekvenciakategóriához tartoznak az ugráló, transzpozon szekvenciák. A géntechnológia eszközeit alkalmazó növénynemesítés kulcs problematikája az, hogy miként lehet olyan géneket azonosítani és izolálni, amelyek előnyösek az agrotechnika, az élelmiszeripar vagy a környezetvédelem, továbbá a bioenergia termelés szempontjából. A génizolálási programokban a megközelítések egész sora jöhet számításba, ezért itt csak néhány fontosabbat mutatunk be példának. Mint említettük, több tízezer gén közül kell megtalálni azt a DNS molekularészt, amely felelős a kiválasztott tulajdonságért. A génvadászathoz felhasználhatjuk a genomi DNS-t vagy a kifejeződő géneket reprezentáló ún. kópia, cDNS-eket. 4.1. A termőképességet, a szemek méretét befolyásoló egyik rizs gén izolálása géntérképezéssel Talán az könnyen belátható, hogy a búza vagy a rizs termésének mennyisége a növényenkénti szemek számától, a felhalmozódott keményítő mennyiségétől és így a szemek méretétől függ, amit az ezerszemsúllyal fejezünk ki. A szemek nagyságát meghatározó gének ezért a termést növelő növénynemesítés kulcsszereplőivé válnak. Kérdés, hogyan találhatunk ilyen géneket? Olyan feladat ez, mint gombostűt keresni a szalmakazalban. A rizs 40 ezer génje közül kell kiemelni a szemek szélességét meghatározót. A géntérképezésen alapuló génvadászat számos sikert hozott, ezért érdemes egy példa segítségével a folyamat főbb lépéseit megismerni. Song és mtsai. (2007) ilyen géntérképezésen alapuló módszerrel klónozták meg a szemek méretét befolyásoló egyik gént. Amennyiben az utód két, génállományában és így tulajdonságaiban eltérő növénytől származik, akkor keresztezéskor a gének és a tulajdonságok új kombinációja jön létre. Ezt használja ki a géntérképezés, amikor DNS szekvencia markerekhez köti egy adott tulajdonság megjelenését. A kapcsoltság

5

ismeretében lehetőség nyílik valamely tulajdonság kialakulásáért felelős gén kromoszómán elfoglalt helyének meghatározására. A követett génizolálási stratégia általánosan használható, ezért röviden ismertetjük. A rizs kísérlet során két szemméretben jelentősen különböző fajta keresztezésével állították elő a térképezési populáció F2 generációját. Mint az a 2. ábrán látható, az indica FAZ1 fajta kis szemeket produkál (17,9g ezerszemsúly), a japonica WY3 fajta szemei pedig igen nagyméretűek (41,9g

ezerszemsúly).

Az

F1

növények

öntermékenyítéséből

származó

F2

növények

visszakeresztezése a FAZ1 növényekkel a BC1F1 generáció szemeit eredményezte. Az ezekből felnevelt növények közül kiválasztották azokat, amelyek heterozigóták abban a GW2 régióban, ahol a keresett gén található, viszont a FAZ1 szülőre nézve minden más régióban homozigóták.

2. ábra. A nagy szemű rizs kialakításáért felelős GW2 gén izolálása nagy felbontású genetikai térkép segítségével (Song és mtsai., 2007) a) A két szülői fajta rizsszemeinek mérete; b) A GW2-régiót közrefogó molekuláris markerek (WO24, WO04) a második kromoszómán és a rizs genomikus DNS-darab bakteriofág B1 vektorban (AP005004); c) Stabil rekombináns vonalak a FAZ1 szülőkkel történt visszakeresztezések után, amelyeknek megvan a 8,2 kb GW2 DNS-régiójuk, széles szeműek

A nagy szemű rizs kialakításáért felelős GW2 gén izolálása nagy felbontás segítségével (Song és mtsai 2007) A 2. ábra azt mutatja, hogy a genetikai GW2 lokusztérkép (génhely) 8.2 kb régiója a WO24 és WOO4 markerek közötti szakaszban található. A széles szemek és a GW2 régió közötti kapcsolatot az 2/c ábrarész szemlélteti. A rekombináns vonalak (R1, R2, R3), melyek a GW2 gén WY3 változatát hordozzák, szignifikánsan szélesebbek, ezek közé tartozik a C1WY3 homozigóta szülő. A GW2 régiót közrefogó markerek segítségével meg lehetett klónozni és szekvenálni a GW2 gént, mind a WY3, mind a FAZ1 fajta DNS-ének felhasználásával. Ekkor derült ki, hogy a nagy szemért felelős GW2 gén WY3 variánsa esetében egy szekvencia szakasz hiányzik, ami működésképtelenséget eredményezett. Természetesen a szekvencia adatok alapján azonosítható volt a gén fehérjeterméke. A GW2 gén normál változata egy olyan, a fehérjék lebontásában szerepet játszó enzimet kódol, amelyik a sejtek osztódását gátolja. Így aktívabb sejtosztódás jellemzi a hibás gént hordozó WY3 növényeket. 6

4.2.Gének klónozása génkifejeződési mintázat alapján A DNS szekvenálásra épülő genomprogramok mellett a funkcionális genomikai megközelítések - a génkifejeződési mintázat teljes körű elemzésével - olyan gének felfedezését teszik lehetővé, amelyek valamely tulajdonság, élettani folyamat szabályozásáért felelősek. A röghöz kötött növények különösen kiszolgáltatottak a szélsőséges időjárási körülményeknek. A víz hiánya, az aszály az egyik legsúlyosabb stressz, amihez az egyes fajták, genotípusok különböző mértékben képesek alkalmazkodni. A szárazságtűrő növények többféle védekezési mechanizmust is képesek működtetni, ezért fontos azoknak a géneknek az azonosítása, amelyek részt vesznek a jobb vízhasznosítási tulajdonságok kialakításában. A 3. ábra a különböző búzafajták közötti alapvető eltéréseket szemlélteti, aszálytűrő képességüket tekintve. A Plainsmann ellenálló fajta erőteljes gyökérzetével szemben az érzékeny Capelle Desprez növények gyökérrendszere lényeges tömegcsökkenést mutat. Az Emese fajta hosszabb gyökeret fejleszt a vízhiányos talajban, az érzékeny Élet fajta gyökérhossza pedig kisebb a szárazság körülményei között. 3. ábra. A gyökérstruktúra és a hajtás alakulása függ a búzanövények genotípusától a rossz vízellátottságú talajban A) optimális vízellátás; B) szárazságstressz (Györgyey J. és mtsai. kísérlete)

A szárazság okozta stresszre adott eltérő válaszok alapján indokolt az említett genotípusok gyökeréből származó mRNS-populációk összehasonlító vizsgálata optimális és hiányos vízellátás mellett. Az AGILENT cég által készített, szintetikus oligonukleotidokat hordozó mikroarray 15000 búza gén szekvenciáját reprezentálja, amellyel meghatározható az aktivált, illetve represszált gének köre (4. ábra). A DNS chip adatok alapján értékelhető a fontos gének, géncsoportok működése, és kiválaszthatók olyan gének, amelyek az adaptációra képes fajtákban jelentős kifejeződésbeli változást mutatnak.

7

Genomszintű génkifejeződés-vizsgálat: DNS-csip

4.3.

4. ábra. A szárazságstressz okozta változások a génkifejeződési mintázatokban az ellenálló és érzékeny genotípusok összehasonlításában 15 ezer szintetikus búza oligonukleotidot tartalmazó DNS csip (Agilent technológia: piros = aktivált gének; kék = gátolt gének) (Györgyey J. kísérlete)

A szárazságstressz okozta változások a génkifejeződési mintázatokban az ellenálló és érzékeny genotípusok összehasonlításában 15 ezer szintetikus búza oligonukleotidot tartalmazó DNS-csip (Agilentmint technológia) Györgyey J. kísérlete Mutánsok gyűjteményei, a génizolálás alapanyagai

A sikeres és célirányos génizolálási programok feltétele, hogy végső soron kapcsolatot lehessen felállítani egy adott gén vagy annak alléljei (nukleotid szekvencia variánsok) és a hozzátartozó fenotípusos bélyeg között. A mutációk, mint a DNS molekula szerkezetében bekövetkező, öröklődő megváltozások többnyire a tulajdonságok módosulásában is tükröződnek. Így a mutánsok gyűjteményéből kiválaszthatók a kívánt változást hordozó variánsok, amelyek aztán felhasználhatók a felelős gén azonosításához. A mutáció bekövetkezhet egyetlen nukleotid bázis kicserélődésével, ezek az ún. pont mutánsok, de gyakran DNS molekula-darabok beépülése rontja el a gén működését. Az utóbbi ún. inszerciós mutánsok különösen alkalmasak az érintett gén azonosítására és izolálására. Az 5. ábra példaként a tulajdonságok változatosságát mutatja be egy Arabidopsis inszerciós mutáns kollekcióból.

5. ábra. Arabidopsis inszerciós mutánsok formagazdagsága, amelyek ugráló gének -traszpozonok- vagy T-DNS beépülése eredményezett (K. Shinozaki RIKEN Plant Science Center)

8

A transzpozon mutagenezis úgy valósítható meg egy aktív és egy inaktív ugráló szekvencia segítségével, hogy a beépülés egyszeri és stabil legyen. A T-DNS mutagenezist eredményező integráció folyamatát egy későbbi fejezetben tárgyaljuk. Az inszerciós mutánsok esetében megkönnyíti az elrontott gén megtalálását, hogy többnyire ismert a hibát okozó DNS molekulaszakasz szekvenciája és így annak segítségével megtalálható az érintett gén. Mintegy címke kerül a génre, melynek segítségével az felszaporítható és izolálható. Mivel a címke-DNS beépülése a genomi DNSbe véletlenszerű, ezért nagyszámú mutáns előállítására és jellemzésére van szükség. Az Arabidopsis esetében mintegy 200 ezer beépülés és a környezetének szekvenciája ismert, ami azt jelenti, hogy a fehérjéket kódoló gének 80%-át érinti a T-DNS okozta mutáció. A

funkcionális

genomika

eszköztárában

igen

hasznosnak

bizonyultak

azok

a

mutánsgyűjtemények, amelyekben az integrálódott DNS molekula erős kifejeződést biztosító szabályzó elemmel, az ún. promóterrel rendelkezik. Amennyiben a beépülés gén vagy gének közelében történt, akkor a címke fokozott génkifejeződést okozhat, és az aktivált gén hatására jellegzetes fenotípus alakulhat ki, mint azt a 6. ábra szemlélteti. A japán kutatók kísérletében 13 ezer független címkével aktivált vonalat vizsgáltak, és olyan variánst találtak, amelynek egyedei alacsonyabbak, felálló levelűek. A bugák rövidsége mellett a szemek is kevésbé nyúltak meg. Az SG1 gén fokozott működése a csökkent hormonérzékenységre vezethető vissza. (Nakagawa és mtsai., 2011)

6. ábra. Az SG1 gén aktiválása beépüléses mutagenezissel A: A konroll (wt) és homozigóta mutáns (Sg1-D homo) növények B:T-DNS promótere (35S) aktiválja az SG1 gént és működteti a PAT szelekciós markert C: a mutáns heterozigóta (Sg1-D/+) homozigóta (Sg1-D homo) szemei kisebbek, mint a vad típusé (wt) (Nakagawa és mtsai., 2011).

4.4 A gének filogenetikai konzerváltsága segítheti a növényi gének izolálását Már az 1980-as években, amikor az első növényi géneket sikeresen izolálták, és meghatározták DNS-ük nukleotid bázis sorrendjét, kiderült, hogy jelentős megfelelés, homológia mutatható ki még az evolúciós törzsfán távolinak tekintett növények génjeinek szerkezetében is. Sőt, a megegyezés számottevő, ha a növényi géneket mikrobák, állatok vagy akár az ember megfelelő

9

génjeihez hasonlítjuk. A „synteny”jelenség figyelhető meg, ha különböző fajok kromoszomális géntérképeit hasonlítjuk össze. Egyes kromoszóma szakaszokon a gének elhelyezkedésének sorrendje megegyező lehet. Ha a szekvencia konzerváltság megfelelő kiterjedésű, akkor ismert gének alapján más növények azonos génjei is izolálhatók. Különösen széles lehetőségeket teremt az ilyen génizolálási stratégiák számára az, hogy egyre nő azon fajok száma, amelyek esetében már a teljes genom szekvenálása megtörtént.

7. ábra. Egy adott DNS szakasz felszaporítása, izolálása polimeráz-láncreakcióval az ún. PCR módszerrel

10

Napjainkban bármely gén izolálása nagy biztonsággal elvégezhető a polimeráz láncreakció (PCR) felhasználásával. Még a kis példányszámú specifikus DNS szekvencia részek is megsokszorozva szintetizálhatók meg, és ezzel a gének izolálhatók. Az 7. ábra a PCR-alapú génfelszaporítás főbb lépéseit mutatja be. Reakciókeverékhez két mesterségesen szintetizált DNSfragmentet, ún. oligonukleotidot (primert) adnak, amelynek szekvenciája olyan bázisokból áll, hogy kapcsolódni tudjanak a cél-DNS bázisaihoz. A primerek szekvenciájának megtervezését egy másik faj génjének nukleotid sorrendje alapján végezhetjük el. Talán még meglepőbb, ha azt tapasztaljuk, hogy a szekvencia megfelelőségen túl, a rendszertanilag igen távoli fajokból származó gének funkcionálisan is helyettesíthetik egymást. Erre több példát is találhatunk, különösen akkor, ha az alapvető sejtfunkciók génjeit vizsgáljuk. A sejtek osztódását szabályzó mechanizmusok sokban hasonlítanak az élesztőtől az emberig. Így felmerül annak lehetősége, hogy valamely hibás élesztő sejtosztódási gént növényi génnel kíséreljünk meg kijavítani. Egy ilyen kísérletet mutat be a 8. ábra, amelyen megnyúlt alakú, osztódásra képtelen élesztősejteket láthatunk, mert egy osztódási génjük nem működik. Ezekbe az élesztősejtekbe be lehet építeni például a homológ lucerna gént, ami helyreállítja a sejtosztódási képesség hibáját. Ez a komplementáció a mutáns élesztőgén növényi homológjának izolálására is felhasználható. Ilyenkor valamely növényből származó cDNS keveréket, bankot transzformálunk be a mutáns sejtekbe, amelyekből kiszelektálódnak az osztódásra képes élesztősejtek, mivel hordozzák a keresett növényi osztódási gént. Ezzel a módszerrel azonosítottuk például a lucerna egyik sejtosztódási génjét (Hirt és mtsai., 1991). 8. ábra. A lucerna sejtosztódási gén képes kijavítani az élesztő mutációból eredő osztódási képtelenséget. Jobb oldali kép: nem osztódó, mutáns élesztősejtek; bal oldali kép: a lucerna gént hordozó élesztősejtek (Hirt és mtsai., 1991)

5. GM növények születése génbeépítéssel: módszerek A géntechnológiával létrehozott új génállományú növények egyrészt a kutatásban nélkülözhetetlenek, másrészt mind nagyobb szerepet kapnak a fajtaelőállító nemesítésben. A növényi

11

GMO-k létrehozásához használt módszerek kidolgozását hosszú kutató-fejlesztő munka alapozta meg. Ma már elmondható, hogy többféle út is járható, ha izolált géneket akarunk beépíteni egy adott növény genomjába. Magát ezt a beavatkozást genetikai transzformációnak nevezi a szakma, az új növényeket pedig transzformánsoknak. A GMO elnevezés elterjedése a köznapi szóhasználatban nem szerencsés, de ma már megkerülhetetlen. A GM növények előállításának folyamata az alábbi műveletekre épül: 5.1 A célgén működőképes változatának összeépítése transzformációs vektor molekulával A módszerek bemutatása előtt tekintsük át a növényi GMO-k alaptípusait! Az ún. ciszgenikus növények esetében a beépített gén a befogadó fajból vagy annak őséből, illetve azzal ivarosan keresztezhető fajokból származik. Logikus az lenne, ha az ilyen, saját gént hordozó GM növény termesztésére vonatkozó szabályozás figyelembe venné, hogy a génállomány összetétele lényegében változatlan, a génsebészeti beavatkozás csak az érintett gén sajátosságait módosítja. Hasonló változások következnek be a hagyományos nemesítés során, akár a keresztezést, akár a szelekciót követően. Az ún. transzgenikus növények rendszertanilag távoli növényből vagy bármilyen más élőlényből izolált gént hordoznak. Az evolúciós határok átlépése teljesen új tulajdonságokkal ruházhatja fel a befogadó faj növényeit. Az ilyen növények termesztésének előnyeit illetve kockázatait az új genotípusból eredő tulajdonságok figyelembe vételével, esetenként kell értékelni. Egy növény termesztését csak azért tiltani, mert nemesítése során géntechnológiai módszert is alkalmaztak, szakmaiatlanság, ha előbb nem mérlegeljük az adott gén és a befogadó faj új kombinációjának sajátosságait. Ennek szabályait mind az európai uniós mind a nemzeti törvényi előírások rögzítik. A célgént különböző DNS molekula típusok formájában lehet génbeépítéshez felhasználni. A genomikus DNS működőképességét az biztosítja, ha a beépítésre kerülő molekulaszakasz a gén valamennyi funkcionális egységével rendelkezik, úgymint a kifejeződést biztosító promóterrel, a hírvivő ún. mRNS molekulák szintézisét irányító kódoló szakasszal, majd a terminációs szerepet betöltő DNS szekvenciával. A mRNS molekulák a fehérjék szintézisét irányítják. Leggyakrabban cDNS molekulákat építenek be a transzformációs vektorokba. Ezek a mRNS molekulákról szintetizált ún. kópia DNS-ek aktív géneket reprezentálnak. Ha nem növényből származó gén kifejeztetése a cél, akkor érdemes a transzgént a növényi kódhasználat figyelembevételével mesterségesen megszintetizálni. Természetesen a cDNS molekulák alkalmazása esetén is szükség van promóter szekvenciákra. Számos géntechnológiai megoldás igényli, hogy a célgént a növény minden sejtjében és magas szinten fejezzük ki. Ilyen erős, mindig működő promóterek izolálhatók vírusokból vagy akár egyes növényi gének genomikus szekvenciájának felhasználásával. Sok esetben a kívánt biológiai hatás eléréséhez szükség van a célgén sejt- vagy szövetspecifikus működtetésére (lásd később a 12. ábrát). Kívánatos lehet, hogy a célgén csak meghatározott környezeti feltételek között működjön. Például a szárazságtűrést javító gén kifejeztetését indokolt a vízhiányra korlátozni. Ma már a promóterek széles választéka áll rendelkezésre. Ezek a DNS molekulák gazdasági értéket képviselhetnek, ezért sok esetben szabadalommal védettek.

12

Akár a növényi funkciók megismerése, akár előnyös agronómiai tulajdonságok kialakítása céljából hozunk létre GM növényeket, két fő géntechnológiai stratégia jöhet számításba. Az egyik esetben a gén termékének felfokozott szintézise a cél, amit erős promóterek alkalmazásával érhetünk el. A másik megoldás egy adott gén kikapcsolásával kívánja a növény valamely tulajdonságát megváltoztatni. A gén elhallgattatás többféle úton vihető végbe, például a fehérjeszintézis megakadályozása a célgénről, vagy a mRNS molekulák specifikus lebontása. Az utóbbi úgy érhető el, hogy a cDNS molekulát fordított irányban építjük össze a promóterrel, mellyel ún. antiszensz RNS molekulák szintetizálódnak, amelyek kettős szálat, RNS-RNS hibridet képeznek a kikapcsolandó génről szintetizálódott mRNS molekulákkal. A mRNS-ek specifikus degradációját eredményezhetik, az ún. kis interferáló RNS-szakaszok. A fentiek alapján érdemes felvázolni egy ideális növényi transzformációs vektort. A 9. ábra bemutatja egy ilyen, többnyire kör alakú molekula legfontosabb alkotóelemeit. Természetesen szükség van a célgén kifejeződését biztosító blokkra, ami a promótert, a célgént, és a terminációs szignált foglalja magába. Mint később látni fogjuk, bármilyen génbeviteli módszert is alkalmazunk, a célgén csak a növényi sejtek töredékébe kerül be, ezért meg kell különböztetni, és ki kell szelektálni a transzformált sejteket, szöveteket. Ezt szolgálják a szelekciós markerek. Ebben a blokkban is szükség van egy növényi promóterre, a rezisztencia vagy riporter génre és a terminációs jelre. A kezdeti génbeépítési munkákban gyakran antibiotikum rezisztencia kialakításával teremtettük meg a szelekció lehetőségét. A GMO ellenzők, a kísérletek eredményeit figyelmen kívül hagyva erre hivatkozva támadták a géntechnológia nemesítési felhasználását, ezért alternatív megoldásként előtérbe kerültek a gyomirtó szer ellenállóságot biztosító gének (lásd a 14. ábrát). Mivel a vektor molekulákat baktérium sejtekben kell felszaporítani, ezek a plazmidok bakteriális replikációs és szelekciós marker génekkel is rendelkeznek.

. 9. ábra. Egy növényi transzformációs vektor vázlatos bemutatása a főbb funkcionális részek feltüntetésével

13

5.2 A célgén bejuttatása a gazdanövény sejtmagjaiba és integrációja a genomba valamint a transzformált sejtek, szövetek szelekciója Bár a növény transzformációs módszerek több változata között lehet választani, a napjainkra kialakult gyakorlat szerint egy, a természetben is előforduló folyamatra, az Agrobacterium közvetítette génátvitelre alapozott technológiák alkalmazása vált széleskörűvé. Mára számos kísérlet igazolja, hogy Agrobacterium fertőzéssel nemcsak kétszikű, hanem egyszikű gabonafélék is sikeresen transzformálhatók. Természetesen az Agrobacterium sejtekben található Ti plazmidot át kellett alakítani ahhoz, hogy a kívánt génbeviteli és integrációs funkciói megmaradjanak, és közben kikerüljenek azok a gének, amelyek zavart okozhatnak a növények fejlődésében. Az Agrobacterium talajbaktérium Ti plazmidjának T-DNS-ére alapozott vektorok rendelkeznek határszekvenciákkal (RB, LB), amelyek által határolt DNS fragment épül be a növény DNS állományába. A transzformáció molekuláris folyamatai mind bakteriális, mind növényi faktorok, fehérjék segítségével biztosítják az idegen DNS integrációját a gazdanövény genomjába. Ma már számos csúcstechnológiát jelentő vektor áll rendelkezésre a kívánt DNS bináris transzformációs vektorokba való hatékony beépítésére. A fejlesztések lehetővé tették a nem kívánt szekvencia részek minimalizálását, markermentes transzgenikus növények előállítását, illetve egyidejűleg több gén beépítését. A növényi szövetek sejtjeinek fertőzése Agrobacterium- mal sokféleképpen lehetséges. A növényregenerációra

képes

sebzett

levélszöveteinek

rázatása,

illetve

vákuum

infiltrálása

Agrobacterium-os tápoldatban, majd az inkubációt követő szövettenyésztés és hajtásregeneráció lehetővé teszi a transzgenikus növények fölnevelését. Az in vitro tenyésztés elkerülhető a virágbimbók Agrobacterium-szuszpenzióba mártásával. Nyilvánvaló, hogy nem minden növényi sejt részese az Agrobacterium–növény kölcsönhatásnak. Ezért szelekciós nyomás alkalmazásával kell elérni azt, hogy csak a transzformált sejtek szaporodjanak, és azokból nevelhessük fel a GM növényt. A növényi szelekciós markergént a T-DNS-en kell elhelyezni, az általában folyamatosan működő, ún. konstitutív promóter irányításával. A herbicidrezisztencia-gének, mint szelekciós markerek lehetővé teszik szulfonamid vagy bialafosz/foszfinotricin- kezeléssel a nem transzformált sejtek vagy szövetek elpusztítását. A GM növények előállítása érdekében sikeresen alkalmazható a génbelövés, mely során a DNS-t rászárítják aranyrészecskékre és magas nyomású gázzal belövik a szövetekbe. Pontosabban, a transzgén beépüléséhez az kell, hogy az idegen gén a sejtmagban legyen. A gazdanövény genomjában a DNS szintézis idején kerülhet sor a transzgén beépülésére Talán érdekes az a megoldás, amikor lemeztelenített, sejtfal nélküli sejtekbe az ún. protoplasztokba történik a DNS bevitele, kémiai kezeléssel. A 10. ábra egy ilyen transzformációs műveletsor folyamatát mutatja be: a gyomirtó szer rezisztenciagén beépítését kukoricasejtekbe. A kezelt sejtek osztódását követően a szövetekben elindítható a hajtások regenerálódása és teljes értékű, termést hozó kukoricanövények nevelhetők fel. Az ábra olyan kukoricanövényeket is bemutat, amelyek a GM növények második generációs utódai. Láthatunk foszfinotricinnel történt permetezés

14

után elpusztult növényt, egy szegregánst, a rezisztencia gén nélkül. Mellette lévő társa hordozza az ellenállóság génjét, így az, a kezelés ellenére, nem sérül. A transzgén ugyanolyan öröklődési

törvényeket

követ,

mint

a

befogadó faj több tízezer génje.

10. ábra. A bialafosz/foszfinotricin rezisztencia gén beépítése kukoricába (Omirulleh és mtsai., 1993) A:kukorica sejtszuszpenziós tenyészet, amelyben embriók differenciálódhatnak (Mórocz Sándor által kinemesített genotípus) B: Frissen izolált sejtfal nélküli protoplasztok, amelyek alkalmasak a plazmid DNS molekulák felvételére C: protoplaszt eredetű többsejtes mikroszövetek D: hajtások differenciálódása protoplaszt eredetű kallusz-szövetekben E: foszfinotricin permetezést követően érzékeny és rezisztens szegregánsok a GM növény utódai között

5.3 A transzformáns növények molekuláris jellemzése: a célgén kimutatása és kifejeződésének igazolása A GM növények jellemzése a laboratóriumban kezdődik, majd az üvegházban és a kísérleti parcellákon folytatódik. Mindenekelőtt vizsgálni kell, hogy a kiszelektált szövetek és az azokból felnevelt növények genomjában valóban jelen van-e a transzgén illetve hány példányban integrálódott. Számos közleményben a szerzők az ún. Southern hibridizáció módszerével igazolják a transzgén jelenlétét. Ilyenkor a transzgén DNS darabját foszfor izotóppal megjelölik és a befogadó növény restrikciós enzimekkel feldarabolt DNS-éhez hibridizálják, amit gélelektroforézissel frakcionáltak és filterhez rögzítettek. A 11./A ábra egy ilyen hibrizdizáció eredményét mutatja be, amikor a GM repce genomjában kellett az uidA (GUS) riporter gént kimutatni. Alternatívaként, mivel a beépített DNS molekula szekvenciája ismert, PCR primerek

tervezhetők

és

segítségükkel az izolált genomikus DNS-ből

megsokszorozható

a

vizsgált idegen DNS szakasz, vagyis igazolható az új gén jelenléte (11./B ábra). 11. ábra. A GUS riportergén (uidA) kimutatása Southern hibridizációval (A: 2-3 GM növény), illetve PCR technikával (B: 2-5 GM növény) (Stefanov és mtsai., 1994)

15

A beépített uidA riportergén működőképessége a β-glukorodináz (GUS) enzimreakcióval is igazolható, ahol a szövetek festése után kék szín jelzi azokat a sejteket, amelyekben a GUS enzim képződött. A 12. ábra olyan dohánytranszformánsok gyökér- és hajtástenyészcsúcsát mutatja, amelyekben a beépített génkonstrukció promótere csak osztódó sejtekben működőképes. 12. ábra. A kék szövetrészek osztódó sejtekben gazdagok. Ebben az esetben a GUS riportergén promóterének aktivitása az osztódó sejtekre korlátozódik (Kapros és mtsai kísérlete, 1993)

A

transzgének

fehérjetermékének

kimutatására

gyakran

használnak

immunológiai

módszereket. A Western hibridizáció megbízhatóan mutatja a beépített gén termékének mennyiségét. A korábbiakban ismertetett génbeépítési technológiák hiányossága, hogy a transzgén integrációja véletlenszerű, ezért utólag kell ellenőrizni, hogy a gén beépítése okozott-e nem kívánt változást. Erre való tekintettel több független GM vonalat célszerű előállítani, hogy lehetőség legyen a hibás növények kizárására. Természetesen intenzív kutatás folyik a helyspecifikus génbeépítés módszereinek kidolgozása érdekében. Növényi genomok szerkesztését célozzák azok a kísérletek, amelyek a cinkujj-nukleázokra (ZFN) alapozott technológiák kidolgozását szolgálják. Génspecifikus mutációkat létrehozhatunk kémiai úton szintetizált DNS molekulákkal, oligonukleotidokkal. A növénybiológia témakörében megjelenő tudományos közlemények sok esetben használják a GM növényeket az alapvető élettani, fejlődésbiológiai kérdések tanulmányozása során. Igen csak nehéz olyan tulajdonságot találni, amelyet ne változtattak volna meg génbeépítéssel. Az ismeretlen gének szerepének tisztázásához is nélkülözhetetlenek a GM növények. A sok-sok példa közül a 13. ábra egy igen meglepő jelenséget mutat be. A növényi őssejt állapot fenntartásában szerepet játszó WUSCHEL (WUS) fehérje génjének fokozott működtetése a GM dohánynövények gyökércsúcsán embriók kialakulását okozhatja. Ezek a testi sejtekből differenciálódó embriók igazolják a növények

16

fejlődési programjának nagyfokú rugalmasságát, hiszen úgy tudjuk, hogy az embriogenezis természetes folyamata

az

ivarsejtek

egyesülésével indul meg.

13. ábra. A WUSCHEL gén fokozott kifejeződése embriók differenciálódását eredményezheti a GM dohánynövény gyökércsúcsán (Zuo és mtsai., 2002.)

A GM növények tesztelését sokszor indokolt szabadföldi kísérletekkel is elvégezni. Egy ilyen példát mutat be a 14. ábra. Pauk János és munkatársai a valamikori szegedi Gabonakutató Intézet kutatói, a bialafosz/foszfinotricin gyomirtó szerrel szembeni ellenállóság génjét építették be génbelövéssel, búzába. Mint a képen látható, a permetezést követően a kontrollnövények elpusztultak, míg a GM búza vonalak egyértelmű rezisztenciát mutatnak.

14. ábra. A szabadföldi kísérletben is kimutatható a GM búza genotípus bialafosz/foszfinotricin rezisztenciája. A bal oldali két sorban a kontrollnövények elpusztultak a rezisztencia gén hiányában. (Pauk és mtsai. kísérlete)

17

6. A transzformáns GM növények felhasználása a nemesítési programokban A növényi produkció maximalizálása fontos nemesítési cél, hiszen a fajták genetikai képességétől sokban függ a növénytermesztés gazdaságossága. Ugyanakkor az emberiség globális problémáinak kezelésében is jelentős szerep vár a növénytermesztésre. A növények rendelkeznek azzal a genetikai programmal, amely a fotoszintézist, mint egy természetes energia-átalakító folyamatot működteti, és ami a Földünkön az élet alapja. Ennek során a légköri széndioxid-gáz szénmolekuláiból energiahordozó szénhidrátok keletkeznek. A termés, legyen szó bármilyen növényi szervről a molekuláris, élettani, valamint fejlődési folyamatok bonyolult rendszereinek terméke. Ez a sejtek, szövetek működésében megnyilvánuló komplexitás összhangban van azzal, hogy az ilyen mennyiségi tulajdonságok nagyszámú gén szabályozása alatt állnak. A belső genetikai program megvalósítását azonban a növényt érő külső hatások lényegesen befolyásolhatják, ezért a fenotípus, a növény végső jegyeinek összessége, e kettős meghatározottság eredőjeként alakul ki (15. ábra).

15 .ábra. A növényi produkció, a termés egy olyan fejlődési program terméke, amelyet a gének és a környezet hatásainak összjátéka irányít. A gazda felelőssége, hogy a termesztés optimális feltételei meglegyenek még akkor is, ha a szélsőséges időjárási körülmények kárt okozhatnak. A növények nemesítője a tudományos kutatás eredményeit használja fel a legkedvezőbb génösszetétel kialakításához.

A környezeti hatások egy része klimatikus, de a növényeket nevelő gazdától függ, milyen a tápanyagok mennyisége, lehet-e öntözni, és hatékony-e a kártevőkkel szembeni védekezés. Láthatjuk, hogy a környezeti tényezők befolyásolhatják a gének funkcióit és ezzel a növények anyagcseréjét. A

18

mestergének szabályozhatják további géncsoportok aktivitását. Nemesített vetőmagok vetésével, a földművelés és növényápolás technológiáinak tökéletesítésével vált lehetségessé a hozamok folyamatos növelése. Az igények emelkedése a jövőben is folytatódik, hiszen a prognózisok szerint 2050-re az élelmiszertermelés megduplázására lesz szükség 9 milliárd ember táplálásához. Ez egy igencsak életbevágó kihívás, különösen akkor, ha számolunk a szélsőséges időjárási események (aszály, fagy, kánikula, belvíz) gyakoriságának növekedésével, a termőterületek csökkenésével. Sokan a vízellátást tekintik a legkritikusabb feltételnek. Az agrárium feladatainak teljesítésében kiemelt szerep vár a tudományos kutatásra, az innovációra. Ha elfogadjuk azokat az angliai becsléseket, melyek szerint például a búza jelenlegi 7-8t/ha terméséhez viszonyítva a biológiai teljesítőképesség 20t/ha is lehet, akkor nyilvánvalóvá válik a kihasználatlanság mértéke, amit a kutatás-fejlesztés segítségével lehet gazdaságosabbá tenni. A 15. ábra azt is szemlélteti, hogy a korábban bemutatott eszközökkel a növénynemesítő a gének összetételének módosításával avatkozik be a növény életének alakulásába. Egyetlen gén jelenléte vagy hiánya jelentős hatású lehet, de a növények fejlődési programját, a környezeti hatásokra adott válaszreakciókat, ezzel a végső termőképességet közvetlenül vagy közvetve az egész genom, a gének összessége befolyásolhatja. A vetőmagiparban nagy a verseny, ami arra készteti a növények nemesítőit, hogy a leghatékonyabb módszerek együttesét használják az új fajták, hibridek előállítása során. Így a géntechnológia szerepe még akkor sem nélkülözhető, ha ideológiai vagy politikai megfontolásból vannak ellenzői. A teljességre törekvés igénye nélkül az alábbiakban bemutatok néhány példát a nemesítést segítő géntechnológiai stratégiák közül. 6.1. Gének a heterózishatás hátterében A heterózis (hibridvigor) jelenségét felhasználó nemesítés igen jelentős sikereket ért el különböző gazdasági növény termőképességének növelésében. Heterózis hatásról akkor beszélünk, ha a keresztezéssel előállított hibridnövények tulajdonságaikban felülmúlják a beltenyésztett szülőkét. Éppen a heterózis gazdasági jelentőségének köszönhetően igen sokoldalúan tanulmányozzák e jelenség molekuláris hátterét. Mind a DNS szekvencia adatok, mind a genom szintű génkifejeződési információk segíthetnek a heterózis komplex folyamatának megismerésében és így a hatások növelését eredményező technológiák kidolgozásában. Beltenyésztett kukoricavonalak DNS-ét összehasonlítva a jelentős nukleotid szekvencia különbségek allélikus variációkként mutathatók ki. A hibridekben ezek kombinálódása kedvező hatású allél variánsok kialakulásához vezethet. A génaktivitásbeli eltérésekért a génkifejeződést szabályzó promóter régiókban lévő szekvencia eltérések lehetnek felelősek. Több mint tízezer kukoricagén kifejeződését vizsgálva, a gének 10%-a mutatott más-más kifejeződést a beltenyésztett, szülői vonalakban. Fontos, hogy a hibridekben ezeknek a géneknek a többsége összegző (additív) kifejeződési mintázattal jellemezhető. Bár a hibridek nagyobb hozama biztosan nem egy génre vezethető vissza, mégis génvadászat folyik a kulcsszereplők

19

megtalálása érdekében. Az F1 növények fenotípusos bélyegei, a nagyobb magasság, a levélfelület, a zöldtömeg és a két-háromszoros termésmennyiség már támpontot nyújt a gének kereséséhez. Lényeges információ, hogy a szervek megnövekedett méretéért 90%ban a nagyobb sejtszám a felelős. Ezt támasztja alá Guo és mtsai. (2010) munkája,

amelyben

a

kukorica

Sejtszámot Szabályzó ún. CNR1 gént GM növényekben elhallgattatták, és ezzel a hibrid hatáshoz hasonló változást idéztek elő (16. ábra).

16. ábra. A sejtszámot szabályozó (CNR1) gén kikapcsolása heterózis jellegű fenotípust eredményez GM növényekben (TG) (Guo és mtsai. 2010)

6.2. A CO2 megkötés, a fotoszintézis hatékonyságának növelése A klímaváltozás hatásainak mérséklésében kiemelt jelentőséget tulajdonítanak a légköri CO2 koncentráció csökkentésének. Nemzetközi egyezmények születtek az egyes országok által kibocsátható CO2 mennyigének korlátozására. A Föld légkörének CO2 háztartásában a növények meghatározó szerepet játszanak akkor, amikor a fotoszintézis során a légköri CO2 gázt 1000-szeres koncentrációban kémiai energiává alakítják, és az a növényi szervekben szénhidrátok formájában (CH2O) halmozódik fel. Az elsődleges növényi szerves anyagok mind táplálékként, mind energiaforrásként nélkülözhetetlenek. Jelenleg a teljes energiafelhasználás 13.4%-a (46EJ/év) származik a növényekből. Ez egy kihasználatlan lehetőség, hiszen 200-400EJ/év energiát nyerhetnénk a növényi eredetű vegyületek felhasználásával. Többek között ezt a célt segítheti a CO2 megkötés hatékonyságának javítása a genetika, a nemesítés eszközeivel. A növények esetében a maximális fotoszintetikus energia-átalakítási hatékonyság: 4.6% - 6.0%. Ez is szükségessé teszi olyan géntechnológiai megoldások kidolgozását, amelyek javítják e nagyon bonyolult biofizikai, biokémiai folyamat gazdaságosságát. A fotoszintetikus apparátusban a különböző klorofill-fehérje komplexek fénybegyűjtő funkciót töltenek

be.

A

klorofill

szintézisének

kiindulási

vegyülete

az

aminolevulinát

szintáz

közreműködésével képződő 5-aminolevulát (ALA). Ezt az enzimet a Hem1 gének kódolják. A Zhang és mtsai. (2011) által végzett génbeépítési kísérletben az Arabidopsis Hem1 gén promóterével kifejeztették az élesztőből származó gént és vizsgálták a dohánynövényekben a megnövekedett ALA mennyigének hatását a fontosabb fotoszintetikus paraméterekre. Az össz-klorofill tartalom nagyobb volt a GM növények leveleiben (2.66 mg/g friss súly), mint a kontroll növényekében (2.07 mg/g friss

20

súly). A 17. ábra fluoreszcencia-indukciós adatai azt is igazolják, hogy a génbeépítés eredményeként jelentősen növekedett a fotokémiai reakció hatékonysága. Fontos megemlíteni, hogy a transzgén kifejeződését ebben a kísérletben egy növényi homológ promóter szabályozta, a fényviszonyoknak megfelelően, és a dohányok nem mutattak növekedési rendellenességet. Ezzel szemben a korábbi kísérletekben túl erős promóter alkalmazásakor a növekedés gátlását tapasztalták.

17. ábra. Megnövekedett fotokémiai hatékonyság (PSII:Fv/Fm) az élesztő aminolevulinát szintáz (Hem1) gént kifejező GM dohány növények leveleiben (Zhang és mtsai.2011)

6.3.GM növények jobb szárazságtűrése a szántóföldön Évről évre aggasztó hírekként találkozhatunk azokkal az adatokkal, amelyek a szárazság okozta termésveszteségek nagyságáról tájékoztatnak. Tapasztalhattunk akár 25%-os kárt is a búza hozamában. A 18. ábra lesújtó képet idéz elénk arról, miként szenvednek a kukorica növények egy kis-alföldi táblán. A gazda nem igen számíthat betakarítható termésre ilyen aszály közepette.

18. ábra. Kukorica növényeket sújt az aszály

Mivel a termésbiztonság kiemelt fontosságú nemesítési cél, a fajta-előállító programok igénylik azokat a hatékony módszereket, amelyekkel javítható a termesztett növények szárazságtűrése, illetve vízhasznosító képessége. A célt sokban segítheti, ha a géntechnológiai megoldások is szerepet

21

kapnak egy hagyományos nemesítési programban. Egy ilyen műveletsor főbb elemeit vázolja a fel a 19. ábra. A vízhiány okozta stresszhez történő adaptációban számos növényi gén, anyagcsereút kaphat szerepet. Ha egy szárazságtoleráns, illetve -érzékeny genotípus génkifejeződési mintázatát DNS chip technológiával összehasonlítjuk, akkor megismerhetjük azokat a géneket, amelyek a génbeépítési analízis érdekes jelöltjei lehetnek. Miután a gént izoláltuk és transzformációs vektorba építettük GM árpa genotípusok állíthatók elő. A génbeépítést követően szövettenyészetben kiszelektálhatók a transzformáns szövetek, majd ezekből növények regenerálhatók. Több független GM vonal előállítását követően üvegházban érdemes a növényeket jellemezni normál és korlátozott vízellátás mellett. A különböző képalkotási módszerek sokban segíthetik a növények fenotipizálását, azaz tulajdonságaik felvételezését. A kevésbé károsodott variánsok bekerülhetnek a keresztezési programokba és további vizsgálatuk már a szabadföldi kísérletekben történik. A 19. ábra egy esőárnyékoló rendszert mutat be, amellyel még csapadékos évjáratokban is előidézhető a vízhiány. Az évek során maga a nemesítő minősíti a tenyészanyagokat, mielőtt sor kerül az engedélyeztetési és fajtabejelentési eljárásokra.

DNS-CHIP: GÉNVADÁSZAT

IZOLÁLT GÉN

FENOTÍPIZÁLÁS

GÉNBEVITEL: GM-növény regenerációja

→

ÜVEGHÁZBAN

20%

TALAJNEDVESSÉG

60%

→

SZÁRAZSÁGTESZT

NEMESÍTETT FAJTA ARATÁSA

ESŐÁRNYÉKOLÓVAL 19. ábra. Fontosabb műveletek az árpa szárazságtűrését javító nemesítési programban, amely a fajtaelőállítás során a géntechnológiát és a fenomikát kombinálja hagyományos módszerekkel.

22

Tekintettel a szárazság okozta jelentős veszteségekre érthető, hogy a tudományos közlemények nagy számban tanulmányoznak olyan géneket, amelyek a transzgenikus növényekben javították a vízhiányhoz történő alkalmazkodást. Igen változatos azon anyagcsereutak köre, amelyek szerepet kaphatnak a stresszhatások okozta károk mérséklésében. Az ígéretes üvegházi kísérletek eredményeire alapozva kevesebb, de így is jelentős számú szabadföldi vizsgálatra került sor. A Deikman és mtsai. (2011) által közölt adatok szerint csak a 2009-2011-es években, szántóföldi körülmények között 13 GM genotípussal végzett vizsgálat igazolta a beépített gének kedvező hatását a termésre. Mint a 20. ábra szemléletesen mutatja a beépített gének jelentősen javíthatják a növények állapotát száraz termesztési körülmények között. A sokféle géntechnológiai stratégia közül érdemes külön kiemelni a Monsanto és BASF cégek együttműködésével

kifejlesztett

szárazság

ellenálló GM kukoricát, amely az USA-ban termesztési

engedélyt

kapott.

Ebben

a

megoldásban egy bakteriális gén biztosítja a növényekben

a

fotoszintézis

képességének

megőrzését, még csökkent vízellátás mellett is. Ez vezet a nagyobb termőképességhez.

A világ

élelmezési kríziseinek kialakulásában az afrikai országokat sújtó aszály gyakran játszik kiemelt szerepet. Ezzel is indokolható, hogy a rezisztens GM

genomtípusok kipróbálása több

afrikai

országban, például Kenyába vagy Ugandában is folyamatban van.

20. ábra. Rizs, repce és kukorica GM növényeknek (jobb oldali képsor) kisebb a károsodásuk, mint a hagyományos tenyészanyagoké (bal oldali képsor) a szárazság sújtotta szántóföldön (Pennisi, 2008)

6.4. A növényi biomassza hozamának növelése génbeépítéssel A megújuló energiaforrások sorában a növények, mint elsődleges szervesanyag-termelő szervezetek kulcsszereppel bírnak. A keményítő alapú etanoltermelés gazdaságossága nyílván nagymértékben függ a szemtermés nagyságától. A nagy szemű rizs kialakulásáért felelős genetikai faktor azonosítását a 2. ábra már bemutatta. A bioenergia-termelési kapacitás iránti igények növekedésével tudatosult, hogy a keményítő ilyen célú felhasználása veszélyeztetheti az élelmiszerszükségletek kielégítését. Ezért intenzív kutatás-fejlesztés indult meg a lignocellulóz alapú

23

nyersanyagokat hasznosító eljárások kidolgozása érdekében. A szalma és a kukoricaszár mellett számos energianövényt, például az évelő energiafüveket, a vesszős kölest (Panicum virgatum) és az óriás olasznádat (Arundo donax), valamint a gyorsan növő fákat, a nyárfát és a fűzfát tekintik használható alapanyagoknak. A növényi sejtfal poliszacharidokból - cellulóz (44%), hemicellulóz (30%) -, továbbá pektinből és ligninből (26%) felépülő struktúra, amelyből etanollá fermentálható cukor szabadítható fel. A savas (H2SO4) előkezelést követően végzett celluláz emésztés glükóz felszabadulását eredményezi. A hemicellulóz és a pektin savas előkezelésével xilóz, arabinóz, glükóz és galaktóz képződését lehet biztosítani. A cukrosítás során termelődött fermentálható cukrokból élesztősejtek készítenek alkoholt. A növények zöld, föld feletti szerveinek méretét egyetlen gén működésének fokozásával is növelhetjük. A 21. ábra egy olyan GM növényt mutat be, amelynek ARGOS génjét erős promóterrel építették össze és beépítették a lúdfű gonomjába. Az ARGOS fehérje az auxin növényi hormon hatásának fokozása révén fejti ki sejtosztódást stimuláló hatását (Hu és mtsai., 2003).

21. ábra Az ARGOS gén túltermeltetése megnövelte az Arabidopsis GM növények tömegét (jobb oldali növény) (Hu és mtsai., 2003)

7. GM fajták termesztése a világon: gazdasági és környezetvédelmi szempontok A legújabb statisztikai adatok szerint a 2011. évben 160 millió hektáron termesztettek géntechnológiával nemesített növényeket (22. ábra). A 29 GM növényeket termesztő országból 19 fejlődő, 10 pedig fejlett, ipari ország. 2011-ben 16,7 millió gazdálkodó vállalkozott GM növények termesztésére. Több mint 90 százalékuk (15 millió gazda), fejlődő országokban gazdálkodó, forrásszegény kistermelő. Ez a tény cáfolja azt a gyakori kritikát, hogy a GM fajták csak a nagyüzemekben hasznosíthatók. A GM tulajdonságok kombinált alkalmazása fontos fejlesztési eredmény : 2011-ben 12 országban vetettek két vagy több hozzáadott tulajdonságot hordozó GM növényt. 1996 és 2010 között a géntechnológiával nemesített növények hozzájárultak az élelmiszer-biztonsághoz, a mezőgazdasági termelés fenntarthatóságához és az éghajlatváltozás lassításához. Ez idő alatt a növénytermesztés által előállított érték 78,4 milliárd dollárral nőtt, 443 millió kilogrammal kevesebb növényvédőszer-hatóanyag került felhasználásra, és csak 2010-ben 19 milliárd kilogrammal csökkent a széndioxid-kibocsátás. A mezőgazdasági eredetű üvegházigázkibocsátás jelentős csökkenése egyrészt a kevesebb üzemanyag-felhasználásból származik, másrészt,

24

mivel a GM növények termesztésénél talajművelési technológiák hagyhatók el, emiatt fokozott a széndioxid talajbeli tárolása.

22. ábra

Ami a fejlesztések költségét illeti, a nagyságrendet talán érzékelteti, ha idézzük a BASF cég egyik munkatársának nyilatkozatát, miszerint a gén felfedezésétől a piaci értékesítésig 15 évre van szükség, és egy kívánt tulajdonság géntechnológiával való kialakítása több, mint 20 millió dollárba kerül. Egyes becslések szerint az engedélyezési költségek pedig a 100 millió dollárt is elérhetik. Látva ezeket a számokat, érthető, hogy még a nagy nemzetközi cégek is szövetkeznek, hogy versenyképes fejlesztéseik megvalósításához lehetőséget teremtsenek. Nagyon fontos kutatások folynak az egyetemeken, állami kutatóintézetekben világszerte. A növényekkel foglalkozó tudományos közleményeket nézve igen nagy a GM-megközelítést használó munkák aránya. Aligha van olyan növényi tulajdonság, amelyet génsebészettel ne változtattak volna meg. Az szükségszerű, hogy amikor gazdaságilag is ígéretes új tulajdonságokat tapasztalnak a kutatók, akkor szabadalmak szülessenek, és elkezdődjék a nemesítési lehetőségek vizsgálata. Egy-egy újdonság szabadalmi védelme is jelentős költséggel jár. Természetesen látni kell a mérleg másik oldalát is. Nyilván megéri a költséges fejlesztésekre áldozni, hiszen a vetőmagok értékesítéséből a nemesítő cégnek nyeresége van, a gazda haszna pedig a többlet-termésből, és a kisebb önköltségből adódik.

25

Ez a kereslet azt jelenti, hogy a globális GM vetőmag-piac 2011-ben 13 milliárd dollárra becsülhető, és a GM szemtermésből előállított végtermék körülbelül 160 milliárd dollár értékű volt. Becslések szerint a GM növényekhez tartozó agrotechnológiák alkalmazása a 2010-es évben 19 milliárd kilogrammal csökkentette a szén-dioxid-kibocsátást. A fenti adatok ismeretében nem meglepő a géntechnológiai fejlesztések egyre szélesebb körű elterjedése. 8. Egészségvédelmi garanciák Magyarország 2012. január 1-től hatályos Alaptörvényének XX. cikke értelmében: "(1) Mindenkinek joga van a testi és lelki egészséghez. (2) Az (1) bekezdés szerinti jog érvényesülését Magyarország genetikailag módosított élőlényektől mentes mezőgazdasággal, az egészséges élelmiszerekhez és az ivóvízhez való hozzáférés biztosításával, a munkavédelem és az egészségügyi ellátás megszervezésével, a sportolás és a rendszeres testedzés támogatásával, valamint a környezet védelmének biztosításával segíti elő." Az Alaptörvény fenti szövegezése azt jelenti, hogy a törvényalkotó a géntől, annak termékétől és a befogadó fajtól függetlenül minden, még a jövőben létrehozandó GM szervezetekről is azt állítja, hogy azok veszélyeztetik a testi és lelki egészségünket, ezért van szükség a tiltásra. Az ilyen szemlélet teljesen ellentétes a tudományos tényekkel, az uniós hatósági megállapításokkal. Ezt sok szakmailag megalapozott adattal igazolhatjuk, de talán érdemes a 41 svéd kutató állásfoglalásából idézni: „500 független kutatócsoport 300 millió eurót kapott az EU-tól a kockázatok tanulmányozására. Az eredményeket összegző egyik közlemény (A Decade of EU-funded Research: Egy évtizednyi kutatás az EU támogatásával) arra a következtetésre jutott, hogy „a GM technológia önmagában nem veszélyesebb, mint a hagyományos nemesítés.” Szemben a törvényi állítás logikájával, lényegében ezt Magyarország is elfogadja, amikor engedélyezi a GM növények termékeinek importját és így fogyasztását. Eközben a magyar gazdákat kizárja a GM növények termesztéséből fakadó előnyök kihasználásából, és az általuk megtermelt megegyező terméket testi és lelki egészséget károsítónak minősíti. Jelenleg az EU-ban 47 GM terméket engedélyeztek élelmiszerként vagy takarmányként történő felhasználásra. További 73 termék engedélyezése van folyamatban, ebből 16 esetében már az uniós ellenőrző szerv, a European Food Safety Agency (EFSA) a felhasználását tudományosan megalapozottnak minősítette.

26

TOVÁBBI FORRÁSOK A TÉMÁBAN Balázs E, Dudits D, Sági L: Genetikailag módosított élőlények (GMO-k) a tények tükrében.: Magyar Fehér Könyv. Szeged, Barabás Zoltán Biotechnológiai Egyesület, 2011. 136 p. Dudits D (szerk.): Zöld géntechnológia és agrárinnováció.: Gazdafórum az Akadémián. Szeged, Barabás Zoltán Biotechnológiai Egyesület, 2009. 200 p. Zöld Biotechnológiai Hírlevél, Barabás Zoltán Biotechnológiai Egyesület, http://zoldbiotech.hu

HIVATKOZÁSOK

Deikman J, Petracek M, Heard JE (2012) Drought tolerance through biotechnology: improving translation from the laboratory to farmers' fields. Curr Opin Biotechnol. (2):243-50. Guo M, Rupe MA, Dieter JA, Zou J, Spielbauer D, Duncan KE, Howard RJ, Hou Z, Simmons CR. (2010) Cell Number Regulator1 affects plant and organ size in maize: implications for crop yield enhancement and heterosis Plant Cell. (4):1057-73. Hirt H, Pay A, Gyorgyey J, Bako L, Nemeth K, Bogre L, Schweyen RJ, Heberle-Bors E, Dudits D (1991) Complementation of a yeast cell cycle mutant by an alfalfa cDNA encoding a protein kinase homologous to p34cdc2. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America 88:1636-1640. Hu Y, Xie Q, Chua NH (2003) The Arabidopsis auxin-inducible gene ARGOS controls lateral organ size. Plant Cell. (9):1951-61. Kapros T, Stefanov I, Magyar Z, Ocsovszky I, Dudits D (1993) A short histone H3 promoter from alfalfa specifies expression in S-phase cells and meristems. In Vitro Cell and Developmental Biology-Plant 29: 27-32. Nakagawa H, Tanaka A, Tanabata T, Ohtake M, Fujioka S, Nakamura H, Ichikawa H, Mori M. (2012) Short grain1 decreases organ elongation and brassinosteroid response in rice. Plant Physiol. 8(3):1208-19. Omirulleh S, Abraham M, Golovkin M, Stefanov I, Karabaev M, Mustardy La, Morocz S, Dudits D (1993) Activity of A Chimeric Promoter With The Doubled CaMV 35S Enhancer Element In Protoplast-Derived Cells And Transgenic Plants in Maize. Plant Molecular Biology 21: 415428. Pennisi E (2008) Plant genetics. Getting to the root of drought responses. Science. 320(5873):173 Song XJ, Huang W, Shi M, Zhu MZ, Lin HX. (2007) A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase. Nat Genet. (5):623-30.

27

Stefanov I, Fekete S, Bogre L, Pauk J, Dudits D, Feher A (1994) Differential activity of the mannopine synthase and the CaMV 35S promoters during development of transgenic rapeseed plants. Plant Science 95: 175-186. Zhang ZP, Yao QH, Wang LJ. (2011) Expression of yeast Hem1 controlled by Arabidopsis HemA1 promoter enhances leaf photosynthesis in transgenic tobacco. Mol Biol Rep. 38(7):4369-79. Zuo J, Niu QW, Frugis G, Chua NH (2002) The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. Plant J. 30(3):349-59.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A szerző ezúton is köszöni Godó Klárának a szöveg szerkesztését, Tóth Sándornénak pedig az ábrák elkészítésében nyújtott segítségét.

28