Novinky VIDIA v di diagnostice i Lymeské L ké borreliózy Marie Šteinbachová Marie Šteinbachová
ELISA testy y VIDIA pro p diagnostiku LB • testy III. generace – vysoce specifické rekombinantní antigeny (IgG verze obsahuje VlsE) – vysoká specifita a citlivost vysoká specifita a citlivost • rekombinantní antigeny jsou odvozené z kmenů borelií izolovaných na území ČR Č • vysoká vysoká shoda ELISA testů s WB (IgM 97%, IgG shoda ELISA testů s WB (IgM 97% IgG 94%)
Princip a uspořádání testu Nepřímý ELISA test • směs specifických antigenů se naváže na povrch mikrotitrační destičky antigen
• pokud jsou ve vzorku přítomny protilátky, navážou se na antigen
Pozitivní vzorek
• na tyto protilátky se naváží sekundární protilátky, značené křenovou peroxidázou • pokud se konjugát nemá na co navázat, vyplaví se při promývání • po přidání barviva s obsahem H2O2 katalyzuje peroxidáza barevnou reakci • změna barvy indikuje přítomnost konjugátu
Negativní vzorek
s peroxidázou a tím i přítomnost protilátek ve vzorku
Spektrum ELISA testů VIDIA • 1) testy bez druhového rozlišení specifických protilátek IgM/IgG – kombinance antigenů protilátek IgM/IgG antigenů borelie afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto • 2) prototypy testů rozlišující druhově specifické protilátky IgM/IgG proti antigenům specifické protilátky IgM/IgG proti antigenům borelie afzelii a garinii ‐ NOVINKA
1) TESTY BEZ DRUHOVÉHO ROZLIŠENÍ
ELISA-VIDITEST anti-Borrelia recombinant IgM a IgG - detekce specifických protilátek IgM a IgG proti antigenům hlavních patogenních kmenů b li (B.afzelii, B.garinii borelie (B f lii B i ii a B.burgdorferi B b d f i sensu stricto) 3 variantyy Kvantitativní verze Semikvantitativní verze Kvalitativní verze
ELISA-VIDITEST anti-Borrelia recombinant IgM a IgG - kvantitativní
ELISA-VIDITEST anti-Borrelia recombinant IgM a IgG - semikvantitativní
ELISA-VIDITEST anti-Borrelia recombinant IgM a IgG – kvalitativní - NOVINKA
NOVINKA kvantitativní
semikvantitativní
kvalitativní
vzorek
sérum, mozkomíšní mok, synoviální tekutina
sérum
sérum
stripy barevně odlišené odlamovací
ANO ‐ IgM červené, IgG ‐ modré, 96 jamek
ředicí roztok
ANO ‐ IgM červené, IgG ‐ ANO ‐ IgM červené, IgG ‐ modré, 96 jamek modré, 96 jamek
jednotný pro ředění všech jednotný pro verzi IgM a druhů vzorků, různý pro různý pro verzi IgM a IgG IgG verzi IgM a IgG verzi IgM a IgG 5 ks r.t.u.
2 ks r.t.u.
3 ks r.t.u.
standard A‐E ‐ 5‐bodová kalibrační křivka
ST A (NKS), ST D (KAL+PKS)
NKS, PKS, COKS
počet jamek nutný pro aplikaci kontrol
10 + 1 blank
3 + 1 blank
4 + 1 blank
konjugát anti‐IgM/IgG Px
101x konc.
101x konc.
r.t.u.
kontroly
korekční faktor ‐ index pozitivity, hodnocení na OD COKS ‐ index pozitivity křížky
hodnocení
jednotky AU/ml
rozsah šedé zóny v indexech h š dé ó i d h pozitivity
‐
IgM/IgG : 1,0‐1,3/1,0 ‐ 1,2
IgM/IgG: 0,9 ‐ 1,1
stanovení intrathekální syntézy specifických protilátek
ANO
NE
NE
inkubační časy a teplota
60‘/60‘/10‘ laboratorní teplota
60‘/60‘/10‘ laboratorní teplota
30‘ 37°C/ 30‘ 37°C / 10‘ labor.t.
2) PROTOTYPY TESTŮ ROZLIŠUJÍCÍ DRUHOVĚ SPECIFICKÉ PROTILÁTKYNOVINKA
ELISA-VIDITEST anti-Borrelia afzelii IgM a IgG - detekce specifických protilátek IgM detekce specifických protilátek IgM a IgG a IgG proti antigenům B.afzelii ELISA-VIDITEST anti-Borrelia garinii IgM a IgG - detekce specifických protilátek IgM detekce specifických protilátek IgM a IgG a IgG proti antigenům B.garinii 1 varianta Semikvantitativní S ik tit ti í verze
bez druhového rozlišení
druhově specifické
semikvantitativní
semikvantitativní
vzorek
sérum
sérum
stripy barevně odlišené odlamovací stripy barevně odlišené odlamovací
ANO ‐ IgM červené, IgG ‐ modré, 96 jamek
ANO ‐ IgM červené, IgG ‐ modré, 96 jamek
ředicí roztok
různý pro verzi IgM a IgG
různý pro verzi IgM a IgG
2 ks r t u 2 ks r.t.u.
2 ks r t u 2 ks r.t.u.
ST A (NKS), ST D (KAL+PKS)
NKS, KAL
počet jamek nutný pro aplikaci kontrol počet jamek nutný pro aplikaci kontrol
3 + 1 blank 3 + 1 blank
3 + 1 blank 3 + 1 blank
konjugát anti‐IgM/IgG Px
101x konc.
101x konc.
hodnocení
korekční faktor ‐ index pozitivity, hodnocení na křížky
korekční faktor ‐ korekční faktor ‐ index index pozitivity, hodnocení na křížky
rozsah šedé zóny v indexech pozitivity rozsah šedé zóny v indexech pozitivity
IgM/IgG : 1 0‐1 3/1 0 ‐ 1,2 IgM/IgG : 1,0‐1,3/1,0 ‐ 12
IgM/IgG : 1,0‐1,3 : 1 0‐1 3
stanovení intrathekální syntézy specifických protilátek
NE
NE
inkubační časy a teplota
60‘/60‘/10‘ laboratorní teplota
60‘/60‘/10‘ laboratorní teplota
kontroly
Připravujeme: NOVINKA Konfirmační test III. generace: IMMUNOLINE-VIDITEST anti-Borrelia recombinant IgM, IgG • Obdoba WB – rozdílem je způsob imobilizace antigenů na nitrocelulosovou membránu ‐ antigeny přímo nanášeny na nitrocelulosovou membránu ‐ antigeny přímo nanášeny na membránu vhodnou technikou • Hlavní výhoda tohoto testu – III.generace ‐ využití vysoce specifických rekombinantních antigenů, které poskytují testu vysokou specifitu a citlivost x WB jsou většinou testy nižší generace, které využívají převážně antigeny nativní a vyznačují se nižší specifitou.
Princip testu Sekundární protilátka značená enzymem
Membránový strip Proužky rekombinantních y antigenů
Antigeny borrelia afzelii + garinii, popř. burgdorferii sensu stricto
Druhově specifické Ag – A/G
Kontrolní proužky substrát
Verze IgM • Antigeny borrelie afzelii + garinii: OspC, FlaB‐190 (p41i), BmpA (p39), DbpA (Osp17), p30 • Druhově specifické antigeny: OspC, p31 (OspA),……..dle výsledků sekvenční analýzy • Kontrolní proužky: human IgM, EBV, anaplasma
V Verze IIgG G • Antigeny borrelie g y afzelii + garinii: VlsE, BmpA g , p (p (p39), DbpA ), p ((Osp17), p ), BBK32, p83, p35(OspB), p58, OspC, p30, OspE, p31 (OspA) • Druhově Druhově specifické antigeny: DbpA specifické antigeny: DbpA (Osp17), ……..dle výsledků sekvenční (Osp17) dle výsledků sekvenční analýzy • Kontrolní proužky: human Kontrolní proužky: human IgG, (EBV), anaplasma IgG (EBV) anaplasma
Výhody ý y immunoline testu • Test III.generace – vysoká specifita a citlivost • Jednoduché provedení obdobné klasickým WB • Možnost odlišit druhově specifické protilátky v jednom testu • Široké spektrum vysoce specifických rekombinantních antigenů • Kontrolní proužky – p y možnost sledovat křížové reaktivity y sérových protilátek • Diagnostika anaplasmosy
Děkuji k za pozornost
