Nieuwe technieken die oude
Diagnostiek is….handelen
overbodig maken? FES Fyto Symposium 22 juni 2010
Detectie-signaal
Localiseren
Kwantificeren
Dr. Piet M. Boonekamp Plant Research International
Maatregelen
Signaalgestuurd advies
Duurzaamheid
Drempelwaarde
VERANTWOORD ONDERNEMERSCHAP
Voor welke organismen Identificatie/Detectie?
Virussen
Insecten
Schimmels
Bacteriën
Nematoden
Onkruiden
Diagnostiek is….technologie Om te zorgen voor de gewenste: Specificiteit (eigenschappen en soorten) Gevoeligheid (maatwerk voor het gewenste doel) Kostenefficiëntie (goede prijs/kwaliteit verhouding) Robuustheid Snelheid (in 1 dag analyse en uitslag?) Betrouwbaarheid en toepasbaarheid (zowel on-site als in high-tech laboratoria)
Diagnostiek is… weten waar het zit
Correcte technologie ?? Technieken voor identificatie en detectie:
Biologische karakteristieken
Morfologische karakteristieken
Eiwitkarakteristieken z
Antisera
DNA/RNA-karakteristieken z
PCR in allerlei vormen
Biologische karakteristieken (1)
Biologische karakteristieken (2)
Uitplaten van bacteriën op selectieve media Foto PPO Naaldwijk
Morfologische karakteristieken (1)
Biologische karakteristieken (3)
Microscopische karakterisering van typische structuren
Eiwitkarakteristieken (1)
Morfologische karakteristieken (2)
pollen
Steve Hurst, USDA-NRCS
Immunofluorescentie
zaad
bacteriën
Ambrosia artemisiifolia Alsemambrosia
ELISA van plantenvirussen
Plantenziektenkundige Dienst
Eiwit karakteristieken (2) Microspheres/beads
Luminex multiplex immunoassay: principle
Multiplex Elisa in 1 monster
Multiplex Luminex assay
DNA/RNA-technologieën… 5-plex Potato Extract
5-plex PBS 2500
2500
2000
2000
1500
Cms (MFI) 1500 Rsol (MFI)
Rsol (MFI)
PLRV (MFI)
PLRV (MFI)
PVX (MFI) 1000 PVY (MFI)
1000
500
Enkelvoudige detectiemethoden
PCR-
Kwantitatieve detectie
Multiplex detectie
Kwantitatieve multiplex detectie
PVX (MFI) PVY (MFI)
500
0
Cms (MFI)
0 Cms AB Rsol AB
PLRV AB
PVX AB PVY AB
All
Cms AB Rsol AB
PLRV AB
PVX AB PVY AB
DNA-detectie
All
Diagnostiek is….handelen Detectie-signaal
Maatregelen
Duurzaamheid
Multiplex SCAR-PCR Meloidogyne species
Localiseren
Signaalgestuurd advies
Kwantificeren
Drempelwaarde
VERANTWOORD ONDERNEMERSCHAP
Localisatie/extractie: Nematoden uit grond
Localisatie/extractie: Bacteriën in aardappel
Probleem:
Probleem:
z z z
Grond wordt opgespoeld en nematoden worden verzameld in suspensie Directe extractie van nematodensuspensie geeft soms remming in PCR Aanpassen DNA-extractiemethode gewenst
Localisatie/extractie: Bacteriën uit zaad
z
Erwinia bepalen in naveluiteinden van knollen
z
Ogen worden vermalen in buffer. Rechtstreekse extractie van buffer geeft problemen. Verrijkingsstap is noodzakelijk Verrijking gaat in 10% van de gevallen niet goed
z z
Localisatie/extractie: Waar zit het pathogeen? GFP-tagged Dickeya sp.
Probleem: z z z
Extractie vanuit zaden is een probleem voor detectie bacteriën Zaden worden na schoning vermalen Aanwezigheid in vermalen zaad van extreem hoge concentraties van reservestoffen zoals oliën en polysacchariden (waaronder zetmeel), die bekende inhibitoren van PCR zijn
progeny tuber
stolon
* 20 days after soil infestation
Diagnostiek is….handelen Detectie-signaal
Maatregelen
Duurzaamheid
Localiseren
Signaalgestuurd advies
Kwantificering over de jaren heen Kwantificeren
Drempelwaarde
No
VERANTWOORD ONDERNEMERSCHAP
Source: NAK
Kwantificering via AmpliDet
Levend/dood-bepalingen
Fluorescence
1.5
1
0.5
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-0.5
Time
Diagnostiek is….handelen
4 = Dead cells + PMA
SCV 3F NT 3F SCV/SVBV/SMYEPV 3F SVBV 3TR NT 3TR SCV/SVBV/SMYEPV 3TR
Primer mix SCV/SVBV 3-mix SMYEPV SMYEPV 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix SCV/SMYEPV SCV/SMYEPV SVBV/SMYEPV SVBV/SMYEPV 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix 3-mix
3 = Dead cells
2
Target SCV/SVBV SCV/SVBV SMYEPV SMYEPV SMYEPV SMYEPV SCV/SVBV/SMYEPV SCV/SVBV/SMYEPV SCV/SMYEPV SCV/SMYEPV SVBV/SMYEPV SVBV/SMYEPV NT SCV/SMYEPV SCV/SMYEPV SVBV/SMYEPV SVBV/SMYEPV SCV SVBV NT NT NT
2 = Live cells + PMA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
1 = Live cells
PMA-PCR Xanthomonas campestris pv. campestris Sample:
+ PMA
Dead cells (comprised membrane)
Viable cells (intact membrane) Photoinduced crosslinking
Soluble, amplifiable DNA
Insoluble DNA, Gets lost with cell debris, not lifi bl
Herkenning aardappelplant in bietenperceel 0.5 0.45
Detectie-signaal
Localiseren
Kwantificeren
0.4 0.35
Reflection
0.3 Graan Klei Biet Klei Biet Zand Aardappel Klei Aardappel Zand
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 440
490
540
590
640
690
740
790
840
890
Wavelength
Maatregelen
Signaalgestuurd advies
Duurzaamheid
Drempelwaarde
VERANTWOORD ONDERNEMERSCHAP
Infectiekansen Nederland 2006 (mei – september)
DSS voor Phytophthora
Spatial, temporal simulation model
& 2007
Survival
Infection
DCM Zwaagdijk 27-05-2007
Spore release
29-07-2007
Detection of Globodera pallida
Reconstruction of infestation
Op basis van locale bemonstering
Locale genetische diversiteit van de isolaten
Mobiel PCR-apparaat
Dip stick Lelystad 2005
Diagnostiek voor nieuwe problemen
Door wereldwijde handelsstromen steeds nieuwe problemen (en oud weer nieuw!) z z z z z
Pepino mozaïekvirus Nieuwe PVY in aardappel Nieuwe Erwinia in aardappel en bollen ‘Zuur’ in bollen Etc., etc.
Valthermond 2005
Diagnostiek is… is…. innoveren
regelgeving verandert
toepassen van de juiste technologie
van simplex naar multiplex van separate naar geïntegreerde kennis
MAAR: kennis van pathogenen blijft nodig!
Dank u voor de aandacht
Diagnostiek is….handelen
Science
Detectie-signaal
Maatregelen
Duurzaamheid
Localiseren
Signaalgestuurd advies
Kwantificeren
Drempelwaarde
VERANTWOORD ONDERNEMERSCHAP
© Wageningen UR
Practice
