Nederlandse samenvatting Contributing authors Curriculum vitae Acknowledgements
Appendices
Appendices
Nederlandse samenvatting Dengue virus infectie: invloed van antilichamen, maturatie status en antivirale geneesmiddelen
A
154
Dengue is wereldwijd de meest voorkomende humane virale infectieziekte overgedragen door muggen. Infectie vindt voornamelijk plaats in subtropische en tropische gebieden al zijn er recent ook dengue uitbraken geweest in gebieden met een meer gematigd klimaat, zoals op het Portugese eiland Madeira. Er bestaan 5 verschillende serotypen van het virus en elk van deze serotypen kunnen leiden tot ziekte in mensen variërend van een milde koortsige ziekte tot ernstige hemorragische verschijnselen en orgaanfalen. Dengue virussen zijn bolvormige deeltjes met een doorsnee van 50 nm. Binnenin deze deeltjes bevindt zich het nucleocapside. Het nucleocapside bestaat uit een enkelstrengs RNA molecuul en meerdere kopieën van het capside eiwit. Het nucleocapside wordt omgeven door een membraan waarin zich twee eiwitten bevinden, het envelop (E) en het membraan (M) eiwit. Het ecto-domein van het E eiwit bestaat uit 3 verschillende structurele domeinen (DI, DII, DIII) en is verantwoordelijk voor de afgifte van het genetisch materiaal in gastheercellen. Het M eiwit wordt gesynthetiseerd als een voorloper eiwit genaamd prM en is belangrijk tijdens exocytose van nieuw gevormde virusdeeltjes in geïnfecteerde cellen. Zodra een dengue mug een bloedmaal neemt komt het virus in de huid en het bloed terecht. Met name immuuncellen, zoals macrofagen, dendritische cellen en monocyten, dienen als gastheer voor virusvermenigvuldiging. Om infectie te bewerkstelligen moet het virus eerst binden aan de gastheercel. Dit vindt plaats door binding van het virale E eiwit aan een receptor molecuul op het celoppervlak. Vervolgens zal het virus door de cel worden opgenomen en naar zure blaasjes (endosomen) worden getransporteerd. In deze zure omgeving zal het E eiwit een conformationele verandering ondergaan waardoor het virale membraan en het cellulaire membraan met elkaar versmelten. Het genetisch materiaal komt vervolgens vrij in het cytoplasma van de cel. Hierna vindt translatie en replicatie van het virale genoom plaats waarna er nieuwe virusdeeltjes worden aangemaakt. Deze virusdeeltjes zijn nog immatuur en bevatten prM/E heterodimeren in het membraan. Het prM eiwit beschermt het E eiwit tijdens exocytose van nieuw gevormde virusdeeltjes. Vlak voordat het virus de cel verlaat wordt prM geknipt tot zijn mature vorm M door het cellulaire enzym furine. Echter deze knipreactie is weinig efficiënt want er worden zowel M-bevattende als prM-bevattende virusdeeltjes door de cel uitgescheiden. Virusdeeltjes die voornamelijk prM in het membraan hebben zijn weinig infectieus in cellen. De algemene veronderstelling is dat met name M-bevattende virusdeeltjes belangrijk zijn voor infectie. Dengue-specifieke antistoffen kunnen de infectieuze eigenschappen van het virus beïnvloeden. Sterk neutraliserende antistoffen kunnen dengue virus infectie
Appendices tegengaan door bijvoorbeeld het membraanfusieproces van dengue virusdeeltjes te blokkeren. Antistoffen kunnen het infectieproces ook positief beïnvloeden. Bijvoorbeeld, prM-bevattende dengue virusdeeltjes worden hoog infectieus zodra er antistoffen aan gebonden zijn. Ook M-bevattende deeltjes worden hoger infectieus als er niet neutraliserende of lage concentraties neutraliserende antistoffen aanwezig zijn. Antistoffen hebben daarom een tweeledig effect op het verloop van een dengue infectie. Algemeen wordt aangenomen dat de verhoogde infectiviteit van dengue virusdeeltjes in aanwezigheid van antistoffen de basis vormt voor het ontstaan van ernstige ziekte. Ernstige ziekte wordt hoofdzakelijk gezien bij dengue virus herinfecties met een ander serotype en tijdens primaire infecties in zuigelingen met een dalende maternale antistoftiter. Ondanks dat we al ruim 40 jaar weten dat pre-existerende dengue antistoffen belangrijk zijn voor de ontwikkeling van een ernstige dengue virus infectie weten we nog steeds niet hoe antistoffen de infectiviteit van dengue virusdeeltjes beïnvloeden. In dit proefschrift staat beschreven via welke opnameroute dengue virusdeeltjes macrofagen infecteert in aan- en afwezigheid van antistoffen. Ook wordt beschreven welk type E antistof de infectiviteit van prM-bevattende virusdeeltjes stimuleert. Naast het ontrafelen van de eigenschappen van virus opname hebben we ook twee moleculen geïdentificeerd die het infectieproces van dengue virusdeeltjes blokkeren in af- en aanwezigheid van antistoffen. In Hoofdstuk 1 wordt een algemene introductie gegeven op het onderwerp. Hoofdstuk 2 beschrijft de mogelijkheden en toepassingen van laser microscopie voor het bestuderen van het infectieproces van dengue. Door dengue te labelen met de fluorescerende stof DiD kunnen we één virusdeeltje zichtbaar maken met laser microscopie. Wanneer de DiD-gelabelde deeltjes aan levende cellen worden toegevoegd kunnen we monitoren hoe het virus door de cel beweegt. We kunnen hiermee bijvoorbeeld de dynamiek van virus-cel binding, de opname route en de plaats van membraanfusie vaststellen. Tevens wordt een kwantitatieve binding en fusie methode beschreven op basis van laser microscopie. Deze zeer geavanceerde technologie maakt het mogelijk het infectieproces van virussen in detail te bestuderen en is veelvuldig toegepast in de studies beschreven in dit proefschrift. In Hoofdstuk 3 staat beschreven welke invloed dengue E antistoffen hebben op de infectieuze eigenschappen van prM-bevattende virusdeeltjes. Er zijn in totaal 27 verschillende E antistoffen getest. prM-bevattende dengue virusdeeltjes zijn op zichzelf niet in staat macrofagen te infecteren. Aangetoond werd dat verreweg de meeste E DI, DII, DIII antistoffen de infectieuze eigenschappen van prM-bevattende virusdeeltjes stimuleren. Infectie is afhankelijk van de activiteit van het enzym furine, wat suggereert dat het prM eiwit na opname wordt geknipt tot M waarna het virus infectieus is. De in vitro resultaten worden bevestigd in vivo want muizen ingespoten
A
155
Appendices met alleen prM-bevattende deeltjes worden niet ziek, terwijl muizen ingespoten met E antistof gebonden prM-bevattende virusdeeltjes doodgaan aan de gevolgen van de infectie. Dit laat wederom zien dat prM-bevattende deeltjes geen belangrijke rol spelen in de pathogenese van een primaire dengue virus infectie. In aanwezigheid van antistoffen echter, dus tijdens herinfecties, dragen prM-bevattende deeltjes en de antistoffen die deze deeltjes herkennen waarschijnlijk wel bij aan het totaal aantal circulerende infectieuze virusdeeltjes en daarmee het ontstane ziektebeeld. In Hoofdstuk 4 is de opnameroute van dengue virusdeeltjes in macrofagen onderzocht in af- en aanwezigheid van antistoffen. Opname is geanalyseerd voor zowel standaard dengue viruspreparaten gekweekt op insectencellen als prM-bevattende dengue virusdeeltjes gekweekt op een cellijn deficiënt voor het enzym furine. Dengue virus opname in afwezigheid van antistoffen is afhankelijk van clathrine, dynamine, actine, pH en onafhankelijk van caveolae en PI3K. Na opname worden de virusdeeltjes direct afgeleverd aan late endosomen waar membraanfusie plaatsvindt. In aanwezigheid van antistoffen vindt opname plaats via een route die op fagocytose lijkt. Actinegemedieerde membraanuitstulpingen tasten de omgeving af en vangen virusdeeltjes waarna ze worden opgenomen. Na opname vindt transport plaats naar vroege en late fagosomen. Fusie kan in beide organellen plaatsvinden. Er werd geen verschil waargenomen in de opname route tussen antistof-gebonden standaard dengue en antistof-gebonden prM-bevattende dengue virusdeeltjes, hetgeen laat zien dat het antistof en niet de eiwitsamenstelling van het virus de opnameroute dicteert. prMbevattende deeltjes fuseren gemiddeld genomen wel op een later tijdspunt en dit hangt vermoedelijk samen met de tijd die nodig is voor het knippen van prM eiwit tot M door het enzym furine. Antistoffen dirigeren virusdeeltjes niet alleen naar een andere opname route, deze route lijkt ook meer efficiënt aangezien er meer membraanfusie werd waargenomen na antistof-gemedieerde opname van dengue. Kortom, deze studie geeft een gedetailleerd inzicht in het infectieproces van dengue en laat zien hoe antistoffen dit beïnvloeden.
A
In Hoofdstuk 5 zijn de antivirale eigenschappen van LCTA-949, een derivaat van het antibioticum teicoplanine, onderzocht. Er werd een dosis afhankelijke antivirale activiteit waargenomen tegen het dengue virus maar ook tegen het verwante gele koorts virus en het teken encefalitis virus. Experimenten met DiD-gelabelde dengue virusdeeltjes lieten zien dat infectie wordt geremd op het niveau van virus binding/ opname. LCTA-949 interfereert ook met het infectieproces van antistof-gebonden dengue virusdeeltjes. Samenvattend, LCTA-949 remt dengue virus infectie in een vroeg stadium van de vermenigvuldigingscyclus en is werkzaam in af- en aanwezigheid van antistoffen. In Hoofdstuk 6 zijn de antivirale eigenschappen van een analoog van het antibioticum doxorubicine, SA-17, getest. Eerdere studies hebben laten zien dat SA-17 antivirale
156
Appendices activiteit vertoont tegen dengue virus serotype 2 en het gele koorts virus. In deze studie is de werking van SA-17 nader onderzocht. Aangetoond werd dat SA-17 interfereert met binding en opname van dengue virusdeeltjes in cellen. SA-17 remt ook infectie van antistof-gebonden standaard en prM-bevattende dengue virusdeeltjes. SA-17 werd toegevoegd voor, tijdens en na binding van antistoffen aan dengue virusdeeltjes en onder alle condities werd antivirale activiteit waargenomen. De IC50 waarden varieerden van 0,26 tot 2,89 µM. Kortom, SA-17 en LCTA 949 hebben antivirale kenmerken tegen dengue in af- en aanwezigheid van antistoffen en zijn daardoor potentieel toepasbaar tijdens primaire en secundaire dengue virus infecties. Door de studies beschreven in dit proefschrift hebben we ontdekt hoe antistoffen opname van dengue virusdeeltjes mediëren. Hiermee hebben we een beter inzicht gekregen in de achtergronden van antistof-gemedieerde verergering van ziekte. Daarnaast hebben we twee moleculen geïdentificeerd die specifiek interfereren met het infectieproces. De meest belangrijke resultaten van het proefschrift worden herhaald en bediscussieerd in Hoofdstuk 7.
A
157
Appendices
Contributing authors Department of Medical Microbiology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, Groningen, The Netherlands Jolanda M. Smit Jan Wilschut Júlia M. da Silva Voorham Izabela A. Rodenhuis-Zybert Heidi van der Ende-Metselaar T.E. Hoornweg D.P.I. van de Pol Patsaporn Jarupathirun Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands
Rega Institute for Medical Research, K.U. Leuven, Minderbroedersstraat 10, 3000 Leuven, Belgium Tine De Burghgraeve Suzanne J. F. Kaptein Johan Neyts Fundacion Instituto Leloir, Buenos Aires, Argentina Juan A. Mondotte Andrea V. Gamarnik Université de la Méditerranée, Marseille, France
Department of Medicine, Section of Infectious Diseases, Medical Institute Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA
Boris Pastorino Xavier de Lamballerie
Department of Molecular Microbiology, and Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA Michael S. Diamond Department of Infectious Diseases & Immunology, Virology Division,
158
H.M. van der Schaar
K.A. Sjollema
Tonya M. Colpitts Erol Fikrig
A
Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands
Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia Svetlana S. Printsevskaya Maria Preobrazhenskaya Royal Free & University College Medical School, London, UK Michael Jacobs
Appendices
Curriculum Vitae Personal information Surnames / First names Nationality Date of birth Place of birth e-mail
Ayala Núñez, Nilda Vanesa Mexican 16/04/1981 Nueva Rosita, Coahuila, Mexico
[email protected]
Education 2009-2014
PhD, University of Groningen, The Netherlands
2005-2009 PhD on Microbiology (Magna Cum Laude), Universidad Autónoma de Nuevo Leon, Mexico
2001-2005 Bachelor of Biology (Magna Cum Laude), Universidad de las Americas-Puebla, Mexico
Publications Ayala-Nunez, N.V., T. Hoornweg, D. van de Pol, K.A. Sjollema, H. van der Schaar, J.M. Smit. Seeing is believing: how antibodies alter the cell entry pathway of dengue virus particles in living macrophages. Submitted. Ayala-Nunez, N.V., P. Jarupathirun, S.J.F. Kaptein, J. Neyts, J.M. Smit. Antibodydependent enhancement of dengue virus infection is inhibited by SA-17, a doxorubicin derivative. Antiviral Research (2013) DOI: 10.1016/j.antiviral.2013.08.013 De Burghgraeve, T., S.J. Kaptein, N.V. Ayala-Nunez, J.A. Mondotte, B. Pastorino, S.S. Printsevskaya, X. de Lamballerie, M. Jacobs, M. Preobrazhenskaya, A.V. Gamarnik, J.M. Smit, and J. Neyts. An analogue of the antibiotic teicoplanin prevents flavivirus entry in vitro. Plos One 2012, 7(5):e37244 da Silva Voorham, J.M., I.A. Rodenhuis-Zybert, N.V. Ayala Nuñez, T.M. Colpitts, H. van der Ende-Metselaar, E. Fikrig, M.S. Diamond, J. Wilschut, and J.M. Smit. Antibodies against the Envelope Glycoprotein Promote Infectivity of Immature Dengue Virus Serotype 2. Plos One 2012, 7(3): e29957 Ayala-Nunez, N.V., J. Wilschut, and J.M. Smit. Monitoring virus entry into living cells using DiD-labeled dengue virus particles. Methods 2011, 55(2):137-43 Lara, H. H., N. V. Ayala-Nuñez, L. Ixtepan, and C. Rodríguez. Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HIV-1. Journal of Nanobiotechnology 2010, 8:1 Lara, H. H.*- N. V. Ayala-Nuñez*, L. Ixtepan and C. Rodríguez. Bactericidal effect of silver nanoparticles against multidrug-resistant bacteria. World J Microbiol Biotechnol 2010, 26:615–621 Ayala, N.V., H. H. Lara, L. Ixtepan, and C. Rodríguez. Silver Nanoparticles Toxicity and Bactericidal Effect Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Nanoscale Does Matter. NanoBiotechnology 2009, 5:2-9 Ayala, N.V., H. H. Lara, C. Rodríguez, and L. Ixtepan. 2009. Microbicidas rectales y vaginales: medicamentos tópicos para la prevención del VIH/SIDA. Aleph Zero. 51. Published online: http://hosting.udlap.mx/profesores/miguela.mendez/alephzero/archivo/historico/az51/ microbicidas51.html Lara, H. H., N. V. Ayala, and C. Rodríguez. Bioseguridad en el laboratorio: medidas importantes para el trabajo seguro. Bioquimia 2008, 33(2): 59-70. Lara, H. H., N. V. Ayala, and C. Rodríguez. Laboratorios de bioseguridad nivel 3 y 4: Investigación de patógenos peligrosos. Rev Mex Patol Clin 2007, 54:177-186.
A
159
Appendices
Acknowledgements
It is impossible to mention and thank all the persons that were part of my professional and personal life in Groningen. The last four years changed my life in such a way that I see a different person in the mirror compared to the one that initially came from Mexico. I have no words to express what I feel. This is just a bit of what I can say… To my supervisor: Jolanda Smit, you gave me the strength and support to finish. I would have never done this without you. Even though I was stressed, confused and/or extremely worried, I always walked out of your office with hope. Thanks for all. To my colleagues and friends at the UMCG: To Klaas Sjollema. Your enthusiasm and love for microscopy is contagious. Thanks for being willing to spend time in this project. To Jan Wilschut. Thanks for your advice and warm words. To Anke, Toos, Adriana and Aalzen. One of the main lessons I learned from you was to be always willing to listen and help, no matter how busy you are. Thank you all. To Dengue group (Heidi, Iza, Mariana, Bastiaan and Jacky). Thank you guys for all the advice, help and fruitful discussions. I will miss sharing a meeting table with you. To Jolanda Oldengarm, Jacqueline, Marijke, Tjarko, Annemarie, Wouter, Baukje Nynke, Joke. You are the strength of the group, the driving force that keeps MolVir going. You were always there willing to help me. I will never forget your advice and patience. My dear Peng, you were my friend, my colleague, my accomplice, my therapist, my advisor. Four years we followed the same track, I hope one day our paths will meet again.
A
My dear Mareike, your sweetness and sense of humor made me smile many times. Thanks for your friendship and kindness and, of course, for the cookies, chocolates, sweets, cakes, cheese soup, bread, tea and German vitamins. Denise, it’s obvious that without your help I would have never been able to finish the last part of my PhD. Thanks for your support and patience. Tabitha, I will not forget your tenacity and strength. Thank you for your help. Silvia, jamás olvidaré tus palabras llenas de sabiduría y sentido del humor. Muchísimas veces me ayudaste a volver del mundo ideal donde me encontraba para ver la realidad. Te llevas toda mi admiración y respeto. Nunca olvides a Doña Mercedes Sosa. No olvides que, como la cigarra,
160
Appendices seguirás resucitando cuantas veces sea necesario. Júlia, gracias por las sonrisas y consejos. Tú fuiste la primera persona en este país que me abrió sincera y cálidamente su mundo. Nunca lo olvidaré. Mayra, sinceramente espero algún día volvernos a encontrar en algún concierto, festival o conferencia. Veremos lo que nos depara el destino. To George, the man on the moon. Thank you for your friendship, music, time and support. To Harshad, the smiling officemate. To all those PhD students and postdocs that shared this time and space with me. To Marcy, Stephanie, Maartje, Shafique, Oana, Aom, Zoraida, Tobias, Tjalke, Mitra, Maaike, Sandrine. Hope to see you all again. To each and every person that has been part of Molecular Virology in the last four years. To my friends: Isis, mi amiga y roommate. Hiciste de Visserstraat 36B un lugar cálido y tranquilo al cual regresar cada día. Recuerda que siempre estaré allí si me necesitas, no importa en qué parte del mundo me encuentre. Genaro, mi amigo y confesor. ¿Qué te puedo decir que no sepas ya? Confío en tí como en pocas personas. Fuiste uno de los apoyos más grandes que tuve en estos años. To all those wonderful persons that made my life so intense and interesting. Thank you, dankje, gracias, 謝謝, danke, obrigado, merci. To my family: Paloma, palomito, aunque te parezca cursi lo tengo que decir: te quiero mucho. Tu cariño y atenciones me ayudaron mucho a seguir adelante. Junto con Raco y Sebastián, me dieron la calidez y el apoyo que necesitaba. Para mamá, papá, Chuy, Saulo, los Núñez y los Ayala. To this country: Thank you Netherlands for your acceptance and respect. I will leave a piece of my heart with you.
A
Nilda Vanesa Ayala Núñez April, 2014
161
