Název:
Vypracovala: Zuzana Lacková
Datum: 7. 2. 2014
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
MĚLI BYCHOM ZNÁT: • informace, které má analýza poskytnout (př. AMK) • analyty a jejich předpokládané obsahy (koncentrace) • další složky materiálu a jejich obsahy (obsah proteinu) • požadavky a parametry analytické metody (způsob úpravy vzorku, přesnost) • skupenství vzorku (u tuhých vzorků velikost částic, mechanické vlastnosti) a stabilita vzorku
VZOREK: • nesmí být degradovaný, plesnivý, zkažený či jinak poškozený
Mezinárodní norma. [online]. [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: web.vscht.cz/~koplikr/1_Odb%C4%9Br_vzork%C5%AF.pdf
záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN
2) GFP
3) METHALOTIONEIN 3
4) LAKTOFERIN
5) MAXIMIN H5 + 6 bodových mutací??
rozdělení složek vzorku na základě jeho fyzikálních a chemických vlastností separace peptidů vyžaduje vysokou separační účinnost, protože jsou složité a mají vysoký počet komponent
založená na rozdílné pohyblivosti částic unášených mobilní fází při průchodu stacionární fází
Ing. Dr. Otakar, MIKEŠ, DrSc., LABORATORNÍ CHROMATOGRAFICKÉ METODY. Praha: SNTL, 1980, 676 s.
interakce molekul solutu podle jejich polarity (hydrofobní interakce se stacionární fází) s klesající polaritou látek vzrůstá jejich retence (zadržení) v koloně polární mobilní fázi (směs vody a zředěných kyselin či zásad) nepolární stacionární fázi (silikagel-C řetězce), sorbent či oxidy kovu) separace peptidů, léčiv či biochemických sloučenin
X
NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 235 s. ISBN 978-80-260-4244-0.
výměna iontů mezi mobilní a stacionární fází na základě rozdílných nábojů (silné elektrostatické interakce-přitahování opačných nábojů) analyt v průběhu separace prostupuje směrem k měniči iontů, poté prochází měničem a dochází k vlastní výměně iontů stacionární fáze je tvořena ionexem (měnič ionů) anex-kladný náboj (-NH2, -NHR, -NR2, -N+R3)
katex-záporný náboj (-OH, -COOH, -PO(OH)2, -SO3H) mobilní fáze-vodné roztoky (vzorek či eluční činidlo) interakce iontu s ionexem stoupá s jeho nábojem (polaritou) a klesá s jeho velikostí chování aminokyselin, peptidů, bílkovin
VAŇKOVÁ, Hana. PEPTIDOVÉ MAPY. Chemické listy 93. 1999, s. 120-127.
Způsoby uvolňování iontů z kolony:
Ionex (anex)
a)Eluce vytěsněním (gradientem iontové síly):
ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38.
Způsoby uvolňování iontů z kolony:
Ionex (anex)
b)Eluce přenábojováním (gradientem pH):
ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38.
LAKTOFERIN
rozdělování molekul podle jejich velikosti a tvaru ve svislé koloně, která je naplněna pórovitým polymerním gelem stacionární fáze-gel (složený z dextrinů zesítěných epichlorhydrinem) gel slouží jako molekulové síto-kolonou protéká konstantní rychlostí mobilní fáze stejného složení jako má roztok v pórech gelu a látky procházejí kolonou různou rychlostí dělení makromolekulárních látek, proteinů, enzymů, polysacharidů apod.
Doc. Ing. Milan POPL a DrSc. Ing. Jaroslav KUBÁT, CSc. Separace látek. Praha: SNTL, 1986, 172 s.
Current (x10 -5 A)
-0.200 -0.175 -0.150 -0.125 -0.100 -0.075 -0.050 -5 -0.025 0 0.025 -1.750
MT: LEDVINY A
B
Fractions
Rack Pos.: Tube #: 2.00 100.0 % Buffer B 1.75
2.00 1.75
1.50
1.50
1.25
1.25
1.00 50.0
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
0.00 0.0
0.00
-0.25
-0.25
AU
0.00
30.00
60.00
-1.500
Fractions
A 2
10 mM Tris+150 mM NaCl, pH 8,6
-0.750
-0.500
od 10 μg/ml
5 6 7 8 2.00
AU
Min.Tenth
-1.250Potential -1.000 (V)
254 nm
1.75
205 nm
1.50
215 nm
1.25
280 nm
1.00 0.75 0.50 0.25
0
0.00 -0.25
Intens. [a.u.]
0.00
30.00
x104
1.5
1.0
60.00 Min.Tenth
90.00 A
B
BSA (Albumin from bovine serum) 1,5 mg/ml
AU
Fractions
Rack Pos.: Tube #: 2.00 100.0 % Buffer B 1.75
2.00 1.75
1.50
1.50
1.25
1.25
1.00 50.0
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
0.00 0.0
0.00
-0.25
-0.25
0.5
0.0 0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000 m/z
AU
0.00
30.00
60.00 Min.Tenth
AU
specifické interakce vhodných partnerů: enzym - inhibitor, substrát protilátka - antigen receptor - hormon stacionární fáze je tvořena nosičem (agarosa), na který je chemicky navázán jeden z partnerů mobilní fáze navazovací pufr promývací pufr eluční činidlo separace bioaktivních látek, oddělení proteinu z komplexní směsi aplikace v lékařství a proteomice, analýza látek
ZOUHAR, Jan. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINU NA VÁZANÝCH KOVOVÝCH IONTECH. Chemické listy 93. 1999, s. 683-685.
promytí
navázání ligandu
promytí a deaktivace
navázání látky
promytí
SORBENT
SORBENT
SORBENT
SORBENT
NOSIČ
NOSIČ
NOSIČ aktivace nosiče
desorpce a rekonstituce
MT-3
25000 20000 15000
10000 5000 0
445
545
645
745
gradientová eluce se snižující se iontovou sílou mobilní fáze retence solutů je ovlivňována přídavkem organických nebo anorganických solí do vody stacionární fáze A. homogenní povrch (silikagel) B. nízký obsah hydrofobních skupin (propyl, bytyl) na selektivitu separace má vliv:
stacionární fáze typ soli (síran amonný, chlorid sodný, síran sodný) teplota pH mobilní fáze
zvýšení koncentrace soli v mobilní fázi → přechod solutu do stacionární fáze → zvýšení retence separace proteinů a velkých peptidů
Future aspects in peptide chemistry: selected contributions presented at the Ringberg conferences. Editor Gunter Fischer, Wolfgang Voelter. Prague: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, 1999, viii, 243 s. Collection symposium series. ISBN 80-862-4103-3.
GFP 1.00
2.00
100.0 % Buffer B
1.75 0.75
0.50 50.0
1.50
25000
1.25
20000
1.00 0.75
0.25
0.50
0.00 0.0
AU
0.00
2.00
4.00 Min.Tenth
6.00
15000 10000
0.25
5000
0.00
0
-0.25
AU
GFP (6.11.) water
445
545
645
745
Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Mgr. et Bc. Markéta Komínková
Celému týmu laboratoře metalomiky a nanotechnologií
Práce vznikla za podpory CZ.1.07/2.4.00/31.0023
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
1) Future aspects in peptide chemistry: selected contributions presented at the Ringberg conferences. Editor Gunter Fischer, Wolfgang Voelter. Prague: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, 1999, viii, 243 s. Collection symposium series. ISBN 80-862-4103-3. 2) ZOUHAR, Jan. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINU NA VÁZANÝCH KOVOVÝCH IONTECH. Chemické listy 93. 1999, s. 683685. 3) ŠIMAN, Pavel. Chromatografie. Ústav lékařské biochemie, 2013, s. 38. 4) NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 235 s. ISBN 978-80260-4244-0. 5) MOTYKA, Kamil a Jan HLAVÁČ. Stručný přehled separačních metod. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2009, 45 s. ISBN 978-80-244-2304-3.
6) LEHOTAY, Jozef a Slovenská technická UNIVERZITA. Separačné metódy v analytickej chémii. Bratislava: Slovenská technická univerzita, 2009. ISBN 978-802-2730-365. 7) Ing. Dr. Otakar, MIKEŠ, DrSc., LABORATORNÍ CHROMATOGRAFICKÉ METODY. Praha: SNTL, 1980, 676 s. 8) Doc. Ing. Milan POPL a DrSc. Ing. Jaroslav KUBÁT, CSc. Separace látek. Praha: SNTL, 1986, 172 s. 9) VAŇKOVÁ, Hana. PEPTIDOVÉ MAPY. Chemické listy 93. 1999, s. 120-127. 10) Mezinárodní norma. [online]. [cit. 2014-01-29]. Dostupné z: http://web.vscht.cz/~koplikr/1_Odb%C4%9Br_vzork%C5%AF.pdf
