Mykotoxiny a jejich konjugáty v potravinářských surovinách a krmivech: trendy, rizika dietární expozice, možnosti prognózy osudu při zpracování

Klasifikace:

Draft

Pro vnitřní potřebu VVF

Oponovaný draft

Pro vnitřní potřebu VVF

Finální dokument

Pro oficiální použití

Deklasifikovaný dokument

Pro veřejné použití

Název dokumentu:

Mykotoxiny a jejich konjugáty v potravinářských surovinách a krmivech: trendy, rizika dietární expozice, možnosti prognózy osudu při zpracování

Poznámka:

Zpracovali: Prof. Ing. Jana Hajšlová, CSc. ve spolupráci s Ing. Milenou Zachariášovou, Ing. Alexandrou Malachovou, Ing. Martou Kostelanskou, Doc. Ing. Vladimírem Kocourkem CSc. a Doc. Dr. Ing. Janem Poustkou

Výzkumný ústav rostlinné výroby,v.v.i., Drnovská 507, 161 06 PRAHA 6 - Ruzyně Tel.: +420 233 022 324 , fax.: +420 233 311 591, URL: http://www.phytosanitary.org

1

Souhrn Mikroskopické vláknité houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny mnoha zemědělských plodin. Mezi nejčastěji se vyskytující druhy patří F. graminearum, F. culmorum. Tyto patogeny napadají vegetativních i reprodukčních orgány rostlin a způsobují jejich poškození a případně úhyn. U cereálií způsobují poškození klasů a následně zrna, u kukuřice pak poškození palic. Fusariové vláknité houby mohou způsobovat i takzvané asymptomatické infekce, jejichž důsledkem je výskyt mykotoxinů v zrnech obiloviny zdánlivě dobré jakosti. Fusariové houby produkují velké množství toxických sekundárních metabolitů, které jsou řazeny do několika skupin. Především se jedná o skupinu trichothecenů, fumonisinů a zearalenon. Kromě volných forem mykotoxinů však existují i formy vázané, většinou konjugáty se sacharidy, jež jsou výsledkem detoxifikačního procesu rostlin. Tyto mykotoxinové konjugáty jsou často označovány jako „maskované“, protože díky své zvýšené polaritě, unikaly běžné analytické detekci. Nejznámějším a doposud nejprobádanějším konjugátem trichothecenů je deoxynivalenol-3-glukosid, který se v obilovinách vyskytuje v koncentracích odpovídajících až 30 % koncentrace „volného“ DON. Jeho přítomnost na relativně vysokých hladinách byla dále prokázána v mnoha produktech na bázi cereálií, zejména fermentovaných. Tato studie shrnuje nejnovější poznatky týkající se nejrozšířenějšího trichothecenového mykotoxinu deooxynivalenolu (DON) a jeho majorotní konjugované formy, deoxynivalenol-3glukosidu (DON-3-Glc). Jsou zde ilustrovány moderní analytické metody využívané pro stanovení volných i konjugovaných mykotoxinů, které jsou založené na kapalinové chromatografii s hmotnostně spektrometricou detekcí (LC-MS), i rychlé screeningové imunochemické metody Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Studie dále ilustruje dynamiku volných i vázaných mykotoxinů v průběhu technologického zpracování potravin, konkrétně v průběhu pekárenských a sladařsko-pivovarských technologií.

VŠCHT PRAHA

2

Summary Microscopic filamentary fungi Fusarium genera are significant pathogens of large amount of agricultural crop plants. Most widespread Fusarim species are F. graminearum and F. culmorum. Those pathogens cause plant diseases like Fusarium Head Blight (FHB) of small grain cereals and or Fusarium Ear Rot (FER) of maize. Fusarium fungi can also cause so called asymptomatic infections, which means that mycotoxins occur in grains of relatively good quality. Fusarium fungi produce high amount of toxic secondary metabolites, which are divided into several groups, e.g. trichothecenes, fumonisins and zearalenon. In addition to free mycotoxins, there are some mycotoxin conjugates with sugars, which results from the plant detoxification process. Those mycotoxins conjugates are often called as “masked”. Their different physiochemical properties, especially enhanced polarity, caused that they escaped to routine analytical detection. The most well-known trichothecene conjugate is deoxynivalenol-3glucoside, which occur in crops in concentrations reaching up to 30% of free DON contamination. Relatively high amounts of DON-3-Glc were documented in many cereal based product, especially fermented. This study summarizes the latest research concerning the most well known trichothecene mycotoxin - deoxynivalenol (DON) and its major conjugated form - deoxynivalenol-3-glucoside (DON-3-Glc). Modern analytical methods for mycotoxins determination are illustrated (methods based on liquid chromatography coupled to mass-spectrometry (LC-MS) and rapid screening Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). The study further summarizes changes in free and conjugated mycotoxins content during the technological processing of foods, in particular during milling, malting and brewing technologies.

VŠCHT PRAHA

3

Obsah 1. Úvod ........................................................................................................................................ 5 2. ...................................................................................................................................................... 5 3. Producenti fusariových mykotoxinů ....................................................................................... 6 4. Fusariové mykotoxiny ............................................................................................................. 7 1.1 Trichotheceny .................................................................................................................. 7 1.2 Fumonisiny .................................................................................................................... 11 1.3 Zearalenon ..................................................................................................................... 11 1.4 Maskované mykotoxiny ................................................................................................ 12 5. Vliv primárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů ................................ 18 1.5 Podmínky ovlivňující předsklizňové období................................................................. 18 1.5.1 Přírodní faktory ..................................................................................................... 18 1.5.2 Podmínky ovlivňující období sklizně .................................................................... 21 1.5.3 Podmínky ovlivňující posklizňové období ............................................................ 21 6. Vliv sekundárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů ............................ 22 1.6 Čištění a třídění zrn ....................................................................................................... 23 1.6.1 Mletí ...................................................................................................................... 23 1.6.2 Pekárenství ............................................................................................................ 25 1.6.3 Extrudované výrobky ............................................................................................ 27 1.6.4 Sladařství a pivovarnictví ...................................................................................... 28 1.6.5 Vliv sladařství a pivovarnictví na obsah fusariových mykotoxinů ....................... 30 7. Analytické metody stanovení ................................................................................................ 31 8. Legislativa ............................................................................................................................. 35 9. Přílohy ................................................................................................................................... 37 10. Závěr.................................................................................................................................. 63 11. Literatura ........................................................................................................................... 64

VŠCHT PRAHA

4

1. Úvod S rostoucí osvětou populace v oblasti výživy a jejího vlivu na lidské zdraví roste zájem o kvalitní potraviny, a to jak z nutričního hlediska, tak z hlediska jejich zdravotní nezávadnosti. V popředí zájmu o ochranu zdraví populace figuruje především snaha o prevenci před civilizačními chorobami, proto je kladen značný důraz na hygienicko-toxikologickou nezávadnost potravin a minimalizaci kontaminace potravního řetězce průmyslovými kontaminanty, těžkými kovy, pesticidy a v neposlední řadě také přírodními toxiny. Přírodní toxiny jsou látky rostlinného i živočišného původu, nacházejí se v zemědělských surovinách, v mořských plodech a rybách. Jednou z nejobávanějších skupin zmíněných toxinů jsou celosvětově rozšířené mykotoxiny, které mohou představovat vysoké zdravotní riziko pro populaci, ekonomické ztráty v zemědělství a také problémy při technologickém zpracování potravinářských surovin. Mykotoxiny jsou sekundární metabolity mikroskopických vláknitých hub a mohou být obsaženy především v obilovinách (pšenice, ječmen, žito, oves), rýži, kukuřici, olejnatých semenech a potravinách obsahujících tyto potravinářské suroviny. V klimatických podmínkách mírného pásu jsou nejrozšířenější mykotoxiny produkované vláknitými houbami rodu Fusarium – fusariové mykotoxiny.

VŠCHT PRAHA

5

2. Producenti fusariových mykotoxinů Mikroskopické vláknité houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny mnoha zemědělských plodin. Tyto mikromycety patří mezi půdní mikroorganismy vyskytující se v oblastech Evropy, Ameriky, Asie a Austrálie s mírnými klimatickými podmínkami1,2. Optimální podmínky pro růst těchto vláknitých hub jsou teplota 11 - 23ºC a vlhkost 95 -100 %. Zrno obilovin může být těmito mikroskopickými vláknitými houbami napadeno během růstu rostlin či v průběhu skladování zrna v silech. K přenosu infekce na rostlinu dochází především ze zbytků rostlin, které zůstávají na poli z předcházející slizně, či z infikované setby. K šíření infekce může docházet také pomocí větru či deště3. Mezi nejčastěji se vyskytující druhy patří F. graminearum a F. culmorum, jež jsou nejvýznamnějšími původci onemocnění obilovin zvaného Fusarium head blight (FHB), jehož následkem je znehodnocení obilného zrna a možná tvorba fusariových mykotoxinů. Infikovaná zrna jsou malá, svraštělá, typicky bíle až růžově zbarvená, (Obr. 1, Obr. 2)4. Infekce zrn fusarii mohou představovat pro člověka a hospodářská zvířata značná zdravotní rizika a má za následek i výrazné ekonomické ztráty. Tyto ztráty vznikají v důsledku znehodnocení zemědělské produkce, snížené nutriční a technologické kvality zrn4,5.

Obr. 1: Fusarium head blight (FHB)

Obr. 2: Obilky napadené FHB

Mikromycety rodu Fusarium bývají označovány jako „polní plísně“, které poškozují zrna i jiné rostlinné tkáně v předsklizňovém období. Za příznivých podmínek však mohou růst také v průběhu skladování. K příznakům napadení fusarii souhrnně označovaných Fusarium head blight patří: •

Listové nekrózy – na listech se objevují hnědo-šedé vodnaté skvrny.

VŠCHT PRAHA

6

•

Vadnutí klasů – dochází k prorůstání mycelia mikromycet z místa primární infekce do celého klasu, klasy napadené v době kvetení jsou ve zralosti sterilní bez vyvinutých obilek. Zrna jsou svraštělá bílé až narůžovělé barvy.

•

Hniloby kořenů – k napadení fusarii dochází hlavně v období zimy, kdy postihují nesklizené rostliny, které později přenáší infekci na zdravé rostliny.

•

Plesnivění semenáčků – vzniká při nesprávném namoření osiva4.

3. Fusariové mykotoxiny Tvorba fusariových mykotoxinů je podmíněna řadou faktorů. Mezi nejdůležitější patří klimatické podmínky, množství srážek volba předplodiny vhodné pěstební plodiny. Fusariové mykotoxiny jsou tedy nežádoucí sekundární metabolity produkované mikroskopickými vláknitými houbami rodu Fusarium. Z důvodu značných zdravotních a ekonomických rizik jsou z této pestré skupiny mykotoxinů sledovány především trichotheceny, fumonisiny a zearalenon6.

1.1 Trichotheceny V současné době je známo více než 150 trichothecenů. Z hlediska chemické struktury se jedná o tricyklické seskviterpeny s šestičlenným cyklem, obsahujícím dvojnou vazbu mezi uhlíky C-9 a C-10 a epoxyskupinu v poloze C-12 a C-13 (Obr. 3)6. Podle typu a počtu funkčních a substitučních skupin se dělí trichotheceny do čtyř následujících skupin: •

typ A - nemá na C-8 oxoskupinu

•

typ B - na C-8 je oxoskupina

•

typ C - další epoxyskupina v poloze C-7 a C-8 nebo C-8 a C-9

•

typ D - makrocyklický kruh mezi C-4 a C-5 H

H3C

H

H

O

H

OH

O R2 H

CH2

CH3

OCOCH3

H

H3C

H

H

O

R1

O H R1

O OH

CH2

CH3

H R2

OR3

Typ A Typ B Obr. 3: Ukázka strukturních vzorců trichothecenů typu A a B Vláknité houby rodu Fusarium produkují nejčastěji trichotheceny typu A a B, přičemž k nejvýznamnějším z nich patří deoxynivalenol, nivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol, 3VŠCHT PRAHA

7

acetyldeoxynivalenol, fusarenon-X, T-2 toxin a HT-2 toxin. Funkční skupiny jednotlivých trichothecenů jsou uvedeny v Tab. 1. Jednotlivé trichotheceny produkuje celá řada mikromycet (Tab. 2). Tab. 1: Funkční skupiny nejvýznamnějších trichothecenů A a B6 typ A

B

název mykotoxinu HT-2 toxin T-2 toxin nivalenol deoxynivalenol 15-acetyldeoxynivalenol 3-acetydeoxynivalenol fusarenon-X

zkratka HT-2 T-2 NIV DON 15-ADON 3-ADON FUS-X

R1 OH OCOCH3 OH OCOCH3 OH OH OH

R2 OCOCH2CH(CH3)2 OCOCH2CH(CH3)2 H H H OH OCOCH3

R3 H H COCH3 H H

Tab. 2: Mikromycety rodu Fusarium produkující jednotlivé trichotheceny7 trichothecen NIV DON 15-ADON 3-ADON FUS-X HT-2 T-2

druh vláknité houby F.graminearum, F. equiseti, F. sambucinum, F. semitectum, F. crookwellence F. culmorum, F. graminearum, F. roseum, F. nivale, F. sporotrichioides F. graminearum F. graminearum, F. culmorum, F. roseum F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F. semitectum. F.sporotrichioides, F. culmorum, F. crookwellence, F. poae,F. solani, F. nivale F. acuminatum, F. graminearum, F. poae, F.sporotrichioides, F. solani, F. sporotrichiella, F. trinictum, F. culmorum. F. sporotrichioides, F. poae, F. acuminatum, F.culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F.semitectum, F. solani, F. tricinctum, F. nivale

Mykotoxiny způsobují onemocnění souhrnně nazývána mykotoxikózy. Při expozici člověka trichotheceny dochází k napadení jater, ledvin, nervového, oběhového a endokrinního systému. Trichothecenům

přítomným

v

zemědělských

produktech

je

přičítána

řada

technologických problémů vyskytujících se v průběhu zpracování surovin na finální produkty. Při výrobě piva mohou inhibovat syntézu enzymů ve sladu a také zpomalovat růst kvasinek při kynutí těsta v průběhu výroby pečiva4 Nejčastěji vyskytujícím se trichothecenovým mykotoxinem je deoxynivalenol (DON) neboli vomitoxin, proto bývá považován za indikátor mykotoxinové kontaminace. Chemicky je to 3α,7α,15–trihydroxy–12,13–epoxytrichothec–9–en–8–on (Obr. 4)8. Běžně bývá detekován v pšenici, ječmeni a kukuřici. Nálezy však byly také prokázány v rýži, čiroku, hořčičném semenu, sojových bobech, podzemnici olejné, bramborách a slunečnici7. DON je relativně termostabilní, degradace byla pozorována až při teplotách vyšších než 210oC. Je stabilní v slabě kyselém prostředí, kdežto v zásaditém prostředí se rozkládá8.

VŠCHT PRAHA

8

H

H3C

H

H

O

OH

O O OH

CH2

CH3

OH

Obr. 4: Strukturní vzorec deoxynivalenolu V posledních dvou letech se začaly rozšiřovat i chemotypy mikromycet produkující ve velké míře další mykotoxin typu B – nivalenol (NIV). Chemicky se jedná o 3α, 4β, 7α, 15tetrahydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one. Poprvé byla tato látky izolována z F. nivale, což je atypický druh F. sporotrichioides. Nejčastějšími producenty NIV jsou F. cerealis, F. poae a v malém množství také F. culmorum a F. graminearum. NIV byl detekován v cereáliích, jako je ječmen, pšenice a kukuřice a také ve sladu, pivu a chlebě. Z důvodu značné polarity NIV je velice obtížné jeho stanovení multidetekčními chromatografickými metodami. Vzhledem k tomu, že pro NIV zatím neexistuje platná legislativa definující jeho nejvyšší povolená množství v potravinách, řada analytických laboratoří se jeho analýzou nezabývá. Postupně se ale NIV, vzhledem ke stoupající frekvenci svého výskytu v posledních letech, dostává do popředí zájmu odborníků. Probíhá množství toxikologických studií, na jejichž základě budou postavena legislativní opatření upravující nejvyšší povolená množství NIV v daných komoditách.

H

H3C

H

H

O

OH

O O OH

CH2

CH3

OH

OH H

Obr. 5: Strukturní vzorec nivalenolu V současné době je v rámci EU věnována velká pozornost mykotoxinům reprezentujících skupinu trichothecenů typu A, tedy HT-2 toxinu (HT-2) a T-2 toxinu (T-2). HT-2 je triviální název

sloučeniny

4β,15-diacetoxy-3α,dihydroxy-8α-[3-methylbutyryl-oxy]-12,13-

epoxytrichothec-9-en (Obr. 6), systematický název T-2 je 15-acetoxy-3α,4β-dihydroxy-8α-[3methylbutyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9-en (Obr. 6). Jelikož se in vivo T-2 snadno

VŠCHT PRAHA

9

metabolizuje na HT-2 jsou tyto látky většinou stanovovány společně a jejich koncentrace je uváděna v sumě. H

H3C

H

H

O

OH

O

O

O OH CH3

H3C

CH2

CH3

OH

O

O

H

OH

O

Obr. 6: Strukturní vzorec HT-2 toxinu

H3C

H

H

O

OH

O

O CH3

H

H3C

CH3

CH2

CH3

O

O

CH3 O H

O

CH3

Obr. 7: Strukturní vzorec T-2 toxinu

Z hlediska toxicity je T-2 nejúčinnější z trichothecenových mykotoxinů. Je významný svojí akutní toxicitou. Způsobuje onemocnění známé jako alimentární toxická aleukie, dále kožní problémy doprovázené krvácivými ložisky v oblasti hlavy a pohlavních orgánů pokusných zvířat. Oba toxiny patří mezi významné kontaminanty cereálií, především ovsa, žita, pšenice a ječmene. K hlavním producentům HT-2 a T-2 patří druhy plísní jako F. poae, F. sporotrichoides, F. equiseti a F. acuminatum. Jejich výskyt je v poslední době velmi často a v relativně vysokých koncentracích zaznamenáván v ovsu. Nedávné vědecké výzkumy poukázaly na důležitý jev, tzv. asymptotický výskyt těchto mykotoxinů, který se projevil v testovaných vzorcích ovsa. Jedná se o to, že u obiloviny nemusí být napadení Fusarii v průběhu vegetace vůbec pozorovatelné (na rozdíl od pšenice a ječmene), plísně se rozvíjí latentně a kontaminují jej svými sekundárními toxickými produkty. Aktuálnost popsaného problému dokumentuje celá řada studií, které jsou zaměřené na kontaminaci ovsa trichotheceny typu A indikující reálné zdravotní riziko pro časté konzumenty potravinářských komodit na jeho bázi, a to přesto, že z dietetického hlediska je oves považován za nutričně nejvyváženější ze všech druhů obilovin a jeho produkce dosahuje v Evropské unii několika milionů tun ročně. Většina laboratoří zaměřených na analýzy fusariových mykotoxinů se specializuje na DON a zearalenon (ZON), pro jejichž stanovení již byla v praxi zavedena celá řada analytických metod. Toto bohužel neplatí pro HT-2 a T-2. Z důvodu zvyšujícího se výskytu těchto kontaminantů je třeba zavést metody, které by sloužily jak pro rychlý monitoring přítomnosti toxinů v zemědělských nebo potravinových komoditách, tak pro přesné a citlivé stanovení výskytu těchto dvou analytů, kterých lze dosáhnout například pomocí vysokoúčinné kapalinové

VŠCHT PRAHA

10

chromatografie v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS/MS). Tato technika umožňuje stanovení širokého spektra látek v rámci jedné analýzy během relativně krátkého času, což bude využito pro multidetekční stanovení trichothecenových mykotoxinů (pro orientační stanovení řady mykotoxinů lze samozřejmě využít i imunochemické postupy jako je technika ELISA).

1.2 Fumonisiny Doposud bylo identifikováno nejméně patnáct sloučenin, které byly zařazeny do této skupiny mykotoxinů9. Nejvýznamnější z hlediska kontaminace obilovin jsou fumonisiny B1 a B2. Jde o vysoce polární, ve vodě rozpustné diestery propan 1,2,3-trikarboxylové kyseliny s pentahydroxydimethyleikosanem, který obsahuje vázanou aminoskupinu. Jednotlivé typy fumonisinů se liší typem navázaných funkčních skupin (Obr. 5)6,10. Za hlavní producenty této skupiny mykotoxinů jsou považovány Fusarium proliferatum a F. verticillioides2,6,9,10. O CH3

O

H3C

O

OH O

CH3

OH

OH NH2 CH3

OH

O

O O

O

OH

OH

OH

Obr. 8: Strukturní vzorec fumonisinu B1 Nejvýznamnější nálezy fumonisnů byly zjištěny v kukuřici a kukuřičných produktech11. V pšenici a ječmenu nejsou fumonisiny běžnými kontaminanty. Tyto obiloviny pravděpodobně obsahují látky, které inhibují jejich tvorbu11. Nálezy fumonisinů byly také hlášeny v rýži a v prosu6. Fumonisiny vyvolávají u hospodářských zvířat řadu závažných onemocnění, která mohou při vyšší intoxikaci vést ke smrti (např. mykotoxikósa koní – leukoencephalomalasia)7. U hlodavců byla prokázána hepatotoxicita a nefrotoxicita2,9. Dle International Agency for Research on Cancer (IARC) jsou fumonisiny řazeny do skupiny pravděpodobných lidských karcinogenů12.

1.3 Zearalenon Povahou je zearalenon (ZON) nesteroidní estrogenní mykotoxin, který je biosyntetizován různými druhy mikroskopických vláknitých hub rodu Fusarium. Mezi nejvýznamnější

VŠCHT PRAHA

11

producenty patří F. graminearum (Gibberella zeae), F. culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. crookwellense a F. semitectum13. Zearalenon (ZON) vykazuje u některých organismů silné estrogenní účinky a výsledkem je nepříznivý vliv na reprodukční systém. Chemicky se jedná o μ-lakton 6-(10-hydroxy-6-oxotrans-1-undecenyl)-β-resorcyklové kyseliny (Obr. 9). Triviální název zearalenon je odvozen z názvu hlavního producenta ZON Gibberella zeae, z laktonu kyseliny resorcyklové a z koncovky – en, udávající dvojnou vazbu mezi C-1´ a C-2 uhlíkem13.

OH

CH3

O O

HO O Obr. 9: Strukturní vzorec zearalenonu ZON je bílá, opticky aktivní, krystalická pevná látka. Je termostabilní, k rozkladu dochází při teplotách nad 180oC působících po dobu 30 minut. ZON je odolný také vůči hydrolýze. ZON fluoreskuje v ultrafialové oblasti a působením UV záření přechází přírodní trans-isomer na cisisomer (Obr. 10)24.

OH

CH3

O

OH

O UV záření

HO

O

HO

H3C

H

O O

Obr. 10: Isomerace ZON

1.4 Maskované mykotoxiny První zmínky o maskovaných mykotoxinech se objevily již v polovině 80. let 20. století, kdy byly pozorovány mykotoxikosy zvířat, při kterých výsledky klinických studií zvířat neodpovídaly množství mykotoxinů stanovenému ve zkrmovaném krmivu. Neočekávaně vysoká toxicita použitého krmiva byla pravděpodobně způsobena konjugovanými formami mykotoxinů, které v tehdejší době unikaly analytickým stanovením. Konjugované formy mykotoxinů pravděpodobně vznikají při detoxikačních procesech obilovin63, což prokázaly i následně

VŠCHT PRAHA

12

uskutečněné studie zabývající se transformacemi mykotoxinů v rostlinách. Do dnešní doby byly identifikovány rostlinné metabolity DON, ZON a ochratoxinu A64. Detoxikační reakce pravděpodobně chrání rostliny před toxickými látkami z okolního prostředí, ale také před sloučeninami, které rostliny tvoří samy, a zahrnují především tzv. transformace (deepoxidace, deacetylace a isomerace) a konjugace. Během těchto reakcí jsou reaktivní funkční skupiny redukovány či maskovány tak, aby se toxicita nově vzniklého produktu snížila či úplně eliminovala64. Při konjugacích jsou volné mykotoxiny vázány na více polární látky, např. na glukosu, sulfát či glutathion a vzniklé konjugáty jsou následně ukládány do buněčných vakuol63,66.Celý proces, který pravděpodobně probíhá v rostlinné buňce znázorňuje Obr. 11. První prokázané metabolické transformace mykotoxinů byly pozorovány u kukuřice infikované F. graminearum, u které bylo během růstu nejprve sledováno navýšení hladiny DON a následně její snížení, způsobené pravděpodobně aktivitou rostlinných enzymů. Následné zkoušky prokázaly nestabilitu DON během skladování, a to i při teplotách -18°C64. Studie zabývající se metabolismem ZON v suspenzi kukuřičných buněk prokázala tvorbu zearalenonu4-β-D-glukopyranosidu a α– a β-zearalenolu (viz Obr. 12, 13) 64,67.

vakuola “polárnější látka - rozpustná ve vodě”

buněčná stěna

VŠCHT PRAHA

cytosol

13

vakuola

buněčná stěna

cytosol

FÁZE II glukosylace HO H

H3C

O

O O

O

H

OH O

HO HO

buněčná stěna

OH O OH

CH 3

OH HO

HO

OH

H

H

O OH

O H

CH 3

vakuola

O

O

cytosol

FÁZE III produkty glykosylace

VŠCHT PRAHA

14

HO H

H3C

O

OH

H

H

O O

O

H

OH

HO

O OH

CH3

OH HO

H

H3C

O

O O

O

H

OH O H HO

CH3

OH

OH O H

CH3

O

OH

HO

HO

OH

O O

HO

O

O O

HO

HO

OH O

CH3

OH HO

ABC transport?

OH

H

H

O

vakuola

O

cytosol

buněčná stěna

FÁZE IV převedení do vakuol HO

H

H3C

O

O O

O

H OH HO

OH

H

H

OH

HO

O OH

CH3

H

H3C

O

O O

O

H OH HO

OH O H HO HO HO

O O

HO

CH3

HO

O

HO OH

O

OH

H

H

OH O OH

CH3

O O

OH O H

CH3

O

OH

vakuola

O

cytosol

buněčná stěna

FÁZE V zabudování do buněčné stěny

Obr. 11: Znázornění tvorby maskovaných mykotoxinů62

VŠCHT PRAHA

15

OH

O

CH2OH O O OH OH

CH3

O

O

OH

Obr. 12: Strukturní vzorec zearalenonu-4-β-D-glukopyranosidu OH

CH3

O

OH

CH3

O O

O

HO

HO

OH

OH

α- zearalenol

β- zearalenol

Obr. 13: Strukturní vzorec α– a β-zearalenolu Detoxikace probíhající v zemědělských plodinách však nemusí nutně vést ke snížení rizika pro konzumenty. Biologická dostupnost a toxicita těchto látek není doposud známa. Potencionální nebezpečí maskovaných mykotoxinů spočívá v jejich hydrolýze při průchodu trávicím traktem savců, při kterém může dojít k uvolnění původního, více toxického mykotoxinu. Při pokusech na prasatech krmených krmivem kontaminovaným zearalenon-4-β-Dglukopyranosidem byly zaznamenány příznaky odpovídající intoxikaci organismu volným ZON 64,67

K rozkladu konjugovaných mykotoxinů dochází pravděpodobně také za vhodných podmínek při technologickém zpracování obilného zrna. Young a kol. (1984) například prokázal téměř 100% nárůst hladiny DON při fermentačním zpracování kontaminované pšeničné mouky. Tuto skutečnost vysvětluje metabolickou přeměnou tohoto toxinu v pšenici na neznámou sloučeninu, která může být následně za vhodných podmínek přeměněna opět na původní DON 64,68

. Konjugované formy mykotoxinů nejsou stále rutinně analyzovány a běžným analytickým

stanovením unikají hned z několika důvodů. Kvůli své vyšší polaritě jsou při použití běžných extrakčních činidel hůře extrahovatelné, dochází k jejich ztrátám v průběhu přečištění a pro kvantitativní analýzy nebyly donedávna komerčně dostupné jejich standard63. Jediným komerčně

VŠCHT PRAHA

16

dostupným standardem maskovaného mykotoxinu je v současné době standard deoxynivalenol3-β-D-glukopyranosidu (D3G) dodávaný firmou Biopure (USA). Syntéza deseti konjugátů DON byla popsána ve studii Savard (1991). Konjugované sloučeniny zahrnovaly osm esterů mastných kyselin a dva glukosidy66. Dall´Asta a kol. (2005) a Berthiller a kol. (2005) ve svých studiích uvádí přípravu deoxynivalenol-3-β-D-glukopyranosidu a deoxynivalenol-15-glukopyranosidu

63,69

. Syntéza deoxynivalenol-3-β-D-glukopyranosidu

z 3,15-diacetyl-deoxynivalenolu dle Savarda (1991) je zobrazena na Obr. 1466.

OAc

O

H3C

O

OH

O

H3C

HCl/MeOH

O

O

O

OH CH3 OAc 3,15-diacetyl-DON

OH CdCO3

CH3 OAc

Br OAc

O

15-acetyl-DON

OAc

OAc

OAc

O

O

H3C

OAc OAc

O

O

OAc OAc

O OH

CH3 OAc

KCN/MeOH DON-glukosid-acetát

HO

O

O

H3C

OH

O

O

OH OH

O OH

CH3 OAc

DON-3-glukosid

Obr. 14: Syntéza deoxynivalenol-3-β-D-glukopyranosidu

První studie zabývající se monitoringem D3G v přirozeně infikované pšenici a kukuřici ukázala, že D3G byl detekován v sedmi vzorcích z osmi v koncentračním rozmezí 50 – 200 μg/kg. DON byl přítomen na hladinách 90 – 5 000 μg/kg ve všech vyšetřených vzorcích. Ve

VŠCHT PRAHA

17

vzorcích pšenice bylo obsaženo 7% D3G z celkového množství DON a v kukuřici 10% z celkového množství DON63.

4. Vliv primárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů Obsah mykotoxinů v zemědělských komoditách je možné ovlivnit řadou faktorů. Důležité je předcházet jejich vzniku již v průběhu pěstování obilovin na poli, tzn. zamezit napadení mikromycety. Je třeba dodržovat správné zásady při pěstování, skladování a transportu plodin. Hlavní faktory ovlivňující napadení fusarii ukazuje Obr. 15.

Lokalita Pořadí plodin v jednotlivýc h letech

Ekologie/druh fusaria, ostatní mikroflora

Enviromentální podmínky

Klimatické podmínky Fungicidy

Vlhkost a teplota

Fyziologický stav rostliny

Infekce

Produkce mykotoxinů

před sklizní

Obsah vlhkosti při žních – aktivita vody ve

sklizeň

Režim sušení Okolní sušení Teplota sušícího vzduchu

Typ skladovánímanagement

Hygiena skladování po sklizni

Obr. 15: Faktory ovlivňující napadení fusarii Primární podmínky ovlivňující obsah mykotoxinů se dělí na předsklizňové, podmínky v období sklizně a posklizňové podmínky. Dnes je do zemědělské praxe zaváděn systém HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point). V rámci HACCP se určí podmínky, které je třeba kontrolovat a udržovat v určitém rozmezí po celou dobu pěstování a skladování53.

1.5 Podmínky ovlivňující předsklizňové období 1.5.1 Přírodní faktory Hlavním faktorem ovlivňujícím napadení plodin fusarii a rozvoj FHB jsou klimatické podmínky, které hrají velkou roli ve všech vývojových stádiích mikromycet. Vlhkost vzduchu

VŠCHT PRAHA

18

určuje kritičnost a intenzitu nemoci. Dešťové srážky a intenzita záření mají vliv na množství inokulů (počet spor na 1 klas). Mírné teploty a vysoká vlhkost v zimním období zajistí přežití velkého množství spor v posklizňových zbytcích plodin – fusaria jsou schopny sporulace, díky tomu přežijí i podmínky ne pro ně optimální. Jarní klimatické podmínky určují jaký typ a kvalitu spor budou fusaria produkovat, dobu jejich rozšíření a intenzitu napadení. Počátek kritické fáze infekce rostlin nastává tehdy, pokud se doba kvetení plodin shoduje s dobou rozšiřování spor. U propuknutí FHB záleží na virulenci druhu, na rezistenci rostlin, na přítomnosti a konkurenci dalších patogenních druhů aj. V letním období dochází k prorůstání mycelia rostlinou a případné produkci mykotoxinů4.

1.5.1.1 Polní management – techniky pěstování Polní management zahrnuje tzv. správnou zemědělskou praxi (GAP), která zahrnuje střídání plodin na jednom poli, správné ošetření půdy po sklizni a před novou setbou, systém zavlažování, dobu a hustotu setí, aplikaci umělých hnojiv a použití pesticidů4.

Střídání plodin Na napadení úrody má velký vliv předplodina (plodina pěstována v minulém období). Vliv střídání plodin je stále předmětem výzkumu. K dosažení potřebného efektu je důležité časté střídání plodin, dále také znalost odolnosti (rezistence) předplodiny vůči původci mykotoxinové kontaminace, frekvence pěstování dané plodiny a množství zbytků plodin po sklizni na poli. Nejvýhodnější je zavést do cyklu střídání plodin rostliny, které nejsou vhodným substrátem pro mikroskopické vláknité houby. Cukrová řepa snižuje výskyt FHB v následujícím roce o 50 %. Po vojtěšce se výskyt nemoci neprokázal. Jako „čistící plodina“ se využívá len. Luštěniny, např. sója, se jeví také jako vhodná předplodina. Po sóji zůstává na poli jen málo odpadu a je vhodným substrátem spíše pro Fusarium sporotrichioides, tento druh obiloviny příliš nenapadá4. Za velice nevhodnou předplodinu je považována kukuřice. Plodina pěstována v následujícím roce po kukuřici bývá více napadena fusarii a následná produkce mykotoxinů je vyšší, než po jiných předplodinách. Organických zbytků po kukuřici je značné množství a bývá napadena nejčastěji druhem Fusarium graminearum. Použití ječmene jako předplodiny dokonce zdvojnásobí množství inokulů v půdě4.

VŠCHT PRAHA

19

Obsah DON v pšenici pěstované po sóji se sníží o 25 % oproti pšenici pěstované po pšenici a o 49 % oproti pšenici pěstované po kukuřici. Pšenice pěstována po kukuřici má obsah deoxynivalenolu šestkrát větší než stejná pšenice zaseta po jiné předplodině4.

Zpracování půdy Způsob orby má řadu přímých a nepřímých efektů na strukturu a mikroklima půdního ekosystému a tím rovněž na rozvoj mikroskopických vláknitých hub, zejména rodu Fusarium. Hluboká orba snižuje výskyt inokulů fusarií, zatímco plýtká orba má opačný efekt. Téměř 90 % Fusarium roseum se vyskytuje 10cm pod povrchem půdy. Rozvoj tohoto druhu fusaria závisí na přístupu kyslíku. Ačkoli se tento patogen může nacházet až 25cm pod povrchem půdy, virulentní je pouze v hloubce 5cm. Rozšíření Fusarium roseum závisí také na množství a dostupnosti rostlinného substrátu. Proto snížení množství odumřelých rostlin na povrchu půdy vede k redukci množství inokulů v půdě4.

Systém zavlažování Zavlažování pole ovlivňuje jeho mikroklimatické podmínky a může přispět k rozvoji patogenních organismů. U zavlažovaných polí je frekvence a intenzita FHB větší než u nezavlažovaných polí4.

Obsah minerálních látek v půdě Podíl minerálních látek na napadení fusarii je stále nejasný. Aplikace dusíkatých hnojiv podporuje růst rostlin, takže se zvětšuje hustota porostu, který udržuje určité mikroklima a tím i rozvoj různých nemocí rostlin včetně FHB. Dusíkatá hnojiva významně zvyšují incidenci fusariové infekce na pšenici, ječmeni a triticale4. Bylo prokázáno, že použití dusíkatých hnojiv snižuje výskyt nemoci v prvním roce, avšak v druhém roce toto snížení již nebylo prokázáno4. Na druhou stranu bylo zjištěno, že úroveň výskytu FHB při přítomnosti i absenci 140 kg/ha dusičnanu amonného je stejná54. Odlišné formy dusíku v umělých hnojivech mají rozdílný efekt. Močovina redukuje výskyt FHB více než amoniak. Dosud nebyla vysvětlena příčina tohoto faktu, jde pouze o hypotézy. Aplikace hnojiv obsahujících fosfor má stejné účinky jako ošetření dusíkatými hnojivy4. Použití draselných hnojiv snižuje transpiraci pomocí průduchů, a tím napomáhá ke snížení vzdušné vlhkosti. Hnojiva obsahující draslík podstatně snižují klíčení spor. Kromě toho vysoké hladiny draslíku podporují syntézu vysokomolekulárních látek např. celulózy, snižují dostupnost nutricientů patogenům a zvyšují mechanickou rezistenci vůči penetraci parazitů4.

VŠCHT PRAHA

20

Plán setby Doba setí je také součástí polního managementu, ale na možnou infekci má pouze nepřímý vliv. Setbu je potřeba naplánovat tak, aby se doba kvetení neshodovala s dobou rozšiřování spor. Ranné kultivary jsou více rezistentní vůči FHB než kultivary zrající později. Trvání růstové periody u pšenice má významný pozitivní efekt: u delšího cyklu růstu byl zaznamenán nižší stupeň kontaminace. Tento efekt však nebyl pozorován u ječmene a ovsa. Pro určení optimální doby setí je důležitá oblast pěstování, klimatické podmínky a výběr plodiny. Správná kombinace těchto tří faktorů je však neustále předmětem výzkumu4.

Hustota porostu Jestliže jsou inokula primárně přenášena deštěm je hustota porostu velice důležitým faktorem, který může tvořit překážku na cestě jejich rozšiřování. Vysokou hustotu porostu zajišťuje aplikace dusíkatých hnojiv, vysoká hustota setí a malé mezery mezi jednotlivými řadami rostlin. V tomto případě byly pozorovány dva protikladné efekty: •

zvýšení vlhkosti a tím rašení spor

•

vytvoření překážek při vertikálním šíření spor4

Chemické ošetření plodin Efektivnost fungicidních přípravků je různá a obtížně předpověditelná. Účinnost fungicidu závisí na typu fungicidu, přesné dávce, době aplikace, klimatických podmínkách a fyziologickém stavu rostliny.

1.5.2 Podmínky ovlivňující období sklizně V průběhu sklizně je velmi důležitým faktorem vlhkost. Dostupná voda je limitujícím faktorem pro život fusarií. Aktivita vody vyšší než 0,65 je dostačující k udržení jejich metabolismu. Udává se, že vlhkost zrna okolo 15 % postačuje k přežití. Proto jsou kombajny vybaveny vlhkostním analyzérem, který spouští vzdušnou regulaci, při překročení určité vlhkosti11. Dále je třeba zamezit kontaktu zdravé obiloviny s půdou, kde se nacházejí spory mikroorganismů, z toho důvodu se u kombajnů nastavuje výška sečení11.

1.5.3 Podmínky ovlivňující posklizňové období Po sklizni je důležité oddělení scvrklých a jinak narušených zrn od zdravým, aby se eliminovala možnost přenesení mikroskopických vláknitých hub na zdravou úrodu. V některých případech je úroda ponechána po sklizni nějakou dobu na poli ve sběrných nádobách, což VŠCHT PRAHA

21

zvyšuje pravděpodobnost kontaminace mykotoxiny. Při skladování je důležitý vhodný systém sušení a provzdušňování zrn (Obr. 16) 11.

Mokrá zrna

Sušící se zrna Suchá zrna vhánění vzduchu Obr. 16: Schéma sušení zrn v silech při provzdušňování Kromě vlhkosti je potřeba také při skladování udržovat stejnou teplotu jako během sklizně v centru sila. Samotná zrna jsou dobrým izolátorem. Zrna nacházející se poblíž stěny sila chladnou rychleji než zrna v jeho centru, což způsobuje klesající teplotu uvnitř sila. Mokrá zrna tak mohou být dobrým substrátem pro mikroorganismy. Proto je nezbytné při skladování kombinovat chladící a sušící operace spojené s provzdušňováním. Při skladování hraje hmyz velkou roli, protože narušuje vnější obaly zrn, a tím se stávají náchylnějšími vůči mikroorganismům. V průběhu skladování se aplikují některé ochranné chemické prostředky. Řada studií ukazuje, že použití antioxidantů jako jsou butylhydroxyanisol (BHA), parabeny, skořicová silice nebo resveratol snižuje akumulaci DON a NIV až o 90 %53.

5. Vliv sekundárního zpracování plodin na obsah fusariových mykotoxinů Tvorbě mykotoxinů v zemědělských produktech nelze v průběhu pěstování zcela zabránit, proto je snaha o snižování jejich obsahu v průběhu technologických zpracování, aby výsledná expozice člověka byla minimální55.

VŠCHT PRAHA

22

1.6 Čištění a třídění zrn Obiloviny určené k lidské výživě je třeba před dalším zpracováním očistit. Čištěním se odstraní sláma, prach a také poškozená zrna. Jednotlivé operace třídícího procesu jsou založeny na několika fyzikálních principech – rozměrové třídění na sítech a triérech, aerodynamické třídění, třídění na základě rozdílné hustoty zrna a nečistot. K třídění se používá např. odkaménkovač. Tento stroj odděluje od sebe částice přibližně stejné velikosti jako obilné zrno, ale rozdílnou hustotou. K odstranění zrn stejné hmotnosti a hustoty jako obilné zrno, ale odlišného tvaru slouží soustava strojů nazývaných triéry. Dalším krokem je kartáčování a loupání56. Po vytřídění hrubě kontaminovaných zrn se snížil obsah DON o 74 %. Mnohá kontaminovaná zrna jsou téměř k nerozeznání od zdravých zrn, takže rutinními třídícími operacemi dochází pouze k 20 % snížení obsahu trichothecenů57. Čištění nemá téměř žádný vliv na snížení hladiny DON v cereáliích. U ZON byl pozorován úbytek přibližně o 30 %55.

1.6.1 Mletí Mletí je složitým procesem řady základních technologických uzlů označovaných jako mlecí chody neboli pasáže, které sestávají z drcení a následného třídění rozemletého produktu. Technologie mletí se podle provedení dělí do dvou kategorií – suché mletí a mokré mletí56.

1.6.1.1 Složení obilného zrna Obilné zrno se skládá ze tří základních částí: •

obalových vrstev

•

klíčku

•

endospermu

Obalové vrstvy chrání obilku před vnějšími vlivy, v mlýnské technologii se nazývají otruby. Jsou složeny z nerozpustných sacharidů typu celulosy s velkou mechanickou pevností. Z hlediska pekárenské technologie mají tyto složky negativní účinek na kvalitu a zpracovatelnost těsta. Klíček je vlastním zárodkem nové rostliny a nositelem genetických informací. Při mlýnském zpracování je oddělován. Endosperm (vnitřní obsah zrna) představuje největší podíl zrna a je technologicky nejvýznamnější částí. Pšeničná mouka je čistý rozdrcený endosperm, kdežto do žitné mouky se

VŠCHT PRAHA

23

dostává více obalových vrstev. Až tři čtvrtiny endospermu tvoří škrob. Na kvalitu pekařského těsta mají vliv také bílkoviny, které tvoří přibližně 10 % endospermu56.

1.6.1.2 Suché mletí Při mletí dochází k dezintegraci materiálu a následným roztříděním rozemletého produktu. Proces mletí pšenice dělíme do tří základních etap: •

šrotování

•

luštění krupic

•

vymílání

Při šrotování dochází k šetrnému otevření zrna, k oddělení endospermu od obalových vrstev v hrubších částicích (krupice). Luštění krupic zahrnuje drcení vytříděných a vyčištěných krupic. Vymílací částí procesu se drtí částice čistého endospermu na požadovanou granulaci. Mletím se získají čtyři druhy produktů: mouka, klíčky, otruby a krmný šrot. Mnoho studií ukázalo, že největší koncentrace trichothecenů byly nalezeny v otrubách a krmném šrotu, nižší koncentrace byly ve vymleté mouce. Distribuce DON v jednotlivých frakcích získaných mletím závisí na stupni penetrace fusarií do endospermu. Jestliže je penetrace nízká, můžeme nalézt vysoké koncentrace DON na povrchu zrna – v otrubách a snížený obsah ve finální pšeničné mouce. Pšeničná mouka obsahuje poloviční množství, zatímco otruby dvakrát větší množství DON než původní zrno. Distribuci DON v jednotlivých frakcích získaných při mletí ukazuje Tab. 357. Tab. 3: Distribuce DON v jednotlivých produktech získaných mletím produkt pšenice mouka otruby lepek

obsah µg/kg 1928 994 4680 293

1.6.1.3 Mokré mletí Technologie mokrého mletí se využívá při zpracování kukuřice, kde hlavními produkty jsou kukuřičná krupice a glukosový sirup. Trichotheceny jsou rozpustné ve vodě a proto přecházejí do vodné frakce a částečně do škrobové frakce. Např. T-2 přechází do vody ze 66 %. Do frakce obsahující škrob přechází mykotoxiny vzájemnou kontaminaci s vodní frakcí. DON přechází do škrobové frakce ze 30 %. Distribuce DON v jednotlivých frakcích získaných při mletí kukuřice je znázorněna na Obr. 1757. Opačná situace je u relativně nepolárního ZON, kdy nejnižší koncentrace se nacházejí ve vodné části a nejvyšší v pevné frakci. VŠCHT PRAHA

24

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% škrob

máčená kukuřice

lepek

klíčky

Obr. 17: Distribuce DON v jednotlivých frakcích získaných při mletí kukuřice

1.6.2 Pekárenství Jednou z charakteristik výroby pečiva je postup nakypření těsta za účelem vytvoření struktury charakteru tuhé pěny, která umožňuje poživatelnost výrobků. K nakypření se používá tří způsobů: •

biologického – fermentace vyvolaná kvasinkami Saccharomyces cerevisiae

•

chemického – použití kypřících prášků

•

mechanického nebo termického – šlehání, expandování za vysokého přetlaku atd.56

Celkové technologické postupy mají velmi podobné schéma, ale detailní podmínky postupu se v jednotlivých zemích zásadně liší (např. intenzita hnětení, podmínky fermentace, použití aditivních látek), což se samozřejmě projevuje v tom, že řada studií sledujících vliv těchto technologií na obsah mykotoxinů uvádí značně rozdílné výsledky57. V této oblasti byla provedena řada studií, které měly velice rozdílné výsledky (Tab. 4).

VŠCHT PRAHA

25

Tab. 4: Shrnutí studií zabývajících se vlivem pečení na obsah DON ve finálních produktech studie počáteční podmínky % zbylého DON, koncentrace DON a zpracování mouka=100% zdroje Egyptský chléb - fermentace 75 115 2000 μg/kg (spike) (El-Banna, 1983) min 3300 μg/kg - pečení 350°C, 2 (přírodní) min Kanada: pečení chleba přírodně - fermentace 80 102 (Scott, 1983, 1984) kontaminované min 107 4100 μg/kg pečení 205°C, 30 1000 – 6800 μg/kg min Kanada: pečení bez mouka na sušenky koblihy 42 použití kvasinek koláč 61 330 μg/kg (Young, 1984) sušenky 66 mouka na koláče 290 μg/kg US (Seitz, 1986) - fermentace 53-64 220 – 3200 μg/kg 30°C, 1,5 – 2h (220 μg/kg) US (Boyaciouglu, 1993) 2900 μg/kg

-

Argentina: 1370 μg/kg (Neira,1997;Samar,2001) 15000 μg/kg

-

fermentace 30°C, 3h pečení 220°C, 20 min

93 (bez aditiv)

fermentace 25°C, 5-11h fermentace 30 – 50°C, 1,5 – 2h

78,4 44 (Vídeňský chléb) 59 (Francouzský chléb)

Ve studii J. C. Younga byl pozorován vliv kvasinek na obsah DON. Prokázalo se, že u finálních produktů vyráběných z těst obsahujících kvasinky se zvýšila hladina DON57. Tento jev je přičítán enzymatické konverzi jeho prekurzorů. Řada jiných vědeckých prací naopak tvrdí, že při fermentaci dochází až k 40 % snížení hladiny DON57. Pozorováním účinků aditivních látek na obsah DON, bylo zjištěno, že kyselina askorbová a bromid draselný nemá na obsah DON žádný vliv, kdežto přídavek cysteinu nebo fosforečnanu amonného snižuje jeho obsah až o 40 %55. Výskyt mykotoxinů v pečivu závisí na kvalitě surovin a použité technologii. V Argentině byl sledován výskyt DON v pšeničném chlebě a sladkém pečivu, Kanadě v pšeničných výrobcích, v USA byly kontrolovány hladiny DON v pšeničných a ovesných VŠCHT PRAHA

26

výrobcích. V Německu byla studie zaměřena na pečivo vyrobené v pekárnách supermarketů. Výsledky výzkumu shrnuje Tab. 558. Tab. 5: Hladiny DON nalezeny v pekařských výrobcích stát % kontaminovaných vzorků Argentina 92,8 Kanada 43 USA ∗ Německo ∗

hladina DON μg/kg 200-2800 9-4060 1600-5400 92

∗neuvedeno

Jiná studie výskytu trichothecenů v pečivu byla provedena v Německu v okolí Stutgartu. Vzorky byly odebrány z pečiva (různých druhů chlebů) lokálních pekařských podniků. Cílem výzkumu bylo rovněž porovnání výskytu trichotecenů v jednotlivých typech chlebů vyrobených ze surovin produkovaných konvenčním zemědělstvím a z biosurovin (Tab. 6)58. Obsah DON v základních surovinách produkovaných konvenčním a bio-zemědělstvím se téměř neliší, tudíž rozdíly hladin DON v konvenčním chlebě a biochlebě jsou dány odlišnou technologií výroby. Při výrobě bio-chleba se nepoužívají aditivní látky13. Tab. 6:Porovnání hladin DON konvenčního a bio-chlebu typ chleba % pozitivních nálezů 1 rýžový chléb konvenční chléb 80 bio-chléb 75 míchaný rýžový2 konvenční chléb 100 bio-chléb 86 míchaný pšeničný3 konvenční chléb 96 bio-chléb 75 pšeničný chléb4 konvenční chléb 100 bio-chléb 100

hladina DON μg/kg

1 obsahuje > 90% rýže

59 18 155 71 280 47 167 116

2 obsahuje 51-89% rýže 3 obsahuje 50-89% pšenice 4 obsahuje > 90% pšenice

1.6.3 Extrudované výrobky Extruzí se získávají různé polotovary na obilném základě, které se dále upravují smažením nebo jiným způsobem na finální produkty. Je to složitý proces, při kterém se syrový materiál za vysokých tlaků a teplot stlačuje a jinak upravuje. Touto technologií se vyrábí cereální snídaně, lahůdky, snacky a krmivo pro psy a kočky56.

VŠCHT PRAHA

27

Ačkoliv vysoká teplota a tlak může značně degradovat mykotoxiny, jejich efekt na snížení kontaminace je minimální, doba extruze je příliš krátká55. Práce C. E. Wolf-Halla demonstrovala na vzorcích extrudovaných výrobků s přídavkem DON jeho inertnost vůči působení vyšších teplot a tlaku. V páře autoklávu došlo k redukci DON o 12 %57. U ZON došlo k redukci o 65-85 %, ztráty byly vyšší při teplotě 120oC než při 180oC55.

1.6.4 Sladařství a pivovarnictví

1.6.4.1 Výroba sladu Pro výrobu sladu jsou základními surovinami ječmen a voda. Na základě technologických zkoušek a hospodářských výsledků jsou u nás pěstovány především odrůdy jarních sladovnických ječmenů Akcent, Amulet, Kompakt, Krona a Olbram. Cílem sladování je vyrobit řízeným procesem klíčení a hvozdění z ječmene slad, obsahující potřebné enzymy, barviva a aromatické látky nezbytné pro výrobu určeného druhu piva. Schéma výroby sladu znázorňuje Obr. 1859. Příjem, čištění a skladování ječmene Máčení ječmene Klíčení ječmene

Hvozdění zeleného sladu Odklíčení, leštění, balení, expedice sladu Obr. 18: Schéma výroby sladu

VŠCHT PRAHA

28

Při příjmu se ječmen třídí podle odrůdy a jakosti. Odstraňují se také mechanické nečistoty. Vyčištěný a vytříděný ječmen se skladuje v silech. Sila jsou vybavena pneumatickou dopravou, provzdušňovacím zařízením, popř. zařízením na ničení škůdců59. Cílem máčení je zvýšení obsahu vody v ječném zrnu z 12-15 % na 42-48 %. Dosažení obsahu vegetační vody je nezbytné pro enzymové pochody zajišťující optimální průběh sladařského klíčení. Dosažený obsah vody v namočeném ječmeni se nazývá stupeň domočení a liší se podle typu vyráběného sladu59. Klíčením se aktivují enzymy a dosáhne se požadovaného stupně rozluštění modelováním podmínek přirozeného klíčení vhodnou teplotou, vláhou a přístupem kyslíku. Řízení klíčení ječmene ve sladovně se nazývá vedení hromad, liší se podle druhu vyráběného sladu a kvality zpracovávaného ječmene. Konečným produktem klíčení je zelený slad, který se dále zpracovává hvozděním59. Hvozděním se snižuje obsah vody pod 4 %, čímž se zastaví vegetační pochody při zachování požadované enzymové aktivity a vytvoření chuťových, barevných a oxidoredukčních látek tvořících charakter sladu59.

1.6.4.2 Výroba piva Pivovarnictví je potravinářské průmyslové odvětví zabývající se výrobou piva, která se dělí do tří výrobních úseků (Obr. 19), zahrnujících řadu složitých mechanických, fyzikálně-chemických a biochemických procesů. Výroba mladiny

Kvašení mladiny a dokvašování mladého piva Závěrečné úpravy a stáčení zralého piva Obr. 19: Schéma výroby piva Výroba mladiny sestává z následujících technologických operací: •

šrotování sladu

•

vystírání sladového šrotu do vody

•

rmutování

VŠCHT PRAHA

29

•

scezování sladiny a vyslazování sladového mláta

•

chmelovaru a závěrečných úprav mladiny

Tyto operace probíhají při různých teplotách v rozmezí 35-78oC, při nichž dochází mnoha enzymovým reakcím včetně rozkladu škrobu na monosacharidy. Pro kvašení mladiny se používají svrchní pivovarské kvasinky (Saccharomyces cerevisie) kvasící při teplotách 24oC nebo spodní pivovarské kvasinky (Saccharomyces cerevisie var. uvarum) při teplotách kvašení 6-12oC. Kvašení trvá většinou 6-10 dní, přičemž závisí na druhu piva. Dokvašování a zrání mladého piva probíhá v ležáckém sklepě, kdy pivo při teplotách 1-3oC pozvolna dokvašuje, čiří se, zraje a sytí pod tlakem oxidu uhličitého v uzavřených ležáckých tancích. Doba ležení je závislá na typu piva. U běžných piv, u kterých nepřesahuje koncentrace ethanolu 10% bývá 3 týdny, pro speciální exportní piva se zvyšuje až na několik měsíců59. Po dokvašení se pivo zbavuje zbytků mikroorganismů filtrací, pasteruje se při 62oC a stáčí do cisteren, sudů, lahví nebo plechovek59.

1.6.5 Vliv

sladařství

a

pivovarnictví

na

obsah

fusariových

mykotoxinů Změny obsahu mykotoxinů v jednotlivých krocích sladování a kvašení piva jsou shrnuty v Tab. 7 a Tab. 857. U ZON došlo v průběhu kvašení k metabolické přeměně na α-ZEA a β-ZEA55. Vliv sladařství a pivovarnictví na obsah mykotoxinů je předmětem výzkumu a v této oblasti se dosahuje stále nových poznatků. Tab. 7: Změny obsahu trichothecenů při sladování tech. operace změna obsahu trichthecenů příčina máčení snížení obsahu DON vyluhování ve vodě podmínky klíčení mohou podnítit růst fusarií a klíčení zvýšení obsahu DON produkci toxinů

VŠCHT PRAHA

30

Tab. 8: Změny obsahu trichothecenů při vaření piva tech. operace změna obsahu trichthecenů příčina enzymatické uvolnění vázaného DON z rmutování 4 x zvýšení hladiny DON proteinů ∗ na přítomnost TT má vliv varianta použitých kvasinek. V prvních 20 hod. se hladina DON zvýšení způsobil vznik DON z metabolických zvýšila, potom následovalo prekursorů,snížení je přičítáno degradací DON kvasinkami nebo jeho navázání na kvasinky fermentace snížení ∗ TT - trichotheceny

Hladiny DON v pivu se v jednotlivých zemích pohybují v různém rozmezí (Tab. 9). Největší nálezy DON byly objeveny v německém pivu60. Tab. 9:Hladiny DON v pivu ve vybraných státech stát celkový počet kontaminované analyzovaných vzorky vzorků Nizozemí 51 3 Kanada 50 29 Německo ∗ ∗ Korea 54 14 ∗neuvedeno

hladina DON μg/kg 26-41 0,3-50,3 569 ∗

6. Analytické metody stanovení Maskované formy mykotoxinů jsou polárnější než jejich volné prekurzory a nejsou pro ně komerčně dostupné analytické standardy. Z těchto důvodů unikají rutinní analytické kontrole. Výjimkou je D3G, jehož standard je v současné době již běžně komerčně dostupný s a proto je jediným maskovaným mykotoxinem, který lze rutinně analyzovat spolu s volnými mykotoxiny multidetekčními analytickými metodami. Na Ústavu chemie a analýzy potravin Vysoké školy chemicko-technologické v Praze byla vyvinuta a validována analytická metoda pro stanovení mykotoxinů v cereáliích, která byla akreditována Českým institutem pro akreditaci (ČIA) dle ISO 17025. Používaná analytická metoda spočívá v extrakci homogenizovaného vzorku směsí acetonitril:voda (84:16,v/v) po dobu 1 hodiny na třepačce, následuje fitrace, přečištění vzorku přes SPE kolonku MycoSep®226. SPE je hojně používaná čistící technika využívající obchodně dostupné kolonky či náplně na jedno použití. Je to rychlá metoda, která nahrazuje kolonovou chromatografii a extrakci kapaliny kapalinou (LLE). Odstranění

VŠCHT PRAHA

31

nečistot ze vzorku trvá přibližně 10 sekund. Multifunkční filtr tvoří náplň kolonky obsahující ve vrstvách aktivní uhlí, iontoměniče, křemelinu a oxid hlinitý mezi dvěma filtry.61 Po přečištění jsou 4ml alikvotu odpařeny na rotační vakuové odparce. Odparek je rozpuštěn v 2krát 500μl směsi methanol:voda (50:50,v/v). Identifikace a kvantifikace je prováděna pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií typu iontová past. Schéma analytické metody shrnuje Obr. 20. Pro účely analýzy maskovaného mykotoxinu D3G je však v krok přečištění přes SPE kolonku MycoSep®226 vynechán z důvodu jeho nízké výtěžnosti způsobené jeho afinitou k sorbetu kolonky.

EXTRAKCE acetonitril:voda (84:16,v/v)

PŘEČIŠTĚNÍ EXTRAKTU SPE kolonky MycoSep 226

PŘEVEDENÍ DO MOBILNÍ FÁZE methanol:voda (50:50,v/v)

IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE

LC-MS/MS Obr. 20: Schéma akreditované analytické metody pro stanovení mykotoxinů v cereáliích Při stanovení mykotoxinů v pivu bylo využito přečištění pomocí celitu, který D3G nesorbuje (viz Obr. 21).

VŠCHT PRAHA

32

EXTRAKCE acetonitril+celit

PŘEVEDENÍ DO MOBILNÍ FÁZE methanol:voda (50:50,v/v)

IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE

LC-MS/MS Obr. 21: Schéma analytické metody pro stanovení mykotoxinů v pivu Velmi užitečnou technikou pro přečištění vzorků při stanovení mykotoxinu je imunoafinitní chromatografie, která zaručuje rychlé přečištění vzorku založené na specifické interakci mykotoxinu s protilátkou navázanou na organickém nosiči, následném promytí nečistot a eluci mykotoxinu. Mykotoxiny jsou obvykle eluovány methanolem nebo acetonitrilem. V současné době jsou komerčně dostupné kolonky pouze pro některé fusariotoxiny (DON, T-2, ZON) a každá kolonky je určena k separaci jediného mykotoxinu. Imunoafinitní kolonky Donprep® však umožňují vedle DON (pro který jsou určeny) také stanovení D3G. Obsažené protilátky totiž s maskovaným mykotoxinem D3G křížově reagují. Použití těchto kolonek umožňuje tedy dokonalé odstranění matrice a zároveň zakoncentrování DON a D3G ve vzorku. Na Obr. 22 a 23 jsou uvedeny ukázky chromatogramu směsného standardu mykotoxinů LC-MS/MS metody.

VŠCHT PRAHA

33

C:\Documents and Settings\...\s ts d500

05/08/2008 00:29:28

RT: 0.00 - 21.99 SM: 15B NL: 6.12E7 TIC MS s ts d500

13.49

100 95

T-2

90 85 80 75 70

FUS-X

65

Relative Abundance

60

HT-2

7.25

55

12.22 50

DON D3G

45

NIV

40

3.90

35

5.75

30 25

ADONs

20

ZON

8.91

15 10

5.95

5 0.88

0 0

6.14

1.60 2.16 2.77

1

2

3

4

5

6

9.37

8.07 7

8

9

11.14 11.79 10

11 Time (min)

14.33 12

13

14

15.91 15.48

15

16.36

16

17.98 18.41

17

18

19.77

19

20

21.23 21

Obr. 22: Chromatografický záznam směsného standardu na hladině 500 ng/ml C:\Documents and Settings\...\stsd500

05/08/2008 00:29:28

RT: 0.00 - 21.99 SM: 15B

7.25

50

3.90 0.88

0 100

2.16 2.77

TIC

12.22

5.75 4.92

6.76

8.07

8.91

15.48 15.91 16.36

10.10 11.22 11.79

17.98 18.41

19.77

21.23 NL: 2.22E7

3.90

TIC F: - c APCI SRM ms2 [email protected] [ 280.50-281.50, 310.50-311.50] MS stsd500

NIV

50 0.88

0 100

2.16 2.77

NL: 2.66E7 TIC F: - c APCI SRM ms2 [email protected] [ 264.50-265.50, 294.50-295.50] MS stsd500 NL: 1.21E7 TIC F: - c APCI SRM ms2 [email protected] [ 426.50-427.50, 456.50-457.50] MS stsd500 NL: 3.33E7

5.78

DON

50

Relative Abundance

NL: 6.12E7 TIC MS stsd500

13.49

100

4.72

0 100

5.59

D3G

50 4.98

0

7.25

100

TIC F: - c APCI SRM ms2 [email protected] [ 262.50-263.50, 352.30-353.30] MS stsd500

FUS-X

50 6.76

0 100

8.91

NL: 8.59E6 TIC F: - c APCI SRM ms2 [email protected] [ 306.50-307.50, 336.50-337.50] MS stsd500 NL: 3.14E7 TIC F: + c APCI SRM ms2 [email protected] [ 322.50-323.50, 424.30-425.30] MS stsd500 NL: 6.12E7

ADONs

50 7.76 8.07

0 100

12.22

HT-2

50 10.10 11.14 11.79

0 100

13.49

TIC F: + c APCI SRM ms2 [email protected] [ 244.50-245.50, 304.50-305.50] MS stsd500

T-2

50 12.99

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12 Time (min)

13

14.33 14

15

16

17

18

19

20

21

Obr. 23: Chromatografický záznam směsného standardu na hladině 500 ng/ml

VŠCHT PRAHA

34

7. Legislativa Maximální povolené limity vybraných fusariových mykotoxinů v potravinách jsou v České republice a Evropské unii stanoveny Nařízením komise (ES) č. 1126/2007 ze dne 28. září 2007, který upravuje nařízení (ES) č. 1881/200670. Toto nařízení stanovuje (i) maximální limity pro deoxynivalenol, zearalenon a fumonisiny v µg na 1 kg příslušné potraviny a (ii) tolerovatelné denní příjmy (TDI) těchto látek na 1kg tělesné hmotnosti. Maximální limity a TDI pro jednotlivé toxiny a potravinové komodity jsou souhrnně uvedeny v Tab. 10, 11, 12 a 13. Pro 3-ADON a 15-ADON není nutné zavádět zvláštní limity, jelikož jejich výskyt je většinou spojen s výskytem deoxynivalenolu, jehož TDI současně chrání konzumenty i před těmito dvěma mykotoxiny. Pokud jde o HT-2 a T-2 toxin, legislativa definující limity jejich obsahu v ovsu a ovesných výrobcích je stále pouze ve stadiu příprav (Vědecký výbor pro potraviny, Scientific Comittee on Food, zatím stanovil pouze hodnotu tolerovaného denního příjmu (TDI = 0,06 µg na kg tělesné váhy)). Připravované maximální povolené limity pro sumu T-2 a HT-2 toxinu jsou 100 µg/kg pro nezpracované obiloviny, 500 µg/kg pro nezpracovaný oves, 200 µg/kg pro ovesné výrobky a 50 µg/kg pro dětskou výživu. Konečné hodnoty by však měly vejít v platnost až v červnu 200968,69. Tab. 10: Maximální limity pro DON ve vybraných potravinách dle (ES) č. 1226/2007 Potravinové komodity Nezpracované obiloviny jiné než pšenice tvrdá, oves a kukuřice Nezpracovaná tvrdá pšenice a oves Nezpracovaná kukuřice, kromě nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím Obiloviny určené k přímé spotřebě, obilná mouka, otruby a klíčky ve formě konečného výrobku uváděného na trh pro přímou lidskou spotřebu kromě obilných příkrmů určených pro kojence a malé děti Těstoviny (v suchém stavu) Pečivo, jemné a trvanlivé pečivo, sušenky, svačinky z obilovin a snídaňové cereálie Obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti

Max. limit [µg/kg] 1250 1750 1750 750 750 500 200

Tab. 11: Maximální limity pro ZON ve vybraných potravinách dle (ES) č. 1226/2007 Potravinové komodity VŠCHT PRAHA

Max. limit [µg/kg] 35

Nezpracované cereálie jiné než kukuřice Nezpracovaná kukuřice kromě nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím Obiloviny určené k přímé spotřebě, obilná mouka, otruby a klíčky ve formě konečného výrobku uváděného na trh pro přímou lidskou spotřebu kromě kukuřice určené k přímé spotřebě, kukuřičných svačinek a snídaňových cereálií a obilných a kukuřičných příkrmů určených pro kojence a malé děti Rafinovaný kukuřičný olej Pečivo, jemné a trvanlivé pečivo, sušenky, svačinky z obilovin a snídaňové cereálie kromě svačinek z kukuřice a kukuřičných snídaňových cereálií Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě, svačinky z kukuřice a kukuřičné snídaňové cereálie Obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti Kukuřičné příkrmy pro kojence a malé děti

100 350 75 400 50 100 20 20

Tab. 12: Maximální limity pro fumonisiny ve vybraných potravinách dle (ES) č. 1226/2007 Max. limit [µg/kg]

Potravinové komodity Nezpracovaná kukuřice kromě nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě a kukuřičné potraviny k přímé lidské spotřebě kromě snídaňových cereálií, svačinek a příkrmů pro kojence a malé děti z kukuřice Kukuřičné snídaňové cereálie a svačinky z kukuřice Kukuřičné příkrmy a ostatní příkrmy pro kojence a malé děti

4000 1000 800 200

Tab. 13: TDI vybraných fusariových mykotoxinů dle (ES) č. 1226/2007 Mykotoxin Deoxynivalenol Zearalenon Fumonisiny Nivalenol Suma T-2 a HT-2 toxinu

TDI [µg/kg bw] 1 0,2 2* 0,7 * 0,06 **

* prozatimní TDI ** kombinovaný prozatimní TDI

VŠCHT PRAHA

36

8. Přílohy

Případová studie 1: Fusariové mykotoxiny a jejich konjugované formy v průběhu cereálních technologií – mlynárenství a pekařství Cereální výrobky tvoří důležitou součást potravního koše. Objasnění vlivu cereálních zpracovatelských technologií na konečný obsah fusariových mykotoxinů v potravinách je proto nezbytné pro stanovení limitů, které předepisují maximální množství těchto toxických látek v potravinách a krmivech a určují tolerovatelné denní příjmy (TDI) těchto látek pro člověka a zvířata. Většina dosud publikovaných studií byla zaměřena na fusariotoxin DON, často považovaný za marker kontaminace potravin a krmiv touto skupinou mykotoxinů. Studie uskutečněné na Ústavu chemie a analýzy potravin na VŠCHT Praha, zabývající se vlivem fermentačních technologií na obsah volných i konjugovaných mykotoxinů, prokázaly výskyt obou těchto forem v surovinách, meziproduktech i konečných výrobcích studovaných mlynárenských i pekařských technologií. Podle některých, již dříve uskutečněných, studií jsou finální hladiny DON v pečivu ovlivňovány především použitou surovinou, aditivy, enzymy, metabolickou aktivitou kvasinek a dalšími ději, které probíhají v těstě během zrání, kynutí a pečení. V rámci uvedené studie byl sledován vliv: •

mlynárenské technologie - analyzovány obsahy mykotoxinů v původním pšeničném zrnu, v jednotlivých mlýnských frakcích i v konečné hladké mouce a dalších moukách získaných v maloobchodní síti ČR

•

pekařské technologie – testován vliv hlavních technologických fází pekařského procesu, tedy zrání, kynutí a pečení na obsah mykotoxinů v konečných výrobcích, pozornost byla věnována také zlepšujícím pekařským přípravkům, které jsou v současnosti nepostradatelnou ingrediencí pekařských receptur, a o jejichž vlivu na obsah fusariových mykotoxinů v pečivu jsou informace pouze omezené Všechny testované vzorky byly analyzovány metodou LC-MS/MS, která je

v současnosti celosvětově uznávanou referenční metodou v oblasti kontroly fusariových mykotoxinů v potravinách. Další část experimentů byla zaměřena na porovnání výsledků získaných uvedenou metodou s výsledky získanými pomocí screeningových metod ELISA. VŠCHT PRAHA

37

MLYNÁRENSKÁ TECHNOLOGIE Vlastnímu procesu mletí sklizeného obilí předchází proces čištění, při kterém jsou odstraněny hrubé nečistoty (kaménky, semena plevelů, poškozené zrna, atd.) a prach od vlastního zrna určeného k mletí. Mletí zrna je složitý několika-fázový proces, jehož cílem je oddělit obalové části zrna od endospermu a dále endosperm rozmělnit na mouku o požadované hrubosti. Obilné zrno je nejprve drceno na válcových stolicích a získané hrubé částice se dále rozmělňují na válcích s hladkým povrchem dokud se nedosáhne požadované zrnitosti. V průběhu mletí je získáno několik druhů tzv. pasážních mouk (šrotovací a vymýlací), které se liší velikostí částic a složením, a odpad (otruby a klíčky. Na přítomnost mykotoxinu DON a jeho hlavní konjugované formy DON-3-glukosidu byly testovány vzorky pšenice, dodané Zemědělským výzkumným ústavem v Kroměříži. Jednalo se o dvě odrůdy, Ebi a Sulamit. Zrno pšenice bylo zpracováno na laboratorním mlýně a z každého mlecího pokusu bylo získáno celkem 13 dílčích frakcí – tři odpadní frakce (propad sítem, příměsi a nečistoty, prach po loupání), šest pasážních mouk (3 šrotovací mouky a 3 vymílací mouky), hrubý a jemný propad a z něho namleté mouky. Schéma procesu je uvedeno na Obr. 24.

PŠENICE

NEČISTOTY

PŘEČIŠTĚNÉ ZRNO

PRACH

3 ŠROTOVACÍ MOUKY

3 VYMÝLACÍ MOUKY

OTRUBY

Obr.24: Schéma procesu mlynárenství.

VŠCHT PRAHA

38

4000 Ebi

3500

Sulamit

DON (µg/kg)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Zrno

PS

Pr

ŠM1

ŠM2

ŠM3

VM1

VM2

VM3

HO

JO

MHO

MJO

Obr. 25: Obsahy DON v mlecích frakcích pšenic dvou odrůd (Ebi, Sulamit). (PS propad sítem, PR prach po loupání, ŠM šrotovací mouky, VM vymýlací mouky, HO hrubé otruby, JO jemné otruby, MHO mouka z HO, MJO mouka z JO).

300 Ebi

D3G (µ g/kg)

250

Sulamit

200 150 100 50 0 Zrno

PS

PR

ŠM1 ŠM2 ŠM3

VM1 VM2 VM3

HO

JO

MH

MJO

Obr. 26: Obsahy DON-3-glukosidu v mlecích frakcích pšenic dvou odrůd (Ebi, Sulamit). (PS propad sítem, PR prach po loupání, ŠM šrotovací mouky, VM vymýlací mouky, HO hrubé otruby, JO jemné otruby, MHO mouka z HO, MJO mouka z JO).

VŠCHT PRAHA

39

Na základě výsledků znázorněných na Obr. 25 a 26 je patrné, že v průběhu zpracování zrna dochází k nerovnoměrné distribuci obou analyzovaných forem mykotoxinů mezi jednotlivé frakce mletí. Nejvíce kontaminovány byly odpadní frakce, především prach po loupání, které byly od zrna odděleny již během čistícího procesu. Naopak nejnižší hladiny mykotoxinů byly zjištěny ve vymílacích moukách. Hygienický limit pro DON (1250 μg/kg) pro nezpracované obiloviny a 750 μg/kg pro obilné mouky pro přímou spotřebu daný nařízením komise (ES) č.1126/2007 nesplňuje pouze mouka z hrubých otrub semletá z pšenice Sulamit. Vedle vzorků z laboratorního mlecího experimentu byly analyzovány rovněž mouky různého typu (hladké, hrubé, pšeničné, žitné, pšeničné pro výrobu tmavého pečiva, multicereální, biomouky), které byly zakoupeny v maloobchodní síti České Republiky. Celkově bylo testováno 9 vzorků mouk, výsledky jsou graficky znázorněny na Obr. 27. Mykotoxin DON byl obsažen ve všech analyzovaných vzorcích, jeho průměrný obsah činil 58µg/kg a žádný výrobek nepřekročil stanovený hygienický limit 750µg/kg (EC 1126/2007). DON-3glukosid byl obsažen celkově v 7 vzorcích mouk, jeho průměrný obsah byl 7µg/kg. Celkově byly vyšší hladiny toxinů stanoveny ve vzorcích multicereálních nebo tmavých mouk, které obsahují větší množství obalových vrstev zrna. 140

DON

120

D3G

100 80 c(µg/kg)

60 40 20 0 Pšenice Pšenice Pšenice Pšenice Pšenice

Žito

Pšenice Multi- BIO m ix Tm avá cereální

Obr. 27: Obsahy DON a DON-3-glukosidu v různých typech mouk zakoupených v maloobchodní síti ČR.

VŠCHT PRAHA

40

PEKAŘSKÁ TECHNOLOGIE Další část práce byla zaměřena na sledování obsahů fusariových mykotoxinů v celozrnném pečivu a dynamiku jejich výskytu během výroby v závislosti na nastavení pekařských

pokusů.

Pozornost

byla

věnována

především

době

trvání

hlavních

technologických fází: (i) době zrání, (ii) době kynutí a (iii) době pečení. Základní receptura celozrnných výrobků byla ve všech experimentech stejná. Smícháním mlynárenských frakcí pšenice, které byly získány v rámci experimentů popsaných výše, byly připraveny celozrnné pšeničné mouky s různou mírou kontaminace fusariovými mykotoxiny. Pečivo bylo z každé mouky připraveno ve třech variantách, kdy proměnnými technologickými parametry experimentů byla doba zrání, kynutí a pečení. V obou analyzovaných moukách A(odrůda pšenice Ebi) i B (odrůda pšenice Sulamit) byl zjištěny obsahy fusariotoxinu DON i jeho dvou konjugovaných forem (ADONs a DON-3glukosid). Mykotoxiny NIV, Fus-X, HT-2, T-2 a ZON nebyly detekovány v žádném ze získaných vzorků pečiva.

Zrání těsta Prvním ze zkoumaných technologických parametrů byla doba zrání těsta. V praxi trvá proces zrání, při kterém v těstě probíhá alkoholové kvašení a začíná se vytvářet pórovitá struktura těsta, 15-30 min u drobného pšeničného pečiva, chleby se nechávají zrát až 1 hodinu. Pro naše pokusy byly zvoleny doby 30, 40 a 50 min. Výsledky analýz jsou zobrazeny na Obr 28. Obsahy sledovaných mykotoxinů ve vzorcích pečiva jsou přepočteny na jejich množství v původní mouce. Z výsledků je zřejmé, že ve srovnání s kontaminací mouky došlo po upečení vzorků ke snížení hladin všech forem DON. „Volný“ DON poklesl o 34 %, glukosylovaný DON o 50 % a suma ADONs o 49 %. Se zvyšující se dobou zrání těsta docházelo postupně k nárůstu obsahů volného DON a zároveň k poklesu konjugované formy tohoto analytu. Příčiny tohoto jevu realizované pokusy neumožňují objasnit. Maximální množství ADONs se objevilo v pečivu po 40-ti minutovém zrání. Jak v přirozeně tak v uměle kontaminované mouce zůstávaly poměry všech tří forem DON zachovány, a to přibližně 90:9:1 (DON:D3G:ADONs).

VŠCHT PRAHA

41

100 90 80 70 60 %

50 40 30 20 10 0

Flour

30

40

DON

50

Flour

30

40

D3G

50

Flour

30

40

50

ADONs

Obr. 28: Vliv délky zrání těsta na hladiny DON, D3G a ADONs (množství D3G přepočteno na množství volného DON) ve vzorcích celozrnného pečiva.

Kynutí těsta Dalším sledovaným technologickým parametrem byla doba kynutí těsta, což je doba mezi tvarováním výrobků a pečením. V praxi tato fáze trvá 25 až 50 min. Doba kynutí zvolená v rámci našich pokusů byla 40 a 50 min. Graf na Obr. 29 zobrazuje změny, ke kterým došlo během kynutí oproti mouce. V porovnání s moukou došlo k poklesu obsahu všech tří sledovaných fusariotoxinů, a to o 33, 48 a 49 % pro DON, D3G a ADONs. Ze získaných výsledků nelze určit obecně platný trend chování DON a jeho acetylovaných a konjugovaných forem v závislosti na délce kynutí. Poměry těchto látek v těstě zůstaly stejné jako u zrání těsta.

VŠCHT PRAHA

42

100 90 80 70 60 %

50 40 30 20 10 0

Flour

40

DON

50

Flour

40

D3G

50

Flour

40

50

ADONs

Obr. 29: Vliv délky kynutí těsta na hladiny DON, D3G a ADONs (množství D3G přepočteno na množství volného DON) ve vzorcích celozrnného pečiva.

Pečení Při pečení probíhá v těstě řada fyzikálně-chemických změn, které mají zásadní vliv na texturu a chuť finálního výrobku. Doba pečení drobného pečiva se v praxi pohybuje okolo 15 min. při teplotě 240°C, chléb se nechává péct až 1 hod při 220 °C. Pro naše pokusy byly zvoleny časy 10 a 20 min. a teplota 240 °C. Téměř ve všech případech se s prodlužující dobou pečení snižovaly i obsahy všech tří sledovaných forem DON, v průměru o 32, 49 a 47 % pro DON, D3G a ADONs. Poměry analytů zůstaly opět vzájemně zachovány. Graf výsledků je uveden na Obr. 30.

VŠCHT PRAHA

43

100 90 80 70 60 %

50 40 30 20 10 0

Flour

10

20

Flour

DON

10

20

D3G

Flour

10

20

ADONs

Obr. 30: Vliv doby pečení výrobků na hladiny DON, D3G a ADONs (množství D3G přepočteno na množství volného DON) ve vzorcích celozrnného pečiva.

Na základě naměřených dat lze souhrnně konstatovat, že celkové obsahy fusariových mykotoxinů jsou pekařskou technologií ovlivňovány. Ve srovnání s pekařskou surovinou, tedy celozrnnou moukou, je kontaminace výrobků nižší, a to průměrně o 33 % pro DON, 49% pro D3G a o 50 % pro ADONs. Z výsledků také vyplývá, že při uvedeném nastavení experimentů, kdy se vzájemně mění více technologických parametrů, nelze jednoznačně určit míru jejich působení na hladiny fusariových mykotoxinů.

Zlepšující pekařské přípravky Z porovnání hladin DON, D3G a sumy ADONs, které je zobrazeno na obrázku XXX je patrné, že ve vzorku, který byl připraven se ZPP došlo po fázi zrání k navýšení obsahu DON, které bylo bez ZPP pouze nepatrné. Výrazná změna nastala po následující fázi kynutí, kdy ve vzorku bez ZPP dochází k poklesu obsahu DON na polovinu původně přítomného množství, zatímco ve vzorku se ZPP k této změně prakticky vůbec nedochází. U vzorku bez ZPP po upečení nastává pouze malý nárůst hladiny DON, takže ve výsledném pečivu je přítomno 61 % jeho původního množství. Ve vzorku s ZPP poklesl DON po upečení o 9 %, na konečných 91 % původně přítomného množství. U sumy acetylovaných DON došlo ve vzorku bez zlepšujících přípravků během hnětení k nárůstu o 36 %. Během zrání došlo k dalšímu VŠCHT PRAHA

44

navýšení o 34 % na celkových 170 % původního množství. V průběhu kynutí však došlo k poklesu cca na množství původně přítomné v mouce. Během pečení nedochází už prakticky k žádné změně, takže ve výsledném výrobku došlo k nárůstu sumy ADONs o pouhých 7 %. Ve vzorku se zlepšujícím přípravkem došlo k poklesu obsahu ADONs po hnětení na cca 30 % původního množství. Během dalších fází se obsahy ADONs výrazně neměnily a v upečeném chlebu tedy byla přítomno necelých 40 % množství původně přítomného v mouce. U konjugované formy D3G nastal u vzorku s i bez ZPP v průběhu hnětení, zrání a kynutí pokles obsahu ve srovnání s původním množstvím v průměru o 30 %. Rozdíl mezi vzorky vznikl až po pečení, kdy ve chlebu se ZPP došlo k výraznému nárůstu obsahu D3G na konečných 142 % původního množství. U chleba připraveného bez ZPP došlo po kynutí jen k mírnému nárůstu, takže konečná hladina D3G byla ve srovnání s původním obsahem cca o 10 % nižší. Nárůst „volného“ DON zjištěný po přidání ZPP do těsta ve srovnání se vzorky, u kterých nebyl ZPP použit, může být pravděpodobně dán uvolněním tohoto mykotoxinu z jeho konjugovaných forem či z vazeb na cukerné složky vzorku.

180 160 140 120 100

%

80 60 40 20

bez ZPP

ZPP DON

bez ZPP

ZPP D3G

mouka hnětení zrání kynutí chléb

mouka hnětení zrání kynutí chléb

mouka hnětení zrání kynutí chléb

mouka hnětení zrání kynutí chléb

mouka hnětení zrání kynutí chléb

mouka hnětení zrání kynutí chléb

0

bez ZPP

ZPP ADONs

LC-MS/MS - extrakce H2O, s Imunokolonkou

Obr. 31: Srovnání hladin DON, D3G a ADONs ve vzorcích připravených z mouky Kroměříž s a bez použití zlepšujícího pekařského přípravku (ZPP)

VŠCHT PRAHA

45

Případová studie 2: Fusariové mykotoxiny a jejich konjugované formy v průběhu cereálních technologií – sladařství a pivovarství;

Cílem této studie bylo objasnění vlivu sladařských a pivovarských technologií na obsah fusariových mykotoxinů ve finálních produktech, a to nejen těch volných, ale i jejich konjugovaných forem, jejichž výskyt byl ve sladech a pivech již na Ústavu chemie a analýzy potravin prokázán již dříve.71 Ve spolupráci s Výzkumným ústavem pivovarsko-sladařským byla monitorována dynamika obsahu mykotoxinů během sladařské a pivovarské technologie, a to jednak metodou ELISA (pomocí kitu Ridascreen® DON, R-Biopharm) a jednak s využitím metody LC-MS/MS. Při výrobě sladů je ječmen nejprve máčen s cílem odstranit lehké nečistoty a zvýšit obsah vody v zrnu pro zahájení enzymatických reakcí a klíčení zrna. Z hlediska kvality budoucího sladu je máčení považováno za jeden z nejdůležitější kroků. Po máčení následuje krok klíčení, jehož cílem je aktivace enzymů, případně jejich syntéza pomocí fytohormonů, a takzvané „rozluštění zrna“, tj. štěpení buněčných stěn, škrobových zrn a bílkovin na jejich nízkomolekulární produkty. Závěrečnou fází výroby sladu je hvozdění, jehož prostřednictvim je naklíčený ječmen převeden na takzvaný zelený slad (prostřednictvím zvýšené teploty jsou zastaveny luštící pochody v zrně a vytvořeny barevné a aromatické látky pro slad charakteristické). Co se týká sladů světlých, je zelený slad na hvozdě nejprve předsušen při teplotách do 60°C a pak vyhřát a dotažen při 80 – 105 °C. Při výrobě sladů barevných je zelený slad nejprve zcukřen při teplotě 72°C a dále pak dotahován při vysokých teplotách od 120 – 180°C podle barvy požadovaného sladu. Na hvozdění pak navazuje odkličování, při němž se slad zbaví klíčků, kořínků a poškozených zrn. Co se týká pivovarství, do výroby vstupuje vyrobený slad, který je nejprve sešrotován, dále vystírán a rmutován, aby došlo k převedení škrobu a ostatních vysokomolekulárních látek do roztoku. Dále následuje zcezování a chmelovar. Analýzou meziproduktů sladařské technologie bylo zjištěno, že máčením se obsah mykotoxinů sníží, a to až na 50% původní hodnoty. Během klíčení zeleného sladu pak obsah mykotoxinů vzrůstá, pravděpodobně díky činnosti aktivovaných enzymů, které se podílejí na štěpení buněčných stěn a škrobových zrn a tím uvolňování mykotoxinů z vázaných forem. Míra nárůstu mykotoxinů během klíčení se však liší, záleží zde pravděpodobně na „zásobě“ VŠCHT PRAHA

46

vázaných mykotoxinů v konkrétní odrůdě. Po odklíčkování zeleného sladu hladina mykotoxinů opět mírně klesne (viz Obr. 32). V celkové bilanci obsahu mykotoxinů ve sladu dochází oproti původnímu ječmeni ke snížení hladin (viz Obr. 33). Co se týká výroby speciálních sladů, je zde potvrzen trend, že čím větší teplota dotahování je při výrobě použita, tím větší odezva je zaznamenána v ELISA (viz Obr. 34).

180

LC-MS

ELISA

klíčky

Ridascreen

DON

160

DON – 233 ng/g

DON-3-Glc

DON-3-Glc – 116 ng/g

140

ng/g

120 100 80 60 40 20 0 barle y

ječmen

s te e pe d

máčený ječmen barle y

gre e n zelený m alt

slad

m alt

slad

Obr. 32: Hladiny mykotoxinů v intermediátech výroby světlého sladu, LC-MS/MS vs. ELISA (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2007).

VŠCHT PRAHA

47

400 350 300

DON DON-3-Glc sum of DON

%

250 200 150 100 50 0

máčený steepedječmen barley

ječmen barley

zelený slad green malt

slad malt

Obr. 33: Dynamika mykotoxinů během výroby světlého sladu, hodnoty vychází z LCMS/MS stanovení (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2007).

400 350

LC-MS

ELISA Ridascreen

DON 300

DON-3-Glc

ng/g

250 200 150 100 50

zelený slad

m al t

máčený ječmen

gr ee n

ba rl ey

ječmen

st ee pe d

ba rl ey

0

zcukřený slad

světlý karamel

Polotmavý karamel

tmavý karamel

Obr. 34: Hladiny mykotoxinů v intermediátech výroby speciálních sladů, LC-MS/MS vs. ELISA, (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2007).

VŠCHT PRAHA

48

400 350

DON DON-3-Glc

300

sum of DON

%

250 200 150 100 50

m al t

máčený ječmen

g re en

st ee p ed

ječmen

b ar le y

b ar le y

0

zelený slad

zcukřený slad

světlý karamel

Polotmavý karamel

tmavý karamel

Obr. 35: Dynamika mykotoxinů během výroby speciálního sladu, hodnoty vychází z LCMS/MS stanovení (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2007).

Pokud jde o pivovarství, koncentrace mykotoxinů v meziproduktech technologie postupně klesá, což je způsobeno značným množstvím vody a tedy „ředěním“ obsahu mykotoxinů přítomného v původním sladu (viz Obr. 36). Avšak po výpočtu absolutního množství mykotoxinů v meziproduktech a finálním pivu (pomocí bilance množství vstupních surovin) je zřejmé, že obsah mykotoxinů během technologie stoupl (viz Obr. 37). To je pravděpodobně způsobeno uvolňováním mykotoxinů z vázaných forem během operace rmutování.

VŠCHT PRAHA

49

120

LC-MS

ELISA

DON

100

Ridascreen

DON-3-Glc

ug/kg (ug/l)

80

60

40

20

be er yo un g

or t

or t w ee t

mladina

sw

první výstřelek

w

sladina

t

sladový šrot

fir st w or

m al tg rit s

0

mladé pivo

Obr. 36: Hladiny mykotoxinů v intermediátech výroby piva, LC-MS/MS vs. ELISA (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2008). 180 160 140

DON DON-3-Glc sumof DON

120 %

100 80 60 40 20 0 msladový alt grits šrot

první first wort výstřelek

sladina sweet wort

mladina wort

mladé youngpivo beer

Obr. 37: Dynamika mykotoxinů během výroby piva, hodnoty vychází z LC-MS/MS stanovení (výchozí ječmen odrůdy Sebastian, sklizeň roku 2008).

VŠCHT PRAHA

50

Případová studie 3: Stanovení fusariových mykotoxinů a jejich konjugovaných forem v cereáliích a cereálních výrobcích; porovnání ELISA a LC-MS/MS Pro účely kontroly obsahu mykotoxinu deoxynivalenolu (DON) v cereáliích je často využíváno screeningových ELISA metod. Z důvodu nálezu vysokých hladin konjugovaného DON-3-glukosidu ve fermentovaných výrobcích, zvláště sladech a pivech71, byla realizována studie zaměřená na porovnání výsledků zjištěných pomocí těchto imunochemických metod a referenční metody LC-MS/MS. V rámci studie byly testovány čtyři komerčně dostupné ELISA kity určené pro stanovení DON ((i) Ridascreen® DON (R-Biopharm, Darmstadt, Německo), (ii) Veratox 5/5 DON® (Neogen Corporation, Lansing, USA), (iii) Deoxynivalenol EIA (Euro-Diagnostica, Arnhem, Holandsko), and (iv) AgraQuant® DON Assay 0.25/5.0 Test Kit (Romer Labs, Tulln, Rakousko). Pomocí těchto souprav byla testována křížová reaktivita maskovaného DON-3-Glc a byla prokázána v různém rozsahu ve všech kitech. Ve vodném roztoku byla cross-reaktivita DON-3-Glc stanovena na 78% pro Ridascreen® DON, 37% pro Deoxynivalenol EIA, 32% pro Veratox 5/5 DON® a 45% pro AgraQuant® DON 0.25/5.0 a dále 104% pro Ridascreen® DON, 53% pro Deoxynivalenol EIA, 51% pro Veratox 5/5 DON® a 66% pro AgraQuant® DON 0.25/5.0 v pivu 72. Ve sladech a pivech byl zjištěn poměrně značný rozdíl mezi stanovením ELISA a LCMS/MS, který pravděpodobně souvisí s technologií výroby. Kromě křížové reaktivity s konjugovaným DON-3-Glc hraje při použití ELISA metod také „chemická komplexnost“ vyšetřované suroviny, tedy křížová reaktivita protilátky kitu se složkami matrice. U nezpracovaných cereálií (pšenice a ječmen) a světlých sladů je odezva v ELISA kitu Ridascreen® DON a Deoxynivalenol EIA přibližně rovna celkovému obsahu DON (součtu volného DON a příspěvků DON z jeho konjugovaných forem) stanovenému pomocí LCMS/MS (viz Obr. 38, 39 a 40). Avšak v případě tmavých sladů, při jejichž výrobě figuruje teplota až 180°C, je odezva ELISA kitů mnohonásobně vyšší. Příčinou nadhodnocení ELISA kitů jsou pravděpodobně křížové reakce se složkami matrice vzniklými za vysokých teplot reakcemi neenzymového hnědnutí (Maillardovy reakce), viz Obr. 41 a 42. Obdobná příčina zřejmě způsobuje nadhodnocení DON metodou ELISA ve vzorcích piva (viz Obr. 43, 44 a 45). VŠCHT PRAHA

51

1600

\ ELISA

HPLC-MSMS

1400

DON DON-3-glc ADONs

1200

Ridascreen AgraQuant

1454

23

ng/g

1000

139 800

853 600

400

703

200

0

Obr. 38: Cross-reaktivita konjugátů DON v referenčním materiálu pšenice (wheat P64/D103, R-Biopharm).

VŠCHT PRAHA

52

2000

ELISA

LC-MS/MS

Ridascreen AgraQuant

1800

DON DON-3-glc ADONs

1600 1400

ng/g

1200 1000 800 600 400 200 0 IRM 1

IRM 2

IRM 3

Obr. 39: Cross-reaktivita konjugátů DON v interních referenčních materiálech pšenice (IRM 1 a 2) a ječmene (IRM 3).

1037 ng/g

600

Ridascreen EIA Veratox AgraQuant

ELISA

500

HPLC-MSMS

ng/g

400

DON DON-3-glc ADONs

300 200 100 0 D109

Světlý slad 1

D124

Světlý slad 2

Obr. 40: Cross-reaktivita konjugátů DON ve světlých sladech v různých typech ELISA kitů.

VŠCHT PRAHA

53

864 ng/g

ELISA

500

Ridascreen EIA Veratox AgraQuant

400

HPLC300 ng/g

DON DON-3-glc ADONs

200

100

0 D121

Polotmavý karamelový slad 1

D123

Polotmavý karamelový slad 2

Obr. 41: Cross-reaktivita konjugátů DON v polotmavých karamelových sladech v různých typech ELISA kitů.

HPLC-MSMS 1000

1779

ELISA

DON DON-3-Glc ADONs

Ridascreen EIA Veratox AgraQuant

1767

n g /g

800 600

< LOQ

< LOQ

400 200 0 Tmavý karamelový slad 1 D111

Tmavý karamelový slad 2 D112

Obr. 42: Cross-reaktivita konjugátů DON v tmavých karamelových sladech v různých typech ELISA kitů.

VŠCHT PRAHA

54

186 ng/ml

120

ELISA

HPLC-MSMS

Ridascreen EIA Veratox AgraQuant

DON DON-3-glc ADONs

100

ng/m l

80 60 40 20 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Obr. 43: Cross-reaktivita konjugátů DON ve světlých pivech v různých typech ELISA kitů.

900 800 700 600 %

500 400 300 200 100 0

1

2

3

4

5

8

10

Ridascreen

11

12

1

2

3

4

5

EIA

8

10

11

12

1

2

3

4

5

8

10

Veratox

11

12

1

2

3

4

5

8

10

11

12

AgraQuant

Obr. 44: Nadhodnocení výsledků získaných pomocí jednotlivých ELISA kitů (hladina DON stanovená pomocí LC-MS/MS je 100%). VŠCHT PRAHA

55

350

300

250

(%)

200

150

100

50

0 1

2

3

4

5

8

10

Ridascreen

11

12

1

2

3

4

5

EIA

8

10

11

12

1

2

3

4

5

8

10

Veratox

11

12

1

2

3

4

5

8

10

11

12

AgraQuant

Obr. 45: Nadhodnocení výsledků získaných pomocí jednotlivých ELISA kitů (celkový obsah DON stanovený jako suma příspěvků z ADONs a DON-3-Gls pomocí LC-MS/MS je 100%). Vzhledem k prokázané křížové reaktivitě protilátky ve všech testovaných ELISA kitech proti maskovanému mykotoxinu DON-3-Glc, a tedy k nadhodnocování získaných výsledků, nelze ELISA doporučit jako oficiální metoda pro měření koncentrace DON. Za předpokladu, že DON-3-Glc je biologicky dostupný (kompletní údaje o biologické dostupnosti a toxicitě DON-3-Glc zatím nejsou zcela k dispozici, ale dosavadní výzkum naznačuje, že enzymy určitých bakteriálních kmenů vyskytujících se ve střevech savců jsou schopné štěpit DON-3Glc za uvolnění mateřského DON), může však být stanovení celkového DON prostřednictvím ELISA velmi praktické.

VŠCHT PRAHA

56

Případová studie 4: Monitoring obsahu volných i vázaných fusariových mykotoxinů v ječmenech, sladech, sladovém květu a pivech V rámci této studie byl vyšetřován obsah volných fusariových mykotoxinů a vázaného mykotoxinu deoxynivalenol-3-glukosidu (DON-3-Glc) metodou LC-MS/MS v cereáliích a cereálních výrobcích. Ječmeny sklizené z roku 2007 byly dodány Zemědělským výzkumným ústavem v Kroměříži, vzorky ječmenů ze sklizně 2008 a slady byly získány od českých sladařů a vzorky sladového květu byly získány s pomocí Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského. Vzorky piva pro stanovení mykotoxinů byly zakoupeny na evropském trhu. Monitoring obsahu mykotoxinů v ječmeni V roce 2007 bylo analyzováno 12 vzorků ječmene pěstovaného v různých variantách úpravy půdy (orba 22 a 15 cm, disk 10 cm a bez orby) a po různých předplodinách (po cukrovce v roce 2006 a kukuřici, pšenici a ječmeni jarním v roce 2005). Hladiny DON se zde pohybovaly v rozmezí 81.5-180,7 µg/kg a hladiny DON-3-Glc v rozmezí 29,9-56 µg/kg. DON / DON-3-Glc se vyskytovali přibližně v poměru 3/1 (viz Obr.46). 200.0 180.0

DON

160.0

DON-3-Glc

140.0

ug/kg

120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 orba 22 orba 15 cm cm

bez orby

disk 10 orba 22 orba 15 cm cm cm

po kukuřici a cukrovce

VŠCHT PRAHA

bez orby

disk 10 orba 22 orba 15 cm cm cm

po pšenici a cukrovce

bez orby

disk 10 cm

po ječmeni a cukrovce

57

Obr. 46: Hladiny DON a DON-3-Glc v ječmeni sklizeném roku 2007. V roce 2008 bylo analyzováno 12 vzorků ječmene získaných od českých sladařů, který pak sloužil jako vstupní surovina pro výrobu sladu. Vzorky obsahovaly DON v koncentračním intervalu <5-138,2 µg/kg a DON-3-Glc v rozsahu koncentrací <5-58,1 µg/kg. Poměry DON / DON-3-Glc odpovídaly hodnotám přibližně 3/1 – 1/1 (viz Obr. 47).

160.0 DON DON-3-Glc

140.0 120.0

ug/kg

100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Obr. 47: Hladiny DON a DON-3-Glc v ječmeni sklizeném roku 2008. Z uvedených grafů je zřejmé, že ječmeny sklizené v letech 2007 a 2008 se v obsahu mykotoxinů poměrně lišily. Hladiny DON a DON-3-Glc v ječmenech ze roku 2007 byly přibližně dvakrát až třikrát vyšší než v ječmenech z roku 2008. Důvodem může být počasí v daném roce, ale i konkrétní druh a chemotyp vláknité houby převládající v daném roce. V roce 2008 totiž pravděpodobně převládal chemotyp produkující převážně mycotoxin nivalenol (NIV), protože ječmeny z roku 2008 vykazovaly velmi vysoké hladiny NIV (průměrně 223 µg/kg), zatímco v roce 2007 byl NIV u většiny vzorků pod mezí stanovitelnosti.

VŠCHT PRAHA

58

Monitoring obsahu mykotoxinů ve sladech a sladovém květu Bylo analyzováno celkem 31 vzorků sladu. Ve všech vyšetřených světlých sladech se hladiny DON pohybovaly v rozmezí <0,5-120,1 µg/kg, DON-3-Glc 8,2-164,6 µg/kg a ADONy 3,6-58,5 µg/kg. Hladiny DON / DON-3-Glc a DON / ADONs odpovídaly přibližně poměrům 1/2 a 1/0,5 (viz Obr. 48).

180.0

DON

160.0

D3G ADONs

140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Obr. 48: Hladiny mykotoxinů (µg/kg) ve sladech.

Hladiny mykotoxinů ve vzorcích sladového květu (klíčcích) se pohybovaly v intervalu 55,6-235 µg/kg DON, 16-225 µg/kg DON-3-Glc a 173-337 µg/kg ADONů. Nárůst mykotoxinů během klíčení však závisí na konkrétní odrůdě a ve vztahu k původnímu ječmeni se však může jednat o stovky až tisíce procent (viz Obr. 49 a 50).

VŠCHT PRAHA

59

1800

6040 411 1040 5051200 435 345

300 250

%

200

DON DON-3-Glc ADONs

150 100 50 0 barley ječmen

green m alt (72h) zel. green m alt zel. slad slad 144h (144h) 72h

m alt slad

germ s klíčky

Obr. 49: Ukázka nárůstu mykotoxinů (v %) v klíčcích v průvěhu sladařské technologie (odrůda Bojos 2008).

1132

350

DON 300 250

DON-3-Glc ADONs

%

200 150 100 50 0 barley ječmen

zel. slad green m alt (72h) 72h

green alt zel.m slad 144h (144h)

mslad alt

germ s klíčky

Obr. 50: Ukázka nárůstu mykotoxinů (v %) v klíčcích v průvěhu sladařské technologie (odrůda Sebastian 2008).

VŠCHT PRAHA

60

Monitoring obsahu mykotoxinů v pivech Hladiny DON u vyšetřovaných piv se pohybovaly v rozmezí 1-35,9 µg/l DON, 1,2-37 µg/l DON-3-Glc a 1-25 µg/l ADONů. Ke vzorkům vykazujícím nejnižší hladiny kontaminace mykotoxiny patří např. piva vyrobená ve Švédsku nebo na Islandu (viz Obr. 51). Co se týká obsahu alkoholu v pivu, platil zde trend, že s procenty alkoholu stoupá i obsah mykotoxinů (viz Obr. 52)73. 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Země Marketpůvodu of Sell početSamples vzorků No.of Alcohol % alkoholVol. (%)

BG 4 4.6

CZ 69 4.7

CND 10 4.9

D 43 4.9

S 14 4.9

N 2 5.0

USA 2 5.0

IS 2 5.0

B 4 5.0

IRL 2 5.1

AT 13 5.1

DK 8 5.2

SK 6 5.2

GR 1 5.3

Obr. 51: Průměrné hladiny mykotoxinů v pivech zakoupených v evropské obchodní síti, data agregovaná dle země původu vzorků.

VŠCHT PRAHA

61

10.0 9.0

DON DON-3-Glc ADONs

8.0 7.0 6.0 5.0

c (µg/l)

4.0 3.0 2.0 1.0

< 0.5

0.5 - 3.9

4.0 - 4.9

5.0 - 5.9

ADONs

DON-3-Glc

DON

ADONs

DON-3-Glc

DON

ADONs

DON-3-Glc

DON

ADONs

DON-3-Glc

DON

ADONs

DON-3-Glc

DON

0.0

6.0 - 9.0

Volume % of Alcohol

Obr. 52: Průměrné hladiny mykotoxinů v pivech zakoupených v české obchodní síti, data agregovaná dle procent alkoholu.

VŠCHT PRAHA

62

9. Závěr Problematika kontaminace cereálií a cereálních potravin fusariovými mykotoxiny je aktuálně řešena na celém světě. Vedle diskusí o preferencích konkrétních odrůd pěstovaných plodin (s ohledem na dispozice k růstu fusárií) probíhá dlouhodobé testování a hodnocení obsahů nejvýznamnějších mykotoxinů, z nichž některé již byly zařazeny do legislativních opatření. Kromě výzkumu týkajícího se vývoje analytických metod pro rychlé a citlivé stanovení mykotoxinů se rozvíjí také výzkum zabývající se různými formami jejich výskytu (maskované mykotoxiny), jejich biologickou dostupností a hodnocením zdravotní rizika. V přílohách této studie byly dokumentovány experimenty, které uvádějí nejnovější poznatky týkající se osudu jednoho z nejvíce sledovaných fusariových mykotoxinů – deoxynivalenolu a jeho majoritní konjugované formy – deoxynivalenol-3-glukosidu. Z výsledků je patrné, že jak v mlynárenské a pekárenské technologii, tak i v sladařství a pivovarství, není snadné variabilitu mykotoxinů v závislosti technologickém postupu jednoznačně zhodnotit. Lze však konstatovat, že během technologického zpracování cereálních surovin k zásadnímu poklesu hladin mykotoxinů nedochází a jedním z nejdůležitějších faktorů figurujícím v procesu výroby potravin zůstává kvalita výchozí suroviny. Nutno však konstatovat, ze řešení mykotoxinové kontaminace cereálií se neustále vyvíjí právě v závislosti na nově získaných poznatcích, a pokud jde o průmyslové zpracování potravin, je zde snaha o maximální eliminaci mykotoxinů s minimálním zásahem do tradičních technologií.

VŠCHT PRAHA

63

10. Literatura 1.

Placinta C.M., D`Mello J.P.F., Macdonald A.M.C.: A review of worldwide contamination of cereal grains animal feed with Fusarium mycotoxins, Anim. Feed, Sci. Technol. 78, 21 (1999)

2.

Creppy E.E.: Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe, Toxicol. Lett. 127, 19 (2002)

3.

Radová Z.: Disertační práce – Sledování incidence trichothecenových mykotoxinů v zemědělských plodinách a potravinářských produktech, VŠCHT, Praha 2002

4.

Champeil A., Doré T., Fourbet J.F.: Fusarium head blight: epidemiological origin of the effects of cultural practices on head blight attacks and the production of mycotoxins by Fusarium in wheat grain, Plant Sci. 166, 1389 (2004)

5.

Edwards S.G.: Influence of agricultural practices on fusarium infection of cereals and subsequent contamination of grain by trichothecene mycotoxins, Toxickol. Lett. 153, 29 (2004)

6.

Jan Velíšek: Chemie potravin III, Ossis, Tábor 2002, ISBN 8086659038

7.

Weidenbörner M.: Encyklopedia of Food Mycotoxins, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 2001, ISBN 3540675566

8.

Tutelyan V. A.: Deoxynivalenol in cereals in Russia, Tox. Lett. 153, 173 (2004)

9.

Murphy P. A., Hendrich S., Landgren C., Bryant C. M.: Food Mycotoxins: An update, J. Food Sci. 71 (2006)

10.

Soriano J. M., Dragacci S.: Occurence of fumonisins in food, Food Research Internat. 37, 985 (2004)

11.

Schrödter R.: Influence of harvest and storage conditions on trichothecenes levels in various cereals, Tox. Lett. 153, 47 (2004)

12.

http://www.lfra.co.uk/eman2/fsheet11.asp (1.12. 2008)

13.

Zinedine A., Soriano J.M., Moltó J.C., Manes J.: Review on toxicity, occurrence, metabolism, detoxification, regulation and intake of zearalenone: An oestrogenic mycotoxin, Food and Chem. Tox. 45, 1 (2007)

14.

http://chemfinder.cambridgesoft.com (1.12. 2008)

15.

Placinta C.M., D`Mello J.P.F., Macdonald A.M.C.: A review of worldwide contamination of cereal grains animal feed with Fusarium mycotoxins, Anim. Feed, Sci. Technol. 78, 21 (1999)

VŠCHT PRAHA

64

16.

Schollenberger M., Müller H.M., Rüfle M., Suchy S., Planck S., Drochner W.: Survey of Fusarium toxins in foodstuff and plant origin marketed in Germany, Int. J. Food. Mocrobiol. 97, 317 (2005)

17.

Vrabcheva T., Gebler R., Usleber E., Martlbauer E.: First survey on the natural occurrence of Fusarium mycotoxins in Bulgarian wheat, Mycopathologia 136, 47 (1996)

18.

Scudamore K.A., Nawaz S., Hetmanski M.T.: Mycotoxins in ingredients of animal feeding stuff: II. Determination of mycotoxins in maize and maize products, Food Addit. Contam. 15, 30 (1998)

19.

Labuda R., Parich A., Berthiller F., Tančinová D.: Incidence of trichothecenes and zearalenone in poultry feed mixtures from Slovakia, Int. J. Food Microbiol. 105, 19 (2005)

20.

Odhav B., Naicker C.: Mycotoxins in South African tradicionally brewed beers, Food Addit. Contam. 19, 55 (2002)

21.

Zinedine A., Brera C., Elakhdari S., Catano C., Debegnach F., Angelini S., De Santis B., Faid M., Benlemlih M., Minardi V., Miraglia M.: Natural occurrence of mycotoxins in cereals and spices commercialized in Morocco, Food Control 17, 868 (2006)

22.

Yoshizawa T., Jin Y.Z.: Natural occurrence of acetylated derivatives of deoxynivalenol and nivalenol in wheat and barley in Japan, Food Addit. Contam. 12, 689 (1995)

23.

Park K.J., Park A.R., Lee Y.W.: Natural occurrence of Fusarium Mycotoxins of the 1990 barley crop in Korea, Food Addit. Contam. 9, 639 (1992)

24.

Park J.W., Kim E.K., Shon D.H., Kim Y.B.: Natural occurrence of aflatoxin B1, fumonisin B1, and ochratoxin A in barley and corn foods from Korea, Food Addit. Contam. 19, 1073 (2002)

25.

Hadiani M.R., Yazdanpanad H., Ghazi-Khansari M., Cheraghali A.M., Goodarzi M.: Survey of the natural occurrence of zearalenone in maize from northern Iran by thinlayer chromatography densitometry, Food Addit. Contam. 20, 380 (2003)

26.

Reza Oveisi M., Hajimahmoodi M., Memarian S., Sadeghi N., Shoeibi S.: Determination of zearalenone in corn flour and cheese snack product using highperformance liquid chromatography with fluorescence detection, Food Addit. Contam. 22, 443 (2005)

27.

Scott P.M.: Multi-year monitoring of Canadian grain based foods for trichothecenes and zearalenone, Food Addit. Contam. 14, 333 (1997)

VŠCHT PRAHA

65

28.

Lombaert G.C., Oellaers P., Roscoe V., Mankotia M., Neil R., Scott P.M.: Mycotoxins in infant cereal foods from the Canadian retail market, Food Addit. Contam. 20, 494 (2003)

29.

Silva C.M., Vargas E.A.: A survey of zearalenone in corn using Romer Mycosep 224 column and high performance chromatography, Food Addit. Contam. 18, 39 (2001)

30.

Vargas E.A., Preis R.A., Castro L., Silva C.M.: Co-occurrence of affletoxins B1, B2, G1, G2, zearalenone and fumonisin B1 in Brazilian corn, Food Addit. Contam. 18, 981 (2001)

31.

Resnik S., Neira S., Pacin A., Martínez E., Apro N., Latreite S.: A survey of natural occurrence of aflatoxins and zearalenone in Argentine field maize: 1983-1994, Food Addit. Contam. 13, 115 (1996)

32.

Lauren D.R., Ringrose M.A.: Determination of the fate of three Fusarium mycotoxins through wet-milling of maize using an improved HPLC analytical technique, Food Addit. Contam. 14, 435 (1997)

33.

Creppy E.E.: Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe, Toxicol. Lett. 127, 19 (2002)

34.

Minervini F., Giannoccaro A., Cavallini A., Visconti A.: Investigations on cellular proliferation induced by zearalenone and its derivatives in relation to the estrogenic parameters, Toxicol. Lett. 159, 272 (2005)

35.

Malekinejad H., Maas-Bakker R., Fink-Gremmels J.: Species differences in the hepatic biotransformation of zearalenone, Vet. J. 172, 96 (2006)

36.

Danicke S., Ueberschar K.H., Halle I., Matthes S., Valenta H., Flachowsky G.: Effect of detoxifying agent to laying hen diets containing uncontaminated or Fusarium toxincontaminated maize on performance of hens and carryover of zearalenone, Poultry Sci. 81, 1671 (2002)

37.

Hussein H.S., Brasel J.M.: Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals, Toxicology 167, 101 (2001)

38. ČonKová E., Laciakova A., Pastorová B., Seidel H., Kováč G.: The effect of zearalenone on some enzymatic parqameters in rabbits, Toxicol. Lett. 121, 145 (2001) 39.

Abid-Essefi S., Baudrimont I., Hanssen W., Ouanes Z., Mobio T.A., Anane R., Creppy E., Bacha H.: DNA fragmentation, apoptosis and cell cycle arrest induced by zearalenone in cultured DOK, Vero and Caco-cells: preventionby Vitamin E, Toxicology 192, 237 (2003)

VŠCHT PRAHA

66

40.

Abid-Essefi S., Ouanes Z., Hanssen W., Baudrimont I., Creppy E., Bacha H.: Cytotoxicity, inhibition of DNA and protein syntheses and oxidative damage in cultured cells exposed to zearalenone, Toxicol. In Vitro 18, 467 (2004)

41.

Grosse Y., Ghedira-Chekir L., Huc A., Olbrecht-Pfumio S., Dirheimer G., Bacha H., Pfoh-Leszkowicz A.: Retinol, ascorbic acid and alpha tocopherol prevent DNA adduct formation in mice treated with mycotoxins ochratoxin A and zearalenone, Cancer Lett. 114, 225 (1997)

42.

Kouadio J.H., Mobio T.H., Baudrimont I., Moukha S., Dano S.D., Creppy E.E.: Comparative study of cytotoxicity and oxidative stress induced by deoxynivalenol, zearalenone or fumonisin B1 in human intestinal cell line Caco-2, Toxicology 213, 56 (2005)

43.

Kuiper G.G.J.M., Lemmen J.G., Carlsson B., Corton J.C., Safe S.H., Van der Saag P.T., Van der Burg B., Gustaffson J.A.: Interaction of estrogenic chemicals and phytoestogenes with estrogen receptor β, Endocrinology 139, 4252 (1998)

44.

Hughes Jr. C.L., Chakinala M.M., Reece S.G., Miller R.N., Schomberg Jr. D.W., Basham K.B.: Acute and subacute effects of naturally occurring estrogens on luteinizing hormone secretion in the ovariectomized rat: Part 2, Reprod. Toxicol. 5, 133 (1991)

45.

Hilakivi-Clarke L., Cho E., Clarke R.: Maternal genisten exposure mimics the effects of estrogen on mammary glad development in female mouse offspring, Oncol. Rep. 5, 609 (1998)

46.

McKenzie K.S., Sarr A.B., Mayura K., Bailey R.H., Millar D.R., Rogers T.D., Corred W.P., Voss K.A., Plattner R.D., Kubena L.F., Philips T.D.: Oxidative degradation and detoxification of mycotoxins using a novel source of ozone, Food Chem. Toxicol. 35, 807 (1997)

47.

Huwig A., Freimund S., Käppeli O., dutler H.: Mycotoxin detoxification of animal feed by different sorbents, Toxicol. Lett. 122, 179 (2001)

48.

Avantaggiato G., Havenaar R., Visconti A.: Assessing the zearalenone binding activity of adsorbent materials during passage through a dynamic in vitro gastrointestinal model, Food Chem. Toxicol. 41, 1283 (2004)

49.

Cavret S., Lecoeur S.: Fusariotoxin transfer in animal, Food Chem. Toxicol. 44, 444 (2006)

50.

Megharaj M., Garthwaite I., Thiele J.H.: Total biodegradation of the oestrogenic mycotoxin zearalenone by a bacterial culture, Lett. App. Microbiol. 24, 329 (1997)

VŠCHT PRAHA

67

51.

Varga J., Péteri Z., Tábori K., Téren T., Vágvölgyi C.: Degradation of ochratoxin A and other mycotoxins by Rhisopus isolates, Int. J. Food Microbiol. 99, 321 (2005)

52.

El-Nezami H., Polychronaki N. Salminen S., Mykkänen H.: Binding rather than metabolism may explain the interaction of two food-grade lactobacillus strains with zearalenone and its derivative α-zearalenol, Appl. Environ. Microbiol. 68, 3545 (2002)

53.

Aldred D., Magan N.: Prevention strategies for trichothecenes, Tox. Lett. 153, 165 (2004)

54.

Fauzi M.T., Paulitz T.C.: The effect of plant growth regulators and nitrogen on Fusarium head blight of the spring wheat cultivar max, Plant Dis. 78, 289 (1994)

55.

Magan N., Olsen N.: Mycotoxins in Food, Detection and Control, Woodhead Publeshing Limited, Cambridge England 2004, ISBN 0849325579

56.

Kadlec P. a kol.: Technologie potravin I, VŠCHT, Praha 2002, ISBN 8070805101

57.

Hazel C. M., Patel S.: Influence of processing on trichothecene levels, Tox. lett. 153, 51 (2004)

58.

Schollenberger M., Drochner W., Rüfle M., Suchy S., Terry-Jara H., Müller H.: Trichothecene toxins in different groups of conventional and organic bread of the German market, Jour.of Food Compos. and Anal. 18, 69 (2005)

59.

Kadlec P. a kol.: Technologie potravin II, VŠCHT, Praha 2002, ISBN 8070805102

60.

Omurtag G.Z., Beyoglu D.: Occurence of deoxynivalenol (vomitoxin) in beer in Turkey detected by HPLC, Food Cont. neuvedeno, neuvedeno (2005)

61.

Krska R., Raumgartner S., Josephs R.: The State-of-the-art in the analysis of type –A and –B trichothecene mycotoxins in cereals, Fresenius J. Analyt. Chem. 371, 285 (2001)

62.

B. Poppenberger et al: J.Biol. Chem. 278, 47905 (2003)

63.

Berthiller F., Dall´Asta C., Schuhmacher R., Lemmens M., Adam G., Krska R.: Masked mycotoxins: determination of a deoxynivalenol glucoside in artifcially and naturally contaminated wheat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of agricultural and food chemistry, 53, 3421-3425 (2005)

64.

Engelhardt G., Ruhland M.,Wallnöfer P.R.: Metabolism of mycotoxins in plants, Advances in food science, 21, 71-78 (1999)

65.

Savard M.E.: Deoxynivalenol fatty acid and glucoside conjugates, Journal of agricultural and food chemistry, 39, 570-574 (1991)

66.

Schneweis I., Meyer K., Engelhardt G., Bauer J.: Occurence of zearalenone-β-D glucopyranoside in wheat, Journal of agricultural and food chemistry, 50, 1736- 1738, 2002 VŠCHT PRAHA

68

67.

Young J.C., Fulcher R.G., Hayhoe J.H., Scott P.M., Dexter J.E.: Effect of milling and baking on deoxynivalenol (vomitoxin) content of eastern Canadian wheats, Journal of agricultural and food chemistry, 32, 659-664 (1994)

68.

Dall´Asta C., Berthiller F., Schuhmacher R., Adam G., Lemmens M., Krska R.: DONGlycosides: Characterisation of synthesis products and screening for their occurrence in DON-treated wheat samples, Mycotoxin research, 21, 123-127 (2005)

69.

Langseth W., Rundberget T.: Intrumental methods for determination of makrocyclic trichothecenes in cereal, foodstuffs and cultures, J. Chromatogr. A 815, 103 (1998)

70.

Nařízení komise (ES) č. 1881/2006 z 19. prosince 2006: Maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách – dostupné na http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ (staženo 1.12.2008)

71.

Lancová K., Hajšlová J., Poustka J., Krplová A., Zachariášová M., Dostálek P., Saschambula L: Transfer of Fusarium mycotoxins and 'masked' deoxynivalenol (deoxynivalenol-3-glucoside) from field barley through malt to beer, Food Add. Cont. 25 (6), 732-744 (2008)

72.

Zachariášová M., Hajšlová J., Kostelanska M., Poustka J., Krplova A., Cuhra P., Hochel I.: Deoxynivalenol and its conjugates in beer: A critical assessment of data obtained by enzyme-linked immunosorbent assay and liquid chromatography coupled to tandem mass spektrometry, Anal. Chim. Acta, 625, 77-86 (2008)

73.

Kostelanska M., Hajšlová J., Zachariášová M., Malachová A., Kalachová K., Poustka J., Fiala J., Scott P. M: Occurrence of Fusarium toxins and major deoxynivalenol conjugate, deoxynivalenol-3-glucoside, in beer and some brewing intermediates, J. Agr. Food Chem., in prep

VŠCHT PRAHA

69