MUTACE A REPARACE DNA
Lekce 6 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
• MUTACE se dělí na: i) genomové – změna počtu chromozómů ii) chromozómové – změna struktury chromozómů iii) genové – změny DNA v rámci jednoho genu - somatické m. – vznikají v somatických buňkách a postihují jen část těla → organismus jeví mozaicismus (chimérismus) - gametické m. – vznikají v buňkách zárodečných linií nebo v gametách a jsou přenášeny do následných generací - dominantní m. x recesivní m. – většina mutací je recesivních a ztrátových, ale mohou vznikat i nové znaky - forward m. – mutace od standardního k mutovanému typu - zpětná (back) m. – mutace od mutovaného ke standardnímu typu
- letální m. – působí smrt jedince ve stádiu zygoty nebo ve stádiích před rozmnožováním - semiletální m. – působí snížení životaschopnosti - neutrální m. – beze změny na vitalitu - supervitální m. – zvyšují životaschopnost jedinců - spontánní m. – vznikají z vnitřních známých příčin, nikoliv zásahem z vnějšku - m. indukované fyzikálními, chemickými nebo biologickými faktory - morfologické m. – vyvolávají (nápadné) změny fenotypu (u mikroorganismů je jejich spektrum velmi omezené, např. mutace petite u kvasinek, vzhled bakteriálních kolonií – rouhg x smooth) - nutriční m. – m. vedoucí ke změně prototrofie na auxotrofii (neschopnost syntetizovat si veškeré potřebné látky k životu, ty pak musejí být dodávány v médiu)
- podmíněné m. – mutace projevující se ve fenotypu jen za určitých podmínek prostředí (např. podmíněně letální jsou u E. coli teplotně senzitivní mutace – ty dovolují růst organismu jen za určité nižší, permisivní, teploty, zatímco za obvyklé, tj. vyšší, restriktivní, teploty nikoliv) - teplotně citlivý není gen, ale jeho produkt, tj. bílkovina - podmíněná m. bez letálního efektu – siamská kočka, králík himalájský
Mutace indukované biologickými faktory - podmíněné transpozicemi genetických mobilních elementů nebo integracemi retrovirů a T-DNA - somaklonální variabilita – genetické a epigenetické změny v rostlinných buněčných a tkáňových kulturách Typy genových mutací i) substituce (záměna) bází ii) inzerce (vložení) nebo delece (ztráta) bází iii) expanze trinukleotidových repetic
i) substituce bází tranzice - Pu za Pu, Py za Py transverze - Pu za Py a naopak, má dramatičtější důsledky než tranzice jak z hlediska genetického (viz degenerace gen. kódu) tak chemického (struktura Pu x Py)
m. měnící smysl (missense m.) – záměnou vznikne triplet kódující jinou AK m. beze smyslu (nonsense m.) - záměnou vznikne stop kodon tiché m. (silent m.) - záměnou vznikne triplet kódující stejnou AK (mezi tiché m. řadíme také záměny bází v intronech a v spacerové DNA)
ii) inzerce a delece bází - molekulární analýzy ukázaly, že tento typ m. je častější než záměny bází - dojde k tzv. posunovým mutacím (frameshift m.), tj. k posunu čtecího rámce - pokud dojde ke změně počtu, který je násobkem tří, dochází k tzv. in-frame inzercím nebo delecím, jejímž důsledkem je pouze ztráta nebo získání AK v kódovaném polypeptidu - pokud dojde ke změně počtu, který není násobkem tří, dojde při posunu čtecího rámce ke změnám ve všech tripletech od místa mutace → záměny AK a vznik předčasného stop kodonu velmi časté iii) expanze trinukleotidových repetic (expanding trinucleotide repeats) - nový typ mutací objevený v r. 1991 - dochází ke zvyšování počtu trinukleotidových přirozeně se vyskytujících repetic
- v současné době je minimálně třináct chorob a pět fragilních míst spojováno s těmito expanzemi
Spontánní mutace - vyvolány vnitřními příčinami nikoliv přítomností mutagenu i) tautomérní přesmyky bází - soudilo se, že jsou hlavní příčinou špatného párování během replikace DNA, ukázalo se ale, že k tvorbě mutací zřejmě nevedou
ii) kolísavé párování bází (non-Watson-Crick base pairing) - dochází k němu díky značné flexibilitě molekuly DNA (tzv. wobble párování) - většina chybného párování během replikace DNA padá na vrub právě wobble párování
iii) deaminace bází - deaminací cytozinu vznikne uracil → rozpoznáno uracil DNA glykosylázou → odstraněn a nahrazen C - deaminací minoritní báze 5-metylcytozinu (páruje se s G) vznikne tymin, který se při replikace bude párovat s A → záměnová m. (tranzice) - deaminací adeninu vznikne hypoxantin párující se s cytozinem → rozpoznán specifickou glykosylázou a nahrazen A
iv) depurinace - ztráta purinu z nukleotidu → AP místo nemůže sloužit jako komplementární templát při replikaci DNA → vkládá se náhodný nukleotid (nejčastěji adenin) → chyba a při následné replikaci je zafixována - depurinace je poměrně častá záležitost (savčí buňka v kultuře ztratí takto denně cca 10 tis. purinů)
v) sklouzávání vlákna DNA při replikaci - dochází k tím k tvorbě inzercí nebo delecí několika nukleotidů a tím k posunovým mutacím
Mutace indukované chemickými faktory - faktor signifikantně zvyšující mutační rychlost se nazývá mutagen - první chemický mutagen objeven Auerbachovou (yperit, Drosophila, tajný vojenský výzkum → publikováno až 1947) i) analogy bází - látky připomínající velmi svojí strukturou standardní báze, takže mohou být inkorporovány do replikované molekuly DNA - 5-bromouracil (5BU) je analog tyminu a také se normálně páruje s A, avšak někdy se nesprávně páruje s G, což nakonec vede k tranzici (T.A →5BU.A →5BU.G →C.G)
- 2-aminopurin (2AP) je analog adeninu → páruje se s T, avšak výjimečně také s C → v konečném důsledku tranzice (T.A →T.2AP →C.2AP →C.G)
ii) kyselina dusitá – způsobuje deaminaci bází, především cytosinu iii) hydroxylamin – hydroxyluje cytosin na hydroxylaminocytosin, který se páruje s adeninem (tranzice CG → TA)
iv) interkalační látky - svoji strukturou a velikostí připomínají dvojice bází → vmezeřují je do molekuly DNA → narušení 3D struktury DNA → jednonukleotidové inzerce nebo delece
v) oxidativní reakce - látky způsobující poškození DNA prostřednictvím reaktivní formy kyslíku (peroxid vodíku, hydroxylový a superoxidový radikál) vznikají v buňce během normálního aerobního metabolismu (nebo je jejich vznik indukován ionizujícím zářením) - např. z guaninu vznikne 8-oxy-7,8-dihydrodeoxyguanin, který se často nesprávně páruje s A → transverze G.C →T.A
vi) alkylační látky - jsou to elektrofilní látky → mají afinitu k DNA, která má negativní náboj (každý nukleotid má negativní náboj na fosfátu a parciální negativní náboje na bázi) - alkylační látky reagují s těmito místy a zanechávají na nich alkyl skupiny (alkylace DNA) - na bázích jsou nejvíce náchylné k alkylacím N7 guaninu a N3 adeninu → destabilizace → vznik apurinního místa → mutace - alkylovány mohou být rovněž všechny atomy N a O podílející se na tvorbě vodíkových můstků → nesprávné párování takové báze → mutace - dělí se na monofunkční (EMS – etylmetansulfonát, MMS – metylmetansulfonát, ENU – etylnitrosomočovina, MNNG – metylnitronitrosoguanidin) a bifunkční (ty způsobují také hodně chromozómových mutací – zlomů = klastogenní účinek; sirný a dusíkatý yperit)
vii) aflatoxin B1 - silný kancerogen produkovaný plísněmi rodu Aspergillus (aflatoxiny jsou akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní) - váže se na guanin v pozici N7 → destabilizace vazby báze-cukr → vznik AP místa → mutace - potraviny choulostivé na výskyt aflatoxinů jsou arašídy, para ořechy, chilli, koření, sušené ovoce (např. fíky), sója, kukuřice - viz též http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/obsah.php
Mutace indukované zářením - poprvé popsán mutagenní účinek záření (X paprsků) v r. 1927 H. Müllerem - X záření, gama záření, kosmické záření (ionizační záření) x UV záření i) UV záření - má nízkou energii → proniká jen nepatrně a nezpůsobuje ionizaci, nicméně je vysoce mutagenní - způsobuje tvorbu pyrimidinových dimerů (nejčastěji T-T, méně často C-C nebo C-T) v rámci jednoho vlákna DNA vytvořením cyklobutanového kruhu → změna 3D struktury DNA → inhibice replikace a transkripce) nebo 6-4 fotoproduktu - nejsilnější mutagenní účinek má UV 260 nm (DNA nejsilněji absorbuje záření stejné vlnové délky)
ii) ionizující záření - vysoká energie → vysoce pronikavé - způsobuje tvorbu volných radikálů a reaktivních iontů, které napadají DNA a vedou nejčastěji k dvouřetězcovým zlomům (ionizační záření je klastogen = mutagen způsobující zlomy) → nepřímý účinek záření - přímý účinek – zásah přímo molekuly DNA a její poškození (zlomení)
Reverze - reverzní m. je změna vedoucí od mutovaného ke standardnímu fenotypu - pravá reverze – změna DNA na původní sekvenci - supresorová m. – genetická změna potlačující efekt jiné (forward) mutace
- intragenová suprese – druhá mutace v rámci téhož genu
- intergenová suprese – obnovení fenotypu je dosaženo zavedením druhé mutace do jiného genu (obr.17-10)
•
REPARACE DNA i) přímá reparace ii) nepřímá reparace (excizní) iii) reparace chybného párování (mismatch repair) iv) postreplikační reparace v) reparace dvouřetězcových zlomů (DSB repair) vi) SOS reparace
i) přímá reparace: DNA fotolyáza (fotoreaktivace) - opravuje pyrimidinové dimery, energii získává z viditelné části světla - enzym poškozené místo rozezná, opraví a poté z DNA disociuje
O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferáza - opravuje přímo báze alkylované v pozici O6-guanin, O4-tymin a alkylovaný fosfát odstraněním (přenesením) navázaných alkylových skupin - „sebevražedný“ enzym (jedna alkyl skupina přenesená na cystein enzymu ho ireverzibilně inaktivuje)
ii) nepřímá reparace: Excizní reparace – poškozená DNA je odstraněna a nahrazena nově syntetizovanou DNA - base excision repair (BER) - DNA glykosyláza rozpozná poškozené místo (existují různé glykosylázy na rozpoznávání různých typů poškození DNA) → přerušení vazby cukr–báze a její uvolnění → vznik AP místa → enzym 5‘-AP endonukleáza vytvoří jednořetězcový zlom → 5‘→3‘ exonukleáza začne odstraňovat přilehlé nukleotidy (krátký úsek) → DNA polymeráza I (u bakterií) nebo ß (u eukaryot) zaplní uvolněné místo → ligáza kovalentně spojí - DNA polymeráza ß nemá korekční (proofreading) aktivitu (1 chyba na 4000 inkorporovaných nukleotidů; v lidském genomu je denně opraveno tímto způsobem 20-40 tis. nukleotidů, tj, polymeráza by takto denně vyrobila až 10 mutací) → tuto aktivitu zajišťují při této opravě speciální AP endonukleázy, tzv. APE1
- nucleotide excision repair (NER) - velmi univerzální, odstraňuje velké množství typů poškození - komplexní proces řízený velkým počtem genů - komplex enzymů vyhledává na DNA distorze → separace vláken DNA v oblasti poškození a jejich stabilizace navázáním speciálních proteinů → zlomy poškozeného vlákna ve vzdálenosti 5 nukleotidů na 3‘ konci a 8 nukleotidů (u bakterií) nebo 21-23 nukleotidů (u eukaryot) na 5‘ konci → DNA polymeráza zaplní uvolněné místo → DNA ligáza kovalentně spojí iii) reparace chybného párování - DNA polymeráza má spolehlivost 10-4 až 10-5, její proofreadingová aktivita zvyšuje spolehlivost replikace až na 10-9 - zbývající chyby opravuje mismatch reparace a dále opravuje malé smyčky DNA vznikající díky sklouzávání vláken DNA při replikaci
iv) postreplikační reparace - probíha po replikaci DNA rekombinačním způsobem - poškození DNA neopravuje, ponechává ho na místě, ale umožní replikaci DNA i v oblasti léze
v) reparace dvouřetězcových zlomů Existují dva základní mechanismy opravy: i) homologní rekombinace (jako templát pro opravu DSB využívá totožné nebo velmi podobné sekvence DNA) ii) nelegitimní rekombinace (NHEJ – nonhomologous end joining; rekombinuje zcela odlišné sekvence) Homologní rekombinace (HR) - je důležitá při opravě DNA v somatických buňkách a při meióze - existují 3 modely HR (založené ovšem především na studiích na kvasinkách) Nelegitimní rekombinace (NHEJ) - nejčastější způsob opravy DSB v eukaryotních buňkách - iniciační rozpoznání zlomu je zprostředkováno komplexem KU70 a KU80 - následuje opracování konců DNA molekuly (komplex MRN), aby byly substrátem pro DNA ligázu - závěrečná ligace je katalyzována komplexem DNA ligázy IV a proteinu XRCC4
vi) SOS reparace (chybující, error-prone) - dovoluje překonat replikační blok i za cenu vnesení četných chyb do DNA (což může být meší zlo než nedokončená replikace DNA, která je fatální) - komplexní proces zahrnující nejméně 25 genů
Detekce mutagenů v prostředí - začíná se nejjednoduššími testy, tj. testy s mikroorganismy - stěžejní je test Amesův, jenž pracuje s auxotrofním mutantem (his-) Salmonella typhimurium a sleduje vznik zpětných mutací na prototrofii - bakterie má inaktivován reparační systém (=zvýšení citlivosti) a modifikovanou lipopolysacharidovou stěnu (=zvýšení průniku látek z okolí) - pracuje se s řadou kmenů určených pro detekci různých skupin chemických mutagenů - modifikace s mikrozomální jaterní frakcí S9 umožňuje přiblížit prokaryotní systém systému eukaryotnímu a tím dovoluje identifikovat tzv. promutageny, tj. látky, které samy o sobě nejsou mutagenní, mutagenem se stanou až po metabolické aktivaci organismem (buňkou)
