MOBILNÍ GENETICKÉ ELEMENTY
Lekce 13 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
• Demerec (1937) popsal nestabilní mutace u D. melanogaster • B. McClintocková (1902-1992, Nobelova cena 1983) ukázala ve 40. a 50. letech při studiu chromozómových zlomů u kukuřice, že její genom obsahuje mnoho mobilních elementů způsobujících somatické mutace (Ac/Ds) • molekulární analýza těchto elementů mohla být prováděna až zhruba od konce 70. let • prvními klonovanými elementy byly elementy z D. melanogaster (1978), které nyní známe pod označením "Copia-like" elementy • nalezeny u všech organismů, u kterých byly hledány (s výjimkou parazita Plasmodium falciparum): u rostlin až 80 % genomu, u živočichů 3-45 %, u hub 2-20 % • úseky DNA schopné přenosu na jiné místo genomu (transpozice), ať už autonomně či s pomocí příbuzných elementů
- dělí se podle způsobu své transpozice na dvě třídy - ty jsou dále děleny na základě své struktury, sekvenční podobnosti a detailů transpozičních mechanismů na podtřídy, řády, superrodiny atd. a) TŘÍDA I (retrotranspozony): transpozice přes RNA intermediát replikativním způsobem („copy and paste“) – transkripce genomické kopie elementu, reverzní transkripce do DNA, integrace nového elementu do nového místa genomu - tento způsob transpozice vede ke zvyšování počtu kopií elementu v genomu - tvořena 5 řády i) LTR (long terminal direct repeat) retrotranspozony (Ty1copia, gypsy-Ty3) - strukturou připomínají retroviry - jsou velké 5-9 kbp, mají LTR a v centrální oblasti ORF odpovídající gag-pol (kapsidový gen, polyproteinový gen = proteáza, RT/RNaseH, integráza) ii) LINE (long interspersed nuclear elements) - nemají LTR, ale 1-2 ORF (RT a nukleáza), počet jejich kopií může být velmi velký (u člověka je tvořeno 17 % jeho genomu elementem LINE 1)
iii) SINE (short interspersed nuclear elements) - nemají signifikantní ORF, proto je jejich replikace i integrace závislá na LINE - jsou odvozeny od různých transkriptů RNA polymerázy III - rodina Alu tvoří v lidském genomu asi 15 % iv) DIRS-like elementy (Dictyostelium intermediate repeat sequence) - kódují místo integrázy tyrozin rekombinázu a pravděpodobně užívají jiný způsob integrace v) Penelope-like elementy - objevena u Drosophila virilis - kódují RT doménu podobnou telomeráze a endonukleáze
Čtyři typy ME tvoří téměř 50 % lidské genomu:
b) TŘÍDA II: transpozice přes DNA intermediát mechanismem „cut and paste“ - dělí se na dvě podtřídy na základě rozdílů v počtu DNA řetězců, jež se během transpozice zlomí - nicméně nikdy nevzniká při transpozici RNA intermediát, tím je vždy samotná genomická DNA První podtřída je tvořena 2 řády: i) TIR (terminal inverted repeats) elementy - až 9 superrodin (P z D. melanogaster, hAT [Ac-Ds kukuřice]) - transpozize je zprostředkována transpozázou, jež rozeznává TIR – vystřižení a integrace na jiné místo genomu, za přispění hostitelského systému reparace dvouřetězcových zlomů ii) Crypton elementy - obsahují dlouhý gen s řadou intronů kódující pravděpodobně tyrosinrekombinázu
Druhá podtřída obsahuje rovněž 2 řády, jež mají pravděpodobně odlišný mechanismus transpozice než předcházejí 2 řády - zřejmě používají replikativní copy and paste strategii. i) Helitron elementy - replikují se zřejmě mechanismem valícího se kruhu (rollingcircle, RC), jako např. některé plazmidy nebo bakteriální TE - pozoruhodnou vlastností je, že jsou schopny přenášet fragmenty DNA získané z hostitelského genomu ii) Maverick elementy - velké transpozony s dlouhými TIR a kódující četné proteiny - mechanismus transpozice není ještě dobře znám, pravděpodobně se replikují za použití DNA polymerázy, kterou sami kódují
• Jak mobilní elementy I. tak i II. třídy mohou být buď autonomní nebo neautonomní. • Neatonomním elementům chybí některé (nebo všechny) geny kódující proteiny nezbytné pro jejich transpozici – musí si tedy proteiny “vypůjčovat“ od elementů autonomních. • Mezi neautonomní elementy I. třídy odvozené od LTR patří LARD (large retrotransposon derivatives) nebo TRIM (terminal repeat retrotransposons in miniature). • K II. třídě patří např. MITE (miniature inverted-repeat transposable elements).
Prokaryotické mobilní genetické elementy - u prokaryot několik rozdílných skupin mobilních elementů: i) inzerční sekvence (IS1, IS2, ….) ii) transpozony (Tn1, Tn2, ….) iii) fág mu i) IS jsou segmenty DNA o velikosti řádu stovek párů bazí s invertovanými opakováními na koncích o velikosti řádu desítek párů bází - dostane-li se IS do kódující sekvence genu, způsobí jeho inaktivaci; protože v některých případech obsahují transkripční a translační terminační signály, mohou IS blokovat i expresi dalších genů téhož operonu ležící za IS směrem od promotoru ("downstream") → příklad tzv. polární mutace, tj. mutace, která ovlivňuje funkci všech genů transkripčně downstream
ii) transpozony byly objeveny jako mobilní genetické elementy nesoucí rezistenci k lékům - jsou většinou tvořeny IS elementy obklopujícími gen zodpovědný za určitou rezistenci - vyskytují se na bakteriálních plazmidech, které se označují jako R faktory (R=rezistence), jež je tvořen jedním nebo více transpozony, často vloženými vzájemně do sebe, a oblastí nesoucí geny zajišťující přenos rezistence mezi bakteriálními buňkami, která se nazývá RTF oblast (resistance transfer functions)
iii) fág mu je normální fág, má však mnoho společných rysů s IS sekvencemi - je sice značně delší (zhruba 36 kbp), ale je schopen se v jakékoliv orientaci integrovat na kterékoliv místo bakteriálního nebo plasmidového genomu (jeho inzerce do lokusu způsobuje mutaci, stejně jako je tomu u IS, mu vzešlo z "mutator") - umožňuje mobilizaci jakékoliv DNA a její začlenění kamkoliv do genomu Transpozice prokaryotních ME - probíhá buď replikativním nebo konzervativním (nereplikativním) způsobem - v prvém případě dochází replikací k vytvoření kopie elementu, která se integruje na nové místo v genomu, zatímco původní místo zůstává obsazeno originálním elementem (přitom dochází k tvorbě kointegrátu tvořeného donorovým i recipientím plasmidem) - při konzervativní transpozici je element po excizi z původního místa integrován na nové místo v genomu
Eukaryotické mobilní genetické elementy - k významným skupinám patří např. kvasinkové retrotransposonové superrodiny Ty1 a Ty3, P elementy, Copia-like elementy nebo Foldback elementy drozofily nebo superrodina hAT, jejímiž členy jsou např. Ac/Ds z kukuřice,Tam3 z hledíku nebo hobo z drozofily Transpozice ME třídy I: - původní element zůstává na svém místě → transpozice retrotranspozonů vede principiálně ke zvětšování počtu jejich kopií v genomu (počty retroelementů v genomu řady druhů dosahují ohromných hodnot v řádu miliónů) - proces reverzní transkripce nepracuje bez chyb (je errorprone a nikoliv error-free) → nové kopie elementů obsahují četné mutace → kopie jsou proliferačně defektní (neaktivní) - protože retrotranspozony se během transpozice nevyštěpují z původního místa, jsou mutace jimi způsobené, na rozdíl od mutací způsobených mobilními elementy II. třídy, stabilní
Transpozice ME třídy II: transpozici obvykle bezprostředně předchází replikace chromozomu, při které dojde k vytvoření kopie mobilního elementu na sesterské chromatidě - transpozičně aktivní je pouze jedna z kopií a mechanismem regulace jsou nejspíše metylace na obou koncích mobilního elementu (obr. 4B), na nichž jsou lokalizovány sekvence rozpoznávané enzymem transpozázou, která katalyzuje vlastní transpozici elementu (na obou sesterských chromatidách vznikne rozdílný pattern interakce elementu s transpozázou, přičemž pouze jeden z nich vede k zahájení procesu transpozice) - po excizi ME z donorového místa následuje jeho inzerce na jiné, většinou velice blízké, místo téhož chromozomu eventuálně na místo na jiném chromozomu (přitom mohou nastat různé eventuality, obr. 4A)
Obr.: hypotetický model Ac transpososomu, který vysvětluje excisi mobilního elementu a jeho následnou reinzerci jako důsledek štěpící aktivity transpozázy na koncích terminálních invertovaných opakování na obou koncích elementu a na akceptorovém místě
P elementy u D. melanogaster - plně funkční má délku cca 2900 bp, každý má terminální opakování velikosti 31 bp a při své inzerci do genomu generuje přímé opakování o 8 bp - kóduje transpozázu a represor transpozice, který se vyskytuje v cytoplazmě → vyskytuje se jen v samičích gametách → výsledky reciprokých křížení linií P+ a P- nejsou identické - P element se u druhu D. melanogaster objevil asi až před 65 léty (všechny přírodní populace ho obsahují, zatímco žádný laboratorní kmen drozofily založený před r. 1945 ho nemá) a rychle se rozšířil v celém druhu - jeho zdrojem byl druh D. willistoni a přenašečem roztoč Proctolaelaps regalis parazitující na obou druzích
Původ mobilních genetických elementů - při sledování původu (a evoluce) mobilních elementů se vychází ze společných domén - např. gag nebo reverzně transkriptázové domény u retrotranspozonů a integrázové-transpozázové domény, která je charakteristická pro LTR retrotranspozony a mobilní elementy II. třídy - řada výsledků, ale jednoznačný závěr velmi těžké udělat (např. proto, že nacházíme funkční a sekvenční podobnosti u elementů, které se vyskytují ve velice vzdálených druzích či dokonce říších) - má se za to, že to má na svědomí horizontální přenos genetické informace (částečně plodní mezidruhoví kříženci, polyspermie, symbiotické a parazitické vztahy zvláště s velkým počtem hostitelů)
Osud mobilních genetických elementů - mohou být inaktivovány reversibilně metylací, nebo ireverzibilně akumulací mutací - další možností je mutace v nějakém hostitelském genu (viz gen flamenco a Gypsy element, kdy nepermisivní alela genu flamenco inhibuje Gypsy amplifikaci) - u třídy II vede ztráta aktivní kopie k imobilizaci defektních kopií (např. Ac/Ds), které vyžadují k transpozici trans působící protein (transponázu) - aktivní kopie se může stát defektní nejrůznějšími mutacemi (např. v TIR u třídy II, v RT u třídy I) - ME mají potenciál produkovat všechny druhy mutací delece, inzerce, posunové mutace, inverze, duplikace, translokace či velké genomové přestavby; způsobují také změny v prostorovém a časovém uspořádání genové exprese i její síly
- je-li ME příčinou nového patternu genové exprese se selekční výhodou, může se stát, že takový element bude hostitelským genomem natrvalo využit (domestikován, příkladem je telomeráze podobná funkce dvou retrotranspozonů Het-A a TART u drozofily, když bylo ukázáno, že ztráta terminálních sekvencí chromozomu je vyvážena transpozičním přidáním zmíněných elementů na uvolněné místo) - jsou ME sobeckou (selfish) DNA nebo jsou jedním z hlavních zdrojů změn v evoluci?; zdá, že v poslední době mírně převažují zastánci druhé možnosti a jejich argumenty zní takto: a) ME mají ohromný potenciál indukovat sekvenční proměnlivost a funkční změny; b) ME mohou indukovat regresní evoluci (ztráta funkce či anatomické nebo fyziologické struktury, např. orgánová a pigmentová redukce u živočichů žijících v jeskyních) - ke ztrátám docházelo v evoluci zvláště rychle a často nezávisle na různých místech světa a vysvětlit by to bylo velice snadné zahrnutím podílu mobilních elementů;
c) ME mohou indukovat vznik různých ekotypů (organismů jednoho druhu s adaptací ke speciálním podmínkám vnějšího prostředí); experimentální příklady zahrnují genovou inaktivaci - inaktivace genu pro transportní protein pro těžký kov, který je pro rostlinu toxický, vede k rezistenci organismu k tomuto kovu, neboť těžký kov se již do vnitřního prostředí rostliny nedostává; jindy je látka, přijímaná z vnějšího prostředí, metabolismem modifikována na toxický produkt, jeli enzym řídící tuto přeměnu inaktivován, stává se organismus vůči dané látce rezistentní Hlavní rozdíl, který zatím nepřekonatelně leží mezi zastánci jedné nebo druhé teorie, spočívá v názoru na to, zda ME přežívají a šíří se v organismech, protože přinášejí svým nositelům selekční výhody, nebo přestože svému hostiteli přitěžují.
