MIMOJADERNÁ DĚDIČNOST
Lekce 11 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
• • • •
Plastidový genom (plus apikoplast) Mitochondriový genom Dědičnost podmíněná viry nebo jinými inf. agens Predeterminace
Je-li znak řízen mimojadernými geny, dědičnost má tyto rysy: i) Výsledky reciprokých křížení nejsou identické, znak je přenášen často jen v mateřské linii (matroklinně). ii) Fenotyp jedince není určen genotypem jádra. iii) Tyto znaky často vykazují somatické štěpení. iv) Některé mimojaderné genetické faktory jsou infekční.
CHLOROPLASTOVÝ GENOM
Chloroplastová DNA (cpDNA): - kruhová dvouvláknová molekula o délce 120-220 kb - prokaryontní organizace genů (řada genů v operonech), ale s introny - každý chloroplast má více molekul DNA, ty v tzv. nukleoidech (protein nehistonového charakteru připojený k thylakoidu, kolem navinuta DNA); v každém chloroplastu 10-20 nukleoidů na každém několik molekul DNA, v buňce desítky chloroplastů → v buňce vyšších rostlin několik tisíc kopií cpDNA - cpDNA vyšších rostlin je si hodně podobná co do výskytu genů i co do jejich uspořádání → typický plastidový genom kóduje 4 rRNA, 30-35 tRNA a kolem 80 proteinů (ribozomálních nebo plastidových), zbývající proteiny kódovány v jádře a do plastidů jsou transportování díky přítomnosti signální sekvence - klíčovým enzymem kódovaným cpDNA je velká podjednotka RuBisCO (ribuloso-1,5-bisfosphate carboxylase-oxygenase); RuBisCO tvoří cca 50 % rostlinných bílkovin → pravděpodobně nejrozšířenější protein na Zemi
- ze sekvenování cpDNA řady druhů (k 30. 4. 2013 známo 332 sekvencí) vyplynulo, že nejčastěji je cpDNA tvořena dvěma úseky převrácených opakování (IRA, IRB) mezi nimiž je kratší (SSC) a delší (LSC) unikátní úsek
- v buňkách nezelených pletiv jsou jiné plastidy: amyloplasty (škrob), elaioplasty (oleje), chromoplasty (karoteny), nepotřebné geny inaktivovány metylací
Dědičnost znaků kódovaných cpDNA: - typická je dědičnost syntézy chlorofylu – panašování - panašovaná rostlina je genetickou chimérou - u většiny rostlin se přenášejí plastidy do potomstva samičí gametou, na cpDNA samčí rostliny nezáleží (ne však u Pelargonium, Oenothera, Hypericum, Nepeta)
APIKOPLASTOVÝ GENOM Apikoplast - vyskytuje se v cizopasných prvocích ze skupiny výtrusovců (Apicomplexa; Plasmodium falciparum způsobuje malárii) - v minulosti sloužil jako chloroplast, nyní už neobsahuje žádný pigment → nefotosyntetický plastid - živočichové, kteří představují hostitele těchto cizopasníků, plastidy nemají, a tak je apikoplast předmětem zájmu pro výzkum léčiv proti parazitům z řad výtrusovců - vznikl sekundární endosymbiózou (má 4 membrány)
APIKOPLASTOVÝ GENOM
MITOCHONDRIOVÝ GENOM
Mitochondriová DNA (mtDNA) - u živočichů a většiny hub kruhová dvouvláknová molekula, u savců o délce 15-18 kb - u rostlin je mt genom často tvořen komplexem kruhových molekul různé velikosti a má celkem 186-2500 kb (mt plazmidy x chromozomální mtDNA) - každá mitochondrie má více (5-10) molekul DNA a každá buňka má více (stovky) mitochondrií → tisíce kopií mtDNA na buňku - mt genom lze na základě rozdílného výskytu a organizace genů dělit na dvě velké skupiny: i) ancestrální genomy – zachovaly si mnoho charakteristik jejich eubakteriálních předchůdců (mají více genů, jejich rRNA geny jsou podobné eubakteriálním, kódují téměř kompletní sestavu tRNA, obsahují i introny a spacerovou DNA, geny mají organizované do klastrů jako eubakterie); některé rostliny a protista ii) odvozené genomy – obvykle menší, obsahují meně genů, rRNA geny jsou zcela jiné než u eubaktérií; většina živočichů a hub - k 30. 4. 2013 sekvenováno 3320 kompletních mtDNA
Lidská mtDNA - 16 569 bp dlouhá, kóduje 2 rRNA, 22 tRNA, 13 polypeptidů podjednotek enzymů oxidativní fosforylace (zbývajících 74 polypeptidů je kódováno v jádře) - nemá introny a téměř žádné nekódující nukleotidy mezi geny a její mRNA neobsahuje na 5‘ ani 3‘ konci nepřekládané oblasti - vlákna se liší obsahem G → těžké (H) a lehké (L) vlákno - každé vlákno má jen jeden promotor → transkripcí vznikají 2 velké prekurzorové mRNA později rozštěpené na jednotlivé mRNA - mnoho polypeptidových genů neobsahuje kompletní terminační kodon, jejich mRNA končí buď U nebo UA a teprve přidáním poly(A) na 3‘ konec vznikne stop kodon UAA
Kvasinková mtDNA - organizace zcela jiná než u lidské mtDNA (5 x větší, ale nese jen o 6 genů více, rozdíl je tvořen introny a nekódující DNA dlouhými spacery, mRNA většinou obsahuje 5‘ a 3‘ UTR)
mtDNA vyšších rostlin - největší a nejkomplexnější mt genom (186 kbp u hořčice, 2400 kbp u dýně) - díky přítomnosti dlouhých přímých repetic v jejich mtDNA je možná mezi nimi homologní rekombinace za vzniku menších molekul
- u mtDNA existují odchylky od univerzálního genetického kódu, které jsou často u různých organismů různé - redakce (editing) RNA úprava nukleotidové sekvence mRNA nízkomolekulárními RNA
Mitochondrie jsou nositeli šlechtitelsky vysoce žádoucího matroklinně dědičného znaku rostlin – cytoplazmatické pylové sterility (CMS, cytoplasmic male sterility). - je podmíněna geny ležícími na chromozomální mtDNA, ale výskyt určitého spektra mitochondriálních plazmidů se zdá být v korelaci s projevením znaku - podstatou je tvorba abnormálního proteinu, který se specificky projevuje v mitochondriích prašníků, u jednoho druhu přitom může existovat několik různých typů CMS - nalezena u asi 150 druhů, jednotlivé druhy mají různé proteiny a mechanizmy působení - CMS se využívá k produkci heterózního osiva, kdy odpadá nutnost pracné ruční kastrace květů - maximálního využití doznala CMS u kukuřice, ale dnes se používá masivně u řady dalších plodin (rajčata, brukvovité) - tuto sterilitu lze eliminovat působením alel jaderných genů nazvaných obnovitelé fertility (Rf, fertility restorer): po opylení pylově sterilních jedinců s alelami rfrf pylem rostlin genotypu RfRf vznikne fertilní potomstvo konstituce Rfrf
Mutace v mtDNA jsou zodpovědné u kvasinek za mutace označovaných jako „petite“ nebo „poky“ u Neurospora. U člověka jsou mutace mtDNA zodpovědné především za neuromuskulární choroby. Mitochondrie nemá žádný systém reparace DNA, ta je však vystavena vysokým koncentracím kyslíkových radikálů → vysoká mutabilita (u obratlovců 5-10 x větší než v jaderné DNA) → evoluční studie. Procesy replikace, transkripce a translace mtDNA jsou u různých organismů velice variabilní, přičemž vykazují pozoruhodnou směs eubakteriálních, eukaryotických a pro mitochondrie specifických rysů.
DĚDIČNOST PODMÍNĚNÁ VIRY NEBO INFEKČNÍMI AGENS - některé organismy nebo typy buněk obsahují infekční složky, které se mohou předávat do dalších generací i) viry ii) viroidy iii) priony VIRY - dědičná informace virů je velice mnohotvárná stejně jako mechanismy transkripce a translace virového genomu - rostlinných virů je známo přes 300 typů s tím, že většina má jako genetickou složku RNA (88 %, ze všech virů má RNA 62 %)
• Virus tabákové mozaiky (TMV, tobacco mosaic virus) - infikuje asi 200 druhů, mezi nimi i významné kulturní plodiny - RNA(+) cca 6400 bází, cca 2100 jednotek plášťového proteinu - kóduje informaci pro 4 proteiny (2 tvoří virovou RNA polymerázu, movement protein, plášťový protein)
Reprodukce TMV: - pomocí hostitelských ribozómů se vytvářejí dvě podjednotky specifické virové RNA polymerázy (překládaný úsek obsahuje stop kodon UAG, který je „pročten“ díky přítomnosti specifické – izoakceptorové – tRNA, která na místo stop kodonu včleňuje tyrozin → vzniká druhý polypeptid, jenž má s prvním společný první úsek, ale je delší) - dochází k zahájení replikace RNA(+) na RNA(-), z tohoto vlákna opět vzniká replikací RNA(+), jednak v úplné velikosti, jednak ve zkrácené podobě tzv. dvou subgenomových RNA - na nich informace pro syntézu jak MP proteinu tak CP (plášťového) proteinu
The replication cycle of Tobacco mosaic virus (TMV). TMV enters a wounded plant cell to begin the replication cycle [1]. As the cost protein (CP) molecules are stripped away from the RNA [2], host ribosomes begin to translate the two replicase-associated proteins. The replicase proteins (RP) are used to generate a negative-sense (- sense) RNA template from the virus RNA [3]. This - sense RNA is, in turn, used to generate both full-length positive-sense (+ sense) TMV RNA [4] and the + sense subgenomic RNAs (sgRNAs) [5] that are used to express the movement protein (MP) and CP. The + sense TMV RNA is either encapsidated by the CP to form new TMV particles [6] or wrapped with MP [7] to allow it to move to an adjacent cell for another round of replication.
VIROIDY - skupina rostlinných infekčních agens tvořených krátkými (240380 bází) jednovláknovými kruhovými molekulami RNA - působí vážná onemocnění důležitých plodin (kokosová palma, brambory, chmel…) - šíří se mechanicky, nemají žádný plášťový protein, jsou lokalizovány v jádře, především v jadérku - nedochází na nich k translaci, ale choroby vyvolávají interferencí s regulačním aparátem rostlinných buněk - na vlákně řada komplementárních úseků → sekundární struktura ve formě prutu se střídáním jedno- a dvouvláknových úseků (všechny známé viroidy obsahují typickou sekvenci GAAAC, v její blízkosti se nachází centrální konzervativní oblast)
VIROIDY
VIROIDY
A model for the role of RNA silencing in the pathogenicity and evolution of viroids and viral satellite. Replication of the subviral RNAs generates dsRNA intermediates, which are processed by Dicer into 21- to 25-nt siRNAs, and these siRNAs are then incorporated into siRNA-ribonuclease complexes (RISC). If significant sequence identity exists between a region in the subviral RNA genome and a region in host gene mRNA (shown in red), RISC will target the host gene for degradation leading to symptom development. RISC can also target the subviral genome for degradation, forcing the subviral RNA to evolve and to adopt and maintain RNA silencing-resistant secondary structure. (M.-B. Wang et al., Proc Natl Acad Sci, 101:3275–80, 2004.)
- replikují se modelem rotujícího kruhu (replikací vznikne dlouhá lineární (-) molekula, která je oligomérní → rozštěpení na jednotkové úseky a jejich cirkularizace → replikace rotujícím kruhem → oligomer (+) jednotek a jeho rozštěpení) - štěpení na jednotkové úseky je katalyzováno samotnou viroidovou RNA (RNA působí jako enzym → ribozym = RNA s enzymatickou aktivitou)
Viroidům jsou velmi podobné virusoidy. Jsou to infekční agens tvořené opět jednořetězcovou RNA a napadající rostliny. Na rozdíl od viroidů se nemohou replikovat nezávisle, ale vyžadují pomocný virus, v jehož kapsidách se i šíří. Podobně jako viroidy nekódují žádný protein, ale na rozdíl od nich se nereplikují v jádře buňky pomocí jaderných RNA polymeráz, nýbrž v cytoplazmě. Virusoidy patří do větší skupiny infekčních agens zvaných satelitní RNA. Ty se nacházejí u baktérií, hub, rostlin i živočichů. PRIONY - infekční bílkoviny způsobující závažná neurodegenerativní onemocnění - první popis prionového onemocnění z r. 1738 (Francie, ovce, klusavka, scrapie), v r. 1920 neuropatolog H. G. Creutzfeld popsal lidské degenerativní onemocnění mozku, v r. 1925 totéž A. M. Jacob - v 50. letech 20. stol. na Nové Guinei popsána choroba kuru spojená s rituálním kanibalismem (po jeho zákazu vymizení nemoci)
- prionová bílkovina PrPC je běžnou součástí hlavně nervových buněk (význam pro dlouhodobou paměť ??), její patologická forma PrPSc se vyznačuje změnou konformace, jež je příčinou jejích zcela nových vlastností
- ve VB se krávy nakazily infekční kostní moučkou z ovcí - přenositelnost mezi druhy závisí na míře příbuznosti PrP (čím větší rozdíly, tím menší možnost přenosu ??) - prionová onemocnění postihují řadu dalších druhů (jelen, los, kočka, norek, mýval, antilopa kudu) - člověk získá nemoc spontánní mutací, dědičně od předka, nakaženým jídlem (maso ??), dříve též iatrogenně při transplantaci rohovky nebo podáním znečištěného růstového hormonu z hypofýzy zemřelých lidí
PREDETERMINACE - není určena cytoplazmatickou dědičností, ale napodobuje ji svou matroklinitou - některé fenotypové rysy potomka závisí na obsahu mateřské mRNA Př.: zavíječ moučný (Ephestia kühniella) - pigmentace kutikuly larev a očí imág je podmíněna dominantní alelou genu A, která řídí syntézu bezbarvého prekurzoru pigmentu (kinureinu), larvy aa jsou tedy světlé s červenýma očima - při křížení samice Aa se samcem aa je sice polovina larev genotypu aa a měly by být světlé, ve skutečnosti však jsou všechny larvy zpočátku tmavé; s dalším vývojem však intenzita pigmentace klesá a imaga štěpí v barvě očí 1:1 - důvodem je to, že ve všech vajíčkách heterozygotní samice byl přítomen kinurein (matka byla Aa), ze kterého vznikl příslušný pigment, u jedinců aa však nový kinurein a tím ani pigment nevznikal, takže došlo k postupnému „vyředění“
Př.: plovatka toulavá (Limnea peregra) - o pravo- nebo levotočivosti ulity rozhoduje prvé dělení zygoty, přičemž jeho průběh se řídí mRNA vajíčka, o níž rozhoduje mateřský genotyp
TKÁŇOVÉ A BUNĚČNÉ KULTURY - kultury rostlinných pletiv a živočišných tkání na syntetických médiích (kultury in vitro) - počátky u rostlin Haberlandt (1902), u živočichů Roux (1892) - rozdíly mezi živočišnými a rostlinnými kulturami: i) kultivace rostlinných buněk časově neomezená x trvale lze z ž. buněk kultivovat jen buňky nádorové* a kmenové buňky ii) rostlinné kultury umožňují regenerovat celou rostlinu z jediné somatické buňky x u živočichů ze som. buňky obtížně a jen pomocí oocytu iii) média pro rostlinné kultury jednoduchá x pro živ. kultury speciální komplexní média * např. HeLa buňky z cervikálního tumoru pacientky jménem Henrietta Lacks (1920-1951)
• Rostlinné tkáňové kultury - projevy somaklonální variability (komplex genetických a epigenetických změn v kultivovaných buňkách) → při regeneraci nových rostlin se projeví zvýšením variability regenerantů - kultivací prašníků či mikrospor lze získávat haploidní a dihlaplidní rostliny - díky fúzi protoplastů lze získávat somatické hybridy Média - agarová (agarózová) nebo tekutá, obsahují tři hlavní složky: i) anorganické látky (mikro a makroelementy) ii) organické látky (některé látky si rostlinné buňky v in vitro kultuře nedokážou syntetizovat, nebo jen v malé míře; sacharóza, org. zdroj dusíku, vitamíny) iii) růstové látky (hormony; auxiny, cytokininy, gibereliny, ABA)
Typy rostlinných kultur • meristémové kultury - tvořeny nepatrnými (< než 1 mm) částmi vzrostných vrcholů rostlin s dělivými pletivy (meristémy) - dochází k vysokému stupni regenerace rostlin aniž dochází k tvorbě kalusu (dediferencovaného pletiva) → somaklonální variabilita minimální - k pro rychlé množení zejména okrasných rostlin, pro získání geneticky identických rostlin (klonů), eliminaci virových patogenů • kalusové kultury - tvořeny dediferencovanými buňkami, kalus může procházet cyklem rostlina-kalus-rostlina díky změnám poměru RL (obecně je pro indukci kalusů třeba vysoká hladina auxinů nízká cytokininů, pro udržení jeho růstu vysoké hladiny obou skupin RL a pro regeneraci prýtů nízká hladina auxinů a vysoká cytokininů) - vysoká míra somaklonální variability
- regenerace prýtů probíhá buď cestou organogeneze (prýty obvykle vznikají z více než jedné kalusové buňky, a proto mohou být geneticky chimérní), nebo cestou somatické embryogeneze (som. embrya vždy vznikají z jediné kalusové buňky a jednotlivé rostliny jsou tedy geneticky homogenní) • buněčné suspenzní kultury - rozpadavé kalusy pěstované v tekutém médiu - umožňují práci analogickou práci s bakteriálními kulturami (aplikace mutagenu a vysetí kultury na selekční médium) • prašníkové kultury - kultivací prašníků za vhodných podmínek lze docílit androgeneze, vzniku haploidních rostlin (někdy též přímo kultivací mikrospor) - kolchicinem lze získat homozygotní dihaploidní rostliny (využití ve šlechtění, brambor, rajče, řepka…)
• protoplastové kultury - působením celuláz a pektináz lze získat protoplasty - lze do nich vnášet cizorodou DNA, lze je fúzovat a vytvářet tak mezidruhové somatické hybridy - při fúzi dochází někdy spontánně (někdy i záměrně) k eliminaci jaderného genomu jednoho z partnerů za vzniku cybrida (cytoplazmatický hybrid, buňka obsahuje cytoplazmatický genom obou partnerů) - somatická hybridizace se dnes používá při šlechtění (křížení s planým druhem, který bývá zdrojem různých genů, především genů rezistence)
