Možnost určení geografického původu vín multiprvkovou analýzou ICP

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDĚCKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

Možnost určení geografického původu vín multiprvkovou analýzou ICP Diplomová práce

Lucie Šimoníková

Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Viktor Kanický, DrSc.

1

Brno 2016

Bibliografický záznam

Autor:

Lucie Šimoníková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav chemie

Název práce:

Možnost určení geografického původu vín multiprvkovou analýzou ICP

Studijní program:

Chemie

Studijní obor:

Analytická chemie

Vedoucí práce:

prof. RNDr. Viktor Kanický, DrSc.

Konzultant práce:

prof. RNDr. Vlastimil Kubáň, DrSc.

Akademický rok:

2015/2016

Počet stran:

73

Klíčová slova:

víno, rostliny, indukčně vázané plazma, optická emisní spektrometrie, chemometrie

2

Bibliograhic Entry

Autor:

Lucie Šimoníková Faculty of Science, Masaryk University Department of Chemistry

Title of Thesis:

Interregional classification of wine by multielemental analysis with ICP spectrometry

Degree Programme:

Chemistry

Field of Study:

Analytical Chemistry

Supervisor:

prof. RNDr. Viktor Kanický, DrSc.

Konzultant práce:

prof. RNDr. Vlastimil Kubáň, DrSc.

Academic Year:

2015/2016

Number of Pages:

73

Keywords:

wine, plants, inductively coupled plasma, optical emission spectrometry, chemometrics

3

Abstrakt Tématem této diplomové práce je možnost rozlišení geografického původu vína a určení prvku propojujícího systém půda – rostlina – víno. Vzorky moravských biovín, rostlin a půd byly dodány z vinařství Marcinčák z Mikulovské podoblasti. Dále byly k analýze dodány vzorky španělských, italských a maďarských vín. Všechny vzorky byly analyzovány metodou ICP-OES a následně statisticky vyhodnoceny v programu R.

Abstract The topic of this thesis is the possibility of determination of geographic origin of wines and the opportunity to determine the element connecting the system soil – plant – wine. Samples of Moravian organic wines, plants and soil were delivered from the winery Marcinčák in Mikulov sub-region. Samples of Spanish, Italian and Hungarian wines were also delivered for analysis. All samples were analyzed by ICP-OES and then statistically evaluated in program R.

4

5

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu své diplomové práce prof. RNDr. Viktorovi Kanickému, DrSc., svému konzultantovi prof. RNDr. Vlastimilovi Kubáňovi, DrSc., Mgr. Ing. Lubomíru Prokešovi, PhD. za ochotu, trpělivost a cenné rady a připomínky.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně dne 6. ledna 2016

....................................... Lucie Šimoníková

6

Obsah 1.

Úvod ........................................................................................................................................................ 8

2.

Teoretická část ......................................................................................................................................... 9 2.1. Chemické složení révového vína ............................................................................................................ 9 2.1.1. Organické složky ........................................................................................................................... 9 2.1.2. Anorganické složky...................................................................................................................... 11 2.2.

Falšování vín, jejich autenticita a provenience .................................................................................... 13

2.3. Příprava vzorků pro analýzu ................................................................................................................ 15 2.3.1. Příprava vzorků vína .................................................................................................................... 15 2.3.2. Příprava vzorků půdy a letorostů ................................................................................................ 16 2.4. Metody stanovení analytů ................................................................................................................... 16 2.4.1. Prvková analýza .......................................................................................................................... 17 2.4.1.1. Optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES) ............................ 17 2.4.1.2. Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) .................................. 18 2.4.1.3. Atomová absorpční spektrometrie (AAS) ............................................................................... 18 2.4.1.4. Další metody využívané pro stanovení obsahu prvků ve víně ................................................ 19 2.5. 3.

Chemometrické metody ....................................................................................................................... 19

Experimentální část ............................................................................................................................... 20 3.1.

Chemikálie ........................................................................................................................................... 20

3.2.

Popis vzorků a referenčních materiálů ................................................................................................. 21

3.3. Přístrojové vybavení............................................................................................................................. 23 3.3.1. Mikrovlnné rozkladné zařízení ETHOS 1 ..................................................................................... 23 3.3.2. Optický emisní spektrometr s indukčně vázaným plazmatem iCAP 6500 Duo ........................... 24 4.

Výsledky a diskuze ................................................................................................................................. 24 4.1.

Rozklad a příprava vzorků půd a rostlin pro analýzu ........................................................................... 24

4.2. Optimalizace podmínek měření ........................................................................................................... 25 4.2.1. Vliv obsahu organické matrice ve víně na stabilitu měření, optimalizace poměru signálu k pozadí a test robustnosti plazmatu ........................................................................................................... 25 4.2.2. Studium matrix efektu vyvolaného celkovým obsahem organických látek ve vzorcích vín v závislosti na zředění ................................................................................................................................... 32 4.2.3. Výběr analytických čar s ohledem na spektrální interference a meze detekce v reálných vzorcích 35 4.3.

Kalibrace .............................................................................................................................................. 36

4.4. Chemometrické hodnocení výsledků.................................................................................................... 38 4.4.1. Půdy ............................................................................................................................................ 39 4.4.2. Rostliny ....................................................................................................................................... 41 4.4.3. Vína ............................................................................................................................................. 57 4.4.3.1. Moravská vína ........................................................................................................................ 57 4.4.3.2. Moravská vs. zahraniční vína .................................................................................................. 64 5.

Závěr ...................................................................................................................................................... 69

7

1. Úvod První úspěšné pokusy o určení geografického původu vína podle prvkového složení se uskutečnily v r. 1979 (Rb, Mn, K, Li, Mg, Ca, Na, Fe a Sr). Se zavedením nových analytických metod s nižšími detekčními limity se otevřela možnost spolehlivého stanovení stopových a ultrastopových koncentrací prvků. Některé studie prokázaly, že vybrané stopové prvky je možné využít pro „fingerprinting“, někdy dokonce k určení pravosti vína. Určení geografického původu vína je důležité z pohledu falšování vína. Cílem diplomové práce je studium možnosti klasifikace vín pomocí prvkového složení s použitím chemometrických metod.1 Toto s sebou nese úkol vyvinout co nejjednodušší metodu z hlediska zpracování vzorků, dostatečně robustní, přesnou a rychlou. Kompromisem mezi stávajícími metodami je optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem. Pro komplexnost analýzy se nabízí otázka vztahu mezi systémem půda – rostlina – víno. Z tohoto důvodu je dílčím cílem této práce také analýza rostlin (listy, žilnatina) a půdy.

8

2. Teoretická část 2.1. Chemické složení révového vína Vínem je nazýván alkoholický nápoj získaný kvašením odzrněných rozdrcených bobulí vinné révy nebo hroznového moštu. Základním předpokladem pro přípravu dobrého vína jsou kvalitní a zdravé hrozny a správný postup během jejich zpracování. Víno je složitá matrice, obsahující velké množství organických i anorganických složek vodu, sacharidy, kyseliny, minerální látky, dusíkaté sloučeniny, fenolové sloučeniny, vitamíny, aromatické látky a další.2 V roce 1975 bylo určeno 235 složek ve víně, díky novějším analytickým metodám se tento počet zvýšil na více než 1000. Obsah látek ve víně závisí na environmentálních faktorech, odrůdě vína, typu půdy, použitých hnojivech a pesticidech, ale také na způsobu zpracování, použitých aditivech, použitých strojích, skladování a dalších faktorech. K nejvýznamnějším změnám ve složení dochází v průběhu jednotlivých kroků zpracování.3,4 Během fermentace dochází k poklesu obsahu cukrů, kyselin a minerálních látek, zvyšovaní obsahu alkoholu a postupnému srážení vinného kamene, bílkovin a tříslovin. Během zrání dochází k dekarboxylaci kyseliny jablečné a vzniku kyseliny mléčné, vznikají sekundární aromatické látky. Dále se mošt a víno upravuje pomocí odstraňování kalů, síření (K2S2O5 3-20 g/hl), přídavku sacharózy, odkyselení pomocí CaCO3, přídavku kyselin, čiření (K4[Fe(CN)6], bílkoviny, agar, bentonity), stabilizace a tzv. stárnutí.2,5

2.1.1. Organické složky Po vodě druhou nejvíce zastoupenou složkou vína jsou alkoholy. Ve víně jich bylo identifikováno více než třicet. Nejvíce zastoupeným alkoholem je ethanol vznikající alkoholovým kvašením jednoduchých sacharidů působením kvasinek rodu Saccharomyces (fermentací) a jeho obsah se pohybuje mezi 70-100 g/l. Obsah alkoholu závisí na množství sacharidů v moštu. U fortifikovaných vín dosahuje obsah ethanolu hodnoty až 200 g/l. Dalším alkoholem zastoupeným ve víně ve vyšší koncentraci je methanol, jehož přítomnost je spojena s hydrolýzou pektinů a jeho podíl je závislý na délce macerace pevných částí hroznů. Dle OIV (Organisation Internationale de la Vigne et du Vin) je doporučovaná horní hranice obsahu methanolu 300 mg/l u červeného vína a 150 mg/l u bílého vína. Maximální povolený obsah je 10 g/l ethanolu.

9

Alkoholy obsahující více než dva uhlíky (vyšší alkoholy) jsou spolu s estery látkami ovlivňujícími buket vína. Jejich obsah je závislý na odrůdě vinné révy a bývají ve víně obsaženy ve stopovém množství.3 Obsah polyalkoholů závisí na stavu hroznů podrobených fermentaci. Rozdíly se projevují mezi zdravými a vyzrálými hrozny a hrozny postiženými hnilobou, či botrytizovanými hrozny, což jsou bobule napadené ušlechtilou plísní Botrytis, která způsobuje snížení obsahu vody. Jedním z těchto alkoholů je glycerol, jehož obsah ve víně je po vodě a ethanolu třetí nejvyšší a v ideálním případě se pohybuje kolem hodnoty 6,7 g/l při 12% objemových ethanolu. Při fermentaci botrytizovaných bobulí se však obsahu glycerolu může zvýšit až na 20 g/l. Další alkoholy, jejichž přítomnost a obsah závisejí na zdravotním stavu hroznů, jsou erytriol, arabitol, xylitol a ribitol. Obsahuje-li víno větší množství sorbitolu (nad 100 mg/l), lze předpokládat přídavek jiného ovoce (nejčastěji jablka) k fermentaci. Obsah mannitolu vyšší než 100 mg/l svědčí o přítomnosti a aktivitě bakterií mléčného kvašení. Látky ovlivňující sladkou chuť vína jsou monosacharidy (glukóza, fruktóza, galaktóza, xylóza,…) a oligosacharidy (vyšší obsah maltózy ukazuje na podvodné doslazení; laktóza se ve vínech běžně nevyskytuje, může se však objevit při čiření vína; přítomnost sacharózy svědčí o falšování vína…). Další významnou skupinou, která má příznivý vliv na zdraví, jsou polyfenoly. Obsah těchto látek ve víně je zvyšován „Kachetinskou technologií přípravy vína“ (zvláštní místní technologie Gruzínských vín – kvašení moštu ve rmutu). Jeden z polyfenolů, trans-resveratrol - uznávaný anti-karcinogen, se koncentruje hlavně ve slupkách bobulí. Vyskytuje se ve vyšších obsazích v bobulích pocházejících ze severních klimatických podmínek. Bylo zjištěno, že nejvíce resveratrolu produkuje odrůda Pinot noir. Flavonoidy způsobují hořkost vína a tvoří skupinu cca 60 látek, které mají obvykle pozitivní vliv na lidský organismus a vyznačují se skeletem se sumárním vzorcem C 6-C3-C6. Jedná se o pigmenty a třísloviny, jejichž obsah závisí na druhu vína, způsobu zpracování a skladování (dubové sudy – flavonony), klimatických podmínkách a dalších faktorech.3

10

2.1.2. Anorganické složky Obsah minerálních látek ve víně (1,8-2,5 g/l) je nižší než v moštu (3-4 g/l) vlivem srážení a sorpce při jednotlivých technologických operacích (fermentaci, čiření, filtraci atd.). Chloridy bývají ve víně obsaženy v koncentraci do 50 mg/l; vína z přímořských vinic obsahují až 600 mg/l. Zvýšený obsah chloridů ve víně může být způsoben použitím technologie čiření vaječným bílkem v důsledku přítomnosti NaCl. Maximální povolený obsah síranů je 1 g/l, výjimečně 2,5 g/l. Obsah síranů v moštech bývá 100-200 mg/l, ve vínech 160-400 mg/l a tento obsah se může zvyšovat během ležení vín díky tzv. sádrování (výroba sherry vín), postupnému síření a přídavkem síranu amonného do moštu. Přídavek kyseliny sírové je nepřípustný. Obsah oxidu siřičitého je závislý na druhu vína. Nejvyšší povolený obsah je pro výběr z bobulí, výběr z cibéb, ledové víno a slámové víno (400 mg/l) a nejnižší pro červené víno (150 mg/l). Fosfor se nachází ve víně především ve formě fosfátu a kyseliny fosforečné; obsah fosforu bývá 20-300 mg/l (červená vína ho obsahují 2x více než bílá). V některých případech se během fermentace přidává hydrogenfosforečnan amonný, který podporuje růst kvasinek (povolený přídavek je 1 g/l ve formě soli). Obsahuje-li víno přebytek fosforečnanu, vysoký obsah železa a nízký obsah kyselin, pak se tvoří bílý zákal (fosforečnan železitý). Koncentrace fluoru je velmi nízká a závisí na regionu (řádově maximálně jednotky mg/l). Větší obsahy svědčí o postřiku fluorosilikáty nebo vytvrzení stěn nádrží fluorosilikátem hořečnatým. Použití NaF jako antiseptika je zakázané. Bor se vyskytuje ve vínech v koncentracích v rozmezí 1-12 mg/l, přičemž koncentrace 13 mg/l je hraniční hodnotou. Vyšší obsahy poukazují na vína sklizená na vinicích na vulkanických půdách. Dále obsah boru může být zvýšen v důsledku použití boritanu jako antiseptika, či k zabránění vypadávání vinného kamene, což je zakázaná metoda – takto upravené víno se pokládá za falšované. Obsah draslíku závisí na charakteru a hnojení půdy, odrůdě vinné révy a podnože a taktéž na vyzrálosti hroznů. Ze všech prvků je ve vínech v nejvyšší koncentraci obsažen právě draslík. Použití enologických přípravků jeho obsah ve víně zvyšuje, sedimentace draselných solí (vinný kámen) obsah draslíku naopak snižuje. V moštech bývá obsah draslíku vyšší než ve víně (mošt – 0,8-2 g/l, víno – 0,1-1,8 g/l). Přebytek draslíku způsobuje močopudnost. Doporučená hranice pro obsah sodíku ve víně je 60 mg/l. Důležitý je také poměr K:Na >10. Obsahuje-li víno více než 60 mg/l sodíku, pak lze předpokládat čiření sodným bentonitem, přídavek uhličitanu sodného pro odkyselení vína nebo ošetření hydrogensiřičitanem sodným i chloridem sodným při čiření vín. Vína z vinic v blízkosti moře mohou obsahovat i nad 200 mg/l sodíku. Pro tyto případy OIV připouští výjimky. 11

Vápník je obsažen především v bobulích a je po draslíku druhým nejvíce se vyskytujícím kationtem v hroznech. Jeho koncentrace je závislá na pH a obsahu ethanolu (bílá vína s vysokou aciditou mají 80-200 mg/l vápníku; rozpustnost síranu vápenatého klesá se zvyšujícím se obsahem alkoholu). Během ležení dochází ke kolísání obsahu vápníku (stejně jako i draslíku). Vysrážení vínanu vápenatého však není závislé na teplotě, proto jde o nekontrolovatelný proces a dochází k němu při obsahu nad 60 mg/l u červených vín a nad 80 mg/l u bílých vín. Koncentrace hořčíku ve víně bývá 80-140 mg/l. Jeho soli jsou rozpustné ve víně, proto nedochází během ležení vína a fermentace k výraznému úbytku. Vyšší podíl hořčíku vzhledem k vápníku poukazuje na nižší koncentraci kyseliny octové a acetaldehydu a vyšší koncentraci kyseliny citronové a glycerolu. Soli dvojmocného železa jsou i při vyšších koncentracích rozpustné. Železité soli jsou naopak málo rozpustné a jejich obsah závisí na koncentraci kyslíku a SO2. Při obsahu 8-15 mg/l Fe3+ se mohou ve víně vysrážet barviva (modrý zákal) nebo fosforečnany (bílý zákal). Tento jev se dá odstranit např. přídavkem kyseliny citronové, askorbové, fytátem vápenatým, ferrokyanidem (záleží na druhu vína a obsahu železa). Běžná koncentrace železa ve víně je 2-5 mg/l, je-li ho více (15-20 mg/l), pak železo může pocházet z půdních nečistot (špinavé hrozny), nekvalitního kovového vinařského materiálu nebo uskladnění ve špatně opracovaných nádržích. Víno s vysokým obsahem železa komplikuje alkoholické cirhózy. Naopak nízký obsah železa způsobuje anémii. Měď se ve víně vyskytuje jako měďný a měďnatý kation. Obsah mědi ve víně může být až 1 mg/l. Tato měď je převážně exogenního původu (vinařský materiál z mědi, bronzu, mosazi). Nejvíce mědi se do moštu dostává z postřiků – použití pesticidů a fungicidů ovlivňuje obsahy i dalších prvků (Cd, Mn, Pb).7 Během fermentace se obsah mědi snižuje v důsledku redukce siřičitanem, následnou sedimentací a adsorpcí na kvasniční kaly, které se z kvasného prostředí odstraní. Ve víně může vznikat měďný zákal, který při kontaktu se vzduchem mizí oxidací měďných sloučenin na snadno rozpustné měďnaté, lze jej taktéž eliminovat přídavkem ferrokyanidu draselného (jen bílá a růžová vína). Měďný zákal způsobuje hořkou příchuť. Obsah křemíku se ve víně pohybuje v rozmezí 5-20 mg/l; vyšší obsah může být důsledkem použití silikagelu jako flokulantu při čiření vín, což je povolená metoda. Půdy bohaté na mangan mají vliv na obsah tohoto prvku ve víně. Koncentrace se pohybují od 0,4 do 4 mg/l. Obsah manganu také může ovlivňovat použití fytosanitárních přípravků. Zinek obsažený ve víně se pohybuje v koncentracích 0,2-5 mg/l. Vyšší koncentrace jsou důsledkem užívání pokoveného (pozinkovaného) vinařského zařízení a případně i použitím fungicidů. Jak u manganu, tak u zinku dochází během delšího nakvašení rmutu na pevných

12

částech hroznů i ke zvýšení koncentrace zinku ve víně. Vyšší obsah zinku může dodávat vínu svíravou chuť, proto je maximální povolená koncentrace 5 mg/l. Olovo je toxický prvek a jeho obsah ve víně je 5-10 µg/l. Jeho původ je různý – z půdy, z ochranných přípravků, z prachu výfukových plynů (u starších vín), z dešťové vody, z továren (obdobně jako Cd), z nádrží s keramickými dlaždicemi, potrubí z bronzu nebo mosazi, ale i z vinařských materiálů s nátěrem z olovnatých barev. Koncentrace arsenu ve víně je limitována množstvím 0,2 mg/l. Od roku 2001 je platný zákaz používání solí arsenu k postřiku rostlin, které byly dříve používány jako pesticidy. V té době byly zjišťovány vyšší koncentrace arsenu ve víně. Hliník bývá obsažen ve víně v koncentraci 1-5 mg/l. Do vína se hliník dostává během ošetření bentonitem. Vyšší konzumace hliníku může podporovat vznik Alzheimerovy choroby. Dále může dojít ke kontaminaci hliníkem (stejně jako Cd, Cr, Cu, Fe, Zn) z materiálů, se kterými jsou vína dlouhodobě v kontaktu.2,3,6,7,8,9

2.2. Falšování vín, jejich autenticita a provenience Víno, jakožto nápoj rozšířený po celém světě a konzumovaný ve velké míře, má nejen svoji tržní hodnotu, ale také hodnotu sociálně-kulturní. Tento nápoj je snadno falšovatelný a často k jeho falšování dochází. Nejčastěji k tomuto dochází pomocí přídavku vody, ethanolu, glycerolu, cukrů, barviv a úpravou kyselosti vína. Další způsob nekalých obchodních praktik s vínem spočívá v uvedení jiného geografického původu vína, než který odpovídá skutečnosti. Víno je komplexní matrice, jejíž složení závisí na odrůdě, půdě a klimatu, vinařských praktikách (hnojení, postřiky), skladování a dopravě.10,11 Právě na určování geografického původu vína (provenienci) jsou zaměřovány různé analytické metody. Vzhledem ke komplexnosti matrice je vhodná víceprvková analýza, která je využitelná také pro kontrolu povolených limitů obsahu prvků ve víně. Pro stanovení Na, Mg, Si, P, S, K, Ca a Fe je vhodnou metodu optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES) a pro stanovení nižších obsahů a stopových a ultrastopových prvků (vzácné zeminy, těžké kovy, Li, Be, Mn, Sr, Rb. aj.) metoda hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS).12 Různé procesy probíhající během zpracování vína (fermentace, čiření, filtrace) mohou mít v různé míře vliv na obsah prvků ve víně před a po zpracování. Méně ovlivněné jsou koncentrace např. Li, Rb a kovů alkalických zemin. K čiření vín jsou často využívány bentonity, problémem může být uvolňování prvků v nich obsažených v závislosti na pH. Tyto důvody poukazují na důležitost analýzy moštu již před zpracováním.13

13

Pro určení geografického původu vín mají největší význam prvky, které vykazují nejmenší změny během technologických postupů. Jde o tyto prvky: Cr, Co, Sr, Cs, Sc, Eu, Hf, Ta, Li, Rb, lanthanoidy a kovy alkalických zemin. Dále je možné využití stanovení izotopových poměrů (180/16O, 13C/12C), organických sloučenin olova nebo aminokyselin.11

Na obsahy prvků ve víně bylo provedeno již mnoho studií. Dle jedné z nich bylo možné prokázat provenienci vína z různých oblastí Slovinska díky rozdílnému obsahu Cr, K a Se a částečně Sb, Sn, Cu a Zn.14 Další studie byla zaměřena na stanovení obsahů Cr, Cu, Ni, Pb a Zn ve vzorcích vín a moštů z Ukrajiny, dále v zavlažovací vodě, sedimentech, listech a hroznech.15 Pro analýzu vín pocházejících z ČR byly vybrány tyto prvky: Al, As, Ba, Ca, Ce, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, Pb, Rb, Sb, Sn, Sr, Th, U, V, Y a Zn, z čehož byly jako nejvhodnější vybrány Al, Ba, Ca, Co, K, Li, Mg, Mn, Mo, Rb, Sr, V a dále poměry prvků Sr/Ba, Sr/Ca, Sr/Mg. Pomocí těchto parametrů byla provedena správná klasifikace u 97,4% bílých vín a 100% červených vín. 16 Použitím multielementární analýzy metodou ICP-OES a následné chemometrické metodě HCA (hiearchická shlukovací analýza) a PCA (analýza hlavních složek) bylo možno odlišit Španělská vína z oblasti Utiel-Requena a Jumilla od vín z oblasti Valencie a Yecla. Původ těchto vín může být ověřen pomocí metody CART na základě obsahu prvků Li a Mg, což značně zjednodušuje a urychluje stanovení.17 Z oblasti jižního Španělska (Cordóba) byla analyzována vína z Montilla-Morilles a Villaviciosa. Pomocí plamenové atomové absorpční spektormetrie a plamenové atomové emisní spektormetrie a jejich následného zpracování metodou Lineární diskriminační analýzy byly stanoveny signifikantní rozdíly obsahu Mg, Mn, Na, Fe a Zn, dále bylo možné určit rozdíly mezi staršími a mladšími víny na základě obsahu Mg, K, Sr, Zn a Mn.18 U tří významných italských vinařských regionů byla zjištěna diskriminace vín pomocí multivarianční prvkové analýzy: Basilicata - Ag, B, Ca, Cd, Eu, Fe, Ga, La, Lu, Mn, Nd, Pr, Sm, Th, Tm, V, Yb, a Zr; Calabria: Al, B, Fe, Mg, Mn, Ti, Tl, Sc a Zn; Campania: Ba, Eu, K, I, Rb, a Tl. Tyto analýzy byly prováděny metodami AAS a ICP-MS.19 V portugalských vínech byla provedena analýza metodou ICP-MS pro 17 prvků (Al, As, B, Ba, Ca, Co, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni, P, Pb, Sr, Zn). Výsledky byly rozděleny do skupin C1 (litofilní prvky – Ba, Mg, Mn), C2 (vztahující se k hnojení nebo vinařským postupům – B, K, P), C3 (Zn, kovy – podle použití fytosanitárních produktů a ocel/mosaz/nerez materiálů), C4 (As – fytosanitární produkty). Pomocí těchto analýz bylo možné rozlišit druh vína (červené x bílé) a podle označení původu (Alentejo, Bairrada, Da˜o, Vihno Verde).20

14

Korelace obsahu prvků v afrických vínech a v půdách byla prováděna u vzorků z poměrně malé oblasti (do 1000 km2) z kraje Stellenbosch. Byly analyzovány prvky Mg, Ba, Cs, Cu,Ni, Rb, Sr, Tl, V, Zn a následně byla provedena shluková analýza (CA) a diskriminační analýza (DA). Bylo prokázáno, že je nutné vyhodnocovat data zvlášť pro červená a bílá vína, což neplatí pro interregionální vína.21 Určení provenience u rumunských vín a půd vychází ze statistické PCA analýzy prvků Ni, Ag, Cr, Sr, Zn, a Cu pro oblast Valea Calugareasca, Rb, Zn, a Mn pro oblast Murfatlar a Pb, Co, a V pro oblast Moldova metodou ICP-MS.25 Vyšší obsah sodíku ve vínech ze souostroví Madeira a Azory je pravděpodobně způsoben blízkostí moře. Další prvky, na které byla zaměřena analýza, byly K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, Sr, Li a Rb. Za použití analýzy rozptylu (ANOVA) byly prokázany signifikantní rozdíly těchto prvků mezi jednotlivými regiony, což potvrzuje rozdílné vinařské procesy.22 Zájmovými prvky analýzy argentinských vín a půd ze tří různých oblastí byly K, Fe, Ca, Cr, Mg, Zn a Mn, u nichž vyšla diskriminace na 100%. 92% úspěšnost byla u prvků Ca, Cr, K, Fe, Cu, Zn a Mg obsažených v půdách. Pro korelaci mezi vínem a půdami bylo využito kanonické analýzy.4 Analýza rozlišující způsob produkce chorvatského vína (ekologicky x konvenčně) byla zaměřena na obsah polyfenolů, kyseliny chlorogenové, felurové, katechinu, transresveratrolu, hydroxybenzoových kyselin a flavonolů. Hodnota antioxidační aktivity byla vyšší u ekologicky pěstovaných vín. Obsah kovů nevykazoval žádný trend, žádné víno nepřekročilo toxikologické limity. 23

2.3. Příprava vzorků pro analýzu 2.3.1. Příprava vzorků vína Vzhledem ke složité matrici vzorku je doporučována před vlastní analýzou předchozí úprava vzorku. Jedním možným způsobem je zahřívání 10 ml vzorku během noci při teplotě 50°C, kdy se odpaří voda a většina organických složek. Následně je vzorek spalován při 450500 °C po dobu 16 hodin. Po této úpravě je získán popel, ke kterému se přidá 1 ml koncentrované HNO3 a tato směs je spalována po dobu 6 hodin. Poté se popel rozpustí v 1-2 ml konc. HNO3, zfiltruje a doplní do 10 ml destilovanou vodou. Tato úprava není nutná pro analýzu ICP-OES a to díky vysoké teplotě plazmatu, která eliminuje matriční efekt. Pro tuto analýzu je dostatečná pouhá úprava pH na hodnotu kolem 1,5 (1 ml konc. HNO3 do 100 ml vzorku).24 Pro analýzu pomocí ICP-MS je vhodné pro snížení matrix efektu naředit vzorek pro stopovou analýzu v poměru 1:4 a pro analýzu makroprvků v poměru 1:30 a použít thulium 15

jako vnitřní standard o koncentraci 10 ng/g.1 Naopak v další studii byl použit mikrovlnný rozklad (2 ml vzorku + 8 ml konc. HNO3, doplněno do 25 ml).17 Další možností je mikrovlnný rozklad 2,5 ml vzorku s 2,5 ml konc. HNO3 s následným doplněním do 100 ml odměrné baňky.25 100 g moštu se suší přes noc při 105°C, při stejné teplotě je vysušený vzorek extrahován 5 ml peroxidu vodíku, 1 ml kyseliny sírové a 2 ml vody, po smíchání se přidá 1 ml konc. kyseliny dusičné. Roztok se zahřívá pod zpětným chladičem a následně se převede do 50 ml. 26

2.3.2. Příprava vzorků půdy a letorostů Vzorky půdy se odebírají z hloubky 10-20 cm pod povrchem, aby nedošlo ke kontaminaci půdy z okolního prostředí, následně se vysuší a přesejí přes plastové síto s velikostí ok <2 mm, případně pro mikrovlnný rozklad se pomelou na analytickou jemnost. Biologicky dostupné prvky se extrahují podle následujícího postupu: 10 g půdy se naváží do Erlenmayerovy baňky a přidá se 20 ml extrakčního roztoku (0,01 M CaCl2, 0,005 M DTPA – kyselina diethylen-triamin-pentaoctová, 0,1 M TEA - triethanolamin) a dvě hodiny se třepou na třepačce a zfiltrují. Tato extrakce má simulovat přechod prvků z půdy do rostliny. Celkový obsah prvků se stanovuje v roztoku získaném pomocí lučavkového výluhu: 0,5 g vzorku se naváží do Erlenmayerovy baňky, přidá se 7,5 ml konc. HCl a 2,5 ml konc. HNO 3, přes noc se nechá třepat na třepačce a následně se zahřívá do tvorby vlhkých solí. Po ochlazení se roztok převede do 100 ml odměrné baňky. K oběma postupům je třeba vždy současně připravit blank.4 Vhodné je využití mikrovlnného rozkladu 0,25 g vzorku v 9 ml konc. HNO3, 3 ml konc. HF a 2 ml konc. HCl. Rozložený vzorek se převede do 100 ml odměrné baňky.25 V jiném rozkladu bylo použito pro extrakci 20 ml H2O2 a následně 12 ml lučavky královské. Roztok je po dvou hodinách zahřívání pod zpětným chladičem převeden do 100 ml.25 K rozkladu rostlin a listů je vhodný mikrovlnný rozklad za přítomnosti 4 ml HNO 3 a 2 ml H2O2, při navážce 0,2-0,5 g vzorku.

2.4. Metody stanovení analytů Ve vínech se stanovují organické molekuly různými metodami, z nichž významná je například plynová chromatografie (GC), kterou lze stanovit např. alkoholy či estery,27 časté je využití spojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) 28. Tato metoda 16

umožňuje stanovení širokého spektra organických látek, např. různých druhů sacharidů (po jejich úpravě)29, fenolické látky30 a další. Neméně významnou metodou v oblasti organické analýzy ve víně je vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC), kterou je možno stanovit např. fenoly, fenolické kyseliny, flavonoidy, prokyanidiny, organické kyseliny a množství dalších látek.31 Pro stanovení organických kyselin ve víně jsou vhodné také metody iontová chromatografie (IC) či kapilární zónová elektroforéza (CZE).32 Touto metodou je možné stanovit např. i aminokyseliny a aminy.33 Kapilární elektroforéza (CE) je vhodná pro stanovení polárních látek, které se neseparují snadno metodou HPLC, např. mykotoxiny, aminokyseliny, proteiny.34

2.4.1. Prvková analýza 2.4.1.1. Optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES) Ke tvorbě indukčně vázaného plazmatu může docházet v libovolném plynu; upřednostňovány jsou však plyny monoatomické (vzácné plyny) pro jejich jednoduchá, snadno korigovatelná spojitá spektra s malým počtem emisních čar. V plazmatu se netvoří stabilní sloučeniny atomů analytů s těmito plyny. Vzácné plyny jsou pro tento účel voleny také z důvodu vysoké ionizační energie, kterou má sice nejvyšší helium, avšak z ekonomických důvodů bývá nejčastěji používán argon s ionizační energií 15,8 eV.35 Teplota ve výboji se liší podle oblasti (6000-10000 K), s čímž souvisí i koncentrace elektronů (10201021 m-3).36 K transportu kapalných vzorků do plazmatu se používají zmlžovače, jichž se vyrábí několik typů a jejich výběr závisí na typu vzorku.37 Optická emisní spektrometrie je metoda, při níž v budicím zdroji dochází k excitaci elektronů volných atomů do vyšších energetických hladin. Po návratu elektronů na nižší nebo základní hladinu je emitováno záření, které je separováno v závislosti na vlnových délkách. K této separaci dochází v monochromátorech (montáž Czerny-Turner) a polychromátorech (montáž Paschen Runge) nebo pomocí dvojí disperze echelle mřížky a hranolu. Takto separované záření dopadá na detektor. Výhodou ICP-OES je možnost stanovení více než 70 prvků, včetně Cl, Br, I, P a S, rychlé a simultánní měření, nízké meze detekce (1-10 µg/l), relativně vysoké selektivitě, přesnosti (0,5-2% RSD), správnosti, možnosti analýzy mikrovzorků, možnosti analýzy pevných, kapalných i plynných látek a možnosti automatizace.38 ICP-OES je, stejně jako ostatní metody atomové spektrometrie, zatížena interferencemi, a to jak spektrálními, tak nespektrálními. Nespektrální interference lze pozorovat jako změnu směrnice kalibrační křivky vzorku oproti vodnému roztoku analytu (změna citlivosti). Podle místa vzniku rozeznáváme interference vznikající v plazmatu (ovlivnění excitace, změna 17

účinnosti přenosu náboje) a při zmlžování (změna vlastností aerosolu). Nespektrální interference jsou způsobeny např. vlivem kyselin, rozpouštědel a přítomností snadno ionizovatelných prvků. Vliv na nespektrální interference má konstrukce a frekvence oscilátoru, výška pozorování, konfigurace plazmové hlavice, zobrazení výboje a výška pozorování, složení a průtoky plynů. Spektrální interference jsou způsobeny nedostatečným rozlišením čar díky parametrům spektrometru, skutečnému překryvu dvou a více čar (závisí na poměru intenzit a koncentraci), částečnému překryvu analytické čáry křídlem rozšířené interferující čáry, rozptýlenému záření a interferencím vyvolaným strukturním pozadím. Při spektrálních interferencích se projevuje jako rozhodující činitel rozlišení přístroje. Problémem těchto interferencí je nemožnost jejich odstranění. Pokud není možné použít jinou, nerušenou spektrální čáru, pak je nutné tyto interference řešit matematickou korekcí, avšak toto snižuje přesnost a správnost analýzy.39,40

2.4.1.2. Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) Principem této metody je separace iontů vzorku podle jejich efektivní hmotnosti (poměr hmotnosti iontu k náboji) pomocí hmotnostních analyzátorů (kvadrupólový, průletový, sektorový analyzátor s dvojí fokusací, multicollector) a jejich následná detekce. Ve srovnání s ICP-OES má tato metoda nižší meze detekce (stanovení stopových obsahů). Nevýhodou však jsou vyšší provozní náklady a nutnost mineralizace vzorku vína před analýzou.41 2.4.1.3. Atomová absorpční spektrometrie (AAS) Další hojně využívanou metodou v oblasti stanovení obsahu prvků ve vínech je metoda využívající měření elektromagnetického záření, které absorbují volné atomy prvků vznikajících v atomizátoru (plamenová atomizace, elektrotermická atomizace). Jde o typickou metodu pro stanovení jednoho prvku. V praxi byla tato metoda použita pro stanovení Pb a Cd v makedonských vínech,42 Mn v maďarských vínech,43 či mědi v červených a bílých.44 V současné době se nevýhoda stanovení jednoho prvku začíná překonávat použitím výbojky s kontinuálním spektrem. Příkladem je použití metody atomové absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací v grafitové kyvetě a se zdrojem spojitého záření a spektrometrem s vysokou rozlišovací schopností (HR-CS GF AAS) pro současné stanovení Mo a Ni v pevném vzorku půdy a ve víně (přímý nástřik).45 Dalším příkladem je simultánní stanovení deseti prvků rozdělených na dvě části podle použití plynů (Ca, Sr a Be – oxid dusný-acetylen a Cu, Li, Rb, Na, K, Mn, Co – vzduch – acetylen), z nichž nejlepším indikátorem původu brazilských vín byly vyhodnoceny 4 prvky – K, Mn, Rb a Sr.46

18

2.4.1.4. Další metody využívané pro stanovení obsahu prvků ve víně Protony indukovaná rentgenová fluorescenční analýza (PIX), která je vhodná pro stanovení Cu, Zn, Fe, Ni, As a Pb.47 Další využitelnou metodou je instrumentální neutronová aktivační analýza (INAA), jejíž výhodou jsou nízké detekční limity a nedestruktivnost metody, nevýhodou je způsobení radioaktivity analytů. Touto metodou lze stanovit 30 prvků. 48,49 Anodická rozpouštěcí voltametrie (ASV) je další metoda vhodná pro stanovení některých prvků ve víně (Pb, Cu). Její výhodou jsou nízké limity detekce.50

2.5. Chemometrické metody Mezi chemometrické modely používané pro vyhodnocení velkých souborů dat analýzy vín patří vícerozměrné statistické metody, např. shluková analýza (CA), analýza hlavních komponent (PCA), lineární a kvadratická diskriminační analýza (LDA, QDA), klasifikační regresní stromy (CART), umělé neuronové sítě (ANN) a další.51 Pro menší soubory dat je vhodný např. graf nazývaný pohoří („mountain plot“). Jde o graf lomené kumulativní distribuční funkce, funkce je lomená v mediánu.52 Dalším vhodným statistickým modelem je „boxplot“ (krabicový graf) graficky znázorňující výsledky pomocí kvartilů a mediánu. Boxploty nepředpokládají normální rozdělení dat, jsou neparametrické. K vizualizaci dvou proměnných v jednom grafu lze použít rozptylový graf („scatter plot“)

19

3. Experimentální část 3.1. Chemikálie 

ultračistá voda typ I vyrobená v systému Simplicity UV



HNO3, 65%, p.a. (MERCK, ČR)



HCl dýmavá, 37%, p.a. (MERCK, ČR)



H2O2, 30%, p.a. (MERCK, ČR)



Astasol - jednoprvkový kalibrační roztok (Analytika, spol. s r. o., ČR), čistota 99,99%, čistota 1g/l, matrice 2% HNO3: Ba, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Sr, Zn



Astasol - jednoprvkový kalibrační roztok (Analytika, spol. s r. o., ČR), čistota 99,99%, čistota 1g/l, matrice 5% HNO3: Al, Ca



Astasol - jednoprvkový kalibrační roztok (Analytika, spol. s r. o., ČR), čistota 99,99%, čistota 1g/l, matrice H2O: B, S, Si



Astasol - jednoprvkový kalibrační roztok (Analytika, spol. s r. o., ČR), čistota 99,99%, čistota 1g/l, matrice 0,05% H2SO4: P

20

3.2. Popis vzorků a referenčních materiálů K experimentu byly dodány vzorky biovín, rostlin a půdy z Vinařství Marcinčák. Toto vinařství má v současné době výměru vinic 110 ha v pěti katastrech vinařských obcí vinařské podoblasti Mikulovské v rámci vinařské oblasti Morava – ČR. Celá plocha vinic je začleněna do produkce bio vína v návaznosti na kontrolní profesní organizaci Biocont Laboratory Brno. Technologické provozy pro zpracování hroznů má ve vinařské oblasti Novosedly, kde jsou rozmístěny experimentální parcely pro získávání veškerých biologických vstupů pro laboratorní analýzy. Biovína se podle nařízení Komise (EU) č. 203/2012 nesmí upravovat: částečným zahuštěním chladem, odsiřovat fyzikálními metodami, ošetřovat elektrodialýzou (proti srážení vinného kamene), částečně nealkoholizovat, ošetřovat katexem, stabilizovat za použití manoproteinů, karboxymethylcelulozy. Je zakázano používat hexakyanoželezitan draselný, sorban draselný, čiřidlo PVPP, tepelná stabilizace nesmí překročit 70°C. Experimentální parcely pro získání biologických zdrojů k laboratorním analýzám byly rozmístěny do katastru obce Novosedly, neboť v tomto regionu jsou povětrnostní podmínky ustáleny bez extrémních výkyvů a bylo konstatováno, že jsou v intencích hodnot zmíněných pěti katastrů (Brod nad Dyjí, Dobré Pole, Jevišovka, Nový Přerov, Novosedly). Byly zvoleny tři modelové odrůdy – Veltlínské zelené (VZ), Ryzlinky rýnský (RR) a Rulandské modré (RM). A to z těchto důvodů: 

dvě odrůdy bílé (2/3 konzumace bílého vína), jedna odrůda červená (1/3 konzumace) odpovídají hluboké retrospektivě a současnosti zájmu konečných zákazníků



odrůda bílá Veltlínské zelené je odrůdou středoevropských zájmů, odrůda bílá Ryzlink rýnský je součástí zájmů i mezikontinentálních, odrůda červená Rulandské modré je součástí zájmů i v oblastech mimo střední Evropu



všechny zvolené odrůdy lze roubovat na podnož Kober 5BB (odrůda révy speciálně vyšlechtěná křížením jako podnož)53 do půd se středním obsahem vápníku, který podporuje

prosakování

vody

v

půdě

a

tato

se

kontaktuje

s přijímacími vláskovými kořínky a pokračuje ve svém koloběhu i s živnými látkami

Veltlínské zelené – jde o pozdnější osvědčenou moštovou odrůdu, která pravděpodobně pochází z Rakouska. Vyžaduje podmínky mírného pásma a hlinité sprašové půdy s dobrou 21

jímavostí vody. Je středního růstu a olistění, horní strana čepele listu je mírně puchýřovitá, hrozen je větší. Poskytuje pravidelné vyšší sklizně hroznů.54 Ryzlink rýnský – pozdnější moštová odrůda s menším pětilaločným listem, vrchní strana čepele je mírně puchýřovitá. Má malý hustý hrozen s menší bobulkou a krátkou stopkou. Sklízí se v polovině října a je považován za velmi kvalitní odrůdu. Z tohoto důvodu byl rozšířen i na jiné kontinenty.55 Rulandské modré – vysoce kvalitní moštová odrůda pocházející z oblasti Nilu k nám přišla z Francie. Zabírá 60 000 ha světové plochy. Má středně velký třílaločný list se silněji puchýřovitou čepelí. Menší hustý hrozen má krátkou stopku a modročernou bobuli. Technologická zralost přichází v první polovině října.56

Pro experiment byly odebrány půdní vzorky z určených míst na parcele v hloubce 0,12, 0,30 a 0,50 m, smíchány a z této směsi byl odebrán jeden vzorek o hmotnosti 500g. Celkem takto bylo dne 16.6.2014 odebráno 15 vzorků půdy s číslem označení 1-9 a 11-16 v katastru obce Novosedly. Bližší informace k těmto vzorkům nebyly dodány. Vzorky půd byly vysušeny, přesítovány pod 2 mm a kvartovány.

Vzorky rostlin byly odebrány ve třech různých termínech vždy ze stejných pozic a rostlin, vždy 20, 40 a 60 cm od vrcholu jednoletého letorostu. Odebrané vzorky rostlin z keřů na jednotlivých pozicích byly smíchány, separovány na listy a stonky a rozemlety pomocí laboratorního mlýnku Retsch 17. Odběry byly prováděny vždy v místech shodných s odběry půd. Dále byly dodány od každé odrůdy dva vzorky letorostu.

Popis odběrných míst rostlin na experimentálních parcelách: Pro všechny tři odrůdy by zvolen stejný systém odběru: řádek 3; pozice č. 1 (a1); odběrné místo 60. až 67 keř řádek 4; pozice č. 3 (a3); odběrné místo 24. až 30. keř řádek 5; pozice č. 4 (a4); odběrné místo 45. až 52. keř řádek 6; pozice č. 2 (a2); odběrné místo 7. až 12. keř.

22

Bylo dodáno 8 vzorků vína VZ a 8 vzorků vína RM z data odběru 29.11.2014 a dalších 8 vzorků VZ a 8 vzorků RM z data odběru 22.12.2014, dále byly dodány 4 vzorky RR, 4 vzorky RM a 4 zorky VZ z blíže nespecifikovaného data odběru a 2 vzorky VZ z běžné produkce– vše z výše uvedeného vinařství. Dále byly dodány 3 vzorky španělského bílého vína, 2 vzorky španělského červeného vína, 1 vzorek španělského růžového vína, 2 vzorky maďarského bílého vína, 2 vzorky maďarského červeného vína a 3 vzorky italského červeného vína, vše ročníky 2012, bez další specifikace.

Pro ověření metody byly použity 2 certifikované referenční materiály vín TITRIVIN BTB (TITRIVIN, Francie). V obou CRM jsou uvedené hodnoty pro K, Ca, Fe a Mg. Tabulka 1: certifikované hodnoty pro referenční materiály:

Batch T 04061211 B Batch T 04091213 B

Ca (mg/l)

U (mg/l)

Cu (mg/l)

U (mg/l)

Fe (mg/l)

U (mg/l)

K (mg/l)

U (mg/l)

79,7

6,7

0,12

0,02

3,68

0,20

811

20

72,0

2,9

0,56

0,12

4,71

0,19

631

19

U – rozšířená nejistota (2 SD)

3.3. Přístrojové vybavení 3.3.1. Mikrovlnné rozkladné zařízení ETHOS 1 Pro rozklad rostlin byla použita mikrovlnná pec ETHOS 1 (Milestone, Itálie), která je určena pro kyselinové tlakové rozklady. V tomto zařízení je možno použít tři různé typy rotorů podle náročnosti rozkladu a typu vzorku. Rotor SK-10 pro běžné typy rozkladů a extrakce s PTFE nádobkami, Q-20 Quartz Rotor s křemennými nádobkami pro ultračisté rozklady a rotor NOVA-8 pro náročné rozklady (dlouhá doba rozkladu za vyšších teplot). Evaporační rotory umožňují kompletní přípravu vzorku včetně zkoncentrování. Teplota je měřena optickým vláknem nebo termočlánkem, i bezkontaktně.57

23

3.3.2. Optický emisní spektrometr s indukčně vázaným plazmatem iCAP 6500 Duo ICP-OES iCAP 6500 Duo (Thermo, Velká Británie) umožňuje axiální i radiální měření bez možnosti nastavení výšky pozorování. Maximální příkon do plazmatu, který poskytuje polovodičový generátor na frekvenci 27,12 MHz, je 1350 W. Přístroj je vybaven regulátory hmotnostního průtoku plynů (MFC), které řídí průtoky nosného, pomocného (prostředního plazmového) a vnějšího plazmového plynu. Plazmová hlavice je tzv. kombinovaná, sestávající z části tvořené vnější a prostřední plazmovou trubicí a s možností výměny injektoru. Pro měření uvedená v této práci byl použit standardní křemenný injektor s vnitřním průměrem ústí 2 mm. Dvanáctiválečková peristaltická pumpa čerpá roztok s použitím peristaltické hadičky (typ orange/white) do zmlžovače DuraMist (Glass Expansion, Austrálie). Ze vzniklého aerosolu je v mlžné komoře cyklonového typu separován jemný podíl, který je vnášen nosným plynem do ICP výboje. Simultánní spektrometr obsahuje spektrální přístroj s dvojí disperzí, s rytou mřížkou echelle (52,9 vrypů/mm; 166-847 nm). Součástí zkřížené optiky je disperzní hranol z taveného křemene (úhel 9,5°). Záření je přivedeno na CID (Charge Injection device) detektor. Přístroj je ovládán softwarem iTEVA s knihovnou obsahující více než 55 000 spektrálních čar s možností ručního doplňování dalších čar.58

4. Výsledky a diskuze 4.1. Rozklad a příprava vzorků půd a rostlin pro analýzu Pro stanovení prvků ve vzorcích půd byly roztoky připraveny dle normy ISO 11466: do Erlenmeyerovy baňky bylo naváženo 1,5 g vzorku, přidáno 14 ml lučavky královské a vzorky byly louženy přes noc. Druhý den byly pod zpětným chladičem 2 hodiny zahřívány a následně převedeny do 50 ml odměrných baněk. Se vzorky se souběžně připravovaly blanky. Navážka 0,3 g vzorku rostlin byla převedena do teflonové nádobky, do níž bylo přidáno 6 ml HNO3 a 2 ml H2O2. Vzorky byly rozkládány v mikrovlnné peci ETHOS ONE; podmínky rozkladu jsou uvedeny v Tabulce 2.57 Po zchladnutí byly vzorky převedeny do 50 ml odměrné baňky. V mikrovlnné peci je 10 pozic; 9 pozic bylo využito pro rozklad vzorku a jedna pozice pro slepý pokus.

24

Tabulka 2: Podmínky rozkladu: rotor čas rozkladu (krok 1) čas rozkladu (krok 2) teplota 1(krok 1) teplota 1(krok 2) teplota 2(krok 1) teplota 2(krok 2) maximální výkon

SK-10 jednotka~ 15 min 20 min 200 °C 200 °C 110 °C 110 °C 1000 W

4.2. Optimalizace podmínek měření 4.2.1. Vliv obsahu organické matrice ve víně na stabilitu měření, optimalizace poměru signálu k pozadí a test robustnosti plazmatu Dílčím cílem diplomové práce bylo vyvinutí rychlé a jednoduché metody analýzy vín, a proto první pokus spočíval v analýze neředěného vzorku. Při předběžném testu diagnostiky ICP-OES (Mermetův test) provedeném se vzorkem neředěného vína byl zjištěn drift spektrometru projevující se dlouhodobým poklesem signálů spektrálních čar i emise pozadí (Obr. 1-4). Poměr signálů čar hořčíku sledovaný v neředěném roztoku vzorku vína č. 10 jako kritérium robustnosti plazmatu však byl přesto stabilní (Obr. 5) a pohyboval se kolem hodnoty 11,7, což svědčí o ustavení robustního výboje. Pro korekci naměřeného poměru Mg čar v neředěném víně na případnou rozdílnou citlivost pixelů CID detektoru byl použit poměr intenzit emise pozadí obou čar naměřený ve vodě. V takovém případě je pozadí tvořeno pouze spojitým rekombinačním zářením argonu a jeho intenzita v rozsahu vlnových délek 280 až 285 nm je prakticky totožná. Případné rozdíly v naměřené intenzitě emise obou pozadí jsou pak pouze důsledkem rozdílné spektrální citlivosti detektoru pro obě vlnové délky. Použitím vodného roztoku pro stanovení korekčního faktoru tak byly eliminovány případné příspěvky emise organických složek vína k pozadí a příspěvky křídel rozšířených čar hořčíku při vysoké koncentraci tohoto prvku ve vzorku vína. Vzhledem ke skutečnosti, že při zmlžování neředěného vzorku vína současně „zarůstalo“ ústí injektoru, jak se dodatečně ukázalo po skončení tohoto měření, je časový vývoj signálů výsledkem současného působení více faktorů (změna lineární rychlosti proudění nosného plynu, pravděpodobně změna účinnosti zmlžování a transportu aerosolu, fixní výška pozorování …), nelze jednotlivé vlivy jednoznačně rozlišit. Ovlivnění systému ICP-OES vzorkem neředěného vína je zřejmé i ze srovnání časového vývoje signálů čar a pozadí při zmlžování vodného roztoku 50 mg/l Mg (koncentrace blízká koncentraci Mg ve vzorku

25

neředěného vína), kdy je naopak pozorován nárůst všech zmíněných signálů spojený s ustalováním analyzátoru. Z důvodu obsahu alkoholu (10%) v neředěných vzorcích vín byl testován i injektor s vnitřním průměrem ústí 1 mm. Menší průřez ústí umožňuje dosáhnout lineární rychlosti proudění nosného plynu dostačující pro vytvoření analytického kanálu v ICP výboji při nižším objemovém průtoku a tedy sníženém zatížení výboje organickými látkami. Ukázalo se však, že hlavní problém nespočívá v obsahu alkoholu, který může způsobit destabilizaci výboje, ale v zanášení trysky injektoru, které se zmenšením průměru stalo kritičtějším. Od dalšího použití tohoto injektoru bylo upuštěno a ve vývoji metody a při její aplikaci byl používán injektor s vnitřním průměrem ústí 2 mm.39. Závěrem tohoto experimentu bylo rozhodnutí opustit variantu analýzy neředěného vína a vyvinout metodu analýzy s použitím 10x ředěných vzorků vín. Pro optimalizaci byly připraveny vodné roztoky prvků s přídavkem ethanolu odpovídajícím jeho koncentraci ve vzorcích 10 x ředěných vzorků vín, tedy (~1,2%m/m). Stabilita roztoků byla zajištěna přídavkem kyseliny dusičné s výslednou koncentrací 0,1 M.

Obr. 1: Závislost intenzity korigovaného píku Mg (II) 280,2 nm v neředěném víně na čase

1 800 000 1 600 000 1 400 000

I (counts)

1 200 000 1 000 000 800 000 600 000 400 000 200 000 0 0

1 000

2 000

3 000 t (s)

26

4 000

5 000

Obr. 2: Závislost intenzity pozadí Mg (II) 280,2 nm v neředěném víně na čase

1 200,0

1 000,0

I (counts)

800,0

600,0

400,0

200,0

0,0 0

1 000

2 000

3 000

4 000

5 000

t (s)

Obr. 3: Závislost intenzity korigovaného píku Mg (I) 285,2 nm v neředěném víně na čase

160 000 140 000 120 000

I (counts)

100 000 80 000 60 000 40 000 20 000 0 0

1 000

2 000

3 000 t (s)

27

4 000

5 000

Obr. 4: Závislost intenzity pozadí Mg (I) 285,2 nm v neředěném víně na čase

500,0 450,0 400,0

I (counts)

350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 0

1 000

2 000

3 000

4 000

5 000

t (s)

poměr

Obr. 5: Závislost poměru čar Mg (II) 280,2 nm/285,2 (I) nm v neředěném víně na čase

14,0 13,0 12,0 11,0 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0

1 000

2 000

3 000 t (s)

28

4 000

5 000

Vzorec 1: výpočet poměru čar hořčíku pro Mermetův test diagnostiky ICP-OES

𝒑𝒐𝒎ě𝒓 =

𝐼𝑆𝑀𝑔 285,2 𝐼𝑆𝑀𝑔 280,2

∙

𝐼𝐵𝑀𝑔 280,2 𝐼𝐵𝑀𝑔 285,2

ISMg 285,2 ……..Intenzita signálu spektrální čáry Mg (II) 285,2 nm ISMg 280,2 ……..Intenzita signálu spektrální čáry Mg (II) 280,2 nm IBMg 285,2 ……..Intenzita pozadí Mg(I) 285,2 nm IBMg 280,2 ……..Intenzita pozadí Mg (I) 280,2 nm

Optimalizace podmínek měření s ICP-OES byla prováděna pro vzorky vín, rostlin a půd. Pro analýzu vzorků 10 x ředěného vína byla zvolena hodnota příkonu na horní hranici jeho nastavitelného rozsahu, tj. 1350 W. Tato hodnota je vhodná pro analýzu roztoků s vyšším obsahem rozpuštěných látek a roztoků s obsahem organického rozpouštědla a/nebo s obsahem rozpuštěných organických látek. Obsah veškerých netěkavých látek obsažených ve víně se pohybuje v 10 x zředěných vzorcích vín v rozsahu 2-3 mg/l, obsah cukrů v rozsahu 0,03-0,5 g/l (úplně fermentovaná vína) a až 16 g/l (částečně fermentovaná vína), obsah kyselin v rozsahu 0,4-0,9 g/l.59 Vyšší výkon zajišťuje robustní podmínky v plazmovém zdroji, jež jsou příznivé pro snížení matrix efektu s původem v plazmatu. Oprávněnost této volby byla potvrzena občasným „zhasínám“ plazmového výboje s nižší hodnotou příkonu (1150 W) při zmlžování vzorků vín. Pro měření roztoků připravených loužením půd a rozkladem rostlin postačuje hodnota příkonu 1150 W, běžně používaná při analýze vodných roztoků s anorganickou matricí. Vyšší hodnotě příkonu odpovídá také vyšší hodnota průtoku vnějšího plazmového plynu, který odvádí přebytečnou energii konvekcí a snižuje riziko předčasného a nadměrného opotřebení vnější plazmové trubice. Z tohoto důvodu byl pro příkon 1350 W průtok vnějšího plazmového plynu nastaven na hodnotu 14 l/min (Tab. x). Současně byl zvýšen průtok pomocného (středního plazmového) plynu, kterým lze měnit vzdálenost základny plazmového výboje od ústí injektoru a prostřední plazmové trubice. Organické látky v anaerobním prostředí uhelnatějí a produkty (zejména uhlík) usazují se v ústí injektoru. Tento proces způsobuje zúžení průměru ústí a změnu podmínek lineární rychlosti transportu analytu do plazmatu. Uhlík se případně usazuje i na horním okraji prostřední plazmové trubice. Zvýšením průtoku pomocného plynu se základna výboje oddálí od prostřední trubice a ústí injektoru a uvedený efekt se sníží, případně se neuplatní. Úplného odstranění tohoto efektu se dosáhne přídavkem kyslíku, tato varianta však nebyla v práci použita. 29

Experimentálně bylo prokázáno, že změna průtoku těchto dvou pracovních plynů neměla téměř žádný vliv na poměr signálu k pozadí. Pro vzorky půd a rostlin byl zvolen po optimalizaci příkon 1150 W a odpovídající průtoky vnějšího a prostředního plazmového plynu (Tab. x). Poměr signálu analytu k signálu pozadí a tedy mez detekce je nejvýznamněji ovlivněna průtokem nosného plynu a při radiálním pozorování plazmatu výškou pozorování. U použitého spektrometru je výška pozorování fixní a nastavení analytické zóny do této pozorované oblasti se provádí (při dříve nastaveném příkonu a průtocích obou plazmových plynů) změnou průtoku nosného plynu. Nejdůležitější hodnota pro optmalizaci spektrometru je poměr intenzit signál/pozadí, což se nemusí shodovat s nejvyšší intenzitou signálu vzorku (Obr. 6). Pro analýzu vzorků vín byla optimalizována hodnota poměru signálu k pozadí (S/B) v závislosti na průtoku nosného plynu v rozsahu od 0,3 ml/min do 1,0 l/min s krokem 0,05 l/min. Pro většinu prvků se maximum pohybovalo kolem průtoku 0,65 a 0,7 l/min, pouze pro Ca, K a Na bylo maximum při nejvyšším průtoku (Obr. 7), z tohoto důvodu byla zvolena kompromisní hodnota 0,65 l/min. Na (Obr. 7) jsou uvedeny závislosti normalizované hodnoty S/B pro spektrální čáry a prvky odlišných spektrochemických vlastností. Pro analýzu roztoků vzorků rostlin a půd byla optimalizována hodnota S/B v rozsahu průtoků nosného plynu od 0,4 l/min do 1 l/min s krokem 0,1 l/min38, 39, 40 V Tabulce 3 jsou uvedeny veškeré čáry, které byly zkoumány z hlediska možnosti využití pro analýzu vzorků vína, rostlin a půd. Křížky jsou označeny spektrální čáry, které byly vyhodnoceny jako nejvhodnější. Pro tyto čáry byla provedena optimalizace. Obr. 6: Závislost intenzity emise čáry a pozadí Fe 259,9 (II) nm na průtoku nosného plynu

30

Tabulka 3: Použité spektrální čáry spektrální čára (nm) vína rostliny půdy spektrální čára (nm) vína rostliny půdy Al (I) 308,2 Mg (II) 280,2 Al (I) 309,2 Mg (I) 285,2 Al (I) 396,1 x x x Mn (II) 257,6 x x x B (I) 208,8 Mn (II) 259,3 B (I)249,6 Mn (II) 260,5 B (I) 249,7 x x x Na (I) 588,9 x x x Ba (II) 233,5 Na (I) 589,5 Ba (II) 455,4 x x x P (I) 213,6 x x x Ba (II) 493,4 P (I) 214,9 Ca (II) 317,9 S (I) 180,7 Ca (II) 393,3 S (I) 182,0 x x x Ca (I) 422,6 x x x S (I) 182,6 Cu (II) 224,7 Si (I) 212,4 Cu (I) 324,7 x x x Si (I) 260,6 Cu (I) 327,3 Si (I) 251,6 x x x Fe (II) 239,5 Sr (II) 346,4 Fe (II) 240,4 Sr (II) 407,7 x x x Fe (II) 259,9 x x x Sr (II) 421,5 K (I) 766,4 x x x Y (II) 371,0 vnitřní STD K (I) 769,8 Zn (II) 202,5 Mg (II) 279,5 x x x Zn (I) 213,8 x

Obr. 7: Závislost normalizovaného poměru signálu k pozadí na průtoku nosného plynu vybraných prvků pro 10x ředěné víno

normalizovaný poměr signál/pozadí

1,1 0,9 Ba 455,4

0,7

Fe 259,9 0,5

K 766,4 Zn 213,8

0,3 0,1

-0,1 -0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

průtok nosného plynu (l(min)

31

0,9

1,1

Obdobně se postupovalo při hledání ideálních podmínek pro rostliny a půdy. Při optimalizovaných podmínkách měření byla nalezena hodnota poměru čar hořčíku  11 v matrici 10 x ředěných vzorků vín i v matrici po rozkladu rostlin a půd, což odpovídá robustnímu plazmatu. Tyto podmínky byly použity pro další vývoj metody a analýzu reálných vzorků; jsou uvedeny v Tabulce 4.

Tabulka 4: Podmínky měření pro víno, rostliny a půdy Pracovní parametr ICP-OES příkon do plazmatu průtok roztoku průtok nosného plynu průtok vnějšího plazmového plynu průtok pomocného (středního plazmového) plynu doba promývání průtok roztoku při promývání doba ustalování integrační čas (krátkovlnná oblast) integrační čas (dlouhovlnná oblast) počet opakování měření signálu

výška radiálního pozorování

víno 1350 1 0,65 14

rostlina 1150 1 0,7 12

půda 1150 1 0,7 12

0,7 0,5 0,5 30 30 30 2 2 2 15 5 5 15 15 15 5 5 5 3 3 3 radiální radiální radiální fixní, fixní, fixní, nastavena nastavena nastavena výrobcem výrobcem výrobcem

jednotka W ml/min l/min l/min l/min s ml/min s s s

mm

U vzorku vína bylo provedeno kvalitativní měření (Full Frame )– kompletní spektrální informace o analyzovaném vzorku), z nějž bylo patrné, že v 10x zředěných vínech je možné na tomto spektrometru kvantitativně stanovit tyto prvky: Al, B, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, S Si, Sr, Zn.

4.2.2. Studium matrix efektu vyvolaného celkovým obsahem organických látek ve vzorcích vín v závislosti na zředění Vliv organické matrice byl studován pro 10x ředěné víno, 5x ředěné víno, a ačkoli se při dalším vývoji metody nepředpokládala analýza neředěného vína, pro srovnání byl studován i vliv matrice původního, neupraveného vzorku. Multiplikativní interference byla studována jako vliv matrice na směrnici závislosti signálu na koncentraci analytu metodou přídavků standardu. Přídavky analytů byly oproti klasické metodě přídavku standardu používané pro 32

stanovení (tedy kalibraci) větší než obvyklých 50%, 100 % a 150 % obsahu analytu v matrici, aby bylo možno i pro prvky přítomné ve stopových obsazích spolehlivě proložit regresní přímky a testovat statistickou významnost/nevýznamnost rozdílů směrnic pro různé stupně ředění, neředěné víno a vodný roztok, v tomto případě připravený bez přídavku alkoholu a kyseliny dusičné. Směrnice byly testovány T-testem na hladině významnosti =0,05.60 Na Obr. 8 jsou znázorněny přídavky a regresní přímky pro měření na čáře Al I 396,1 nm. (Výrazný systematický konstantní posun přímky pro neředěné víno je dán obsahem hliníku v původním vzorku.) Jako další příklad je uveden stejný experiment pro mangan (Obr. 9). Některé směrnice nevykazují statisticky významný rozdíl (Tabulka 5), jiné vykazují rozdíl na úrovni 5-15%, na statistický rozdíl mají vliv malé směrodatné odchylky směrnic. Závěrem lze konstatovat, že systematickou proporcionální chybu (matrix efekt) na uvedené úrovni (obecně malý pokles směrnice ve srovnání s vodným roztokem) lze kompenzovat použitím porovnávacího prvku a přibližným modelováním matrice na úrovni přídavku ethanolu.

Tabulka 5: Tabulka testování rozdílu shodnosti směrnic pro vybrané prvky

Al (I) 308,2 Al (I) 309,2 Al (I) 396,1 B (I) 208,8 B (I)249,6 B (I) 249,7 Ba (II) 233,5 Ba (II) 455,4 Ba (II) 493,4 Cu (II) 224,7 Cu (I) 324,7 Cu (I) 327,3 Fe (II) 239,5 Fe (II) 240,4 Fe (II) 259,9 Mn (II) 257,6 Mn (II) 259,3 Mn (II) 260,5 Sr (II) 346,4 Sr (II) 407,7 Sr (II) 421,5 Zn (II) 202,5 Zn (I) 213,8

voda-víno 10x ředěné NE

voda-víno 5x ředěné ANO

voda-víno neředěné NE

NE

ANO

ANO

NE

ANO

NE

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

NE

NE

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

NE

NE

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

ANO

NE

ANO

ANO

ANO – směrnice se signifikantně liší, NE – směrnice se signifikantně neliší

33

Obr. 8: Srovnání směrnic pro vodný roztok, 5x a 10x ředěné víno a pro neředěné víno pro Al 396,1 (I) nm.

Al 396,1 (I) nm

y = 1385,3x + 49,815

3000,00

y = 1427,2x + 151,5

2500,00

y = 1473,3x + 247,89 y = 1386x + 1106,5

2000,00 voda 1500,00

vino 10x vino 5x

1000,00

vino neredene 500,00

0,00 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Obr. 9: Srovnání směrnic pro vodný roztok, 5x a 10x ředěné víno a pro neředěné víno pro Mn 260,5

Mn 260,5 (II) nm 70000,00

y = 5722,7x + 84,284 y = 6242,9x - 34,643 y = 6170,6x + 922,64 y = 5659,7x + 3687,3

60000,00 50000,00

voda 40000,00

vino 10x vino 5x

30000,00

vino neredene

20000,00 10000,00 0,00 0

2

4

6

8

34

10

12

4.2.3. Výběr analytických čar s ohledem na spektrální interference a meze detekce v reálných vzorcích Rychlé simultánní měření velkého počtu spektrálních čar realizované se spektrometrem s echelle mřížkou a zkříženou optikou umožňuje získat údaje pro flexibilní rozhodování o výběru analytických čar pro konkrétní aplikaci. Při vývoji metody na stanovení prvků ve vzorcích vín, rostlin a půd byly vyšetřeny vzájemné spektrální interference prvků přítomných v příslušných matricích. Pozornost byla věnována zejména vlivu majoritních prvků na stopové obsahy. Cílem bylo vytvořit jednu sadu spektrálních čar pro všechny tři matrice. Druhým kritériem pro výběr analytické čáry je mez detekce/stanovení. Z nerušených spektrálních čar byly vybrány ty, jejichž meze detekce umožňují kvantitativní stanovení analytů v pokud možno co největším podílu vzorků z dodaných souborů (vín, půd, rostlin), aby se získal dostatečný rozsah souborů pro chemometrickou analýzu. Hodnoty mezí detekce pro 10x zředěná vína byly získány třemi způsoby: 





Instrumentální mez detekce byla vypočtena jako koncentrace odpovídající signálu rovnému trojnásobku standardní odchylky slepého pokusu (ethanol 1,2%, HNO3 0,1 M). Taková hodnota je orientační a nemusí být shodná s mezí detekce v reálném vzorku. mez detekce v roztoku reálného vzorku (byl použit roztok CRM) byla vypočtena jako koncentrace odpovídající signálu trojnásobku standardní odchylky pozadí v reálném vzorku. Pro výpočet bylo použito pozadí v blízkosti příslušné analytické čáry, které se používá pro korekci hrubého signálu. Z tohoto pozadí byla vypočtena koncentrace ekvivalentní pozadí (BEC) a mez detekce byla získána jako součin BEC a trojnásobku relativní standardní odchylky měření tohoto pozadí. hodnota vypočtená softwarem iTEVA z kalibrační přímky

Všechny limity detekce jsou uvedeny v Tabulce 6.

35

Tabulka 6: Limity detekce pro stanovení prvků měřením 10 x ředěného vzorku vína vynásobené 10x = přepočtené na neředěný vzorek Spektrální čára (nm)

LOD z blanku (mg/l)

Al 396,1 (I) B 249,7 (I) Ba 455,4 (II) Ca 422,6 (I) Cu 324,7 (I) Fe 259,9 (II) K 766,4 (I) Mg 280,2 (II) Mn 257,6 (II) Na 589,5 (I) P 213,6 (I) S 182,0 (I) Si 251,6 (I) Sr 407,7 (II) Zn 213,8 (I)

0,2 0,04 0,008 0,2 0,06 0,07 1,4 0,016 0,008 0,3 0,3 2 0,2 0,005 0,02

LOD z CRM (mg/l) 0,5 0,03 0,016 0,5 0,06 0,07 4,0 0,009 0,009 0,8 0,4 2 0,1 0,004 0,03

LOD ze software (mg/l) 0,1 0,03 0,003 0,1 0,03 0,05 0,3 0,002 0,007 0,1 0,2 2 0,1 0,001 0,02

Ve stejném řádu jsou i limity detekce pro roztoky vzorků půd a rostlin, pouze je třeba brát do úvahy navážku a objem pevného vzorku.

4.3. Kalibrace Všechny kalibrační roztoky byly připraveny z jednoprvkových kalibračních roztoků Astasol, podle možnosti byly z některých připraveny směsné a ověřeny na jednoprvkových. Kalibrace byla připravena tak, aby pokrývala předběžně očekávané obsahy prvků ve víně. Pro kontrolu stability během analýzy byl připraven modelový vzorek s koncentracemi odpovídajícími průměrnému složení analyzovaných vzorků.

36

Tabulka 7: Koncentrace kalibračních roztoků prvek Al Ba Cu Zn B Fe Mn Sr Ca Mg Si K Na P S

koncentrace (mg/l) 0 0,1 0,5 1 0 0,1 0,5 1 směsný roztok 0 0,1 0,5 1 0 0,1 0,5 1 0 0,5 1 2 0 0,5 1 2 směsný roztok 0 0,5 1 2 0 0,5 1 2 0 5 10 20 směsný roztok 0 5 10 20 0 5 10 20 0 10 50 100 směsný roztok 0 5 10 20 0 5 10 20 jednoprvkový roztok 0 5 10 20 jednoprvkový roztok

Obrázek 10: Kalibrační přímka vyhodnocená softwarem iTEVA

37

Pro kontrolu správnosti metody byly změřeny referenční materiály a srovnány s certifikovanými hodnotami: Tabulka 8: Srovnání naměřených hodnot v CRM s referenčními hodnotami Ca U Cu U Fe U K U (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) Batch T 04061211 B referenční Batch T 04061211 B naměřená hodnota u

Batch T 04091213 B referenční Batch T 04091213 B naměřená hodnota u

79,7

6,7

0,12

0,02

3,68

0,20

811

20

85

1

< LOQ

~

3,46

0,04

834

8

6,223

~

1,264

2,735

72

2,9

0,56

0,12

4,71

0,19

631

19

71,8

0,6

0,6

0,04

4,65

0,02

621

10

0,39

1,18

3,05

1,18

ukrit(0,05;3) = 1,304 U – rozšířená nejistota (2 SD) Výsledky byly testovány Lordovým testem správnosti (utest  kritická hodnota ukrit.) přičemž 57% výsledků bylo testem označeno za správné. Vhodnější by byl test shodnosti výsledků. Ten však nelze jednoduše uplatnit, poněvadž k certifikovanému materiálu je k dispozici rozšířená nejistota vypočtená ze standardní odchylky získané na souboru 40 výsledků (Gaussovo, resp. Studentovo rozdělení), kdežto stanovení v naší laboratoři bylo provedeno 3x a standardní odchylka se vypočítá v takovém případě z rozpětí. Takto se lišící standardní odchylky nelze v příslušném vztahu pro testování uplatnit (Gaussova/Studentova vs rozpěťová statistika). Při srovnání intervalů spolehlivosti (2SD, rozšířená nejistota) lze však konstatovat, že se vzájemně překrývají, a proto lze v řadě z těchto případů předpokládat, že rozdíly středních hodnot budou statisticky nevýznamné a tudíž je možno je považovat za shodné.

4.4. Chemometrické hodnocení výsledků Chemometrické zpracování bylo zpracováno ve statistickém programu „R“61, zpracování výsledků bylo zvoleno podle počtu vzorků. Cílem práce bylo vybrat takové prvky, které by mohly poukázat na vztah mezi půdou, rostlinou a vínem. Vzhledem k nedostatečným informacím ke vzorkům půd byly srovnány alespoň některé poměry prvků, v nichž by se projevila určitá korelace ve všech třech typech vzorků. Poměry Ba/Sr a Mg/Mn byly korigovány na Ca a to z důvodu podobných fyzikálně 38

chemických vlastností Ba, Sr, Mg (iontový poloměr, oxidační stav) z důvodu jejich vzájemné zastupitelnosti. Korekce byla provedena podělením obsahu prvků obsahem vápníku. Dalším cílem bylo najít statisticky významný rozdíl v obsahu prvků mezi moravskými víny vzájemně, ale také ve vztahu k zahraničním vínům.

4.4.1. Půdy Bylo dodáno patnáct vzorků půd s označením 1-9 a 11-16 bez bližší specifikace. Výsledky analýzy jsou shrnuty v Tabulce 9 a10. Pro lepší přehlednost byla každá trojice půd, jejichž obsahy odpovídaly trojnásobnému odběru v jednom místě, pro tabulku zprůměrována doplněna kombinovanou nejistotou (s) ze zákona šíření chyb. Tabulka 9: Obsah prvků v půdách v hmotnostních procentech Al Ca Fe K Mg s s s s (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m) (%m/m)

0,601 Půda 14-6 1,283 Půda 7-9 0,389 Půda 11-13 2,613 Půda 14-16 0,891 Půda 1-3

0,005 0,007 0,002 0,002 0,004

0,180 0,701 0,076 6,22 11,158

0,001 0,002 0,001 0,01 0,007

0,659 1,376 0,486 3,848 1,243

0,003 0,006 0,005 0,003 0,005

0,163 0,36 0,089 0,608 0,277

0,001 0,01 0,000 0,003 0,009

0,1251 0,312 0,0824 0,93 0,316

s (%m/m)

0,0002 0,009 0,0001 0,02 0,001

Tabulka 10: Obsah prvků v půdách v mg/kg B s Ba s Cu s Mn s Na s (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

Půda 1-3 Půda 4-6 Půda 7-9 Půda 11-13 Půda 14-16

4,9 14,3 2,6 33 16,3

0,3 0,6 0,1 1 0,3

40 75 21,7 124 91,4

2 1 0,1 4 0,6

11,1 90,6 32,1 30,7 13,7

0,5 3,8 0,8 0,7 0,1

237 440 129 504 181

3 1 3 6 1

52,3 86 32 1239 384

0,6 5 1 9 3

P s S s Si s Sr s Zn s (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

Půda 1-3 Půda 4-6 Půda 7-9 Půda 11-13 Půda 14-16

368 828 297 1254 958

10 2 10 50 3

90 229 52 451 600

2 4 2 6 1

489 731 625 1257 1185

6 4 3 20 10

Pro všechny následující obrázky platí: a = vlevo, b = vpravo

39

10,7 26,2 6,7 228 296

0,1 0,6 0,1 4 4

25,7 63,8 15,9 82,1 56,3

0,3 0,1 0,7 0,3 0,2

0.030 0.020 0.010

Ba/Ca

80 100 20

0.000

40

60

Ba(ug/g)

140

Obr. 11 a, b: Rozptylový graf závislosti obsahu Ba na Sr (a) a obsahu Ba na Sr po korekci na Ca (b) v půdách

0

50

100

150

200

250

300

0.004

0.006

0.008

0.010

Sr/Ca

Sr(ug/g)

100

200

300

400

500

600

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Mg/Ca

6000 2000

Mg(ug/g)

10000

Obr. 12 a, b: Rozptylový graf závislosti Mg na Mn (a) a Mg na Mn po korekci na Ca (b) v půdách

0.00

Mn(ug/g)

0.05

0.10 Mn/Ca

40

0.15

0.20

10000 20000 30000 40000

Fe(ug/g)

Obr. 13: Rozptylový graf závislosti obsahu Fe na Al v půdách

5000

15000

25000

Al(ug/g)

V případě poměrů Ba/Sr a Mg/Mn korigovaných na vápník lze pozorovat určitý trend, nejvýraznější je pro poměr Fe/Al.

4.4.2. Rostliny Vzorky rostlin byly odebrány ve třech různých dobách. Na následujících obrázcích jsou pomocí Boxplot (krabicových) diagramů (program R) zobrazeny rozdíly v obsahu vybraných prvků pro jednotlivé odrůdy v listech, žilnatině a v letorostech. Vzhledem k nízkému počtu vzorků letorostů je tato informace spíše ilustrativní. Linie uvnitř „krabice“ znázorňuje medián, jednotlivé body značí odlehlé body. Jednotlivé odběry jsou chronologicky seřazeny A, B, C. Listy nesou označení „l“, žilnatina „z“, letorosty „leto“. Trend pro listy vs žilnatinu je shodný pro Al, Ba, Cu, Ca, Fe, Mn, Sr, Zn Kompletní výsledky analýzy rostlin jsou uvedeny v příloze na přiloženém CD.

41

Obr. 14 a, b: Srovnání obsahu Ba v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b) z chronologického hlediska

Obr. 14 c: Srovnání obsahu Ba v rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

Na obrázcích srovnání obsahu Ba (obr. 14 a, b, c) v rostlinách z časového hlediska je vidět očekáváný nárůst Ba v listech i v žilnatině, který odpovídá postupné výživě rostlin. Podobný trend vykazují rostliny pro B, Ca, Sr, pouze s rozdílem, že obsah Ca je v listech výrazně vyšší než v žilnatině (obr. 15).

42

Obr. 15: Srovnání obsahu Ca v rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

Obr. 16 a, b: Srovnání obsahu Cu v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b) z chronologického hlediska

43

Obr. 16 c: Srovnání obsahu Cu v rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

U vzorků rostlin (obr. 16 a, b, c) je na první pohled výrazný nárůst obsahu Cu při posledním odběru, který může být způsoben měďnatým postřikem, který se ve vinařství používá jako fungicid.

Obr. 17 a, b: Srovnání obsahu Fe v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b) z chronologického hlediska

44

Obr. 17 c: Srovnání obsahu Fe v rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

Trend v obsahu Fe ve vzorcích rostlin je naopak klesající. Stejný trend vykazuje Al, Na, P, Zn a částečně Mg. Zmíněné kationty snadno tvoří sloučeniny s fosforečnany, toto může být důvodem jejich korelace.62 Mg vykazuje stejný trend pouze částečně, protože na obsah tohoto prvku má vliv chlorofyl, jehož je hořčík stavebním prvkem, z tohoto důvodu je obsah Mg v listech vyšší než v žilnatině. Klesající trend má také síra, ale pokles je jen mírný. Dalším vysvětlením tohoto trendu může být kontaminace půdou.

Obr. 18 a, b: Srovnání obsahu Mn v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b) z chronologického hlediska

45

Obr. 18 c: Srovnání obsahu Mn v rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

Obsah Mn v listech rostlin je nejvyšší ze vzorků odebraných při posledním odběru, obsahy v prvních dvou odběrech se příliš neliší. Trend obsahu Mn v listech je shodný s žilnatinou. Mangan je v biochemických procesech v rostlinách podobný hořčíku a někdy jím může být nahrazen.63

Obr. 19 a, b: Srovnání obsahu K v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b) z chronologického hlediska

46

Obr. 19 c: Srovnání obsahu K rostlině rulandské modré z chronologického hlediska

Pro draslík nebyl nalezen žádný trend, který by byl viditelný mezi jednotlivými rostlinami, listy a žilnatinou, či různou dobou odběru vzorku. Toto může být způsobeno vysokou pohyblivostí draslíku v rostlině. Zvyšující se příjem draslíku snižuje příjem Mg, Ca, Mn a Zn. 63 Vztah mezi prvky v rostlinách je zobrazen v rozptylových grafech.

0.0025

40

50

60

70

0.0005

30

80

Sr(ug/g)

Al Bl Cl Az Bz Cz le

0.0015

Ba/Ca

15

20

25

Al Bl Cl Az Bz Cz le

10

Ba(ug/g)

30

35

Obr. 20 a, b: Korelace mezi Ba a Sr (a) a Ba a Sr po korekci na Ca (b)v rostlině veltlín zelený

0.003

0.004

0.005 Sr/Ca

47

0.006

0.007

0.0012 Ba/Ca

30

40

50

0.0004

20

60

Al Bl Cl Az Bz Cz le

0.0008

10

15

Al Bl Cl Az Bz Cz le

5

Ba(ug/g)

20

Obr. 21 a, b: Korelace mezi Ba a Sr (a) a Ba a Sr po korekci na Ca (b) v rostlině ryzlink rýnský

0.0020

Sr (ug/g)

0.0025

0.0030

0.0035

Sr/Ca

0.0012 Ba/Ca

0.0008

Al Bl Cl Az Bz Cz le

0.0004

5

Ba(ug/g)

Al Bl Cl Az Bz Cz le

10

15

20

Obr. 22 a, b: Korelace mezi Ba a Sr (a) a Ba a Sr po korekci na Ca (b) v rostlině rulandské modré

20

40

60

80

0.002

100

0.003

0.004

0.005

0.006

Sr/Ca

Sr(ug/g)

Některé modré body (žilnatina) mají velké chybové úsečky. Toto je způsobeno malým množstvím některých vzorků žilnatiny. Z rozptylových grafů je opěr patrná korelace mezi Ba a Sr, a to jak přímo (ryzlink rýnský, rulandské modré), tak korekcí na Ca (veltlín zelený). Rozdílné korekce můžou být způsobeny různým rozptýlením Ba a Sr oproti Ca v daných částech rostliny.

48

200

Al Bl Cl Az Bz Cz le

50 100

200

Al(ug/g)

300

Al Bl Cl Az Bz Cz le

0

0

100

Al(ug/g)

300

400

Obr. 23 a, b: Korelace mezi Al a Fe v rostlině veltlín zelený (a) a ryzlink rýnský (b)

50

100

150

200

250

300

50

100

Fe(ug/g)

150

200

250

300

Fe (ug/g)

Obr. 24: Korelace mezi Al a Fe v rostlině rulandské modré

600 400 0

200

Al(ug/g)

800

Al Bl Cl Az Bz Cz le

0

200

400

600

Fe(ug/g)

U rostlin je stejně jako u půd patrná korelace železa a hliníku, z tohoto vztahu lze předpokládat vztah mezi rostlinou a půdou.

49

Ke srovnání obsahů jednotlivých prvků v listech a v žilnatině by použit „mountain plot“, což je v mediánu lomená kumulativní funkce, oproti „boxplot“ je tento typ vizualizace přehlednější z hlediska jednotlivých bodů. Hodnota 50 na ose y vyjadřuje medián. Rostliny byly srovnány dle obsahů z odběrů „C“.

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 25 a, b: Srovnání obsahu Al v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

20

30

40

50

60

70

100

Al(ug/g)

200

300

400

Al(ug/g)

VZz RRz RMz

30 10

20

20

30

folded ECDF

40

40

VZl RRl RMl

10

folded ECDF

50

50

Obr. 26 a, b: Srovnání obsahu B v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

40

50

60

70

80

150

B(ug/g)

200 B(ug/g)

50

250

VZz RRz RMz

30 10

20

20

30

folded ECDF

40

40

VZl RRl RMl

10

folded ECDF

50

50

Obr. 27 a, b: Srovnání obsahu Ba v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

10

15

20

10

Ba(ug/g)

15

20

25

30

Ba(ug/g)

10000

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 28 a, b: Srovnání obsahu Ca v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

15000

20000

25000

10000

Ca(ug/g)

15000 Ca(ug/g)

51

20000

35

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 29 a, b: Srovnání obsahu Cu v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

50

100

150

200

250

0

1000

Cu(ug/g)

2000

3000

4000

Cu(ug/g)

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 30 a, b: Srovnání obsahu Fe v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

60

80

100

120

140

160

100

Fe(ug/g)

200

300 Fe(ug/g)

52

400

500

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 31 a, b: Srovnání obsahu K v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

10000 12000 14000 16000 18000 20000

5000

K(ug/g)

10000

15000

20000

K(ug/g)

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 32 a, b: Srovnání obsahu Mg v listech (va) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

1600

1800

2000

2200

1000

Mg(ug/g)

1400 Mg(ug/g)

53

1800

2200

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30 20

10

10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 33 a, b: Srovnání obsahu Mn v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

100

120

140

160

100

Mn(ug/g)

150

200

Mn(ug/g)

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 34 a, b: Srovnání obsahu Na v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

10

15

20

25

30

30

Na(ug/g)

40 Na(ug/g)

54

50

60

VZz RRz RMz

30 10

20

20

30

folded ECDF

40

40

VZl RRl RMl

10

folded ECDF

50

50

Obr. 35 a, b: Srovnání obsahu P v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

2000

2500

3000

3500

1000

2000

P(ug/g)

3000

4000

P(ug/g)

VZz RRz RMz

30 10

20

20

30

folded ECDF

40

40

VZl RRl RMl

10

folded ECDF

50

50

Obr. 36 a, b:Srovnání obsahu S v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

1800

2000

2200

1600

S(ug/g)

1800

2000 S(ug/g)

55

2200

2400

VZz RRz RMz

30 10

20

20

30

folded ECDF

40

40

VZl RRl RMl

10

folded ECDF

50

50

Obr. 37 a, b: Srovnání obsahu Si v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

1000

1500

2000

2500

1000

Si(ug/g)

2000

3000

4000

5000

Si(ug/g)

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 38 a, b: Srovnání obsahu Sr v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

30

40

50

60

70

80

90

20

100

30

40

50 Sr(ug/g)

Sr(ug/g)

56

60

70

6000

50 40

VZz RRz RMz

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZl RRl RMl

20

50

Obr. 39 a, b: Srovnání obsahu Zn v listech (a) a žilnatině (b) rostlin VZ, RR a RM

12

14

16

18

20

20

22

30

40

50

Zn(ug/g)

Zn(ug/g)

Obsah prvků v rostlinách závisí na typu rostliny, typu půdy, pH a podnebních podmínkách. Shoda obsahu prvků v rostlinách je umístěna v tabulce 12 na konci oddílu 4.4.3. Vína, v této tabulce jsou obsahy v listech a žilnatině srovnány s obsahy prvků ve vínech.

4.4.3. Vína 4.4.3.1. Moravská vína Pro prvotní vizualizaci rozdílů obsahů prvků ve vínech byla použita korelační matice (Spearman) pro VZ a RM. Z chemometrického hlediska byl dodán malý počet vzorků RR, proto tato matice nebyla použita pro srovnání této odrůdy. Tato matice je typ pořadové korelace, který je robustní vůči odlehlým bodům a negaussovskému rozdělení, z tohoto důvodu byla zvolena. Čím jsou elipsy užší, tím je korelace lepší, čím méně se překrývají, tím je větší rozdíl v hodnotě korelačního koeficientu mezi srovnávanými soubory.

57

Obr. 40: Korelační matice pro vína veltlín zelený a rulandské modré

Z tohoto grafu je patrná korelace např. pro poměry prvků Ba/Sr, která je zobrazena v následujícím grafu. Vzhledem k podobným iontovým poloměrům a dalším vlastnostem prvků Sr, Ba a Ca dochází k jejich zastupování a proto je v některých případech vhodnější korekce na vápník (obsahy Sr a Ba jsou poděleny obsahem Ca)– viz Obr. 41 a, b.

VZ RR RM

0.003

Ba/Ca

0.15

0.005

VZ RR RM

0.001

0.10

Ba (ug/g)

0.20

Obr. 41 a, b:Rozptylový graf pro poměry Ba/Sr (a) a Ba/Sr po korekci na Ca (b) ve vzorcích vín VZ, RR, RM

0.35

0.45

0.55

0.65

0.005

Sr (ug/g)

0.010 Sr/Ca

58

0.015

Ve vzorcích vín se projevila závislost Ba/Sr korigovaných na Ca. 2 odlehlé body (červená kolečka) jsou vzorky vína veltlín zelený z běžné produkce. O tomto vínu nebyly od poskytovatele vzorku dodány bližší informace, je možné tedy předpokládat, že toto víno není ze stejné oblasti, proto nezapadá do korelace.

VZ RR RM

1.5

75

80

Mg/Ca

2.0

85

2.5

VZ RR RM

65

1.0

70

Mg (ug/g)

90

95

Obr. 42 a, b: Mg/Mn (a) a Mg/Mn po korekci na Ca (b) ve vzorcích vín VZ, RR, RM

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025

Mn (ug/g)

Mn/Ca

Obr. 43: Poměr Al/Fe ve vzorcích vínech VZ, RR, RM

1.0 0.6 0.2

Fe (ug/g)

1.4

VZ RR RM

0.0

0.5

1.0 Al (ug/g) 59

1.5

Ve vzorcích vína nelze pozorovat oproti půdám a rostlinám korelaci mezi Fe a Al. Vyšší obsah hliníku lze pozorovat v bílých vínech kvůli čiření bentonitem, obsah rozpustných solí Fe ve víně je ovlivněn obsahem kyslíku a SO2, proto není možné najít vztah mezi půdou, rostlinou a vínem pomocí obsahu Fe. Další proměnnou jsou některé obsahy Al pod limitem detekce nebo kvantifikace. Obsah prvků ve vínech VZ, RR, RM je graficky zobrazen v následujících „mountain plots“.

50 40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

Obr. 44 a, b: Srovnání obsahu Al (a) a B (b) ve vínech VZ, RR, RM

0.0

0.5

1.0

4.0

1.5

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

B (mg/l)

Al (mg/l)

Hodnoty Al pod 0,02 mg/l jsou orientační a jde hodnoty pod limitem detekce.

0.10

0.15

30 10

20

folded ECDF

40 30 20

VZ RR RM

10

folded ECDF

VZ RR RM

40

50

50

Obr. 45 a, b: Srovnání obsahu Ba (a) a Ca (b) ve vínech VZ, RR, RM

40

0.20

60

80

100

120

Ca (mg/l)

Ba (mg/l)

Velké rozpětí obsahu Ca ve vzorcích vína veltlín zelený je způsobeno srážením vinného kamene, které není možné nijak ovlivnit. K tomuto jevu dochází při obsahu Ca v bílém víně nad 80 mg/l a závisí na pH vína a obsahu ethanolu.

60

40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

50

Obr. 46 a, b: Srovnání obsahu Cu (a) a Fe (b) ve vínech VZ, RR, RM

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.2

0.30

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Fe (mg/l)

Cu (mg/l)

Odlehlé hodnoty pro obsah Cu pro VZ jsou pro dva vzorky vína z běžné produkce, u RM jde pak vzorky z odběru 22.12.2014. Hodnoty Cu pod 0,06 mg/l jsou jen orientační, jde o hodnoty pod limitem detekce.

50 40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

Obr. 47 a, b: Srovnání obsahu K (a) a Mg (b) ve vínech VZ, RR, RM

600

700

800

900

1000

65

1100

70

75

80 Mg (mg/l)

K (mg/l)

61

85

90

95

50 40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

Obr. 48 a, b: Srovnání obsahu Mn (a) a Na (b) ve vínech VZ, RR, RM

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

5

1.1

10

15

20

Na (mg/l)

Mn (mg/l)

50 40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

Obr. 49 a, b: Srovnání obsahu P (a) a S (b) ve vínech VZ, RR, RM

60

80

100

120

140

40

160

60

80

100

120

S (mg/l)

P (mg/l)

40

VZ RR RM

30

folded ECDF

30

10

20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

20

50

50

Obr. 50 a, b: Srovnání obsahu Si (a) a Sr (b) ve vínech VZ, RR, RM

12

14

16

18

20

0.35

22

0.40

0.45

0.50

0.55

Sr (mg/l)

Si (mg/l)

62

0.60

0.65

50

Obr. 51: Srovnání obsahu Zn ve vínech VZ, RR, RM

30 20 10

folded ECDF

40

VZ RR RM

0.1

0.2

0.3

0.4

Zn (mg/l)

Výsledky byly vyhodnoceny Kruskal-Wallisovým testem, který se používá na testování shodnosti souboru. Jestliže je vypočtená hodnota nižší než kritická hodnota, pak v testovaném souboru není statisticky významný rozdíl na hladině pravděpodobnosti 0,05.64 V Tabulce 11 jsou výsledné hodnoty Kruskal-Wallisovy statistiky, červeně jsou vyznačeny soubory, které se shodují, tzn, že jsou nižší než kritická hodnota 5,991 (kvantil rozdělení chíkvadrát pro hladinu významnosti α = 0,05 a 2 stupně volnosti.) Tabulka 11: Výsledné hodnoty Kruskal-Wallisovy statistiky vína VZ,RR, RM Al 14,607 B 34,183 Ba 32,538 Ca 0,853 Cu 4,170 Fe 27,204 K 29,323 Mg 36,366 Mn 36,366 Na 9,756 P 34,661 S 8,784 Si 25,855 Sr 34,477 Zn 11,671

listy C žilnatina C VZ, RR, VZ, RR, RM RM 19,920 24,545 31,135 11,911 29,230 19,416 22,911 8,068 18,524 20,925 4,383 26,965 25,748 21,938 13,389 23,353 14,173 7,983 8,650 8,240 25,483 20,749 20,020 0,164 8,950 16,889 22,797 21,767 0,619 14,673

listy VZ listy RR listy RM žilnatina žilnatina žilnatina A, B, C A, B, C A, B, C VZ A, B, C RR A, B, C RM A, B, C 23,473 26,956 23,443 5,074 23,869 23,065 6,533 25,497 12,162 18,173 15,965 22,110 11,275 24,101 26,167

27,182 23,838 26,668 25,740 11,586 22,797 18,167 2,745 18,420 26,128 27,405 26,811 19,213 25,754 30,709

63

26,956 15,461 30,920 28,402 26,258 28,230 16,545 8,114 20,056 23,405 27,416 11,628 19,718 30,920 29,869

23,929 30,294 25,207 13,410 23,893 23,443 2,353 18,524 19,632 13,302 15,425 6,977 9,824 22,146 27,569

19,123 26,956 30,920 25,538 30,709 27,164 26,258 22,398 5,668 11,653 29,123 6,902 23,605 27,326 19,686

24,506 26,707 25,635 21,556 25,520 24,653 23,736 23,452 9,491 4,140 28,578 5,628 24,614 27,086 19,149

Získaná data z „mountain plots“a „boxplots“ byla srovnána mezi sebou a s výsledky Kruskal-Wallisova testu a vyhodnocena v tabulce 12 pro shodu prvků mezi odrůdami VZ-RM, VZ-RR a RR-RM pro listy, žilnatinu a víno. Vzhledem k malému počtu vzorků vín RR je srovnání s tímto vzorkem orientační.

Tabulka 12: Shoda obsahů prvků v listech, žilnatinách a vínech pro dvojice vzorků VZ-RM, VZ-RR, RM-RR

prvek Al B Ba Ca Cu Fe K Mg Mn Na P S Si Sr Zn

list NE NE NE NE NE ANO NE NE NE NE NE ANO ANO ANO ANO

VZ vs. RM žilnatina NE NE ANO ANO NE NE NE NE ANO ANO NE ANO NE ANO ANO

víno NE NE NE ANO ANO NE NE NE NE NE NE ANO NE NE NE

list NE NE NE NE NE ANO NE NE NE ANO NE NE NE NE ANO

VZ vs. RR žilnatina NE NE ANO NE NE NE ANO ANO NE NE ANO ANO ANO NE NE

víno NE NE NE ANO ANO NE NE NE NE NE NE ANO NE NE NE

list ANO NE NE NE ANO ANO ANO ANO ANO ANO ANO NE NE NE ANO

RR vs RM žilnatina NE ANO NE ANO ANO NE NE NE ANO NE NE ANO ANO NE ANO

víno NE ANO NE ANO ANO NE NE NE NE NE ANO NE NE NE NE

4.4.3.2. Moravská vs. zahraniční vína S výše studovanými víny byla současně analyzována i vína zahraniční. Výsledky analýzy všech vín jsou shrnuty v příloze na CD. Pro přehled je zde uvedena Tabulka 13 s průměrnými hodnotami výsledků.

64

Tabulka 13: Průměrné hodnoty obsahů prvků v moravských a zahraničních vínech Al (mg/l)

s B s (mg/l) (mg/l) (mg/l)

Ba (mg/l)

s (mg/l)

Ca (mg/l)

s (mg/l)

Cu (mg/l)

s (mg/l)

Fe (mg/l)

s K s (mg/l) (mg/l) (mg/l)

španělské bílé

0,6

0,1

5,78

0,09

0,112

0,002

97,3

0,4

0,19

0,05

2,57

0,08

708

2

maďarské bílé

1,2

0,1

4,57

0,07

0,091

0,003

86,6

0,7


~

4,87

0,04

907

6

1,14

0,09

4,83

0,07

0,124

0,003

98,3

0,8


~

4,86

0,05

1049

6

0,40

0,07

6,74

0,05

0,070

0,001

61,2

0,1

0,15

0,03

2,20

0,05

821

1

1,39

0,08

4,83

0,06

0,111

0,002

84,7

0,5


~

3,19

0,05

980

3

0,6

0,1

8,1

0,1

0,128

0,002

79,2

0,6

0,24

0,02

4,76

0,05

1279

7

VZ 29.11.2014

1,1

0,2

4,2

0,1

0,192

0,004

50

1


~

0,44

0,08

883

8

VZ 22.12.2014

1,4

0,2

4,2

0,1

0,20

0,004

102

2


~

0,31

0,09

852

9,9


~

4,2

0,1

0,123

0,004

58,7

0,7


~

0,18

0,06

901

4

1,51

0,08

3,90

0,07

0,080

0,001

127

1

0,27

0,03

1,21

0,06

1100

8


~

5,54

0,07

0,120

0,003

86,1

0,5


~

1,35

0,06

767

3


~

5,4

0,1

0,075

0,003

80,1

0,8


~

0,64

0,06

691

5

0,6

0,2

5,5

0,1

0,064

0,004

90,3

0,9

0,21

0,04

0,49

0,08

631

4


~

6,38

0,06

0,070

0,004

72,6

0,7


~

0,84

0,07

854

7

Na (mg/l)

s (mg/l)

P (mg/l)

s (mg/l)

S (mg/l)

s (mg/l)

maďarské červené španělské růžové italské červené španělské červené

VZ blíže neurčené VZ běžná produkce RR blíže neurčené RM 29.11.2014 RM 22.12.2014 RM blíže neurčené

Mg (mg/l)

s Mn s (mg/l) (mg/l) (mg/l)

Sr s Zn s (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)

španělské bílé

74,4

0,2

0,67

0,02

25,2

0,2

131

1

140

3

0,748

0,006

0,18

0,01

maďarské bílé

86,2

0,3

1,21

0,02

12,9

0,1

128,0

0,3

201

2

0,734

0,007

0,30

0,02

92,6

0,6

1,64

0,01

15,9

0,2

119,0

0,4

180

4

0,776

0,006

0,45

0,02

62,0

0,1

0,39

0,00

58,8

0,2

193,1

0,9

152

2

0,955

0,001

0,196

0,001

83,4

0,5

1,14

0,03

32,1

0,2

147,0

0,7

199

3

0,635

0,004

0,55

0,02

96,8

0,3

0,92

0,01

40,1

0,4

181

1

128

3

0,996

0,008

0,46

0,02

VZ 29.11.2014

93,6

0,7

0,94

0,02

15,8

0,3

161

1

30

3

0,616

0,007

0,31

0,04

VZ 22.12.2014

92,5

0,7

0,92

0,04

16,1

0,3

160

3

40

4

0,64

0,01

0,32

0,03

80,1

0,4

0,91

0,01

5,2

0,1

98,4

0,8

32

2

0,403

0,004

0,29

0,02

91,6

0,5

1,07

0,01

19,6

0,2

89,7

0,6

129

2

0,625

0,006

0,46

0,01

64,0

0,5

0,66

0,01

8,4

0,1

66,6

0,4

57

3

0,449

0,002

0,10

0,02

72,6

0,6

0,39

0,02

17,7

0,4

62

1

28

4

0,352

0,006

0,42

0,03

73,8

0,5

0,40

0,02

17,5

0,3

64

1

41

3

0,370

0,005

0,44

0,03

69,5

0,2

0,52

0,01

6,7

0,1

72,6

0,8

54

1

0,351

0,003

0,04

0,02

maďarské červené španělské růžové italské červené španělské červené

VZ blíže neurčené VZ běžná produkce RR blíže neurčené RM 29.11.2014 RM 22.12.2014 RM blíže neurčené

s – kombinovaná nejistota měření vypočtená ze zákona šíření chyb

65

Moravská vína se od zahraničních vín liší hlavně v obsahu Fe, Na, S, částečně i dalších prvků, avšak podložení tohoto tvrzení by bylo možné pouze při analýze většího množství vzorků s konkrétnějšími informacemi.

Pro srovnání s moravskými víny byly vykresleny rozptylové grafy, v nichž jsou vyobrazeny nejviditelnější rozdíly obsahů prvků.

Spanelsko Italie Madarsko Morava

0.003

Ba/Ca

0.005

bile ruzove cervene

0.15

Spanelsko Italie Madarsko Morava

bile ruzove cervene

0.001

0.10

Ba (ug/g)

0.20

Obr. 52 a, b: Poměry Ba/Sr (a) a poměry Ba/Sr po korekci na Ca (b) ve vzorcích vín

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0.005

Sr (ug/g)

0.010

0.015

Sr/Ca

Z obou těchto grafů lze pozorovatrozdílné trendy v závislosti Ba/Sr a to jak po korekci na Ca, tek před ní. V obr. 52 b lze pozorovat dva odlehlé body moravského vína, opět jde o veltlín zelený z běžné produkce, ke kterému nejsou žádné bližší informace a proto je vhodné brát tyto dva body za odlehlé.

66

0.5

1.0

1.5 1.0

Spanelsko Italie Madarsko Morava

Spanelsko Italie Madarsko Morava

2.0

2.5

bile ruzove cervene

Mg/Ca

65 70 75 80 85 90 95

Mg (ug/g)

Obr. 53 a, b: Poměry Mg/Mn (a) a poměry Mg/Mn po korekci na Ca (b) ve vzorcích vín

1.5

bile ruzove cervene

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025

Mn (ug/g)

Mn/Ca

Z těchto grafů nelze jednoznačně určit odlišnost v obsahu prvků mezi víny z různých zemí původu a to ani po korekci na Ca

5

Obr. 54: Poměry Fe/Al ve vzorcích vín

2

3

bile ruzove cervene

0

1

Fe (ug/g)

4

Spanelsko Italie Madarsko Morava

0.0

0.5

1.0

1.5

Al (ug/g)

Tento graf zobrazuje hlavně signifikantní rozdíl v obsazích Fe mezi moravskými a zahraničními víny.

67

2

3

Spanelsko Italie Madarsko Morava

1

Fe (ug/g)

4

5

Obr. 55: Poměry Fe/S ve vzorcích vín

0

bile ruzove cervene

50

100

150

200

S (ug/g)

V grafu je vidět největší rozdíl v obsahu prvků, který byl v rámci této práce nalezen. Obsahy Fe jsou ovlivněny poměrem dvojmocných (rozpustných) solí ku trojmocným (málo rozpustným) koncentrací kyslíku a SO2 (antioxidant), což souvisí právě s obsahem síry, který je z velké části ovlivněn právě sířením.

68

5. Závěr Diplomová práce měla dílčí cíle – vytvořit metodu pro analýzu vína tak, aby byla co nejjednodušší příprava vzorku, metoda byla rychlá, robustní a spolehlivá. Vzhledem k robustnosti a limitům detekce byla zvolena metoda ICP-OES. Původní záměr analyzovat víno neředěné s sebou nesl řadu problémů, z nichž největší souvisel s přívodem vzorku do plazmatu, a nebylo možné tento odstranit změnou podmínek ani injektoru. Z tohoto důvodu bylo víno 10x ředěno 0,1 M kyselinou dusičnou (stabilita roztoku) za přídavku yttria jako vnitřního standardu. Metoda byla optimalizována a ověřena na CRM, v němž byly certifikovány hodnoty pro K, Ca, Fe, Cu. Každý z těchto prvků zastupuje jiný koncentrační řád. Dalším cílem bylo nalézt závislost prvkového složení mezi půdou, rostlinou a vínem, problém však byl s nedostatečnou dokumentací k dodaným vzorkům, proto byly pro půdy zpracovány pouze poměry určitých prvků. U těchto vzorků se projevila souvislost mezi Ba a Sr korigovaných na Ca, dále Mg/Na korigovaných na Ca a nejlépe byla vidět korelace pro poměr Fe/Al. Tato závislost se projevila také u vzorků rostlin, částečná korelace byla vidět i u poměrů Ba/Sr, resp. poměrů Ba/Sr korigovaných na Ca. Tato korekce na ca mohla být ovlivněna různou distribucí prvků v rostlině. Ve vzorcích moravského biovína z vinařství Marcinčák se projevila závislost poměru Sr/Ba korigovaných na Ca. Závislost poměru Fe/Al se ve vzorcích vín neprokázala z důvodu změny obsahu prvků během zpracování hroznů na víno a také díky vlivům kyslíku a SO2 obsažených ve víně, které ovlivňují poměr Fe2+:Fe3+. Pro komplexnost práce by bylo vhodné do této analyzované řady přidat analýzu hroznů. Pro lepší statistické zpracování je nutný dostatečný počet vzorků a dostatečné informace o nich. Hlavním cílem bylo nalézt takové prvky, díky kterým by bylo možné odlišit geografický původ vín. Dle této práce byly nejvýraznější rozdíly v obsahu Fe, S, které spolu souvisí z výše uvedených důvodů a také v obsahu Na, který je zvýšený v přímořských oblastech. Dále je možné tato vína od moravských odlišit na základě odlišného poměru Ba/Sr korigovaných na Ca, ale i bez korekce. Byla vyvinuta metoda, která je připravena pro další využití analýzy vín rychlostí cca 20 vzorků za hodinu včetně kalibrace.

69

1

SERAPINAS P., VENSKUTONIS P.R., ANINKEVIC IUS V., EZ ERINSKIS Z. GALDIKAS A., JUZIKIENE V.: Step by step approach to multi-element data analysis in testing the provenance of wine, Food Chemistry, 2008, 107, 1652-1660. 2

JACKSON R. S.: Wine Science: Principles and Applications Third edition. 2008, Elsevier inc., ISBN 978-012-3776468. 3

MICHLOVSKÝ M.: Lexikon chemického složení vína, první vydání. 2014, Vinselekt Michlovský, ISBN 978-80905319-2-5 4

FABANI M.P., ARRUA R.C., VAZQUEZ F., DIAZ M.P., BARONI M.V.,. WUNDERLIN D.A.: Evaluation of elemental profile coupled to chemometrics to assess the geographical origin of Argentinean wines. Food Chemistry, 2010, 119, 372-379. 5

http://web.vscht.cz/~koplikr/6_V%C3%ADno.pdf, citováno 12.10.2014

6

LARA R., CERUTTI S., SALONIA J.A., OLSINA R.A., MARTINEZ L.D.: Trace element determination of Argentine wines using ETAAS and USN-ICP-OES. Food and Chemical Toxicology, 2005, 43, 293-297. 7

POHL P.: What do metals tell us about wine? Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26, 941-949.

8

http://vino.lbc.cz/vady.htm, citováno 19.12.2015

9

KMENT P., MIHALJEVIC M., ETTLER V., SEBEK O., STRNAD L., ROHLOVA L.: Differentiation of Czech wines using multielement composition – A comparison with vineyard soil. Food Chemistry, 2005, 91, 157-165. 10

SCHLESIER K., FAUHL-HASSEK C., FORINA M. ET AL: Characterisation and determination of the geographical origin of wines. Part I: overview. European Food Research And Technology, 2009, 230, 1-13. 11

RAPENAU G., VICOL C., BISCHESCU C.: Possibilities to Assess the Wines Authenticity. Innovative Romanian Food Biotechnology, 2009, 5, 1-9. 12

MARTIN A. E., WATLING R. J., LEE G. S.: The multi-element determination and regional discrimination of Australian wines. Food Chemistry, 2012, 3, 1081-1089 13

NICOLINI G, LARCHER, R, PANGRAZZI, P; et al.: Changes in the contents of micro- and trace-elements in wine due to winemaking treatments VITIS, 2004, 43, 41-45. 14

SELIH V. S., SALA M., DRGAN V.: Multi-element analysis of wines by ICP-MS and ICP-OES and their classification according to geographical origin in Slovenia. Food Chemistry, 2014, 153, 414-423. 15

VYSTAVNA Y., RUSHENKO L., DIADIN D., ET AL.: Trace metals in wine and vineyard environment in southern Ukraine. Food Chemistry, 2014, 146, 339-344. 16

SPERKOVA J., SUCHANEK M.: Multivariate classification of wines from different Bohemian regions (Czech Republic). Food Chemistry, 2005, 93, 659-663 17

GONZALVEZ A., LLORENS A., CERVERA M.L., ARMENTA S., DE LA GUARDIA M.: Elemental fingerprint of wines from the protected designation of origin Valencia. Food Chemistry, 2009, 112, 26-34.

70

18

PANEQUE P., ÁLVAREZ-SOTOMAYOR M.T., CLAVIJO C., GÓMEZ I.A.: Metal content in southern Spain wines and their classification according to origin and ageing. Microchemical Journal, 2010, 94, 175-179. 19

GALGANO F., FAVATI F., CARUSO M., SCARPA T., PALMA A.: Analysis of trace elements in southern Italian wines and their classification according to provenance. Food Science and Technology, 2008, 41, 1808-1815.

. RODRIGUES S. M., OTERO M., ALVES A. A., COIMBRA J., COIMBRA M., PEREIRA E.,*, DUARTE A. C.: Elemental analysis for categorization of wines and authentication of their certified brand of origin. Journal of Food Composition and Analysis, 2011, 24, 548–562 20

21

COETZEE, P. P., VAN JAARSVELD, F. P.; VANHAECKE, F.: Intraregional classification of wine via ICP-MS elemental fingerprinting. Food Control, 2014, 46, 446-454. 22

TRUJILLO J. P. P., CONDE J. E., PONT M. L. P., CÂMARA J., MARQUES J. C.: Content in metallic ions of wines from the Madeira and Azores archipelagos. Food Chemistry, 2011, 124, 533-537. 23

VINKOVIC VRCEK I., BOJIC M., ZUNTAR I., MENDAŠ G., MEDIC-ŠARIC M.: Phenol content, antioxidant activity and metal composition of Croatian wines deriving from organically and conventionally grown grapes. Food Chemistry, 2011, 124, 354-361. 24

PAN X.-D., TANG J., CHEN Q., WU P.-G., HAN J.-L.: Evaluation of direct sampling method for trace elements analysis. in Chinese rice wine by ICP–OES. European Food Research and Technology 2013, 236, 531-535 25

GEANA I., IORDACHE A., IONETE R., MARINESCU A., RANCA A., CULEA M.: Geographical origin identification of Romanian wines by ICP-MS elemental analysis. Food Chemistry, 2013, 138, 1125-1134. 26

ACETO M., ROBOTTI E., ODDONE M., BALDIZZONE M., BONIFACINO G.,BEZZO G., DI STEFANO R., GOSETTI F., MAZZUCCO E., MANFREDI M., MARENGO E.: A traceability study on the Moscato wine chain. Food Chemistry, 2013, 138, 19141922. 27

CAMPO, E.,CACHO, J., FERREIRA, V.: Solid phase extraction, multidimensional gas chromatography mass spectrometry determination of four novel aroma powerful ethyl esters : Assessment of their occurrence and importance in wine and other alcoholic beverages. Journal of Chromatography A, 2007, 1140, 180-188. 28

DE VILLIERS A., ALBERTS P., TREDOUX A.G.J., NIEWOUDT H.H.: Analytical techniques for wine analysis: An African perspective; a rewiew. Analytica Chimica Acta, 2012, 730, 2-23. 29

LUZ SANZ, M., MARTÍNEZ-CASTRO, I., MORENO-ARRIBAS, M. V.: Identification of the origin of commercial enological tannins by the analysis of monosaccharides and polyalcohols. Food Chemistry. 2008, 111, 778-783. 30

MINUTI L., PELLEGRINO R.: Determination of phenolic compounds in wines by novel matrix solid-phase dispersion extraction and gas chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2008, 1185, 23-30. 31

NOLLET L. M. L.: Food Analysis by HPLC, Second edition, 2000, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-8460-X

32

CASTINEIRA A., PENA R.M., HERRERO C., ET AL.: Analysis ofo acids in wine by capillary electrophoresis with direct UV detection. Journal of Food Composition and Analysis, 2002, 15, 319-331.

71

33

SANTALAD A., et al. Pre-capillary derivatisation and capillary zone electrophoresis for amino acids analysis in beverages. Annali di Chimica. 2007, 97, 935- 945 34

GOMEZ F.J.V., MONASTERIO R.P., VARGAS V.C.S, SILVA M.: Analytical characterization of wine and its precursors by capillary electrophoresis. Electrophoresis, 2012, 33, 2240-2252. KANICKÝ V.: Fyzikální základy indukčně vázaného plazmatu . Sborník z kurzu ICP spektrometrie 1995, Vřesovice u Kyjova, ISBN 978-80-903732-8-0. 35

36

CHEN F. F.: Úvod do fyziky plazmatu. 1977, ACADEMIA

37

TODOLI J.-L., MERMET J.-M.: Liquid Sample Introduction in ICP Spectrometry, A Practical Guide. 2011, Elsevier, ISBN 978-0-444-53142-1. 38

ČERNOHORSKÝ T.: AAS, ICP nebo ICP-MS - Reálné možnosti při analýze životního prostředí. Sborník z kurzu ICP spektrometrie 1995, Vřesovice u Kyjova, ISBN 978-80-903732-8-0. 39

KANICKÝ V.: Kalibrace a diagnostika spektrometru. Sborník z kurzu ICP 2009, Brno, ISBN 978-80-903732-8-0.

40

SOMMER L. A KOLEKTIV: Optická emisní spektrometrie v indukčně vázaném plazmatu a vysokoteplotních plamenech. 1992, ACADEMIA, ISSN 0231-6412. 41

BECKER J.S.: Inorganic Mass Spectrometry, Principles and Applications. 2008, John Wiley & Sons, ISBN 978-0470-51634-8. 42

IVANOVA-PETROPULOS V., JAKABOVA S., NEDELOVSKI D., PAVLIK V., BALAZOVA Z., HEGEDUS O.: Determination of Pb and Cd in Macedonian Wines by Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry (ETAAS). Food Analytical Methods, 2015, 8, 1947-1952. 43

NIKFARDJAM M.S.P., GAUSZ I.S., FARKAS V.: Determination of manganese in musts and wines from three different wine regions of Hungary (Vintages 1992 to 2001). Mitteilungen Klosterneuburg, 2012, 62, 143-153. 44

CATARINO S., PIMENTEL I., CURVELO-GARCIA A.S.: Determination of copper in wine by ETAAS using conventional and fast thermal programs: Validation of analytical method. Atomic Spectroscopy, 2005, 26, 73-78. 45

BOSCHETTI W., BORGES A.R., DUARTE, A.T., DESSUY M.B., VALE M.G.R., DE ANDRADE J.B., WELZ B.: Simultaneous determination of Mo and Ni in wine and soil amendments by HR-CS GF AAS. Analytical Methods, 2014, 6, 42474256. 46

BOSCHETTI W., RAMPAZZO R.T., DESSUY M.B., VALE M.G.R., RIOS A.D., HERTZ P., MANFROI V., CELSO P.G., FERRAO M.F.: Detection of the origin of Brazilian wines based on the determination of only four elements using highresolution continuum source flame AAS. Talanta, 2013, 111, 147-155. 47

NOBLE A.C., ORR B.H., COOK W.B., CAMPBELL J.L.: Trace-element analysis of wine by proton-induced X-Ray fluorescence spectrometry. Journal of agricultural and food chemistry, 1976, 24, 532-535. 48

MAY S., LEROY J., PICCOT D., PINTE G.: Application of neutron –activation analysis to the determination of wines from various french vineyards – possibility of identifying the vineyard from the determination of specific oligoelemnts. Journal of Radioanalytical chemistry, 1982, 72, 305-318.

72

49

CVETKOVIC J., JACIMOVIC R., STAFILOV T., ARPADJAN S., KARADJOVA I.: Determination of major and trace elements in wine by k0-instrumental neutron activation analysis. Bulletin of the Chemists and Technologists of Macedonia, 2002, 21, 187-192. 50

YAMASAKI A., OLIVIERA J.A.B.P., DUARTE A.C., GOMES M.T.S.R.: An insight into the adsorption and electrochemical processes occuring during the analysis of copper and lead in wines, using an electrochemical quartz crystal nanobalance. Talanta, 2012, 98, 14-18. 51

SMEYERS-VERBEKE J., LANTERI S., FORINA M., ROMISCH U.: CHaracterization and determination of geographical origin of wines. Part II: descriptive and inductive unvariante statistics. Europian food and fresearch technology, 2009, 230, 15-29. 52 KROUWER J.S., MONTI K.L.: A simple, graphical method to evaluate laboratory assays. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 1995, 33, 525-527. 53

http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/Atlas_reva_Adobe/podnoze/kober_5bb.pdf, citováno 19.12.2015. 54

http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/Atlas_reva_Adobe/bile_most/veltlinske_zel.pdf citováno 1í.12.2015. 55

http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/Atlas_reva_Adobe/bile_most/ryzling_ryn.pdf, citováno 19.12.2015. 56

http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/Atlas_reva_Adobe/modre_most/rulandske_mod r.pdf, citováno 19.12.2015. 57

manuál k mikrovlnnému rozkladnému zařízení ETHOS ONE

58

LUCIE ŠIMONÍKOVÁ: Bakalářská práce, 2013, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita.

59

http://web.vscht.cz/~koplikr/6_V%C3%ADno.pdf, citováno 30.12.2015.

60

HEBÁK P., HUSTOPECKÝ. J.: Průvodce moderními analytickými metodami. 1990, SNTL, ISBN 80-03-00534-5.

61

https://www.r-project.org/

62

http://hgf10.vsb.cz/546/Ekologicke%20aspekty/cviceni/cviceni_lenticky/fosfor.htm, citováno 1.1.2016

63

http://web2.mendelu.cz/af_221_multitext/vyziva_rostlin/html/biogenni_prvky/, citováno 2.1.2016

64

KRUSKAL W. H., WALLIS W. A.: Use of ranks in one-criterion variance analysis. Journal of the american statistical association, 1952, 47, 583-621.

73