Molekulární detekce herbicid rezistentních plevelů. Mgr. Michaela Švécarová, PhD. Katedra botaniky

Molekulární detekce herbicid rezistentních plevelů

Mgr. Michaela Švécarová, PhD. Katedra botaniky [email protected]

Charakteristika plevelů • Každá rostlina, která se na určitém stanovišti vyskytuje proti vůli člověka • Rostliny plevelné a zaplevelující - plevelné (plané rostliny – ježatka kuří noha, chundelka metlice, kopřiva dvoudomá, svízel přítula, turanka kanadská atd.) - zaplevelující (nežádoucí rostliny – žito v porostu pšenice) – výdrol - problém GMO – plodina se může stát dominantní

(Urtica dioica)

(Taraxacum officinale)

Charakteristika plevelů Polní plevele - rostliny, které jsou schopny s porostem pěstovaných plodin negativně interagovat • Negativní interakce – konkurence, parazitismus, alelopatie • Hospodářská škoda – snižování množství či kvality sklízeného produktu

• Nejproblematičtější zaplevelující rostliny jsou obilniny, nejvíce v porostech ozimé řepky • Z okopanin jsou zaplevelujícími rostlinami – brambory • Kromě konkurence jsou zaplevelující rostliny nebezpečné z hlediska přežívání chorob a škůdců

Klasifikace plevelů • Plevele JEDNOLETÉ - Tyto druhy jsou odkázány na generativní rozmnožování (semena, plody), které probíhá pouze v rámci jedné sezony  Plevele efemérní – vyhraněný životní cyklus, vzcházejí na podzim či v zimě – např. huseníček rolní (Arabidopsis thaliana)

 Plevele časné jarní – typické plevele časně setých jařin – oves hluchý (Avena fatua)  Plevele pozdní jarní – teplomilnější druhy plevelů – ježatka kuří noha (Echinochloa crus-galli)

 Plevele ozimé – druhově nejpočetnější skupina – chundelka metlice (Apera spica-venti)

Klasifikace plevelů •

2) Plevele DVOULETÉ AŽ VÍCELETÉ (rozmnožující se převážně generativně)

-

V prvním roce vytvářejí listovou růžici, teprve ve druhém roce vykvétají a produkují semena nebo plody

-

Typicky dvouleté druhy následně odumírají, víceleté druhy setrvávají na stanovišti několik let

-

Mezi dvouleté druhy patří mrkev obecná (Daucus carota) Víceleté druhy – pampeliška (Taraxacum), jitrocel kopinatý (Plantago lanceolata)

(Taraxacum officinale)

Klasifikace plevelů 3) Plevele VYTRVALÉ (rozmnožující se převážně vegetativně) (Elytrigia repens)

-

Vytrvalé druhy se schopností intenzivního vegetativního šíření pomocí nadzemních či podzemních orgánů

 Plevele mělčeji kořenící

-

Plevele s plazivými kořenícími lodyhami – mochna husí, mochna plazivá Plevele s pevnými a tuhými oddenky – hlavní zástupce – pýr plazivý Plevele s měkkými a křehkými výběžky – máta rolní, čistec bahenní Plevele vytvářející hlízy, cibule a ztlustlé kořeny – česnek viničný



Plevele hlouběji kořenící

-

Plevele vytvářející oddenky – přeslička rolní, podběl lékařský Plevele vytvářející kořenové výběžky – pcháč oset, mléč rolní

Klasifikace plevelů • 4) Plevele POLOPARAZITICKÉ a PARAZITICKÉ - Druhy s různou mírou závislosti na hostiteli, na němž parazitují

 -

Plevele POLOPARAZITICKÉ Od hostitele odebírají především vodu a minerální látky Bez hostitele nejsou schopny dokončit životní cyklus Jmelí bílé (Viscum album) (Viscum album)

 Plevele PARAZITICKÉ -

Výživou zcela závislé na hostitelské rostlině, od které odebírají všechny látky nezbytné k růstu Mohou zcela postrádat chlorofyl, případně je překryt jinými barvivy Kokotice jetelová (Cuscuta trifolii)

Klasifikace plevelů 5) Dělení plevelů dle taxonomického zařazení - 2 hlavní skupiny – plevele JEDNODĚLOŽNÉ a DVOUDĚLOŽNÉ  JEDNODĚLOŽNÉ -

Řadíme sem hlavě trávy, tedy zástupce čeledi lipnicovitých (Poaceae) Dále – Juncaceae, Cyperaceae, Alliaceae

 DVOUDĚLOŽNÉ - Někdy se používá označení – širokolisté plevele - Čeleď – hvozdíkovité, merlíkovité, rdesnovité, brukvovité, lilkovité atd. - Mimo tento systém stojí krytosemenné rostliny – přesličky - Nejhojnějším zástupcem je přeslička rolní (Equisetum arvense)

Rozmnožování plevelů 1) VEGETATIVNÍ (nepohlavní, asexuální) -

Vede ke vzniku jedinců geneticky identických s rodiči Velice efektivní, pokud jde o dlouhodobé obsazení prostoru U tohoto typu rozmnožování je důležitá regenerační schopnost Většinou stačí poměrně malý úlomek vegetativní části k tomu, aby dal základ celé nové rostlině

2) GENERATIVNÍ (pohlavní, sexuální) -

Rozmnožování pomocí semen či plodů, vede ke vzniku nových kombinací vlastností rodičů a umožňuje rostlinám rychleji reagovat na měnící se podmínky prostředí

Způsoby rozšiřování plevelů • Rozšiřování plevelů = disperze, migrace • Pokud se jedná o rozšiřování semen a plodů, známe tyto způsoby:  AUTOCHORIE -

Šíření probíhá bez pomocí vnějších vektorů Vzdálenost, na kterou se semena mohou šířit, je limitována, často se jedná o několik či desítky centimetrů

 ANEMOCHORIE -

Spočívá v šíření semen či plodů vzduchem Šíří se na delší vzdálenosti

Způsoby rozšiřování plevelů  HYDROCHORIE -

Šíření semen a plodů pomocí vody

 ZOOCHORIE -

Šíření semen a plodů prostřednictvím živočichů

 ANTROPOCHORIE - Šíření prostřednictvím člověka, respektive lidských aktivit - Pro polní plevele nezastupitelný význam

Škodlivost plevelů  PŘÍMÁ – konkurence s pěstovanou plodinou (voda, živiny, světlo, prostor)  NEPŘÍMÁ  na plevelech přežívají četné choroby, nebo jsou dočasnými hostiteli řady škůdců polních plodin (Např. plevele z čeledi brukvovitých jsou napadány hlenkou kapustovou, která způsobuje nádorovitost kořenů košťálové zeleniny)

 mnohé plevele poskytují potravu a úkryt živočišným škůdcům  snižují produktivitu práce  zvyšují náklady na pěstování

Užitečnost plevelů • Léčivé rostliny – pampeliška lékařská (Taraxacum officinale) – třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum) – jitrocel kopinatý (Plantago lanceolata) – heřmánek pravý (Matricaria chamomilla)

• • • • • •

Pastva včel Humusový materiál Zabránění vodní a větrné erozi Zpevnění břehů Obohacení fytocenózy daného stanoviště Genofond

Regulace plevelů • • • • •

Zkušenosti z předchozích let Diagnóza plevelů Současný stav zaplevelení Technické možnosti aplikace Celý komplex metod

Metody regulace A) Nepřímé – prevence (kontrolované osivo, střídání plodin, půda) B) Přímé - fyzikální (mechanické) – odstranění plevelů před dozráním (termické) – přehřátí rostliny – úhyn - biologické – zavedení patogenů nebo živočišných škůdců - chemické – HERBICIDY - (narušení biochemických procesů)

Regulace plevelů PESTICIDY • chemické látky, které slouží v zemědělství k hubení živých škodlivých činitelů pěstovaných rostlin

PESTICIDY

Herbicidy

Insekticidy

Fungicidy

Regulace plevelů Projevy fytotoxického působení    

Popálení listů Retardace růstu Deformace rostlin Barevné změny

HERBICIDY • Jsou chemikálie, které zpomalují nebo přerušují normální růst a vývoj rostlin

• Narušují základní biochemické a fyziologické pochody • Použití především k regulaci plevelů v zemědělství • Méně nákladné než ostatní regulace plevelů Rizika používání herbicidů - mohou způsobit poškození pěstované plodiny - negativní vliv na obsluhu postřikovačů a jiných osob - zatěžují životní prostředí - vznik rezistentních populací! • Herbicidy nebo meziprodukty jejich rozkladu často přetrvávají v půdě, mohou být vyplavovány do podzemních a povrchových vod, popřípadě jejich rezidua mohou být obsažena i v potravinách!

HERBICIDY • Herbicid je přípravek obsahující účinnou látku a řadu dalších složek jako jsou ředidla, barviva atd. • Herbicidy mají velmi složité chemické značení, proto se používá zjednodušeně pouze název účinné látky • Jednotlivé přípravky mají také svůj obchodní název, pod kterým jsou registrovány a distribuovány

• V současné době je ve všech zemích (kromě Kanady, USA a Austrálie) používána klasifikace HRAC = Herbicide Resistance Action Committee, jež dělí herbicidy dle způsobu účinku do 22 tříd • Klasifikace je vytvořena na základě místa a mechanismu účinku, poškození plevele a chemického složení herbicidu

HERBICIDY • Klasifikace HRAC vznikla na základě iniciativy výrobců herbicidů. Jejím cílem je vytvoření jednotné klasifikace herbicidní účinnosti, použití v co nejvíce zemích světa a tím pádem co nejjednodušší výběr herbicidu zemědělcem • Klasifikovat herbicidy můžeme dle několika kritérií např. podle selektivity, způsobu účinku, doby aplikace, doby trvání účinku nebo již zmíněného mechanismu účinku

DDT • Aromatická halogenskoučenina - 1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan • Nejstarší a nejznámější INSEKTICID! • Poprvé syntetizován v roce 1874 rakouským chemikem Othmarem Zeidlerem • Insekticidní účinky objevil švýcarský chemik Paul Hermann Müller – 1939 • Přípravek k hubení škodlivého hmyzu v zemědělství, ale především k likvidaci komárovitého hmyzu v tropických zemích • Od 2. světové války – použití v masovém měřítku • Do Evropy DDT přivezla americká armáda

DDT

DDT • Rachel Carson – 1962 – Silent Spring – Mlčící jaro • Přítomnost DDT v živočišných tkáních a potravních řetězcích byla zjištěna i v lokalitách daleko vzdálených od míst jeho nasazení a že se hromadí v tkáních živočichů – BIOAKUMULACE • Nejprokazatelnější negativní vliv DDT na životní prostředí byl zaznamenán u dravých ptáků. • Hlodavci – bioakumulace • Predátor – DDT – zeslabení skořápky – vymírání druhů • Zákaz DDT v USA roce 1972

DDT Zamoření v Česku    

Zamořen DDT je bývalý sklad pesticidů v Lubech u Klatov Proniká do povrchové vody Obyvatelům této lokality se nedoporučuje, aby pili vodu z místních studní Náklady na odstranění zamoření se odhadují na 30 milionů korun

Rizika DDT    

DDT zvyšuje riziko Alzheimera Změna hladin estrogenu a progesteronu Výskyt defektních spermií, pokles spermií Nádory prsu u dívek

Klasifikace herbicidů • Podle mechanismu účinku - syntetické auxiny - inhibitory syntézy aminokyselin - inhibitory fotosyntézy - inhibitory buněčného dělení - inhibitory biosyntézy karotenoidů - inhibitory Acetyl-CoA karboxylasy • • • •

Podle selektivity Podle doby použití (před setím, po zasetí, po vzejití plodiny) Podle způsobu účinku Podle doby trvání účinku

Formy herbicidních přípravků  Práškové formy - ve vodě dispergovatelné prášky (DP, WP) - ve vodě rozpustné prášky (VRP, ST)  Granule dispergované ve vodě – (DF, DG, WG, WGD)  Granule určené pro přímý rozptyl po pozemku  Kapalné formy: - emulgovatelné koncentráty (EC, EK) - kapalný koncetrát pro ředění s vodou (SL, LC, KV) - dispergovatelný koncentrát pro ředění vodou (DK, DC) - suspenzní koncentrát pro ředění vodou (SK, SC)

Herbicidy CHLOROSULFURON • Herbicidní skupina – ALS inhibitory (acetolaktát synthasa)

• Chemická skupina – Sulfonylmočovina • Účinná látka – chlorsulfuron • Obchodní název – Glean, Balance

PROPAQUIZAFOP

• • • •

Herbicidní skupina – Inhibitory ACCasy (AcetylCoA karboxylasa) Chemická skupina – Aryloxy-fenoxy propionáty Účinná látka – Propaquizafop Obchodní název – Agil, Garland

Herbicidy ROUNDUP

• • • • • •

Herbicidní skupina – EPSP synthasy Firma Monsanto (USA) Účinná látka – GLYFOSÁT Univerzální herbicid – od roku 1974 v 21. století celosvětově nejpoužívanějšími herbicidy Rezistence rostlin – 24 druhů plevelů (turanka kanadská, laskavec palmerův, přeslička rolní)

ROUNDUP

Herbicidy

• Roundup Klasik je prodáván jako žlutá olejovitá látka, tekutina s nevýrazným aminovým zápachem • U přípravku Roundup Rapid uvádí o 25% více účinné látky • Roundup Expres - sloučenina glyfosátu 1%, kyselina pelargonová 1% hmotnosti, 98% voda a další aditivní látky • Roundup Gel - sloučenina glyfosátu 1%, jiné látky 1%, další aditivní látky 98%. • Roundup Klasik - sloučenina glyfosátu 480g/l • Roundup Original MAX - sloučenina glyfosátu 49% , příměsi 51% • Roundup Pro - sloučenina glyfosátu 480 g/l • Roundup Flex sloučenina glyfosátu 480 g/l • Roundup Bioaktiv - sloučenina glyfosátu 480 g/l • Roundup Rapid - sloučenina glyfosátu 607 g/l • Roundup WeatherMAX - sloučenina glyfosátu 540 g/l, přípravek je v technickém listu označen jako jed • Roundup Ultra2 - sloučenina glyfosátu 540 g/l, přípravek je v technickém listu označen jako jed

Herbicidy „Roundup ready“ plodiny • Kmen bakterie A. tumefaciens • Bakterie je rezistentní vůči herbicidu Roundup • Z bakterie izolován gen pro bakteriální verzi enzymu EPSP synthasy • Tento gen byl postupně vložen do některých zemědělských plodin • Dnes je v tomto ohledu dostupná široká škála glyfosát-rezistentních plodin: (sója, řepka olejná, kukuřice, bavlník, vojtěška a cukrová řepa )

„Roundup ready“ plodiny

Rostliny odolné vůči glyfosátu

Současné problémy v zemědělství • Rezidua syntetických pesticidů v potravinách a ve vodě • REZISTENTNÍ populace (plevele, patogeny, škůdci) • Negativní vliv na NECÍLOVÉ organismy

Nové trendy ochrany rostlin • Nové a zdravotně bezpečné selektivní přípravky • Geneticky modifikované organismy (GMO) • Botanické pesticidy a pomocné látky

• Nové možnosti jak snížit spotřebu syntetických chemických přípravků! • Environmentálně bezpečné (selektivní) • Zdravotně nezávadné • Zabraňují vzniku rezistence

Botanické pesticidy • Přípravky na ochranu rostlin, které obsahují rostlinné extrakty s biologicky aktivními látkami obranného charakteru • 1. generace (historicky staré, obvykle neselektivní insekticidy) • 2. generace (environmentálně bezpečné, selektivní pesticidy a pomocné látky) • 3. generace (pomocné látky zlepšující růst, vývoj a obranyschopnost rostlin, elicitory)

Detekce herbicid rezistentních plevelů • • • • • • • • • •

Acetolaktát synthasa (ALS; EC 2.2.1.6) Biosyntéza esenciálních aminokyselin (Val, Leu a Ile) Lokalizace enzymu v chloroplastech rostlinných buněk Herbicidy – inhibice aktivity uvedeného enzymu Nejvýznamnějšími ALS inhibitory jsou sulfonylmočoviny Chlorsulfuron, tribenuron, amidosulfuron aj. Regulace plevelů v porostech obilnin Uplatnění i v kukuřici, bramborách, cukrovce a řada zeleniny Rozklad herbicidů mikrobiálně i chemicky Poločas rozkladu dny až týdny

• Vznik rezistentních populací! • Rezistentní populace v ČR u chundelky metlice!

Detekce herbicid rezistentních plevelů • • • • •

Acetolaktát synthasa (ALS; EC 2.2.1.6) Mutace Pro197 (záměna za Ala, Ser, Thr) – 3 mutace Mutace Trp574 (záměna za Leu) – 1 mutace Mutace Arg377 (záměna za His) – 1 mutace Další mutace – Ala122, Ala205, Asp376, Ser563 a Gly654

Detekce herbicid rezistentních plevelů

Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti) • • • •

Trsnatá plevelná tráva – čeleď lipnicovité (Poaceae) Vlhké, písčité i štěrkovité půdy Orná půda, pastviny, podél cest Chundelka metlice je původní plevelnou rostlinou našich polí

• V současnosti již vyrůstá v ČR na všech druzích půd • Běžná i ve víceletých pícninách a ozimé zelenině • Tato konkurenčně silná rostlina dokáže při vyšším výskytu pěstovanou plodinu silně potlačit • Řadíme ji mezi nejškodlivější plevele ozimých plodin • Lze ji omezit střídáním plodin, vyséváním pouze čistého osiva a pravidelnými postřiky (Rezistence – ALS) • Chundelka přetrhovaná (Apera interrupta) – Kladenské haldy

Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti)

Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti)

• Mapa výskytu chundelky metlice v ČR (Apera spica-venti) v ozimé pšenici – pravidelný výskyt, nepravidelný výskyt, bez výskytu

Detekce herbicid rezistentních plevelů

Detekce herbicid rezistentních plevelů • Vývoj počtu rezistentních plevelů vůči vybraným skupinám herbicidů v období 1955 – 2015.

Detekce herbicid rezistentních plevelů • Seznam detekovaných účinných látek, ke kterým byla vyvinuta rezistence u chundelky metlice (Apera spica-venti) ve světě

Detekce herbicid rezistentních plevelů – TaqMan PCR • • • • • • • •

Oligonukleotidy – 2 TaqMan proby Fluorescenční značka Krátký úsek DNA Zhášeč (quencher) Velmi specifické oproti SYBR greenu I 5´-exonukleasová aktivita Taq polymerasy Uvolnění fluorescenční sondy do roztoku – fluorescence Intenzita fluorescence přímo úměrná množství PCR produktu

Interactive Fluorophore and Quencher Pairs

Interactive Fluorophore and Quencher Pairs

Detekce herbicid rezistentních plevelů – TaqMan PCR Křivky tání – „melting curve“

Detekce herbicid rezistentních plevelů – detekční PCR • • • • • • • •

Izolace gDNA - (CTAB) – vysočina a olomoucký kraj Ošetření RNasou, detekční PCR Primery (ALS375F, ALS375R) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute™ PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe – ČR) Vyhodnocení výsledků (Geneious) ITS – potvrzení daného druhu rostliny

• • • • • •

ALS375 CGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACAT– forward (F) GTGATGGAGCGGGTGACCTCTA – reverse (R) ITS TCCGTAGGTGAACCTGCGG – forward TCCTCCGCTTATTGATATGC – reverse

Detekce herbicid rezistentních plevelů – detekční PCR (Chundelka metlice) Neředěná gDNA 1

2

3

4

5

6

300 bp

10x ředěná gDNA

300 bp

ALS – Apera spica-venti

ALS – Apera spica-venti

*

ALS – Apera spica-venti

36/3 – lokalita Mostkovice

Detekce herbicid rezistentních plevelů Polní lokality Olomouckého a Moravskoslezského kraje. Červeně je označená lokalita s alespoň jedním jedincem chundelky metlice (Apera spicaventi), u kterého byla analyzována mutace v Pro197 související se vznikem rezistence vůči ALS inhibitorům

Detekce herbicid rezistentních plevelů • • • • • • •

EPSPS geny 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát synthasa (EC 2.5.1.19) Šikimátová dráha – biosyntéza aromatických AMK EPSPS1, EPSPS2 a EPSPS3 Jednobodová mutace Pro106 Záměna za serin nebo threonin Turanka kanadská (Conyza canadensis)

Detekce herbicid rezistentních plevelů Turanka kanadská – (Conyza canadensis) • • • • • • • • • •

Čeleď hvězdnicovité (Asteraceae) Plodem je nažka Příkopy, železnice, rumiska, lesní mýtiny Písčité půdy, nedostatek vláhy Hlavní plevel ve vinicích Olivové a citrusové sady Velmi odolná proti herbicidům! Problém rezistentních jedinců! Glyfosátový anion (herbicid) Roundup (komerční)

Detekce herbicid rezistentních plevelů Turanka kanadská – (Conyza canadensis)

Detekce herbicid rezistentních plevelů – EPSPS1 • • • • • • •

Izolace gDNA - 20 vzorků (CTAB) Ošetření Rnasou, detekční PCR 2 typy primerů (Primer3, Chodová et al., 2009) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute™ PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe – ČR) Vyhodnocení (Geneious)

• Primery (5´- 3´) F: AGGAGGATGTTGCAATTAAA (návrh) R: TCAATGACAACGTCCAAATA (návrh) F: AACGTTGAGGAGGATGTTGC (Chodová et al., 2009) R: TTTCAACATGCAGTGTTCTCTG (Chodová et al., 2009)

Detekce herbicid rezistentních plevelů (Teplotní gradient) 65,1°C

64,5°C

63,1°C

61,1°C

58,7°C

56,1°C

53,4°C

50,8°C

48,5°C

46,6°C

45,3°C

44,9°C

NÁVRH – PRIMER3

* 200 bp

Chodová, 2009

* 300 bp

Detekce herbicid rezistentních plevelů (Turanka kanadská)

3

4

5

7

2.1.

3

4

5

7

2.1.

2.1. 2.1.

200 bp

2x ředěné

Konc. – 4 uL gDNA

• • • •

Přečištění PCR produktů Nanodrop – koncentrace Sekvenace – SeqMe Hledání mutací EPSPS1

10x ředěné – 2 uL

EPSPS1 – Conyza canadensis

*

Detekce herbicid rezistentních plevelů • ACC gen (ACC1 a ACC2) • Acetyl CoA karboxylasa (EC 6.4.1.2) • Klíčový enzym biosyntézy mastných kyselin

• Bodové mutace u rezistentních trav (např. psárka polní) • ACC1 – pozice 1781 – záměna Ile za Leu – pozice 2027 – záměna Trp za Cys – pozice 2041 – záměna Ile za Asn – pozice 2078 – záměna Asp za Gly • ACC2 – pozice 2096 – záměna Gly za Ala

Detekce herbicid rezistentních plevelů Ježatka kuří noha – (Echinochloa crus-galli) • • • • •

Čeleď lipnicovité (Poaceae) Hojný polní plevel Plodem je obilka Podél cest, příkopy, břehy vod a nezemědělská půda V současné době patří mezi nejškodlivější plevele světa

Detekce herbicid rezistentních plevelů Ježatka kuří noha – (Echinochloa crus-galli)

Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha) • • • • • • •

Izolace gDNA - 20 vzorků (CTAB) – Vysočina a Olomouc Ošetření RNasou, detekční PCR 2 typy primerů (ACC1 a ACC2) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute™ PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe – ČR) Vyhodnocení (Geneious)

(Délye et Michel, 2005)

Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha)

300 bp

Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha)

(Stýblová, 2012)

Nalezena mutace u vzorku J2

Děkuji za pozornost!