Molekulární aspekty bipolární poruchy a schizofrenie

Molekulární aspekty bipolární poruchy a schizofrenie DISERTAČNÍ PRÁCE

Autorka: MUDr. Pavla Stopková Školitel: Prof. MUDr. Petr Zvolský, DrSc Obor: Neurovědy Pracoviště: Psychiatrické centrum Praha Ústavní 91 181 03 Praha 8 Telefon: 266003332 Fax: 266003361 email: [email protected]

Praha 2007 1

Poděkování Chtěla bych s hlubokou úctou a vděčností poděkovat především svému školiteli, Prof. MUDr. Petru Zvolskému, DrSc, za mnohostrannou a neutuchající podporu, cenné rady a odborné vedení při práci na tomto projektu. Velký dík patří Herbertu M. Lachmanovi, M.D., za jeho vstřícný dohled nad mojí prací a odborné vedení. Jeho nadšený, vynalézavý a poctivý přístup k vědecké práci podnítil můj zájem o výzkum v oblasti biologické psychiatrie, zejména o genetiku psychiatrických poruch, za což mu upřímně děkuji. Dále velmi děkuji mým kolegům z Psychiatrické kliniky 1. LF UK a VFN, MUDr. Janu Veverovi, PhD, MUDr. Iljovi Žukovovi, CSc. a doc. MUDr. Ivo Pacltovi, CSc., za příjemnou a milou spolupráci v době vzniku této práce a za velké množství práce, které věnovali vzniku českého souboru pacientů s bipolární afektivní poruchou. Mé vřelé díky patří Prof. MUDr. Cyrilu Höschlovi, DrSc., FRCPsych., řediteli Psychiatrického centra Praha, za podporu mojí práce a za vytvoření podmínek k dokončení postgraduálního studia. Děkuji také všem spoluautorům jednotlivých studií a dále pak svým kolegům Psychiatrického centra Praha, kteří mi pomáhali při vzniku této práce i při dalších lékařských a odborných aktivitách. V neposlední řadě děkuji mým nejbližším za jejich laskavou podporu, které se mi dostává nejen v letech postgraduálního studia.

2

Obsah 1. Seznam zkratek 2. Úvod 3. Cíle práce 4. Souhrn disertační práce 5. Summary of PhD thesis 6. Studie č. 1: Skríning polymorfizmů PIP5K2A jako kandidátního genu pro psychiatrické poruchy s vazbou na chromozom 10p. 7. Studie č. 2: Skríning promoterové oblasti PIP5K2A u bipolární poruchy a schizofrenie. 8. Studie č. 3: Identifikace promoterové varianty PIK3C3 asociované s bipolární poruchou a schizofrenií. 9. Studie č. 4: PIK4CA - kandidátní gen pro psychiatrické poruchy s vazbou na chromozom 22q11. 10. Studie č. 5: Analýza SYNJ1 jako kandidátního genu pro bipolární poruchu s vazbou na 21q22 – replikační studie. 11. Seznam publikací autorky 12. Literatura 13. Přílohy

3

1. Seznam zkratek 5HTT - serotoninový transportér BP - bipolární porucha COMT - katechol-O-methyltransferáza DISC1, DISC2 - disrupted in schizophrenia 1, 2 DNA - deoxyribonukleová kyselina IMPA2 - myo-inositol monofosfatáza 2 IQ - inteligenční kvocient KONT - kontroly mRNA - mediátorová ribonukleová kyselina NRG1 - neuregulin 1 PCR - polymerázová řetězcová reakce („polymerase chain reaction“) PI - fosfoinositidový/á PIK3C3 - fosfatidylinositol 3-kináza typ C3 PIK4CA - fosfatidylinositol 4-kináza PIP2 - fosfatidylinositol 4,5-bifosfát PIP5K2A - fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza typ 2A PKC - proteinkináza C PLC - fosfolipáza C PLCG1 - fosfolipáza C gamma-1 PRODH - prolindehydrogenáza RDC - Výzkumná diagnostická kritéria („Research Diagnostic Criteria“) RFLP - polymorfismy různě dlouhých restrikčních fragmentů („restriction fragment length polymorphisms“) RGS4 - regulátor G-proteinové signalizace 4 SADS-L - Dotazník pro afektivní poruchy a schizofrenii – celoživotní verze („Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia – Lifetime Version“) SCID - Strukturovaný klinický rozhovor pro DSM-IV („Structured Clinical Interview for DSM-IV“ ) SNP - jednonukleotidové polymorfismy („single nucletide polymorhisms“) SSCP - jednořetězcový konformační polymorfizmus („single strand conformation polymorphism“) SYNJ1 - synaptojanin 1 SZ - schizofrenie TH - tyrosin hydroxyláza TPH - tryprophan hydoxyláza VCFS - velokardiofaciální syndrom VNTR - sekvence, které se tandemově opakují („variable number tandem repeats“) XBP1 - „Human X box Binding Protein 1“ 4

2. Úvod

Bipolární afektivní porucha a schizofrenie patří mezi relativně časté, závažné psychiatrické poruchy. V obou případech se jedná o heterogenní skupiny poruch, které pravděpodobně obsahují několik nemocí s odlišnou patogenezí, klinickým obrazem a odpovědí na léčbu. Bipolární porucha a schizofrenie patří spolu s většinou běžných onemocnění jako je hypertenze, koronární srdeční choroba, astma bronchiale a diabetes mellitus II. typu mezi takzvané komplexní poruchy. Ačkoli jde o nemoci časté, jsou příčiny komplexních poruch nejasné. Na jejich vzniku se podílejí genetické faktory v kombinaci s vlivy prostředí. Odhady míry dědičnosti u obou nemocí určené pomocí rodinných, dvojčecích a adopčních studií, se pohybují kolem 80 %. Přesný způsob dědičnosti nebyl dosud určen, je ale jasné, že se nejedná o monogenní mendelovský způsob dominantní nebo recesivní dědičnosti. Podle způsobu přenosu v rodinách odpovídá dědičnosti bipolární poruchy i schizofrenie nejlépe oligogenní nebo polygenní typ dědičnosti. Podle tohoto modelu se na vzniku těchto nemocí v případě oligogenní dědičnosti podílí malý počet genů (do deseti) nebo v případě polygenní dědičnosti značně velký počet genů (až stovky). Vzhledem k tomu, že míra konkordance pro bipolární poruchu i schizofrenii mezi jednovaječnými dvojčaty je menší než 100 %, vznik nemoci také ovlivňují vlivy prostředí. Většina badatelů se shoduje, že bipolární porucha je porucha komplexní, na jejímž rozvoji se podílí několik genů v kombinaci s vlivy prostředí. Každý gen má malý efekt a k rozvoji nemoci pouze přispívá, není ani nutný ani dostačující k rozvoji nemoci. Nálezy genetických studií přinášejí stále více důkazů o překryvu genetické predispozice u bipolární poruchy a schizofrenie. Obě nemoci se dědí v rodinách, ale kromě toho se v rodinách pacientů se schizofrenií častěji vyskytuje bipolární porucha a v rodinách pacientů s bipolární poruchou se častěji vyskytuje schizofrenie. Schizoafektivní porucha se pak vyskytuje častěji v rodinách pacientů se schizofrenií i s bipolární poruchou, a obě nemoci jsou častější v rodinách pacientů se schizoafektivní poruchou (Craddock et al., 2006). Mezi hlavní strategie detekce genů predisponujících k bipolární poruše a schizofrenii patří: A. Studium chromozomálních abnormalit vyskytujících se u pacientů B. Vazebné studie (linkage studies) rodin s několika postiženými členy C. Studie genové exprese D. Asociační studie pozičních nebo funkčních kandidátních genů

5

A. Chromozomální abnormality Chromozomální abnormality,jako jsou translokace a delece, mohou vést k patogenezi nemoci několika mechanismy: přímým přerušením genu, vytvořením nového genu fůzí dvou genů, které jsou normálně odděleny, nepřímým narušením funkce sousedících genů nebo změnou dávky genu v případě delecí, duplikací nebo nebalancovaných translokací. U bipolární poruchy ani schizofrenie není známa jednoznačná asociace s chromozomální aberací. U většího počtu jedinců však byly nalezené 2 chromozomální aberace – translokace (1,11) a delece chromozomu 22q11, popisovaná jako velokardiofaciální syndrom. Obě chromozomální aberace jsou spojené s rozvojem bipolární poruchy i schizofrenie. Ostatní chromozomální abnormality popsané u pacientů se schizofrenií nebo s bipolární poruchou se týkají pouze velmi malého počtu případů (jednoho až pěti). Balancovaná reciproční translokace (1,11)(q42,q14.3) byla popsána ve velké skotské rodině s mnoha členy postiženými schizofrenií, bipolární poruchou a depresivní poruchou. Tato translokace přímo přerušuje dva geny na chromozomu 1, které byly pojmenovány DISC1 a DISC2 („Disrupted in Schizophrenia“). Funkce DISC1 je zřejmě kompatibilní s dosavadními poznatky o patogenezi schizofrenie (např. ovlivnění vývoje kortexu a synaptické plasticity). DISC2 nekóduje proteinový produkt, ale může regulovat expresi DISC1 pomocí antisense RNA. Některé studie nalezly pozitivní asociaci různých variant genu DISC1 s bipolární poruchou a schizofrenií (viz níže), ale případná patogenetická mutace nebyla zatím nalezena. Velokardiofaciální syndrom (VCFS), také nazývaný DiGeorgův syndrom nebo sphrintzenův syndrom, je způsobený intersticiální delecí zhruba 3 miliónů párů bazí na chromozomu 22q11. Je charakterizovaný dysmorfrickým obličejem, abnormalitami patra, vrozenými srdečními poruchami, nižším intelektem (průměrné IQ 70; rozsah od normy po 50) a více než 40 dalšími tělesnými abnormalitami. Tento syndrom je spojený s vyšším rizikem rozvoje schizofrenie a bipolární poruchy. Výskyt těchto nemocí se odhaduje u 25-30 % jedinců s VCFS. Prevalence VCFS je asi 1:4000 porodů, není tedy častou příčinou schizofrenie (pouze asi u 0,3-2 % případů) (Papolos et al., 1996). Zprávy o nálezech pozitivní vazby na 22q11 ukazují, že se na části případů budou podílet varianty genů nacházejících se v této oblasti. Mezi geny studované v této souvislosti patří např. katechol-O-metyltransferáza (COMT) a prolin dehydrogenáza (PRODH). B. Vazebné studie Vazebné studie hledají části chromozomů, označené chromozomálními markery, které se přenášejí s nemocí v rodiných se dvěma nebo více postiženými členy. Srovnáním velkého množství chromozomálních markerů mezi mezi zdravými a nemocnými členy rodiny je možné určit tzv. genetickou vazbu neboli pravděpodobnou pozici hledaného genu na chromozomu, a to zcela bez znalosti funkce daného genu či etiologie nemoci. Ke screeningu celého genomu stačí několik stovek genetických markerů. Patří mezi ně např. „single nucletide polymorhisms“ jednonukleotidové polymorfismy (SNPs), u kterých dochází k záměně jednoho nukleotidu za jiný, dále „restriction fragment length polymorphisms“ - polymorfismy různě dlouhých restrikčních fragmentů (RFLP), „variable number tandem repeats“ - sekvence, které se tandemově v různém počtu opakují (VNTR) a mikrosatelity, tvořící zvláštní typ VNTR, tvořené opakováním dinukleotidů (např. bazí CA nebo TG). SNPs mají oproti jiným markerům mnoho výhod, jako je dostatečné množství (stovky tisíc v genomu), rovnoměrný výskyt v celém genomu a jednoduchá struktura umožňující rychlé genotypování.

6

Vazebné studie jsou vhodné pro detekci genů velkého účinku, ale k detekci genů středního nebo malého účinku, jaké se u bipolární poruchy a schizofrenie předpokládají, mají studie vazby malou sílu (power) a k určení lokalizace genu je potřeba velkého množství rodin. Z tohoto důvodu nejsou výsledky dosavadních studií i přes intenzivní, více než desetileté úsilí velké a jsou jen zřídka replikovány, a to hlavně kvůli malému počtu vzorků v jednotlivých studiích. Mezi části chromozomů s vazebnými signály, které se podařilo replikovat alespoň ve dvou studiích, patří u bipolární poruchy oblasti 1q31-32, 4p16, 6pter-p24, 10p14, 10q21-26, 12q23-24, 13q31-32, 18p11, 18q21-23, 21q22, 22q11-13 a Xq24-28 (Baron, 2002). V případě schizofrenie se jedná o oblasti 6p24–22, 1q21–22, 13q32–34, dále 8p21–22, 6q16–25, 22q11– 12, 5q21–q33, 10p15–p11 a 1q42 (Craddock et al 2005). Jak vyplývá z tohoto výčtu, některé oblasti chromozómů se u obou poruch překrývají a ukazují tak možnost společných predispozičních oblastí pro schizofrenii i bipolární poruchu. Sílu vazebných studií výrazně zvyšují metaanaalýzy dosavadních výsledků. Několik oblastí s průkazem vazby k bipolární poruše bylo určeno pomocí dvou nedávných metaanalýz s rozdílným designem. Metaanalýza „Multiple Scan Probability” hodnotí hodnoty p výsledných pozitivních oblastí určených v jednotlivých studií. Badner a Gershon (2002) touto metodou analyzovali 11 kompletních genomových scanů pro bipolární poruchu a 18 genomových scanů pro schizofrenii (celkem asi 1900 jedinců). Výsledky metaanalýzy u bipolární poruchy odhalily oblasti s nejsilnější vazbou na dvou chromozomech 13q a 22q. Tyto oblasti se překrývaly s výsledky u SZ: 8p, 13q a 22q. Je zajímavé, že v těchto překrývajících se oblastech se nalézají geny s možným biologickým vztahem k neuropatologii bipolární poruchy i schizofrenie, a to COMT na 22q11 a G72 na 13q33. Druhým přístupem je „Genome Scan meta-analysis“, který složitějším způsobem hodnotí výsledky všech, nejen pozitivních, oblastí. Segurado et al. (2003) provedl tuto metaanalýzu na 18 bipolárních studiích (které neměl Badner a Gershon k dispozici). Signifikantní vazba nebyla tímto způsobem nalezena, mírné statistické významnosti dosáhly na chromozomech 9p, 10q, 14q a oblasti chormozomu 18. Přesah s výsledky u schizofrenie - 2q, 1q, 3p, 5q, 6p, 8p, 11q, 14p, 20q a 22q - nebyl v tomto typu metaanalýzy nalezen (Lewis et al., 2003). C. Studie genové exprese U schizofrenie jsou v dosavadních studiích posány tři hlavní oblasti změn genové exprese: downregulace klíčových genů pro myelinizaci a pro oligodendrocyty, změny exprese genů ovlivňujících presynaptickou a postsynaptickou funkci a genů kódujích metabolické enzymy (Katsel et al., 2005). Studie Tkacheva et al (2003) zkoumala genovou expresi vždy v 15 mozcích pacientů s bipolární poruchou, se schizofrenií a zdravých kontrol. Pomocí mikroaraye a real-time kvantitativního PCR bylo v obou skupiných pacientů shodně identifikováno celkem 8 genů se vztahem k myelinizaci, mezi nimi např. neuregulinový receptor ERBB3, transferin a SOX10 – transkripční faktor ovlivňující terminální diferenciaci oligodendrocytů (který se mapuje se na 22q11-13, oblast postiženou u VCFS). Je tedy možné, že právě porucha myelinizace je společným patogenetickým podkladem pro bipolární poruchu i schizofrenii.

7

D. Asociační studie Asociační studie zjišťují, které alely - varianty genů - se častěji vyskytují u pacientů ve srovnání s kontrolami. Podle typu zvolených kontrol se rozlišují studie populační a rodinné. Asociační studie jsou vhodné k detekci genů se středním a malým účinkem. U populačních kontrol jsou probandy nepříbuzní jedinci z jedné populace a kontroly tvoří osoby z etnicky stejné populace - to proto, že různé alely genů nejsou mezi etniky rozděleny stejně, daná varianta genu může mít v různých populacích odlišnou frekvenci výskytu. vhodnější pro geny s malým efektem. Ideálními jsou tzv. populační izoláty, populace dlouhodobě oddělené od okolního prostředí, ať již v důvodů geografických či náboženských. Jejich příslušníci se po staletí žení a vdávají pouze mezi sebou a nemísí se tedy s jinou populací. Jiné populace mohou být vždy nehomogenní. Jediný zřejmý genetický izolát s výskytem schizofrenie je v severním Švédsku. Naproti tomu genetické izoláty s vysokým výskytem bipolární poruchy byly popsány v USA ve Starém řádu Amishů, v Kanadě v Quebecu, v Kostarice, ve Finsku a v Etiopii (Torrey 1999). Například mezi přibližně 15 000 Amishů našla Egelandová et al. 69 případů bipolární poruchy (4,6 na 1000 obyvatel), ale pouze 5 případů schizofrenie (0,3 na 1000 obyvatel) a dále také 69 případů velké unipolární deprese (Egeland et al., 1994). Problém nehomogenních populací řeší rodinný design asociačních studií, ve kterých se zkoumají tzv. tria - nejčastěji představovaná nemocným dítětem a jeho dvěma rodiči, ať již zdravými či nemocnými. V tomto typu asociačních studií se srovnávají alely, přenášené z rodičů na dítě, s alelami nepřenášenými, které slouží jako kontrolní skupina. Protože jak přenášené, tak nepřenášené alely pocházejí ze stejného rodiče, etnicky si dokonale odpovídají. K asociačním studiím se běžně používají kandidátní geny nebo markery. U funkčních kandidátních genů se předpokládá pravděpodobná role v patogenezi onemocnění, poziční kadidátní geny se nalézají v oblastech s dříve určenou vazbou k poruše nebo v místě chromozomální aberace. Markery obdobně jako u vazebných studií je možné používat díky tzv. linkage disequilibrium. Tento jev vzniká na základě toho, že nové mutace vznikají na podkladě již existujících variant a pokud jsou dostatečně blízko sebe, pak je rekombinace probíhající v dalších generacích od sebe neoddělí. Lidé s daným markerem mají velmi pravděpodobně i specifickou verzi zatím neznámé, patogenní varianty. Ke screeningu celého genomu je zapotřebí několika set tisíc markerů, a proto se markery většinou používají opět v oblastech s již určenou vazbou k danému onemocnění. Poziční kandidátní geny pro bipolární poruchu a schizofrenii Konvergence pozitivních vazebných studií vedla k několika detailnějším mapováním oblastí se zjištěnou vazbou. Některé z nich vedly k nalezení specifických genů a jejich funkce. Tabulka 2 ukazuje míru dostupných průkazů u jednotlivých kandidátních genů pro rozvoj schizofrenie a bipolární poruchy. Ve většině případů byl predispoziční gen nejprve zaznamenán ve studiích schizofrenie a důkazy jsou také pro tuto nemoc nejvýraznější. Mezi geny s největším vztahem k obou nemocem zároveň patří dysbindin, neuregulin 1, DISC1 a G72/G30. Nálezy u těchto genů poskytují velmi silné důkazy pro existenci genetických oblastí, které zvyšují predispozici přes rozhraní schizofrenie a bipolární poruchy.

8

Tabulka 2. Přehled současných průkazů nejslibnějších genů implikovaných v patogenezi bipolární poruchy a schizofrenie (podle Craddock et al., 2006a, upraveno).

Gen

Umístění na Důkazy u Důkazy u bipolární chromozómu schizofrenie poruchy s psychózou

PRODH

22q11

(+)

RGS4

1q23

++

Dysbindin 6p22

Důkazy u bipolární poruchy

+++++

+

+

NRG1

8p12

++++

+

+

DISC1

1q42

+++

++

+

G72/G30

13q33

++

++

COMT

22q11

+

+

BDNF

11p13

+

+

XBP1

22q12

(+)

5HTT

17q

(+)

Tabulka 2. - legenda: Čím více +, tím více důkazů. Hodnocení je přibližné. Tučně – geny nejsilněji implikované u obou poruch zároveň. (+) – nereplikované studie nebo studie s nekonzistentními výsledky. Zkratky: PRODH – prolindehydrogenáza, RGS4 regulátor Gproteinové signalizace 4, NRG1 - neuregulin 1, DISC1 – „Disrupted in Schizpohrenia 1“, COMT – katechol-O-methyltransferáza, XBP1 – „Human X box Binding Protein 1“, 5HTT – serotoninový transportér Mezi nejlépe prozkoumané možné kandidátní geny pro bipolární poruchu a schizofrenii patří dysbindin, neuregulin, DISC1, G72/G30, COMT a BDNF, které jsou stručně charakterizované níže. Dysbindin (DTNBP1) Dystrobrevin binding protein 1, nazývaný také dysbindin, je spolu s neuregulinem v současnosti genem s nejvíce prokázaným vztahem k rozvoji schizofrenie. Signifikantní asociace s různými markery a haplotypy byla dosud nalezena více než v deseti souborech pacientů se schizofrenií z různých zemí (Williams et al., 2005). Ve skupině pacientů se schizofrenií bylo dále zjištěno, že rizikový haplotyp dysbindinu častěji dědí pacienti s negativními příznaky, které by tedy mohly vymezovat fenotyp spojený s tímto genem. Několik prací však žádnou asociaci nenalezlo a skutečná kauzativní varianta dosud nebyla identifikována. První studie asociace s bipolární poruchou neměla pozitivní výsledky, ale nalezla mírnou 9

asociaci v podskupině pacientů s převažujícími psychotickými epizodami poruchy nálady. Variace dysbindinu může mít tedy vztah spíše k psychóze než k samotné poruše nálady. V nedávné studii 213 pacientů s bipolární afektivní poruchou typu I byla signifikantní asociace s bipolární poruchou identifikována (Breen et al., 2006). Kromě toho prokázaly dvě studie sníženou úroveň exprese mRNA a proteinového produktu dysbindinu v mozcích pacientů se schizofrenií postmortem (Weickert et al, 2004, Talbot et al., 2004). Je tedy možné, že predispozice k onemocnění souvisí se změnami exprese mRNA. Pravděpodobná funkce dysbindinu odpovídá současným poznatků a teoriím o patogenezi schizofrenie. Dysbindin se váže na dvě formy dystrobrevinu, které jsou součástí dystrofinového glykoproteinového komplexu v sakrolemě svalu a v postsynaptických denzitách v několika oblastech mozku, hlavně v cerebelu a hipokampu. Kromě toho je jeho část umístěna presynapticky nezávisle na dystrobrevinu, kde zřejmě ovlivňuje uvolňování a transport glutamátu. Neuregulin 1 (NRG1) Vztah NRG1 ke schizofrenii byl poprvé objeven v islandské populaci při asociačním mapování oblasti 8p21–p22, které odhalilo asociaci schizofrenie a haplotypu o několika markerech na 5‘ konci NRG1. Asociace stejného haplotypu se schizofrenií byla poté nalezena ve velkém souboru ze Skotska a méně silná asociace také v souboru z Velké Británie. Další pozitivní nálezy pocházejí z populace v Irsku, Číně a Jižní Afriky, naopak jiné studie japonského, irského a čínského souboru však asociaci se schizofrenií neprokázaly (celkový přehled viz Owen et al, 2005). Asociace s bipolární poruchou byla zjištěna v jedné studii pacientů se schizofrenií a bipolární poruchou z Velké Británie pro stejný hapolotyp jako u schizofrenie (Green et al., 2005), v této studii byla velikost účinku větší u bipolárních pacientů s převládajícími psychotickými příznaky inkongruentími s náladou a u schizofrenních pacientů, kteří prodělali mánii. Asociace s bipolární poruchou i se schizofrenií byla také nalezena pro nový haplotyp NRG1 v jedné skotské studii (Thomson et al., 2007). Přes podrobné resekvenování nebyly identifikované specifické predispoziční varianty, ale původně identifikovaný islandský haplotyp odkazuje k 5‘ konci genu a tím podobně jako u dysbindinu ke změně exprese nebo splicingu mRNA. Narušenou funkci nebo expresi NRG1 podporují také nálezy změn poměrů jednotlivých typů mRNA v mozcích pacientů se schizofrenií postmortem (Hashimoto et al, 2004). Jakým způsobem se NRG1 může podílet na patogenezi schizofrenie je nejasné. NRG1 kóduje mnoho typů mRNA a zhruba 15 proteinů s širokým spektrem funkcí, které zahrnují mezibuněčnou signalizaci, interakci s ErBb-receptory, vedení axonu, synaptogenezu, diferenciaci glií, myelinizaci a neurotransmisi (Corfas et al, 2004). Všechny tyto funkce mohou mít vztah k rozvoji schizofrenie i bipolární poruchy. Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) V rozsáhlé skotské rodině s vysokým výskytem psychiatrických poruch, mezi které patří schizofrenie, bipolární porucha a velké depresivní epizoda, byla nalezena balancovaná translokace chromozomů 1 a 11. Tato translokace přerušuje dva nové geny, které byly nazvány Disrupted in Schizophrenia 1 a 2 (DISC1 a DISC2) (Millar et al., 2000). DISC1 je u primátů preferenčně exprimován v těch oblastech mozku, které hrají roli při rozvoji schizofrenie (limbický systém, mozková kůra). Funkce DISC1 není podrobně známa, alespoň některé jeho funkce však odpovídají možnému zapojení v patogeneze schizofrenie. Proteinový produkt DISC1 ovlivňuje růst neuritu a reguluje cytoskelet a pravděpodobně ovlivňuje migraci neuronů 10

při vývoji kortexu, synaptickou remodelaci a regulaci translace. V mozcích pacientů se schizofrenií byl zjištěna zvýšená exprese proteinového produktu DISC1. Translokace však mohou několika způsoby ovlivňovat i geny nacházející se vedle přerušených genů. K jednoznačnému důkazu role DISC1 a DISC2 v rozvoji schizofrenie je potřeba identifikovat mutace s asociací ke schizofrenie v dalších populacích. Pozitivní výsledky měla studie rozsáhlého finského souboru pacientů se schizofrenií a souboru z USA, který zahrnoval pacienty se schizofrenií, schizoafektivní poruchou a s bipolární poruchou, jiné studie u obou poruch jsou však negativní (Hennah et al., 2006). Z genetických studií také vyvstávají důkazy pro vztah mezi DISC1 a měřitelnými charakteristikami, jako je pracovní paměť, kognitivní stárnutí a snížený objem šedé hmoty v prefrontálním kortexu, abnormalita struktury a funkce hipokampu a snížení amplitudy evokovaného potenciálu P300 (přehled viz Hennah et al., 2006). G72/G30 Geny označené jako “G72” a “G30” byly objeveny na chromozomu 13q33, v oblasti s průkazem asociace se schizofrenií (Chumakov et al., 2002). Také ve studiích bipolární poruchy byly nalezeny signály o vazbě k této oblasti, které však byly příliš slabé na to, aby se objevily v metaanalýze. G72/G30 se překrývají na komplementárních chromozomálních řetězcích poblíž telomery krátkého raménka, v oblasti, kde se nenalézaly žádné známé geny. Produkt G72 interaguje s D-amino-acid oxidázou (DAO nebo DAAO) a ovlivňuje v mozku hladinu D-serinu, endogenního modulátoru glycinového vazebného místa na N-methyl-D-aspartátovém glutamátovém receptoru. U schizofrenie byla nalezena signifikantní asociace s několika SNPs a jejich haplotypy (kombinacemi jednotlivých SNP) a tento nález byl několikrát replikován, jedna studie 218 rodin z Taiwanu s alespoň dvěma postiženými sourozenci však asociaci nepotvrdila (přehled viz Detera-Wadleigh and McMahon, 2006). U pacientů se schizofrenií bylo také popsáno ve spojistosti s variantou G72 zvýšené riziko pro vznik kognitivní poruchy (Goldberg et al, 2006). Asociace s bipolární poruchou je potvrzena ve třech rozsáhlých nezávislých studiích. Hattori et al. (2003) zkoumal G72/G30 ve dvou souborech rodin s bipolární poruchou, a to v 83 vzorcích z 22 rodin z Clinical Neurogenetics pedigrees (u kterých byla dříve nalezena vazba na 13q32) a v 474 vzorcích ze 152 rodin z National Institute of Mental Health Genetics Initiative pedigrees. V obou souborech byl častěji přenášen stejný haplotyp a v souboru CNG byla nalezena statisticky signifikantní asociace s jednotlivými SNPs. Asociace individuálních SNPs a haplotypu byla také nalezena v populační studii 139 případů původem z USA (Chen 04) a ve vzorku 300 pacientů s bipolární poruchou původem z Německa (Schumacher 04). Studie, ve kterých se nepodařilo replikovat uvedené asociace, nejsou v současnosti známy. Rizikový haplotyp G72 zřejmě predisponuje k psychotickému syndromu přítomnému v rámci schizofrenie nebo bipolární poruchy. Katechol-O-methyl transferáza (COMT) COMT obsahuje funkční variantu, která vede k substituci valinu za methionin. Valin se nachází v termostabilní, vysoce aktivní variantě COMT, jeho výměna za methionin vede k termolabilní variantě COMT s nízkou aktivitou (Lachman et al 1996). COMT je ze dvou důvodů kandidátním genem: jednak se jako klíčový enzym metabolické degradace katecholaminů podílí na více než 60 % metabolické degradace dopaminu ve frontálním kortexu a dále je to jeden z genů deletovaných ve VCFS, asociovaném s 11

mikrodelecí na chromozomu 22. Mezi symptomy VCFS patří i schizofrenie a bipolární porucha (Papolos et al., 1996). Podle některých studií by alela met s nízkou aktivitou mohla predisponovat k bipolární poruše a obzvlášť k rychlému cyklování. Některé studie s rodinným designem svědčí dále o tom, že by val forma mohla být asociovaná s vyšším rizikem rozvoje schizofrenie, avšak většina populačních studií a metaanalýza mají negativní výsledky. Alela val je celkem spolehlivě asociovaná se sníženým výkonem v testech frontálních funkcí, což ukazuje možný způsob, jakým může COMT modifikovat rozvoj schizofrenie nebo bipolární poruchy (přehled viz Craddock et al, 2006). V poslední době byly v COMT identifikovány tři nové SNP. Byla nalezena vysoce signifikantní asociace jejich haplotypu nejprve se schizofrenií a později s bipolární poruchou, a to u 217 bipolárních pacientů z populace Aškenázských židů, s vyšším relativním rizikem u žen (Shifman et al., 2004). BDNF Brain derived neurotrophic factor (BDNF) se nalézá na 11p13-15, v oblasti, kde byla před lety publikována velmi silná vazba k bipolární poruše v souboru Amishů (Egeland et al., 1987). Tento nález byl později korigován, ale také několik pozdějších analýz nalezlo v této oblasti vazbu k bipolární poruše, i když slabší. Tato oblast obsahuje také několik dalších funkčních kandidátních genů pro bipolární poruchu, jako je tyrosin hydroxyláza a tryptofan hydroxyláza. BDNF patří do rodiny nervových růstových faktorů a má širokou oblast účinku: podporuje neuronální vývoj, regeneraci, přežití a údržbu nervové buňky, moduluje synaptickou plasticitu, uvolňování různých neurotransmiterů a intracelulární dráhy účastnící se přenosu signálu a ovlivňuje synaptickou polasticitu včetně takových procesů, jako je dlouhodobá potenciace, učení a paměť. Exprese nervových růstových faktorů hraje roli v mechanismu účinku terapeutických agens, jako jsou stabilizátory nálady, antidepresiva a chronická aplikace elektrokonvulzí (Hashimoto et al, 2002). V mozcích pacientů s bipolární poruchou byla postmortem nalezena nižší hladina proteinu BDNF ve srovnání s normálními kontrolami (Knable et al, 2004). Jeden ze dvou identifikovaných SNP vede k substituci aminokyselin valinu za methionin na kodonu 66 (val66met). Tři nezávislé skupiny, všechny s použitím rodinných asociačních studií, nalezly u jedinců s bipolární poruchou preferenční přenos alely val66 převážně v bělošských populacích. Ostatních pět populačních studií pacientů převážně asijského původu mělo negativní výsledky (přehled viz Craddock et al., 2006). Vzhledem k tomu, že pozitivní asociace val66met polymorfizmu BDNF byla prokázána hlavně v bělošské populaci, a nikoli v japonských nebo čínských vzorcích, je pravděpodobné, že je tato asociace závislá na etnicitě. U schizofrenie většina asociačních studií nebyla úspěšná, pozitivní výsledky přinesly pouze dvě práce ze skotské a španělské populace. Z Japonska pochází zpráva o vztahu polymorfizmu val66met k začátku věku nemoci a závažnosti klinické symptomatiky u pacientů s chronickou schizofrenií (Numata et al, 2006). Funkční kandidátní geny Strategie funkčních kandidátních genů používá geny s předpokládaným funkčním významem pro danou poruchu. Tyto studie zkoumají současný výskyt varianty genu a nemoci buď s užitím populační studie (příbuzní pacienti ve srovnání s populačními kontrolami) nebo na základě studie s rodinným designem (např. trio sestávající z nemocného dítěte a dva rodiče jako 12

kontroly). Nejpříhodnější zdrojem funkčních kandidátních genů jsou neurotransmiterové systémy pro jejich zřejmou roli v regulaci nálady a chování, podpořenou dále poznatky o způsobu účinku léků používaných k léčbě bipolární poruchy. Dosud však byly výsledky kandidátních genů se vztahem k monoaminové neurotransmisi protichůdné a nejednoznačné. Tyrosin hydroxyláza (TH) TH je enzymem limitujícím rychlost syntézy dopaminu a noradrenalinu. TH byla považována za důležitý kandidátní gen pro rozvoj psychiatrických poruch, protože dysfunkce katecholaminové dráhy je již dlouho považována za možný biochemický podklad u bipolární poruchy. Kromě toho časné studie vazby u bipolární poruchy ukazovaly silný pozitivní signál v blízkosti lokalizace TH na chromozomu 1 (Egeland et al., 1987). Pozdější analýzy prokazují vazbu v této oblasti s menší pravděpodobností. Metaanalýza publikovaných asociačních studií (s celkovým počtem 169 pacientů) neodhalila žádnou asociaci mezi bipolární poruchou a TH polymorfismem (Turecki et al., 1997). Tryprophan hydoxyláza (TPH) TPH kóduje enzym limitující rychlost syntézy serotoninu. TPH se nalézá v oblasti chromozomu 11p s nejistým průkazem vazby k BP (viz výše). TPH byla studována v řadě asociačních populačních nebo rodinných studií, většina z nich však neprokázala asociaci s bipolární poruchou (Preisig et al., 2005). Fospholipáza C gamma-1 (PLCG1) PLCG1 hraje důležitou roli ve fosfoinositidovém systému druhých poslů, který je cílem terapeutického působení lithia. Turecki et al. (1998) publikoval předběžné výsledky svědčící, že se u 136 pacientů s BP s dobrou odpovědí na lithium častěji vyskytovala specifická alela tvořená opakování dinukleotidu (PLCG1-5 opakování). Tento nález byl replikován jinou skupinou v souboru 61 norských BP pacientů léčených lithiem. U lithiových respondérů byla také nalezena vyšší frekvence PLCG1-8 opakování než u normálních kontrol (Lovlie et al 2001). Myo-inositol monofosfatáza 2 (IMPA2) IMPA2 je jedním ze dvou genů, kodujících lidskou myoinositol monofosfatázu, která je cílem působení Lithia ve fosfoinositolovém signálním systému. IMPA2 se nachází na chromozomu 18p11.2, na místě s vazbou k bipolární poruše. Nižší aktivita IMPA2 byla nalezena v lymfoblastoidní buněčné linii bipolárních pacientů, a to hlavně lithiových respondérů. Byla publikována signifikantní asociace mezi dvěma IMPA2 promoterovými SNPs a bipolární poruchou v souboru palestinských trií ze 75 rodin a slabší asociace byla pozorována pro odlišný polymorfizmus v populační studii 44 norských, lithiem léčených pacientů (Sjoholt et al., 2004), tento nález však nebyl jednoznačně replikován.

13

3. Cíle práce Vytyčili jsme si následující experimentální úkoly s cílem: A. Identifikovat mutace genu fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza typ 2A (PIP5K2A) a provést asociační studii v souboru pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií a v souboru odpovídajících kontrol. B. Analyzovat promoterovou oblast PIP5K2A na přítomnost mutací a provést asociační studii zjištěných polymorfizmů v souborech pacientů s bipolární poruchou, schizofrenií a v kontrolním souboru. Metodou EMSA („Electromobility Gel Shift Assay“) zjistit, zda identifikované mutace mění vazbu na jaderné proteiny izolované z myších a lidských tkání. C. Skrínovat promoterou oblast fosfatidylinositol 3 kinázy typ C3 (PIK3C3) na přítomnost mutací. Nalezené mutace genotypovat v asociační studii bipolárních, schizofrenních a kontrolních vzorků. Studovat pomocí EMSA, zda detekované polymorfizmy ovlivňují vazbu na jaderné proteiny izolované z myších a lidských tkání. D. Detekovat nové mutace v promoterové oblasti a části vlastního genu fosfatidylinositol 4-kinázy (PIK4CA) a provést předběžnou asociační studii porovnávající frekvenci alel identifikovaných mutací u kontrol a pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. E. Replikovat asociační studii již dříve posaných mutací synaptojaninu 1 (SYNJ1) v novém souboru pacientů z České republiky, který byl vytvořen v letech 20012003 na Psychiatrické klinice v Praze.

14

4. Souhrn disertační práce Disertační práce obsahuje výsledky populačních asociačních studií vybraných genů v souborech pacientů s bipolární afektivní poruchou, se schizofrenií a kontrol. Studované geny jsou součástí fosfoinositidové dráhy, která ovlivňuje přenos neuronálního signálu a řízení synaptického váčku. Tato dráha je pravděpodobným terapeutickým cílem působení lithia, léku účinného v léčbě bipolární poruchy. Mnohé geny této dráhy včetně genů námi studovaných se nacházejí na místech chromozomů se zjištěnou vazbou k bipolární poruše, ke schizofrenii nebo i k oběma poruchám zároveň. První práce se týká genu fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza typ 2A (PIP5K2A), která se podílí na syntéze fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu, klíčového fosfolipidu řídícího přenos signálu a pohyb synaptického váčku. Při skríningu polymorfizmů jsme poblíž „splice donor site“ exonu 9intronu 9 identifikovali oblast s nedokonalým opakováním dinukleotidu CT. V distribuci alel této vysoce polymorfní oblasti jsme nalezli mírný rozdíl při srovnání pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií s kontrolami. U pacientů se častěji vyskytovaly relativně vzácné, krátké varianty a homozygocita pro běžnou, dlouhou alelu byla častěji zjištěna u kontrol. Druhá analýza se týká promoterové oblasti PIP5K2A. Identifikovali jsme vzácnou promoterovou mutaci -1007CT. Tato mutace byla častěji nalezena u pacientů se schizofrenií oproti kontrolám a jediní dva homozygoté pro tuto variantu byli pacienti se schizofrenií. V souboru pacientů s bipolární poruchou nebyly rozdíly v distribuci této mutace zjištěny. Druhým analyzovaným genem je fosfatidylinositol 3 kináza typ C3 (PIK3C3). Při skríningu promoterové oblasti PIK3C3 jsme nalezli variantu -432CT, která se častěji vyskytovala v souborech pacientů s bipolární poruchou a se schizofrenií oproti kontrolám. Čtvrtá práce je věnovaná fosfatidylinositol 4-kináze (PIK4CA), která spolupracuje s PIP5K2A při syntéze fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu. Skríning dvou funkčních domén a promoterové oblasti PIK4CA vedl k identifikaci 15 různých polymorfizmů. Vzácné varianty na „consensus splice donor“ místě a v promoterové oblasti byly nalezeny celkem u 3 pacientů s bipolární poruchou, u 3 pacientů se schizofrenií a pouze jedné kontroly. Identifikovali jsme také několik běžných, nesynonymních záměn a běžný SNP v předpokládané promoterové oblasti. Z těchto běžných polymorfizmů byl u pacientů s bipolární poruchou nalezen mírný rozdíl v distribuci promoterového SNP s trendem ke statistické významnosti. Poslední práce se týká synaptojaninu 1 (SYNJ1), inositol 5-fosfatázy, regulující recyklaci synaptického váčku. Výzkumný tým stejného pracoviště již dříve publikoval nález mutací SYNJ1, které byly zjištěny buď častěji nebo výhradně u pacientů s bipolární poruchou. Naším záměrem bylo zopakovat analýzu SYNJ1 v novém souboru pacientů z České republiky, který byl vytvořen v letech 2001-2003 na Psychiatrické klinice v Praze. Nalezli jsme nárůst počtu homozygotů pro jednu variantu běžné mutace intronu 12, avšak tento nárůst nedosáhl statistické významnosti. Obě výše popsané mutace, -432CT u PIK3C3 a -1007CT u PIP5K2A, jsou podobné další promoterové mutaci (popsané dříve v jiné práci) -1898TC u SYNJ1. Ve všech případech se mutace vyskytuje uvnitř nebo poblíž motivu ATTT. Sekvence ATTT charakterizuje oblasti, na které se váží transkripční faktory Oct-1 a Brn-2. Tyto faktory patří do rodiny transkripčních 15

faktorů POU, která reguluje genovou expresi během vývoje mozku a řídí postnatální fungování neuronů. Kromě toho dvě z těchto variant, -432CT u PIK3C3 a -1007CT u PIP5K2A, vedou ke vzniku tzv. palindromových sekvencí. Takovéto sekvence fungují jako vazebná místa pro proteiny řídící transkripci. Promoterové varianty, které jsme identifikovali, mohou tedy vázat kromě členů rodiny POU i další transkripční faktory. Tuto možnost potvrzují výsledky našich experimentů, v kterých jsme u všech třech mutací prokázali metodou EMSA („Electromobility Gel Shift Assay“) zvýšenou vazbu proteinů izolovaných z myších a lidských mozků na alely s častějším výskytem u pacientů s bipolární poruchou a se schizofrenií. V analýzách několika genů vybraných na základě jejich funkce a pozice na chromozomu jsme nalezli několik potenciálně funkčních mutací, které se mohou podílet na rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie. Naše výsledky ukazují, že abnormální regulace genů fosfoinositidové dráhy může být podkladem rozvoje bipolární poruchy i schizofrenie. Tato hypotéza je v souladu s dosavadními znalostmi o patogenezi obou těchto nemocí, včetně terapeutického účinku lithia, předchozích genetických vazebných studií a řízení neurogeneze.

16

5. Summary of PhD thesis The PhD thesis is a summary of data from case-control studies of selected genes in patients with bipolar affective disorder, schizophrenia, and matched controls. Analysed genes are components of phosphoinositide metabolic pathway involved in neuronal signal transmission and regulation of synaptic function. The phosphoinositide pathway is a putative target of therapeutic action of Lithium, a medication effective in treatment of bipolar disorder. Many phosphoinositide pathway genes map to regions linked to bipolar or schizophrenia susceptibility or, in some cases, to both disorders. The first study is aimed at phosphoinositide 4-phosphate 5-kinase type 2A (PIP5K2A). PIP5K2A takes part in phosphoinositide 4,5-bisphosphate synthesis. Polymorphism screening of PIP5K2A revealed the existence of an imperfect CT repeat polymorphism located near the exon 9-intron 9 splice donor site. A modest difference was found in the distribution of alleles from this highly polymorphic variant when bipolar and schizophrenic subjects were compared with controls; relatively rare short repeat variants were found more commonly in patients and homozygosity for a common long repeat variant was found more commonly in controls. The second study concerns the promoter region of PIP5K2A. We identified a rare promoter variant -1007CT. This mutation was found more frequently in patients with schizophrenia compared with controls and the only two homozygotes for this variant were patients with schizophrenia. There was no difference in the -1007CT mutation in bipolar patients. The third analysis is focused on phosphatidylinositide 3-kinase type C3 (PIK3C3). The promoter region screening revealed a -432CT substitution and a “C” insert at position -86. In each population analyzed, an increase in -432T was found in patients. The next gene studied is phosphoinositide 4-kinase (PIK4CA) which catalyzes the first phosphorylation step in synthesis of phosphoinositide 4,5-bisphosphate, a critical phospholipid involved in signal transduction and vesicular trafficking in the brain and other organs. The preliminary screening of PIK4CA resulted in identification of 15 different polymorphisms. Several rare variants in consensus splice donor site and in the promoter region were found in three bipolar patients, three schizophrenia patients, and only one control. We identified also several common non-synonymous substitutions and one SNP in the putative promoter region. In bipolar patients, there was a moderate difference in the promoter SNP distribution with a trend to statistical significance. In the last analysis we studied synaptojanin 1 (SYNJ1), an inositol 5-phosphatase, regulation synaptic vesicle recycling. Previous mutation screening of SYNJ1 identified several rare variants found primarily or excusively in patients with bipolar disorder. None of the rare variants were detected in an analysis of a new set of bipolar patients from the Czech republic created during 2001-2003 at the Psychiatric Clinic in Prague. There was an increase in the number of homozygotes for one variant of a common intron 12 mutation, however, the increase did no reach statistical significance. The combined data from both studies continue to show a trend toward significance for allele 2 homozygotes in bipolar disorder. Both above described mutations, -432CT in PIK3C3 and -1007CT in PIP5K2A, are remarkably similar to another promoter mutation decribed previously, -1898TC in SYNJ1. In each case, the promoter variants occur within or near an ATTT motif found in members of the POU family of transcription factors, such as Oct-1 and Brn-2. Members of the POU family of 17

transcription factors are important regulators of gene expression during brain development and regulate neuronal postnatal function. In addition, two of the variant alleles, PIK3C3 -432T and PIP5K2A -1007T, both result in palindromes that are often found as core sequences for DNA binding proteins. Thus, the promoter variants we have identified may in fact bind several transcription factors in addition to members of POU family. This is supported by our EMSA (Electromobility Gel Shift Assay) experiments that show multiple band shifts for most of the promoter variants analyzed. The band shifts are indicative of an increased binding of protein extracted from human and mouse brains, as well as several other mouse organs, to aleles found more often in patients with bipolar disorder and schizophrenia. In our analyses of several genes selected with consideration to their function and chromosomal location we identified several potentially functional mutations, which may contribute to bipolar and schizophrenia susceptibility. Our findings suggest that abnormal regulation of phosphoinositide regulatory genes, possibly by members of the POU family of transcription factors, is a pathway underlying the development of both bipolar disorder and schizophrenia. This hypothesis fits well with various aspects of pathogenesis of both disorders, including the therapeutic action of lithium, previous genetic linkage studies, recently identified candidate genes, and neurodevelopmental considerations.

18

6. Studie č. 1: Skríning polymorfizmů PIP5K2A jako kandidátního genu pro psychiatrické poruchy s vazbou na chromozom 10p

Souhrn Lithim je účinným, nekompetitivním inhibitorem inositol monofosfatázy, enzymu zapojeného v metabolizmu fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu, hlavního fosfoinositidu, který reguluje přenos signálu a funkci synaptického váčku. Mnoho genů řídících syntézu a defosforylaci fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu se nachází v oblastech s vazbou k bipolární poruše. Jedním z takových genů je fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza typ 2A (PIP5K2A). Při skríningu polymorfizmů PIP5K2A jsme poblíž „suplice donor site“ exonu 9-intronu 9 identifikovali oblast s nedokonalým opakováním dinukleotidu CT. V distribuci alel této vysoce polymorfní oblasti jsme nalezli mírný rozdíl při srovnání pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií s kontrolami. U pacientů se častěji vyskytovaly relativně vzácné, krátké varianty a homozygocita pro běžnou, dlouhou alelu byla častěji zjištěna u kontrol.

Úvod Fosfoinositidová (PI) dráha je jedním z pravděpodobných cílů terapeutického působení lithia při léčbě bipolární afektivní poruchy (Obrázek 1). V terapeutických koncentracích je lithium účinným, nekompetitivním inhibitorem inositol monofosfatázy, enzymu, který zajišťuje jeden z kroků postupné defosfylace inositolfosfátů na inositol (Hallcher and Sherman, 1980). Předpokládá se, že chronická léčba lithiem může vést ke snížení hladiny inositolu v mozku, které dále vede k poklesu syntézy fosfatidylinositol 4,5-bifosfátu (PIP2) a poklesu přenosu signálu zprostředkovaného PI dráhou. Jde o tzv. hypotézu deplece inositolu (Berridge and Irvine, 1989). Inositol je prekurzorem PIP2, hlavního membránového fosfolipidu, který ovlivňuje přenos signálu a pohyb synaptického váčku (Berridge and Irvine, 1989; Nishizuka, 1992; Cremona et al., 1999; Cockcroft and De Matteis, 2001). Syntéza PIP2 je regulovaná specifickými lipidovými kinázami, které fosforylují fosfatidylinositol na pozicích D4 a D5 (Obrázek 2) (Gehrmann and Heilmeyer, 1998; Funaki et al., 2000). PIP2 je defosforylován lipidově specifickými fosfatázami, jedna z nichž – synaptojanin – se nalézá na synaptických zakončeních (McPherson et al., 1996; Cremona et al., 1999). Klasická funkční dráha PIP2 je zahájena jeho hydrolýzou fosfolipázou C (PLC) na druhé posly inositol 1,4,5-trifosfát, který mobilizuje intracelulární zásoby kalcia, a diacylglycerol, který aktivuje proteinkinázu C (PKC) (Berridge and Irvine, 1989; Nishizuka, 1992). PIP2 se dále váže přímo na proteiny na synaptických váčcích a dalších intracelulárních strukturách a tím hraje nezastupitelnou roli v regulaci pohybu synaptického váčku (Cremona et al., 1999). V neuronech ovlivňuje PIP2 fázi exocytózy i endocytózy cyklu synaptického váčku vazbou na synaptické 19

proteiny jako je synaptotagmin a „clathrin adaptor protein“ AP-2 (McPherson et al., 1996; Cremona et al., 1999; Osborne et al., 2001). Defosforylace PIP2 synaptojaninem vede k odstranění klathrinu z endocytovaného synaptického váčku, která umožňuje recyklaci synaptických vezikulů do zásob dostupných pro nové uvolnění transmiteru (McPherson et al., 1996; Cremona et al., 1999). Obrázek 1: Fosfoinositidová signální dráha

N R PI

DAG

PIP2 PLC G-p

PKC

Li

Li INS

IP3

Li IP4

IP5

IP6

Obrázek 1- legenda: PI – fosfatidylinositol, PIP2 – fosfatidylinositol 4,5-bifosfát, IP3 – inositol 1,4,5-trifosfát, IP4 – inositol tetrafosfát, IP5 – inositol pentafosfát, IP6 – inositol hexafosfát, INS – inositol, PKC – proteinkináza C, PLC – fosfolipáza C, G-p – G-proteiny, R – receptor, N – neurotransmiter. Li – cíle působení lithia. Obrázek 2. Fosfatidylinositol 4,5-bifosfát (PIP2)

P D2 D3

D1 D4

D6 D5

P

P

Obrázek 2 - vysvětlivky: P – fosfát, D1-D6 – pozice inositolového kruhu 20

Lithium dále zvyšuje koncentraci rozpustných inositolfosfátových meziproduktů vznikajících po ligandem aktivované hydrolýze PIP2 (Casebolt and Jope 1991; Sun et al, 1992; Dixon and Hokin, 1997; Manji et al, 2001; Jope and Bijur 2002; Lenox and Wang 2003). Lithium má také další účinky na PI dráhu, mezi které patří inhibiční a excitační vliv na proteinkinázu C, inhibice G-proteinů a inhibice glykogen syntázkinázy, která je cílem fosfatidyinositol 3-kinázové signální dráhy (Klein and Melton, 1996; Manji et al, 2001; Jope and Bijur 2002). Dalším účinkem chronického podávání lithia na fosfoinositidovou dráhu je inhibice některých izoforem PKC (Manji and Chen, 2002). Je zajímavé, že mnoho genů řídících metabolizmus PIP2 i dalších fosfoinositidů a inositol 3-fosfátů a dalších inositolfosfátových druhých poslů se nachází poblíž oblastí chromozomů, u kterých byla zjištěna vazba k bipolární afektivní poruše a schizofrenii (viz diskuse). Patří mezi ně také PIP5K2A, lokalizovaná v oblasti 10p12 s možným vztahem k rozvoji bipolární poruchy i schizofrenie. S ohledem na tato pozorování jsme začali skrínovat fosfoinositidové geny na funkční mutace, které by mohly být asociované s bipolární poruchou a schizofrenií. Nyní jsme se zaměřili na PIP5K2A, která je hojně exprimovaná v mozku. Fosfatidylinositol 5-kinázy katalyzují fosforylaci inositolového kruhu na pozici D5 za použití fosfatidylinositolu nebo fosfatidylinositol 4-fosfátu jako substrátů a jsou zapojeny v přenosu signálu aktivovaném receptorem, funkci iontových kanálů a funkci synaptického váčku (Shyng et al., 2000, Chatah and Abrams, 2001; Wenk et al., 2001). Metody Pacienti Pacienti byli nabíráni z klinik a soukromých ordinací přidružených k Albert Einstein College of Medicine, dále z Coriell Institute ve spolupráci s National Institutes of Mental Health Bipolar Genetics Initiative a z Psychiatrické kliniky Univerzity Karlovy v Praze. Pacienti se schizofrenií byli získáni z Bronx Psychiatric Center, Long Island Jewish Hillside Hospital, Rockland State Hospital a z Beer Yaakov Mental Health Center. Diagnóza byla stanovena naplněním kritérií RDC (Spitzer et al., 1978) na základě interview SCID nebo SADS-L nebo pomocí nestrukturovaného klinického interview upraveného podle SADS-L. Pacienti podepsali informovaný souhlas schválený příslušnou etickou komisí. Kontrolní soubor byl tvořen anonymními dárci krve (USA, Česká republika), pacienty hospitalizovanými pro somatické potíže (Česká republika) a studenty a zaměstnanci nemocnice (Izrael, Česká republika). Přítomnost psychiatrické nemoci u kontrolních osob nebyla testována s výjimkou členů souboru z České republiky, kteří byli skrínováni krátkým psychiatrickým interview. Soubory pacientů a kontrol si složením odpovídaly ve věku, pohlaví a etnickém původu. Sto osmnáct pacientů s bipolární poruchou, 96 se schizofrenií a 119 kontrol bylo ze Severní Ameriky evropského původu. Soubor schizofrenie se dále skládal z 80 pacientů se schizofrenií a 59 kontrol z Izraele. Tito jedinci byli Židé evropského původu. Bipolární skupina také zahrnovala 80 pacientů s bipolární poruchou a 93 kontrol z České republiky. Tyto bělošské vzorky byl spojeny se vzorky z USA, protože frekvence alel pro dvě analyzované varianty byla v každé kohortě podobná. Detekce mutací a genotypování DNA byla izolována z celé krve buď pomocí izolačního kitu DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN) nebo standardní fenolovou extrakcí. Exony PIP5K2A a exon21

intronová spojení byla mapována porovnáním sekvence cDNA s genomovou DNA chromozomu 10. Primery byly navrženy na základě sekvencí intronů tak, aby byly amplifikovány exony a funkční domény na přechodech intronů a exonů. Primery použité ve studii jsou uvedeny v Tabulce 1. Tabulka 1. Primery použité k amplifikaci exonů a přechodů exon-intron PIP5K2A „Forward“ primer

„Reverse“ primer

Velikost

Exon 2

attcaatcaagtcctcctc

acccattgacaaattatgtgat

255

Exon 3

taggcagtgaactctgaacc

cagatcccaattgacacagc

283

Exon 4

gccacacctttaactagttat

cgcatgttaatcttcttggag

267

Exon 5

gaacaccataggcgtatgtat

ctgatgatcaatgacaacatt

312

Exon 6

tttctgcgtgtgaaacccaa

attgggagtatgtgatcatgc

160

Exon 7

agggttggaaggtgtatgtg

aacccaacagggctgatattt

247

Exon 8

cttgtctcctttaaatgttgg

aaggccaaagtcaaaccact

370

Exon 9

tcagcagcaatgctggcact

ctgagttacaggtcacacag

282

Exon 10

agctgtagatattgagtaataat

catactgaccgaagtggatc

470

Fragmenty genomické DNA namnožené pomocí PCR („Polymerase chain reaction“) byly skrínovány na přítomnost polymorfizmů pomocí modifikace SSCP („Single strand conformation polymorphism“) analýzy původně popsané Oritou et al (1989). V úvodním skríningu mutací bylo použito 24-45 vzorků DNA získaných od nepříbuzných pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. PCR reakce byla prováděna v reakční směsi o objemu 20 l, která obsahovala 50 ng genomické DNA, směs čtyř nukleotidů (konečná koncentrace 0.2 mM pro každý z nich), 1× reakční pufr, 20 pmol každého primeru a 1,25 U Taq polymerázy (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR produkty byly označeny přidáním 0.25 l 32P-dCTP (3,000 Ci/mmol). Před elektroforézou byly vzorky denaturovány při teplotě 98°C po dobu 5 min v pufru, který obsahoval 80% formamidu, 0,5× TBE, 0,02 N NaOH, 0,1% xylencyanolu, 0,1% bromokresolovou červeň (5 l produktu PCR a 10 l denaturujícího pufru). Alikvoty (3 l) byly podrobeny elektroforéze na 5% akrylamidovém gelu v 0,5× TBE s 5% glycerolem. Namnožené části exonů 8 a 10 byly před elektroforézou rozštěpeny restrikčními enzymy Ban1 (exon 8) a NlaIII (exon 10) přidáním 5-10 U enzymu přímo do výsledné PCR reakce s inkubací při teplotě 37°C po dobu 4 hodin. Vzorky byly podrobeny elektroforéze v chladové místnosti při teplotě 4°C za stálého výkonu (5 wattů) po dobu přibližně 15-17 hodin, dokud se xylencyanolové barvivo neposunulo o 30-40 cm. Gely byly usušeny a za použití zesilovačů exponovány filmu citlivému na radioaktivní záření za teploty -70°C. Pro fragmenty PCR menší než 225 nukleotidů byl skríning metodou SSCP proveden pomocí systému minigelu Novex (Invitrogen). U vzorků o přibližné délce 225-300 nukleotidů byla analýza SSCP provedena použitím standardního dlouhého sekvenovacího zařízení s radioaktivně označeným produktem PCR. U většiny PRC produktů delších než 300 nukleotidů byly radioaktivně označené produkty PCR rozštěpeny vhodnou restrikční endonukleázou a vzniklé menší produkty byly analyzovány na dlouhém sekvenovacím zařízení. Toto se týkalo 22

exonů 49/50 (HaeIII) a exonů 52/53 (BamHI). K analýze na dlouhých gelech byly produkty PCR označeny pomocí snížení konečně koncentrace dCTP z 200 M na 100 M a přidáním 0.25 l 32 P-dCTP (3,000 Ci/mmol). Vzorky byl denaturovány při teplotě 98°C po dobu 5 min v pufru, který obsahoval 80% formamid, 0,5× TBE, 0,02 N NaOH, 0,1% xylencyanolu, 0,1% bromokresolovou červeň (4 l produktu PCR a 16 l denaturujícího pufru). Enhancerový systém (Invitrogen) byl použit k amplifikaci exonů 3, 7, 8, 9, 10 (1 l enhanceru v reakčním objemu PCR 20 l). U vzorků DNA s SSCP posunem pruhu byla provedena sekvenční analýza DNA. Ta byla provedena na purifikovaných templátech PCR použitím fluorescenčně značeného dideoxy sekvenování na sekvenátoru Applied Biosystems model 377. Byly sekvenovány oba řetězce DNA. V některých případech byla DNA namnožená pomocí PCR, která obsahovala unikátní alely s opakováním dinukleotidů CT, subklonována pomocí PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX). Plasmidová DNA byla izolována použitím Concert Rapid Plasmid Miniprep System (Life Technologies, Grand Island, NY) a podrobena sekvenční analýze DNA, jak je popsáno výše. Analýzou SSCP byly vyhodnoceny všechny vzorky. Hodnocení bylo prováděno nezávisle dvěma výzkumníky. Pokud nedošlo ke shodě, gely byly přehodnoceny a pokud nebyla dosažena shoda, analýza byla zopakována. Vzhledem k přítomnosti artefaktů o nízké molekulární váze, které se vyskytly v analýzách polymorfizmu intronu 9, byly všechny alely menší než 29 opakování potvrzeny sekvenováním. Počítačová analýza Sekvenční údaje byly porovnány s publikovanými sekvencemi pomocí BLASTN ze sítě BLAST při National Center for Biotechnology Information. Identifikace mapování genů, které řídí fosfoinositolový a inositolfosfátový metabolismus byla provedena pomocí Human Genome Resources site na www stránce NCBI. Statistická analýza Asociace k polymorfizmům PIP5K2A byla testována buď pomocí Pearsonova 2 testu nebo Fisherova exaktního testu (tabulka 2×2 pro frekvenci alel). K analýze větších tabulek byl použit 2 test pro nezávislost . (pro tabulky 3×2). K počítání 2 a hodnot P byl použit statistický program XSTAT. Všechny udávané hodnoty P jsou dvoustranné. Výsledky Předběžný skríning PIP5K2A zahrnoval analýzu exonů 2-10, které obsahují katalytickou doménu a vazebnou doménou pro fosfatidylinositol. Exon 1 a předpokládaná promoterová oblast nebyly skrínovány, protože jsme nezískali dostatečně specifické produkty PCR z této oblasti bohaté na GC, přestože jsme používali různé kombinace primerů a různé podmínky PCR. Identifikovali jsme 8 odlišných variant (Tabulka 2). Tři z toho byly synonymní změny (kodony 199, 309 a 391), jeden polymorfizmus v intronu 8 (IVS8 + 20CG) a dva polymorfizmy v netranslatované oblasti 3 - konce (1257TG a 1412GC), které nebyly dále zkoumány. Další byla transice na kodonu 251 v exonu 7, která vedla nesynonymní záměně (N251S) již dříve identifikované (Schwab et al. 2001). Dále byla identifikován vysoce polymorfní oblast na 5 konci intronu 9, poblíž „splice junction“ exonu 9 a intronu 9. 23

Schwab et al. (2001) publikoval signifikantní rozdíl v distribuci alely N251S u schizofrenie. Tento nález jsme však nezopakovali ani u analyzovaných pacientů se schizofrenií (genotypy: X2 = 0,26, P = 0,88, 2df; alely X2 = 0,21, P = 0,65, 1df) nebo s bipolární poruchou (genotypy: X2 = 0,78, P = 0,68, 2df; alely X2 = 0,56, P = 0,49, 1df) (data nejsou uvedena). Tabulka 2. Nalezené varianty PIP5K2A Nalezené varianty Exon 5

Kodon 199 (GTAGTG)

Exon 7

N251S

Exon 8

Kodon 309 (CCGCCA)

Exon 8

IVS8þ20C->G

Exon 9

Opakování CT v intronu 9

Exon 10

Kodon 391 (GAAGAG)

Exon 10

1257T a 1412GC, 3’- netranslatovaná oblast

Polymorfizmus intronu 9, který jsme detekovali, sestává z neúplného opakování dinukleotidu CT. Se začátkem +8 vzhledem ke „splice donor site“ se nachází úsek více než 70 pyrimidinů, přerušených pouze dvěma puriny na pozicích +13 a + 18 (Obrázek 1). Dvě hlavní alely se skládají z 29 a 32 opakování, které se od sebe liší přítomností nebo absencí sekvence CCCTCT. Hlavní struktura 10 opakování dinukleotidů TT, CC a CT je přítomná v každé alele a je následovaná několika typy opakování CT, jak je znázorněno na Obrázku 1. Všechny dosud identifikované alely s počtem 22-27 opakování jsou varianty alely s počtem 29 opakování spolu s alelami s počtem opakování 34-37 a alely 28a a 30b. Alela s počtem opakování 33 a jedna s alel s počtem 31 opakování (31a) jsou odvozeny ze základní alely s počtem 32 opakování. Alely 28b, 28c, 30a a 31b mají unikátní strukturu. Tento polymorfizmus je v silném vazebném disekvilibriu s SNP exonu 7 (pravděpodobnostní poměr 106,68 u kontrol, P < 0,0001). Analýza polymorfizmu s různým počtem opakování ukázala několik rozdílů u psychiatrických pacientů. Nejkonzistnějším nálezem u bipolární poruchy i schizofrenie byl v porovnání s kontrolami nárůst v počtu jedinců s malými, relativně vzácnými alelami s menším počtem opakování než 29. Ačkoli jsme zatím neprokázali, zda jsou tyto alely s různým počtem opakování biologicky významné, pro statistickou analýzu jsme je kvůli malému počtu krátkých alel ve studované populaci sdružili dohromady. Při srovnání všech jedinců s alelami menšími než 29 opakování s ostatními genotypy byl zjištěn trend ke statistické významnosti u pacientů se schizofrenií ve srovnání s kontrolami a podobná tendence ve skupině bipolární poruchy (schizofrenie, Fisherův test = 2,92, P = 0,09; bipolární porucha, Fisherův test = 2,16, P = 0,14). Nejvýraznějším výsledkem byl nález alely s počtem 28 opakování u 9 jedinců s bipolární poruchou a 4 kontrol, a u 9 pacientů se schizofrenií oproti 3 kontrolám, a nález velmi krátkých alel s počtem opakování mezi 22 a 25 u čtyř pacientů s bipolární poruchou, 3 se schizofrenií a pouze u jedné kontroly (Tabulka 2 A, B). Dále byl přítomen také mírně signifikantní rozdíl v distribuci alel mezi bipolárními pacienty a kontrolami při porovnání všech alel s počtem 24

opakování menším než 29 s alelami většími než 29 opakování (X2 = 4,46, P = 0,03). Stejná analýza u schizofrenních pacientů však nebyla signifikantní (X2 = 0,02, P = 0,83).

Obrázek 1. Polymorfizmus intronu 9.

Obrázek 1 – legenda: a. Sekvence s počtem 29 a 32 opakování se sekvencí ccctct, která není přítomná v alele s počtem 29 opakování, sekvence ccctct vyznačená tučně. Hlavní struktura R znázorňuje rozhraní intronu a exonu s exonem zvýrazněným tučně. b. Struktura všech nalezených alel, čísla vlevo představují počet opakování jednotek. Alely s počtem opakování 29 a 32 jsou zvýrazněny tučně a podtrženy. Byl také zjištěn trend ke statistické významnosti v počtu bipolárních pacientů, kteří byli homozygoté pro alelu s počtem opakování 32 (genotyp 32/32 ve srovnání se všemi ostatními genotypy, Fisherův test =2,98, P = 0,08). Výsledky u pacientů se schizofrenií byly obdobné, ale rozdíl těsně nedosáhl statistické významnosti (Fisherův test = 1,85, P = 0,16). Test pro nestejné frekvence haplotypů vytvořené SNP exonu 7 a polymorfizmem s různým počtem opakování intronu 9 u pacientů a kontrol nebyl signifikantní (data nejsou ukázána). Ačkoli je oblast s CT opakováním v různých analyzovaných bělošských populacích vysoce polymorfní, alely s počtem opakování 29 a 32 představují více než 99 % všech nalezených alel u jedinců z Japonska (data nejsou ukázána). Tyto výsledky ukazují, že alely s malým počtem opakování odvozené z polymorfizmu s různým počtem opakování dinukleotidu CT v intronu 9 může způsobovat funkční změnu v expresi PIP5K2A, která přispívá k rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie. Tyto údaje také nasvědčují tomu, že homozygocita pro běžnou alelu s počtem opakování 32 může snižovat riziko 25

rozvoje bipolární poruchy. Jinou možností je, že alela s neúplným opakováním CT je ve vazebném disekvilibriu s funkční mutací, což by vysvětlovalo mírnou asociaci s psychiatrickými poruchami, kterou jsme zaznamenali. Tabulka 2A. Asociační studie polymorfizmu intronu 9 s různým počtem opakování CT > 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 (N = 212)

36 128 31 65 156 4

KONT

0,08 0,30 0,07 0,15 0,37 0,01

(N = 198) 2

26 103 23 59 169 9

(BP)

1

3 0,01

1

1

1 2

0,01 0,07 0,26 0,06 0,15 0,43 0,02

(N = 178) 3

23 110 19 55 138 3

1

(KONT) 0,01 0,06 0,31 0,05 0,15 0,39 0,02

3

1

0,02

(N = 176) 1

28 102 26 48 131 9

4

(SZ)

0,08 0,29 0,07 0,14 0,37 0,03 0,01

1 1 1

Tabulka 2A – legenda: Distribuce alel intronu 9 s opakování CT. Počet jedinců a frekvence alel (v závorkách). Tabulka 2B. Homozygoté pro polymorfizmus intronu 9 s různým počtem opakování CT 32/32 31/31 KONT 23

1

30/30 29/29 4

31

(0,11) (< 0,01) (0,02) (0,15) BP

12

1

6

32

(0,06) (< 0,01) (0,03) (0,16) KONT 17

1

5

26

(0,095) (< 0,01) (0,03) (0,15) SZ

10

1

3

25

(0,06) (< 0,01) (0,02) (0,14) Tabulka 2B –legenda: Distribuce alel s různým počtem opakování CT v intronu 9. Počty a frekvence homozygotů. Diskuse 26

Hypotéza deplece inositolu je zajímavá z mnoha aspektů, včetně přijatelného vysvětlení specificity účinku lithia na náladu u pacientů s bipolární poruchou. Pro tento model však existují jen omezené experimentální důkazy (Jope et al., 1998; Shimon et al., 1998; O’Donnell et al., 2003). Alternativním pohledem na vliv lithia na přenos signálu zprostředkovaný fosfoinositidy je zaměřit se na vliv lithia na rozpustné inositolfosfátové deriváty. Kromě postupné defosforylace PIP2 na inositol je PIP2 také substrátem pro kinázy syntézy inositolových vyšších polyfosfátů, jako je inositol 1,3,4,5- tetrafosfát, inositol 1,3,4,5,6-pentafosfát a inositol hexafostát. Tyto produkty mají funkci druhých poslů a vazbou na některé z těch proteinů, na které se váží fosfoinositidy, ovlivňují exocytózu a endocytózu synaptického váčku (Mochida et al., 1997; Hilton et al., 2001). Buňky ošetřené lithiem následkem inhibice inositol monofosfatázy akumulují inositol monofosfáty a inositol 1,4- bifosfát, a proto může podávání lithia měnit kinetiku různých fosforylačních kroků potřebných k vytvoření vyšších polyfosforylovaných druhých poslů (Sun et al., 1992; Larocca et al., 1995; Dixon and Hokin, 1997). Účinku lithia na metabolizmus inositol fosfátů také lépe než depleci inositolu odpovídá studie Acharya et al. (1998), ve které mutace v inositol polyfosfát 1-fosfatáze u Drosofily vedly k akumulaci inositol 1,4-bifosfátu a měly za následek bifazickou změnu uvolňování neurotransmiteru. Podávání lithia vedlo ke stejnému výsledku bez vlivu na hladinu inositolu. Pozoruhodná je velmi malá vzdálenost některých genů regulujících fosfoinositidový a inositolfosfátový metabolizmus se zjištěnou vazbou k bipolární poruše a schizofrenii. Příkladem je PIK4CA na chromozomu 22, deletovaném přibližně u 90 % pacientů s velokardiofaciálním syndromem, vrozené poruchy spojené s vysokou prevalencí psychiatrických poruch, dále SYNJ1, který je 1-2 megabáze od markerů na 21q22 s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii v několika studiích a PIK3C3, které se nachází několik centimorganů od markerů 18q12 s vazbou k bipolární poruše BD (Morrow et al., 1995; Papolos et al., 1996; Mowry et al., 2000; Escamillia et al., 2001; Saito et al., 2001). Mezi další geny fosfoinositidové dráhy, které se nacházejí poblíž těch oblastí chromozomů, u kterých byla zjištěna vazba k bipolární afektivní poruše a schizofrenii, patří fosfatidylinositol transfer protein beta (22q12), PIB5PA – fosfatidylinositol 5-fosfatáza (22q11.2-13.2), PIP5K2A – fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza (10p) a PIK3C2B, fosfatidylinositol 3-kináza (1q32) (Berrettini et al., 1994; Straub et al., 1994; Detera-Wadleigh et al., 1997, 1999; Lachman et al., 1997; Rice et al., 1997; Schwab et al., 1998, 2001; Straub et al., 1998; Faraone et al., 1998; Shaw et al., 1998; Brzustowicz et al., 2000; Foroud et al., 2000; Levinson et al., 2000; Maziade et al., 2001). Také řada genů ovlivňujících metabolizmus inositol 3-fosfátů a dalších inositolfosfátových druhých poslů se nachází velmi blízko oblastí s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii. Mezi ně patří gen ITPKB, inositol 1,4,5-trifosfátkináza, na chromozomu 1q41, pouze 0,2 megabází od markerů s vazbou ke schizofrenií zjištěnou ve dvou studiích, další inositol 1,4,5-trifosfátkináza – ITPKA (15q14), KIAA0274 – inositol 3-fosfatáza (6q22), synaptická inositol 1,4,5-trifosfát 5-fosfatáza (10q26), SAC2, inositolfosfatáza obsahující doménu Sac (10q26) a myoinositol monofosfatáza 2 (IMPA2) (18p11.2) (Levinson et al., 1998; Nurnberger and Foroud, 1999; Mowry et al., 2000; Yoshikawa et al., 2001; Ekelund et al., 2001; Tsuang et al., 2001; Ewald et al., 2002). Vzhledem k velkému počtu genů zapojených v metabolizmu fosfoinositidů v mozku může však být jejich umístění poblíž oblastí s vazbou k duševním poruchám náhodným artefaktem. Je zajímavé, že jedna z inositol 4-fosfatáz, INPP4B, se nachází do 2 megabází od markeru na 4q, u kterého byla zjištěna vazba k ochraně před rozvojem bipolární poruchy u vysoce rizikových členů rodiny s bipolární poruchou (Ginns et al., 1998). Mutace v tomto genu 27

může mít lithiu podobný účinek na inositolfosfátový metabolizmus, kterým se vyvažuje predispozice způsobená pravděpodobně změnami fosfatidylinositidového a inositolfosfátového metabolizmu zapříčiněnými bipolárními geny předávanými v rodině. V této studii jsme rozšířili naši analýzu fosfatidylinositidových genů na gen PIP5K2A, který se nachází na 10p12, v oblasti s vazbou k bipolární poruše a ke schizofrenii publikované v několika studiích (Rice et al., 1997, Foroud et al. 2000, Faraone et al. 1998, Straub et al., 1998, Schwab et al. 1998, Maziade et al. 2001). Hlavním výsledkem našeho skríningu polymorfizmů byl nález vysoce polymorfní oblasti s nedokonalým opakováním dinukleotidu CT, která se nachází blízko „splice donor site“ exonu 9. Jednotlivé alely byly u pacientů ve srovnání s kontrolami nerovnoměrně rozděleny. U pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií jsme také nalezli mírný nárůst v počtu jedinců s menším počtem opakování a pokles počtu homozygotů pro běžnou alelu s počtem 32 opakování. Tato oblast je tvořena rozsáhlým polypyrimidinovým traktem, jehož funkční význam není v současnosti znám. Polypyrimidinové trakty v délce 10-20 nukleotidů se většinou nacházejí na 3’-konci „splice acceptor site“, kde hrají roli v odstranění intronů z pre-mRNA a alternativním splicingu (Perez et al., 1997; Lou et al., 1999). Role polypyrimidinových traktů na „splice donor site“ však není známá a význam varianty s různým počtem opakování v intronu 9 bude muset být teprve určen. Sekvence CCCTC, která je součástí ústřední sekvence přítomné v alele s počtem 32, ale ne 29 opakování, vytváří vazebné místo pro CTFC, protein s mnoha funkcemi včetně represe transkripce, což ukazuje možnost, že exprese PIP5K2A by mohla být modulována terminací transkripce v intronu 9 (Perez-Juste et al., 2000). V podskupině pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií zřejmě hrají roli společné genetické faktory, jak ukazují nálezy markerů na různých chromozomech s vazbou k oběma nemocemi zároveň (Berrettini, 2000). Podle našeho modelu mohou být hlavním problémem u obou poruch alelické varianty genů ovlivňujících regulaci fosfoinositidových a inositolfosfátových druhých poslů. Pokud je tato hypotéza správná, je třeba vysvětlit dobrou responzivitu části pacientů s bipolární poruchou na lithium a špatnou odpověď na tento lék u pacientů se schizofrenií. Jednou z možností jsou genetické odlišnosti specifické pro jednotlivé poruchy, které se vzájemně ovlivňují s navrženou společnou poruchou fosfoinositidové dráhy a modifikují fenotyp a farmakologickou odpověď na lithium. Společný genetický a biochemický vývoj, který vysvětluje predispozici k bipolární poruše a zároveň ke schizofrenii, by měl důležité důsledky pro pochopení patogeneze těchto nemocí, vytvoření účinnější léčby a predikci dobré odpovědi na lithium. Konvergence genetických, biochemických a farmakologických nálezů popsaných v této práci svědčí o tom, že geny fosfoinositidového a inositolfosfátového metabolizmu by měly být nahlíženy jako přijatelní kandidátní geny pro pravděpodobnou společnou genetickou predispozici k těmto poruchám.

28

7. Studie č. 2: Skríning promoterové oblasti PIP5K2A u bipolární poruchy a schizofrenie

Souhrn Cílem práce byla analýza promoterové oblasti genu PIP5K2A. U pacientů se schizofrenií oproti kontrolám byla častěji nalezena vzácná promoterová mutace -1007CT a jediní dva homozygoté pro tuto variantu byli pacienti se schizofrenií. V souboru pacientů s bipolární poruchou nebyly rozdíly v distribuci této mutace zjištěny. Mutace -1007CT odpovídá 7 z 8 bazí vazebnému místu pro Oct-1, který je členem transkripčních faktorů rodiny POU. Pomocí EMSA jsme prokázali zvýšenou vazbu jaderného proteinu specifického pro mozek k alele 1007T ve srovnání s alelou -1007C. Výsledky ukazují, že homozygocita pro mutaci -1007T může být vzácným genetickým faktorem v rozvoji schizofrenie. Úvod Fosfoinositidová dráha je pravděpodobným cílem terapeutického působení lithia při léčbě bipolární afektivní poruchy (Hallcher and Sherman, 1980; Berridge and Irvine, 1989; Manji et al., 2001; Jope and Bijur, 2002; Lenox and Wang, 2003). Lithium inhibuje myoinositol 1fosfatázu, která se účastní postupné defosforylace inositol fosfátů na inositol. Inositol je prekurzorem PIP2, který je hydrolyzován na druhé posly inositol trifosfát a diacylgylcerol (Berridge and Irvine, 1989; Nishizuka, 1992). PIP2 hraje také klíčovou roli v regulaci funkce synaptického vezikulu (Eberhard et al., 1990; Cremona and De Camilli, 2001). PIP2 je syntetizován z inositolu fosforylací na pozicích D4 a D5 inositolového kruhu ring (Gehrmann and Heilmeyer, 1998). PIP5K2A se nachází na chromozomu 10p v oblasti s vazbou k bipolární poruše i schizofrenii (Rice et al., 1997; Faraone et al., 1998, 1999; Straub et al., 1998; Foroud et al., 2000; Maziade et al., 2001). V předchozích studiích naše skupina skrínovala 9 z 10 kódujících exonů PIP5K2A na přítomnost polymorfizmů u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií (Stopkova et al., 2003). Náš současný rozšířený skríning pokrývá exon 1 a části předpokládané promoterové oblasti PIP5K2A, která jsme dříve neanalyzovali kvůli technickým problémům. Tato oblast je velmi bohatá na CG, což vede k obtížím při amplifikaci fragmentů pro skríning mutací. Objevili jsme dvě nové mutace, z nichž sice žádná nebyla signifikantně asociována s bipolární poruchou nebo schizofrenií, ale homozygocita pro jednu z variant byla zjištěna pouze u dvou pacientů se schizofrenií. Údaje získané metodou EMSA ukazují, že se vzácná promoterová varianta váže 29

selektivně na extrakt mozkových jaderných proteinů, což nasvědčuje možnému funkčnímu významu této mutace. Metody Pacienti Pacienti s bipolární poruchou byli diagnostikovaní na základě interview podle SADS-L nebo nestrukturovaného klinického interview modifikovaného podle SADS-L s použitím RDC kritérií pro diagnózu bipolární poruchy typu I nebo II. Pacienti byli nabíráni z klinik a soukromých ordinací přidružených k Albert Einstein College of Medicine, dále z Coriell Institute ve spolupráci s National Institutes of Mental Health Bipolar Genetics Initiative a z Psychiatrické kliniky Univerzity Karlovy v Praze. Pacienti se schizofrenií byli získáni z Bronx Psychiatric Center, Long Island Jewish Hillside Hospital, Rockland State Hospital a z Beer Yaakov Mental Health Center. Diagnóza byla stanovena naplněním kritérií RDC na základě interview SCID nebo klinického interview. Všichni pacienti a kontroly podepsali informovaný souhlas schválený příslušnou etickou komisí. Kontrolní soubor byl tvořen anonymními dárci krve (USA, Česká republika), pacienti hospitalizovanými pro somatické potíže (Česká republika) a studenty a zaměstnanci nemocnice (Izrael, Česká republika). Přítomnost psychiatrické nemoci u kontrolních osob nebyla testována s výjimkou souboru z České republiky, kteří byli skrínováni krátkým psychiatrickým interview. Soubory pacientů a kontrol si složením odpovídaly ve věku, pohlaví a etnickém původu. Bipolární skupina se skládala ze 134 pacientů z USA (evropského původu) a 80 pacientů z České republiky (se 111 a 100 odpovídajícími kontrolami). Skupina schizofrenie se skládala ze 100 pacientů z USA (evropského původu) a 122 pacientů z Izraele (evropského židovského původu) se 111 a 63 odpovídajícími kontrolami. Vzhledem k tomu, že frekvence alel u analyzovaných byla v každé kohortě podobná, spojili jsme výsledky a statisticky testovali celý spojený soubor. Detekce polymorfizmů a genotypování DNA byla izolována z celé krve pomocí DNA izolačního kitu Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN). K namnožení oblasti přiléhající k 5'- konci byly použity překrývající se primery (pro1F- caacgcggaagccgctcgc, pro1Rttcttcttggtcttggtcttgct; pro2F ctcgcaacccacggcctcctpro, 2R-atccgcgctcagcccgcggc; pro3F-cctgcagcatttcacacctg, pro3Racctccgggcgttcgctccc; pro4F-gttggcagtgacagcccagc, pro- 4R-tcatgcactcacccacgcca; pro5Fgtgtatctggaggaagacgg, pro5R-ccattcaagagggagactcc). Namnožení analyzovaných oblastí bohatých na CG bylo dosaženo pomocí užití „enhancerového“ systému PCR podle instrukcí výrobce (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Fragmenty genomické DNA namnožené PCR byly skrínovány na přítomnost polymorfizmů pomocí modifikace analýzy single strand conformation polymorphism (SSCP) původně popsané Oritou et al (1989) a modifikované naším týmem (Stopkova et al., 2003). Pokud byl na SSCP detekován posun pruhu, byl vzorek namnožen a podroben sekvenční analýze DNA. Genotypy byly hodnoceny nezávisle dvěma výzkumníky. Electromobility Gel Shift Assay (EMSA) 30

EMSA byla prováděna podle publikovaného postupu (Hope et al., 1994). Stručně, byly vytvořeny dvouřetěžcové oligonukleotidové próby obsahující mutovanou alelu promoteru PIP5K2A ( – 1007C 5'-TGAACAGATTTCCACGGACGGTGAGTGCAC-3'; – 1007T 5'TGAACAGATTTCCATGGACGGTGAGTGCAC- 3'; znázorněn pouze horní řetězec, místa polymorfizmů jsou označena tučně). Z myší starých 2-3 měsíce byl izolován jaderný proteinový extrakt pomocí techniky popsané jinde (Hope et al., 1994). Protein (40 g) byl inkubován s próbou označenou 32P (1 ng) po dobu 20 minut, při pokojové teplotě. Vzorky pak byly odděleny elektroforézou na nedenaturujícím, 6% akrylamidovém gelu s 1,6 % glycerolu. Nenavázaný oligonukleotid migroval na konec gelu, migrace oligonukleotidu navázaného na protein byla zpomalena a byl pozorován posun pruhu. Specificita výsledné vazby byla prokázána kompeticí s radioaktivní a neradioaktivní próbou.. Statistická analýza K počítání 2 a hodnot P byl použit statistický program XSTAT. Asociace k polymorfizmům PIP5K2A byla testována buď pomocí Pearsonova 2 testu (tabulka 2×2 pro frekvenci alel sloučené genotypy). Výsledky Skríning překrývajících se fragmentů PCR pokrýval exon 1 a 1041 nukleotidů “upstream” místa začátku translace PIP5K2A, s výjimkou oblasti -285 až -449 uvnitř amplikonu pro2, která nemohla být analyzována pro obtíže s amplifikací pro vysoký obsah CG. Jeden jednonukleotidový polymorfizmus byl nalezen v amplikonu promotor 1, jde o synonymní změnu na kodonu 10 (TCT-TCG), která nebyla dále analyzována. Dvě varianty byly nalezeny s použitím setu primerů pro5 “upstream” od začátku místa translace (pozice 0): – 1007, CT (tgaacagatttccaC/Tggacggtgagtgcac) a – 896TC (Tabulka 1). Alela -896C byla nalezena pouze u 3 jedinců, u jednoho s bipolární poruchou, jednoho se schizofrenií a jedné kontroly. Analýza polymorfizmu -1007 ukázala vyšší frekvenci -1007T u pacientů se schizofrenií ve srovnání s kontrolami, výsledky však nedosáhly statistické významnosti (Tabulka 2: genotypy: TT+CT oproti CC: 2=1,36, P=0,24, alely: 2=2,24, P=0,13; oba výsledky jsou oboustranné). U pacientů s bipolární poruchou a kontrol nebyl zjištěn rozdíl (genotyp: 2=0,32, P=0,57; alely: 2=0,31, P=0,58). Je zajímavé, že pro -1007T byly nalezeni pouze dva homozygoté, oba byli pacienti se schizofrenií. Genotypy u schizofrenie se lišily od Hardy-Weinbergova ekvilibria (P=0,02).

Tabulka 1. Varianty promoterové oblasti a) -1007, C->T, od 5’ k 3’ konci: b) -867, T->C, od 5’ k 3’ konci:

tgaacagatttccaC/Tggacggtgagtgcac agccaagggctctcgaT/Cgaggtccgaggttcctg

Tabulka 1 – legenda: Mutace jsou znázorněny velkými písmeny.

31

Tabulka 2. Asociační studie varianty -1007, C->T

Kontroly SZ

CC 115 (0,935) 118 (0,90)

CT 8 (0,065) 12 (0,09)

TT 0 2 (0,015)

C 238 (0,97) 248 (0,94)

T 8 (0,03) 16 (0,06)

Kontroly BP

212 (0,95) 205 (0,96)

12 (0,05) 9 (0,04)

0 0

436 (0,97) 419 (0,98)

12 (0,03) 9 (0,02)

Tabulka 2 – legenda: Počty osob s frekvencí v závorkách. Genotypy: schizofrenie – SZ: TT +CT versus CC: X2=1,36, P =0,24, alely: X2 =2,24, P = 0,13, bipolární porucha - BP: genotyp: X2= 0,32, P =0,57; alely: X2= 0,31, P = 0,58. Všechny výsledky jsou oboustranné. Alela – 1007T dává vznik palindromické sekvenci osmi nukleotidů (TCCATGGA), který může být cílem pro proteiny, které se váží na DNA. Alela -1007 dále vytváří místo, které ze 7/8 odpovídá hlavnímu vazebnému místu pro Oct-1, člena rodiny transkripčních faktorů POU (konsensuální sekvence ATTTGCAT; Zhao et al., 2002). Ke zjištění, zda se mohou proteiny vázat na segment DNA obsahující polymorfizmus -1007, jsme užili metodu EMSA. Z myších mozků a dalších orgánů byl extrahován jaderný protein, který byl inkubován s radioaktivně označenou dvouřetězcovou oligonukleotidovou próbou obsahující alelu s mutací. Vzorky pak byly odděleny na elektroforéze. Jak ukazuje Obrázek 1, byl nalezen posun pruhu, který je charakteristický pro komplex DNA-protein, a to při použití proteinu izolovaného z mozku, ale ne z ostatních orgánů (šipka, sloupec 1 a 2). Kromě toho se mozkový jaderný protein preferenčně vázal na alelu -1007T (porovnání sloupců 1 a 2). Při použití nadbytku radioaktivně neznačeného oligonukleotidu jsme vyblokovali posun pruhu (sloupec 3), což ukazuje, že interakce mezi proteinem a DNA je specifická. Běžný komplex DNA-protein je vidět ve všech tkáních (pruh pod signálem specifickým pro mozek), přesto není znát výrazný rozdíl v intenzitě signálu při použití obou alel. Diskuse Významný vliv lithia na metabolizmus fosfoinositidů a inositolfosfátů ukazuje, že geny zapojené v fosfoinositidové a inositolfosfátové dráze jsou možnými kandidáty pro dispozici k rozvoji bipolární poruchy. Mnoho genů řídících syntézu nebo defosforylaci PIP2, inositolfosfátů a dalších fosfoinositidů, se nachází velmi blízko oblastí, u kterých byla zjištěna vazba nejen k bipolární poruše, ale zároveň také ke schizofrenii. Patří mezi ně SYNJ1 (21q22), PIK4CA (22q11), PIB5PA (22q12), PIK3C2B a PIK3C3 (v uvedeném pořadí 1q32 a 18q12), ITPKB a ITPKA (v uvedeném pořadí 1q41 a 15q14), KIAA0274 (6q22), synaptická inositol 1,4,5-trifosfát 5fosfatáza (10q26), SAC2 (10q26) a myoinositol monofosfatáza 2 (IMPA2) (18p11.2) (Berrettini et al., 1994; Straub et al., 1994, 1998; Detera-Wadleigh et al., 1997, 1999; Ewald et al., 1997; Lachman et al., 1997; Rice et al., 1997; Faraone et al., 1998, 1999; Levinson et al., 1998, 2000; Schwab et al., 1998, 2001; Shaw et al., 1998; Nurnberger and Foroud, 1999; Brzustowicz et al., 32

2000; Foroud et al., 2000; Mowry et al., 2000; Ekelund et al., 2001; Escamillia et al., 2001; Maziade et al., 2001; Tsuang et al., 2001; Yoshikawa et al., 2001). Obrázek 1: EMSA s použitím proteinového extraktu z myších tkání

Obrázek 1 – legenda: Sloupce 1 a 2: Šipka označuje nárůst vazby proteinu na alelu -1007T. Sloupec 3 ukazuje specificitu vazebné aktivity T-alely prokázáním kompetice s neradioaktivní próbou ve stonásobném nadbytku (T*). Sloupce 4-9: Alela T neovlivnila vazbu na proteinové extrakty ze srdce, ledvin a jater, v tomto pořadí. Sloupce 10 a 11: Oligonukleotidové próby. Nález několika sdílených genetických oblastí u bipolární poruchy a schizofrenie napovídá, že existují genetické a biochemické dráhy společné pro obě poruchy, jako jsou například abnormality ve fosfoinositidovém a inositoltrifosfátovém metabolizmu, které interagují s genetickými faktory specifickými pro danou nemoc a vedou k rozvoji bipolární poruchy s responzivitou na lithium, bipolární poruchy rezistentní na lithium nebo k rozvoji schizofrenie. Takovou společnou dráhou může být například metabolická dráha fosfoinositidů a inositol fosfátů. Je možné, že genetické faktory v této dráze mohou být také podkladem dobré nebo špatné responzivity na lithium nebo dokonce snižovat predispozici k rozvoji bipolární poruchy. Mutace fosfoinositidových nebo inositolfosfátových regulačních genů, které mají na fosfoinositidové nebo inositol trifosfátové dráhy vliv podobný lithiu, by mohly v kombinaci s jinými oblastmi zvyšujícími predispozici k bipolární poruše působit protektivně. V této souvislosti je pozoruhodné, že inositol polyfosfát 4-fosfatáza, INPP4B, se nachází asi 2 megabáze od markeru na 4q s vazbou k faktoru protektivnímu proti rozvoji bipolární poruchy u členů s vysokým rizikem rozvoje nemoci (Ginns et al 1998). V předchozích studiích jsme identifikovali polymorfizmus s nedokonalým opakováním dinukleotidu CT v intronu 9, jehož krátké alely byly asociované s bipolární poruchou i schizofrenií BD (Stopkova et al., 2003). V současné analýze části 5‘-oblasti jsme identifikovali dvě další mutace. Hlavním nálezem je nárůst v počtu alel -1007T u pacientů se schizofrenií ve srovnání s kontrolami. Rozdíl nebyl statisticky signifikantní, pravděpodobně pro malou velikost našeho souboru. 33

Ve studii však byli zjištěni pouze dva homozygoté, oba byli pacienti se schizofrenií. Vytvoření palindromu osmi bází, který odpovídá potenciálnímu vazebnému místu pro POU/Oct1, a výsledky našich analýz EMSA ukazují, že záměna nukleotidu C za T na pozici -1007 vede ke změně funkce. Možná souvislost mezi alelou -1007T a schizofrenií, porovnaná s naším předchozím nálezem asociace mezi krátkými alelami intronu 9 s opakováním CT s bipolární poruchou i schizofrenií, naznačuje, že možná vazba transkripčního faktoru Oct-1/POU může být abnormálně regulována u schizofrenie, ale ne u bipolární poruchy. Tato představa je v souladu s neurodevelopmentálním modelem schizofrenie a s vývojovou expresí transkripčních faktorů POU. Výsledky této studie v kontextu našich předchozích studií a teoretických úvah o fosfoinositidové dráze podporují polymorfizmus -1007 jako jednu z kandidátních alel pro podskupinu pacientů se schizofrenií a bipolární poruchou.

34

8. Studie č. 3: Identifikace promoterové varianty PIK3C3 asociované s bipolární poruchou a schizofrenií

Souhrn Fosfatidylinositol 3 kináza typ C3 (PIK3C3) se nachází poblíž markerů na chromozomu 18, u kterých byla v několika studiích zjištěna vazba k bipolární poruše a také ke schizofrenii. Při analýze promoterové oblasti PIK3C3 jsme identifikovali dva polymorfizmy v úplném vazebném disekvilibriu, záměnu -432C CT a inzert C na pozici -86. Alela -432T se nachází v oktameru s motivem ATTT, který je charakteristický pro členy rodiny transkripčních faktorů POU. V každé analyzované populaci jsme u pacientů nalezli nárůst alely -432T. EMSA prokázala, že se oligonukleotidy s alelou -432T na rozdíl od alely -432C váží na jaderné proteiny mozku. Promoterová mutace PIK3C se může podílet v podskupině pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií na rozvoji onemocnění. Úvod Fosfoinositidy jsou pravděpodobným cílem terapeutického účinku lithia při léčbě bipolární poruchy. Lithium inhibuje myoinostiol 1-fosfatázu, která zajišťuje postupnou defosforylaci inositolfosfátů na inositol (Berridge and Irvine 1989; Hallcher and Sherman 1980). Inositol je prekurzorem PIP2, který je hydrolyzován na druhé posly inositol 1,4,5-trifosfát a diacylglycerol (Berridge a Irvine, 1989; Nishizuka 1992). Léčba lithiem může vést k snížení hladiny inositolu v mozku a postupně i inhibici přenosu signálu zprostředkovaného fosfoinositidy (Berridge a Irvine, 1989). Lithium také zvyšuje koncentraci rozpustných inositolfosfátových meziproduktů následně po ligandem aktivované hydrolýze PIP2 (Casebolt and Jope 1991; Dixon and Hokin 1997; Jope and Bijur 2002; Manji et al 2001; Lenox and Wang 2003; Sun et al 1992). Lithium má také další účinky na fosfoinositidovou dráhu, a to inhibiční a excitační účinky na proteinkinázu C a inhibici glykogen syntázkinázy, která je terčem fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfátové signální dráhy (Jope and Bijur 2002; Klein and Melton 1996; Manji et al 2001). Kromě této klasické role v přenosu signálu řídí PIP2 funkci synaptického váčku, vazbou na synaptické proteiny ovlivňuje jeho exocytózu i endocytózu (Cremona and DeCamilli 2001; Eberhard et al 1990; Holz et al 2000; McPherson et al 1996). Uvolnění neurotransmiteru a recyklování synaptického váčku je také ovlivněna dalšími fosfoinositidy a vysoce fosforylovanými inositolfosfáty odvozenými od fosfatidylinositol 1,4,5-trifosfátu (Hilton et al 2001; Mochida et al 1997). PIP2 se syntetizuje z inositolu fosforylací inositolového kruhu na pozicích D4 a D5. Fosfatidylinositol 3-kinázy katalyzují fosforylaci PIP2 a další fosfatidylinositolových 35

meziproduktů na pozici D3 a dávají tak vznik škále 3-fosforylovaných fosfatidylinositolových signálních molekul (Toker and Cantley 1997). Vzhledem k množství účinků lithia na fosfoinositidovou dráhu a s přihlédnutím k tomu, že se mnohé geny regulující fosfoinositidovou dráhu nacházejí na chromozomech jen několik milionů nukleotidů od markerů s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii, patří geny řídící fosfoinositidový a inositolfosfátový metabolismus mezi možné kandidátní geny pro rozvoj bipolární poruchy a schizofrenie. Nyní jsme analýzu genů zapojených ve fosfoinositidovém metabolizmu zaměřili na PIK3C3, člena rodiny fosfatidylinositol 3-kináz. PIK3C3 se nachází na chromozomu 18q12, asi 5 centimorganů od markerů s vazbou k bipolární poruše a také ke schizofrenii, 18q12 je jednou ze tří oblastí chromozomu 18 identifikovaných ve vazebných studiích bipolární poruchy a schizofrenie (Badenhop et al 2002; Berrettini et al 1994; Detera-Wadleigh et al 1999; Escamilla et al 2001; Ewald et al 2002; Maziade et al 2001). Skríning promoterové oblasti vedl k identifikaci varianty -432CT, která byla nerovnoměrně rozdělená u pacientů se schizofrenií a bipolární poruchou ve třech populacích pacientů ve srovnání s kontrolami. Je pozoruhodné, že -432CT je nápadně podobná variantě PIP5K2A -1007CT a jedné ze vzácných promoterových variant SYNJ1, které stejný výzkumný tým dříve nalezl u jediného pacienta s bipolární poruchou, -1898TC (Saito et al, 2001). Všechny se objevují uvnitř oktamerové sekvence obsahující ústřední motiv ATTT, který se nalézá v promoterech, které se váží k faktorům Oct-1 a Brn-2, členům rodiny transkripčních faktorů POU (Elsholtz et al 1990; Phillips and Luisi 2000; Singh et al 1986; Zhao et al 2002). Metody Pacienti Pacienti s bipolární poruchou byli diagnostikováni na základě interview podle SADS-L nebo nestrukturovaného klinického interview modifikovaného podle SADS-L s použitím RDC kritérií pro diagnózu bipolární poruchy typu I nebo II (Spitzer et al, 1978). Pacienti byli nabíráni z klinik a soukromých ordinací přidružených k Albert Einstein College of Medicine, dále z Coriell Institute ve spolupráci s National Institutes of Mental Health Bipolar Genetics Initiative a z Psychiatrické kliniky Univerzity Karlovy v Praze. Pacienti se schizofrenií byli získáni z Bronx Psychiatric Center, Long Island Jewish Hillside Hospital, Rockland State Hospital a z Beer Yaakov Mental Health Center. Diagnóza byla stanovena naplněním kritérií RDC na základě interview SCID nebo klinického interview. Všichni pacienti a kontroly podepsali informovaný souhlas schválený příslušnou etickou komisí. Kontrolní soubor byl tvořen anonymními dárci krve (USA, Česká republika), pacienti hospitalizovanými pro somatické potíže (Česká republika) a studenty a zaměstnanci nemocnice (Izrael, Česká republika). Přítomnost psychiatrické nemoci u kontrolních osob nebyla testována s výjimkou souboru z České republiky, kteří byli skrínováni krátkým psychiatrickým interview. Soubory pacientů a kontrol si složením odpovídaly ve věku, pohlaví a etnickém původu. Detekce mutací a genotypování Dna byla izolována z celé krve pomocí DNA izolačního kitu Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN). K namnožení oblasti přiléhající k 5'- konci byly použity překrývající se primery (Tabulka 1A). 36

K amplifikaci oblasti pokryté primery pro 1, která je bohatá na GC, byl použit enhancerový systém (Invitrogen, Carlsbad CA) (1 l enhanceru v reakčním objemu PCR 20 l). PCR reakce byla prováděna v reakční směsi o objemu 20 l, která obsahovala 50 ng genomické DNA, směs čtyř nukleotidů (konečná koncentrace 0,2 mM pro každý z nich), 1× reakční pufr, 20 pmol každého primeru a 1,25 U Taq polymerázy (Invitrogen, Carlsbad, CA). K amplifikaci oblasti pokryté primery pro 3 jsme použili kit Qiagenu pro „horký start“, se sestavením reakce v objemu 50 l podle pokynů výrobce. Fragmenty genomické DNA namnožené PCR byly skrínovány na přítomnost polymorfizmů pomocí modifikace analýzy single strand conformation polymorphism (SSCP) původně popsané Oritou et al (1989). V počátečním skríningu bylo použito 30 vzorků DNA nepříbuzných pacientů s bipolární poruchou a 30 se schizofrenií. SSCP analýza byla provedena na standardním dlouhém sekvenovacím zařízení s radioaktivně označeným produktem PCR na 5% akrylamidovém gelu v 0,5× TBE s 5 % glycerolu. Vzorky byly separovány elektroforézou při teplotě 4°C za stálého výkonu (5 watt) po dobu 17 hodin, poté byly usušeny a exponovány filmu citlivému na radioaktivní záření. Tabulka 1. Primery a oligonukleotidy použité ve studii A. Primery použité při amplifikaci promoterové oblasti PIK3C3 “Forward“ primer Pro 1 gtgcacatgcgcggaagggt Pro 2 tggcaaaattccaatttttgtgctt Pro 3 ctagattctaacttgggttagg Pro 4 tcagcaatgcattagacagc

„Reverse“ primer acgccccagcaatcccactc cggaactccccgccgaaaca aacagctttcactggctgcc gcgtgcatgtttaaactggg

B. Dvouřetězcové oligonukleotidy použité v experimentech EMSA PIK3C3 -432C PIK3C3 -432T PIK3C3 -86+/+ PIK3C3 -86insC

5’-CCACTGGAATTTAAACCTGGCAAAATTCCAA-3 3’-GGTGACCTTAAATTTGGACCGTTTTAAGGTT-5’ 5’-CCACTGGAATTTAAATCTGGCAAAATTCCAA-3’ 3’-GGTGACCTTAAATTTAGACCGTTTTAAGGTT-5’ 5’-GGAACCGGAAGTTCCGTGTTGTGGGGCTCA-3’ 3’-CCTTGGCCTTCAAGGCACAACACCCCGAGT-5’ 5’-GGAACCGGAAGTTCCCGTGTTGTGGGGCTCA-3’ 3’-CCTTGGCCTTCAAGGGCACAACACCCCGAGT-5’

Vzorky DNA s posunem pruhu na SSCP analýze byly pak sekvenovány fluorescenčně značeným dideoxy sekvenováním na sekvenátoru Applied Biosystems model 377. Před sekvenováním byly namnožené úseky purifikovány komerčně dostupnou kolonkou (Qiagen). Byly sekvenovány oba řetězce DNA. Sekvenční údaje byly srovnány s dostupnými publikovanými informacemi o sekvencích použitím BLAST. 37

SNP –432 promoter 3 byl analyzován restrikčním štěpením enzymem Swa1, protože přítomnost SNP vytváří restrikční místo pro Swa1. K 17 l produktu PCR bylo přidáno 15 jednotek Swa1 s 1,5 l pufru 3 (New England Biolabs) s celkovým reakčním objemem 20 l. Vzorky byly inkubovány přes moc při 25°C a pak byly separovány elektroforézou na 1% agaróze a genotyp byl hodnocen 2 výzkumníky. Každý experiment obsahoval pozitivní kontrolu pro SNP. Varianta inzerce/delece -86 byla analyzována pyrosekvenátorem PSQ HS 96 (Pyrosequencing, Sweden) podle postupu doporučeného výrobcem. Electromobility Gel Shift Assay (EMSA) EMSA byla prováděna podle publikovaného postupu (Hope et al., 1994). Byly vytvořeny dvouřetěžcové oligonukleotidové próby obsahující mutovanou alelu promoteru PIK3C3 (Tabulka 1B) a byly radioaktivně označeny 32P. Jaderný proteinový extrakt byl izolován z inbredních myší FVB/NTac FBR starých 2-3 měsíce, vážících 40 gramů popsaným postupem (Hope et al., 1994). Protein (40 mikrogramy) byl inkubován s radioaktivně označenou próbou (1 ng) po dobu 20 minut, při pokojové teplotě. Vzorky pak byly odděleny elektroforézou na nedenaturujícím, 6% akrylamidovém gelu s 1,6 % glycerolu. Nenavázaný oligonukleotid migroval na konec gelu, migrace oligonukleotidu navázaného na protein byla zpomalená a byl pozorován posun pruhu. Specificita výsledné vazby byla prokázána kompeticí s neradioaktivní próbou v padesátinásobném nadbytku. Všechny experimenty na myších tkáních byly zopakovány se třemi různými zvířaty. Experimenty na lidských mozcích byly provedeny na 4 vzorcích získaných ze dvou mozků. Naše výsledky ukázané na obrázku 1 byly snadno reprodukovatelné. V experimentu se „supershiftem“ byla použita protilátka proti Oct-1, která zkříženě reaguje s lidským a hlodavčím proteinem Oct1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA). Statistická analýza K počítání 2, hodnot P a Fisherova testu byl použit statistický program XSTAT. Asociace byla testována buď pomocí Pearsonova 2 testu (tabulka 2×2). Všechny hodnoty P byly oboustranné. Hladina statistické významnosti byla nastavena na p<0,05. Nebyly prováděny korekce na opakované testování. Výsledky Promoterová oblast PIK3C3 byla skrínována u pacientů se schizofrenií a bipolární poruchou s použitím navzájem se přerývajících amplimerů PCR, které pokrývaly část exonu 1 a 860 nukleotidů “upstream” od místa počátku translace PIK3C3. Byly nalezeny dva polymorfizmy, inzerce C na pozici -86 nukleotidů vzhledem k počátku místa translace ATG, a transice CT na pozici -432 (Tabulka 2). Mutace –432CT vytváří sekvencí ATTTAAAT palindrom 8 bází. Palindromy často představují místa pro proteiny, které se váží na DNA. Tento polymorfizmus také vytváří shodu 6/8 pro rozpoznávací místo pro faktory Oct-1 a Brn-2, členy rodiny transkripčních faktorů POU (konsensuální sekvence ATTTGCAT). Vzorky byly genotypovány štěpením amplifikovaných fragmentů pomocí SwaI a gelovou elektroforézou. V souboru z USA nebyl signifikantní rozdíl v distribuci alel mezi kontrolami a pacienty se schizofrenií a bipolární poruchou. Byl však přítomen nárůst počtu bipolárních pacientů, kteří byli homozygoté, ve srovnání s kontrolami (0,044 vs 0,013, Tabulka 3). Také jsme analyzovali soubor bipolárních pacientů z České republiky. V této skupině jsme našli statisticky signifikantní 38

rozdíl v distribuci alel, ačkoli byl počet homozygotů stejný (frekvence alel, X2=6,95, p=0,008). Genotypy pacientů a kontrol byly v Hardy-Weinbergově ekvilibriu s výjimkou souboru bipolárních pacientů z USA, který se významně lišil (X2=9,1, p=0,003). Tabulka 2: Detekované promoterové polymorfizmy PIK3C3 -86insC

ggaaccggaagttccgtgttgtggggctc ggaaccggaagttccCgtgttgtggggctc

-432C->T

ggaatttaaaCctggcaaaatt ggaatttaaaTctggcaaaatt

Tabulka 2 – legenda: Shoda s vazebným místem Oct-1/Brn-2/POU je uvedena tučně (atttgcat), polymorfizmus je velkým písmenem. Oktamerová homologie vytváří s alelou -432T palindrom o osmi bazích (podtrženo). V nemutované alele -86 jsou podtrženy dva palindromy o 5 bazích “pantového” typu. Statisticky signifikantní rozdíl byl také detekován v souboru pacientů z Izraele. Soubor z Izraele byl rozdělen na Sefardskou podskupinu a Aškenazi, dvě hlavní etnické židovské podskupiny. Židé Aškenazi jsou východoevropského původu, zatímco sefardští Židé mají původ na Středním Východě a v Africe. V obou skupinách byl zaznamenán výrazný nárůst ve frekvenci alely –432T u pacientů se schizofrenií ve srovnání s kontrolami, a to i přes malou velikost souboru (Aškenazi; Fisherův test=5,67, p=0,02: Sefardé; Fisherův test =5,65, p=0,02: spojený soubor; Fisherův test =12,81, p=0,0003). Homozygoté nebyli nalezeni, což je v souladu s obecně nízkou frekvencí alely -432T u izraelských kontrol. Dále jsme u 320 jedinců analyzovali promoterovou mutaci –86insC- Alela –86insC je v úplném vazebném disekvilibriu s mutací –432T, v analyzovaných vzorcích jsou oba polymorfizmy spřažené, -86insC se vždy nachází u -432T a naopak (r2=1,00). Kvůli silnému vazebnému disekvilibriu nebyl polymorfizmus -86insC analyzován v celém souboru vzorků. Vazebné disekvilibrium mezi -432T a -86insC bylo nalezeno v heterogenní bělošské populaci z USA i v etnicky homogennější skupině z České republiky (kontroly a bipolární pacienti, údaje nejsou uvedeny).

39

Tabulka 3. Asociační studie PIK3C3 -432 C->T SNP U.S.A

CC

CT

TT

C

T

KONT

0,80 (122)

0,19 (29)

0,013 (2)

0,89 (273)

0,11 (33)

BP

0,79 (107)

0,16 (22)

0,044 (6)

0,87 (236)

0,13 (34)

SZ

0,74 (96)

0,23 (30)

0,023 (3)

0,86 (222)

0,13 (36)

Zkratky: KONT – kontroly, BP – bipolární porucha, SZ – schizofrenie. TT vs CC+CT: BP vs KONT, Fisherův test=2,50, p=0,11; SZ vs KONT, Fisherův test=0,49, p=0,49. Frekvence alel BP vs KONT, X2 =,46, p=0,50; SZ vs KONT, X2 =1,31, p=0,25. Všechny výsledky jsou oboustranné. ČR

CC

CT

TT

C

T

KONT

0,82 (84)

0,17 (17)

0,02 (2)

0,90 (185)

0,10 (21)

BP

0,63 (52)

0,35 (29)

0,02 (2)

0,80 (133)

0,20 (33)

Zkratky: KONT – kontroly, BP – bipolární porucha. TT+CT vs CC: BP vs KONT u pacientů z České republiky, Fisherův test =8,36, p=O,004. Frekvence alel BP vs KONT, X2 =6,95, p=0,008. IZR-AŠK

CC

CT

TT

C

T

KONT

0,96 (46)

0,04 (2)

(0)

0,98 (94)

0,02 (2)

SZ

0,79 (38)

0,21 (10)

(0)

0,90 (86)

0,10 (10)

Zkratky: KONT – kontroly, SZ – schizofrenie. Frekvence alel SZ vs KONT v souboru Aškenazi Židů (AŠK) z Izraele, Fisherův test=5,67, p=0,02 ISR-SEF

CC

CT

TT

C

T

KONT

0,93 (38)

0,07 (3)

(0)

0,96 (79)

0,04 (3)

SZ

0,74 (56)

0,26 (20)

(0)

0,87 (132)

0,13 (20)

Zkratky: KONT – kontroly, SZ – schizofrenie. Frekvence alel SZ vs KONT v souboru sefardských Židů (SEF) z Izraele, Fisherův test =5,65, p=0,02. Sloučený soubor vzorků Židů Aškenazi a sefardských Židů SZ vs KONT, Fisherův test =12,81, p=0,0003.

40

K určení, zda se mohou proteiny vázat na fragmenty DNA obsahující polymorfizmy 432CT a –86insC jsme použili EMSA. Z lidských a myších mozků a dalších myších tkání jsme izolovali jaderné proteiny, které jsme inkubovali s radioaktivně označenou dvouřetězcovou oligonukleotidovou próbou obsahující jednu z alel. Vzorky pak byly separovány elektroforézou na gelu (6% akrylamid a 1,6% glycerol) za nedenaturujích podmínek. Nenavázaný oligonukleotid migruje ke spodku gelu, zatímco migrace oligonukleotidu navázaného na protein je zpomalena a lze pozorovat posun pruhu. Jak ukazuje Obrázek 1, byly detekovány posuny pruhů svědčící o komplexech DNA-protein při použití proteinů izolovaných z mozku a dalších tkání. Výsledný vzor byl jednoznačný, specifický pro jednotlivé alely. V myším mozku a dalších vzorcích myších tkání byl komplex DNA-protein nalezen při použití oligonukleotidu obsahujícího -432T, ale ne při užití -432C (označeno „A“ v Obrázku 1). V myším mozku, ledvinách a játrech bylo několik dalších komplexů DNA-protein. Tyto sice nebyly specifické pro alelu jako komplexy pruhu „A“, ale intenzita signálu byla větší při užití oligonukleotidu s -432T než s -432C, s výjimkou jater. V lidském mozku byl ve striatu při použití oligonukleotidu -432T přítomen unikátní komplex DNA-protein (pruh „B“). Běžný pruh nalézající se pod pruhem „B“ byl detekován při použití obou alel, ačkoli intenzita signálu byla větší s -432T. Dokázali jsme vyblokovat vazbu DNA na protein v příslušných pruzích pomocí nadbytku neznačeného oligonukleotidu (sloupec 3), což svědčí pro specificitu interakce mezi proteinem a DNA. Podobné výsledky jsme získali v lidské tkáni (údaje nejsou uvedeny). Obrázek 1. Experiment EMSA s SNP -432.

Obrázek 1 – legenda: Ve vazebné analýze byl použit protein izolovaný z celých myších mozků (1-3), lidský mozek (sloupce 4-7) a různých myších tkání – srdce, ledvin a jater (sloupce 8-13). Jednotlivé alely jsou označené nad sloupci. Sloupec 3 (T*) ukazuje vazebný experiment, ve kterém byl použit 50 násobný přebytek neznačeného primeru s alelou -432T k blokování vzniku komplexu protein-DNA. Sloupce 14 a 15 jsou reakce sestavené bez proteinu. Komplex myšího proteinu – DNA detekovaný pouze s oligonukleotidem -432T je vyznačen šipkou A, komplex lidského proteinu – DNA je vyznačen šipkou B. Kvůli homologii vazebných míst pro transkripční faktory z rodiny POU jsme se pokusili o „supershift“ pruhů pomocí dostupných protilátek proti dvěma faktorům, Oct-1 a Oct-6.

41

Protilátky specifické proti proteinům navázaným na DNA by dále zpomalily migraci komplexu DNA-protein a na autoradiogramu by se znázornily jako superposunutý pruh. Žádný „supershift“ jsme však nedetekovali (není ukázáno). EMSA jsme použili také k analýze polymorfizmu –86insC. V tomto experimentu byla detekována velmi výrazná, alelicky specifická změna v intenzitě signálu při použití oligonukleotidu obsahujícího insert C ve srovnání s nemutovanou alelou (šipka v Obrázku 2). Signál byl přítomen v každé zkoumané myší tkáni, nejvýrazněji v mozku. Společný pruh byl vidět v myší i lidské tkáni s mírným nárůstem v lidském kortexu při užití oligonukleotidu s inzertem C. Obrázek 2. Experiment EMSA s polymorfizmem inzertu C na pozici -86.

Obrázek 2 – legenda: Protein je stejný jako v Obrázku 1. C+ je oligonukleotid s insertem C, C- je oligonukleotid bez inzertu. Sloupec 3 (C*+) je vazebný experiment, ve kterém byl použit 50-násobný přebytek neznačeného primeru k blokování vzniku komplexu proteinDNA. SNP -432 je nápadně podobný dvěma dalším variantám sekvencí, které jsme již dříve detekovali v promoterové oblasti dvou dalších kandidátních genů regulujících fosfoinositidovou dráhu, SYNJ1 a PIP5KCA. Všechny dávají vznik sekvenci připomínající oktamer vazebného místa pro Oct-1/Brn2/POU s motivem ATTT. SYNJ1 –1898TC se nachází v ústředním motivu ATTT a mění shodu s konsensuálním oktamerem z 5/8 na 4/8. PIP5KCA –1007CT zvyšuje počet bází v ústřední konsensuální sekvenci z 6 na 7 (Tabulka 4). Homozygocita pro PIP5K2A –1007CT byla původně nalezena u dvou pacientů se schizofrenií a u žádného pacienta s bipolární poruchou a žádné z kontrol, varianta SYNJ1 – 1898TC byla zjištěna u jediného pacienta s bipolární poruchou (Saito et al, 2001, Stopkova et al, 2004). V obou případech, podobně jako v nálezech u PIK3C3 -432CT ukázaných v Obrázku 1, byla pro oba polymorfizmy zjištěna výrazná, alelicky specifická vazby na mozkový jaderný protein (Stopkova et al., 2005, nepublikované pozorování pro -1898TC). Podobnost mezi variantou -432 zde popisovanou a dvěma vzácnými promotorovými variantami nalezenými v celkovém počtu 3 pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií (a u žádné z kontrol), nacházejícími se v genech regulujících fosfoinositidovou dráhu, které jsme analyzovali jako potenciální kandidáty pro rozvoj těchto poruch na základě jejich polohy na chromozomu a role ve fosfoinositidovém metabolizmu, nasvědčují tomu, že změněná vazba k členům rodiny transkripčních faktorů POU může ovlivňovat expresi genů regulujících

42

fosfoinositidovou dráhu a tak zvyšovat predispozici k rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie v podskupině pacientů. Tabulka 4. Mutace SYNJ1 a PIP5K2A s homologií Oct-1/Brn-2 SYNJ1 –1898T->C aagcacaTttgttgttga C PIP5K2A –-1007C->T cagatttccaCggacgg T Tabulka 4 – legenda: Konsensuální sekvence pro Oct-1/Brn-2 (atttgcat) je znázorněna tučně, varianty jsou velkými písmeny. Podtržen je palindrom 8 bází (atttccat) vytvořený alelou -1007T. Dále je podtržena konsensuální sekvence pro E-box transkripční faktory (canntg) v -1898. Diskuse Mechanizmus terapeutického působení lithia v léčbě bipolární poruchy není znám. Mnohočetné působení lithia na fosfoinositidový a inositolfosfátový metabolizmus však ukazuje, že mezi legitimní cíle lithia patří fosfoinositidy zprostředkovaný přenos signálu nebo fosfoinositidy zprostředkovaná funkce synaptického váčku. Pokud je tomu tak, mohou tyto dráhy hrát roli také v patogenezi bipolární poruchy. Tuto možnost podporuje i skutečnost, že se mnoho genů zapojených v syntéze nebo defosforylaci PIP2 a dalších fosfoinositidů nachází poblíž oblastí chromozomů s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii. V této studii jsem analyzovali člena rodiny fosfatidylinositol 3-kináz, PIK3C3. Fosfoinositidy fosforylované na inositolovém kruhu na pozici D3 se účastní mnoha signálních drah. K vzestupu hladiny 3-fosforylovaných fosfoinositidů dochází v buňkách stimulovaných cytokiny a mitogeny a 3-fosforylované inositidy se podílejí na řízení buněčného růstu, onkogenní transformaci a neuronálním přenosu signálu (Lin et al 2001; Merlot and Firtel 2003; Wymann and Pirola 1998). Například fosfoinositol 3-kináza zprostředkuje synaptické změny indukované neurotropinem 3 v oblasti neurosvalového spojení, ovlivňuje dlouhodobou potenciaci v amygdale v odpovědi na negativní podmiňování a způsobuje dlouhodobou depresi v hipokampu (Daw et al 2002; Lin et al 2001; Yang et al 2001). Fosfatidylinositol 3kináza hraje také roli v endocytóze ligandem aktivovaného receptoru, způsobem indukce down-regulace receptoru (Naga Prasad et al 2001, 2002). Lithium inhibuje glykogen syntázkinázu, která je aktivovaná fosfoinositol 3-kinázovou kaskádou (Jope and Bijur 2002; Klein and Melton 1996; Manji et al 2001). PIK3C3 se nachází na 18q12, několik centimorganů od markerů s vazbou k bipolární poruše a zároveň ke schizofrenii. Pozitivní vazba byla v této oblasti nalezena v několika studiích bipolární poruchy i schizofrenie (Escamilla et al, 2001, Badenhop et al, 2002). Polymorfizmus -432 CT, identifikovaný v našem skríningu mutací, má u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií heterogenní a komplexní distribuci. V souboru pacientů z USA bylo 4,4 % pacientů homozygotních pro alelu –432T, ale pouze jen 1,3 % kontrolních jedinců. Nebyl však zjištěn rozdíl v počtu heterozygotů a v celkové distribuci alel, ani nebyl

43

nalezen signifikantní rozdíl mezi kontrolami a pacienty se schizofrenií. U bipolárního souboru z České republiky byl naopak zjištěn signifikantní nárůst v počtu heterozygotů ve srovnání s kontrolami beze změny frekvence homozygotů. Frekvence alely –432T byla vyšší v souboru bipolárních pacientů než v jiné analyzované skupině. V souboru vzorků pacientů se schizofrenií z Izraele byl nápadný nárůst v počtu heterozygotů se schizofrenií ve srovnání s kontrolami z podskupin Aškenazi a Sefardů, ale velikost souboru byla po rozdělení vzorků z Izraele do dvou hlavních etnických skupin příliš malá, což zvyšuje riziko chyby typu I. Příčina signifikantního rozdílu v distribuci alely –432T u pacientů se schizofrenií byla v nízké frekvenci této alely u izraelských kontrol, frekvence alely –432T u pacientů se schizofrenií z Izraele byla jen mírně vyšší než frekvence zjištěná u kontrol ze Spojených států. Pokud tyto údaje nejsou ovlivněné chybou typu I způsobenou populační stratifikací a malou velikostí souboru, nejjednodušší biologickou interpretací je, že teprve interakce jiných genů s polymorfizmem PIK3C3 vede k rozvoji psychiatrických problémů, a že alelické varianty těchto genů nutné pro manifestaci psychiatrických obtíží jsou v různých etnických skupinách rozděleny nerovnoměrně. Na samotné nálezy analýzy genu PIK3C3 je třeba pohlížet s opatrností vzhledem k vysoké míře zátěže chybou typu I u asociačních studií kandidátních genů u psychiatrických poruch, obzvláště v populaci tak heterogenní jako je použitý vzorek z USA. Pro potvrzení výsledků bude nutné provést asociační analýzy založené na rodině jako je „transmission equilibrium test“ nebo rozsáhlé asociační studie v homogennější populaci s použitím genomických kontrol. Našim nálezům však dodávají na váze výsledky studií EMSA a kontext našich předchozích studií, ve kterých jsme u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií identifikovali ve fosfoinositidových genech vzácné promoterové mutace, které výrazně připomínají SNP –432 PIK3C3. Ve všech případech se promoterová varianta vyskytuje uvnitř nebo poblíž motivu ATTT, který se nachází u transkripčních faktorů rodiny POU. Dále, dvě z těchto alel, PIK3C3 -432T a PIP5K2A -1007T, vytvářejí palindromy, které se často nacházejí jako ústřední rozpoznávací sekvence pro proteiny, které se váží na DNA. SYNJ11898 TC nezasahuje palindrom, ale motiv ATTT se překrývá s konsensuální sekvencí pro transkripční faktory rodiny E-box a zároveň je podobný vazebnému místo pro POU. Promoterové varianty, které jsme identifikovali, mohou tedy kromě členů rodiny POU vázat i další transkripční faktory. Tuto možnost podporují naše experimenty EMSA, které u většiny analyzovaných promoterových variant ukazují četné posuny pruhů. Insert –86C, který je ve vazebném disekvilibriu s –432T, se nenachází v sekvenci konsensuální pro POU, ale uvnitř dvou pětibázovách palindromů po obou stranách jediného nukleotidu. Důležitým poznatkem z EMSA experimentů je skutečnost, že promoterové polymorfizmy častěji nacházené u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií mají výrazný vliv na vazbu jaderných proteinů izolovaných z mozku. Transkripční faktory rodiny POU jsou důležitými regulátory genové exprese během vývoje a několik z nich, hlavně proteiny Brn, hraje klíčovou úlohu při vývoji mozku (Latchman 1999; Phillips and Luisi 2000). Všechny proteiny POU sdílejí společnou vazebnou oblast DNA složenou ze dvou částí, z domény POU a domény homeobox, oddělených krátkou aminokyselinovou spojkou (Herr and Cleary 1995; Malik et al 1997). Mnoho genů exprimovaných v mozku, které jsou nezbytné pro vývojovou a povývojovou funkci neuronů, je ovlivněno proteiny POU, včetně SNAP-25, neurofilament, nikotinového receptoru, KCNN3 a Bcl-2 (Latchman 1999). Pokusy na transgenních knockoutovaných myších ukazují, že ztráta exprese jednotlivých členů rodiny POU má zásadní vliv na vývoj mozku (Latchman 1999).

44

V této diskuzi jsme se soustředili na SNP -432, protože zasahuje motiv ATTT. Pokud je však nález pozitivní asociace skutečný, mohl by být způsobený další alelou ve vazebném disekvilibriu s -432T. Varianta -86insC, která je v úplném vazebném disekvilibriu s -432T, je také možným kandidátem, protože také ovlivňuje vazbu mozkových proteinů alelicky specifickým způsobem. Možnost, že geny regulované transkripčními faktory POU by mohly být kandidáty pro predispozici k rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie, je v souladu s dalšími molekulárními a genetickými nálezy. Na schizofrenii se nahlíží jako na neurovývojovou poruchu, která může být u geneticky predisponovaných jedinců způsobená např. prenatálním poškozením. Protože transkripční faktory rodiny POU hrají ve vývoji mozku i postnatálním fungování mozku nezastupitelnou roli, mohly by být geny ovlivňované transkripčními faktory POU spojkou vývojových a povývojových aspektů psychiatrických poruch. Roli POU faktorů v rozvoji schizofrenie dále podporuje nález zvýšení proteinu Oct-6 postmortem v mozcích pacientů ve srovnání s kontrolami (Ilia et al 2002). Změny fosfatidylinositidového přenosu signálu se dobře doplňují s dalšími kandidátními geny identifikovanými u schizofrenie a bipolární poruchy, s neuregulinem 1 a s GRK3 (Barrett et al 2003; Stefansson et al 2002, 2003). Neuregulin je růstovým faktorem ovlivňujícím růst neuritu, migraci neuronů a apoptózu, který je spouštěn po aktivaci receptorů rodiny EGF/ErbB. Tyto receptory využívají fosfatidylinositol 3-kinázu ve své kaskádě přenosu signálu (Castellino and Chao 1999; Li et al 2003). V rozvoji bipolární poruchy může hrát roli promoterová mutace GRK3, člena rodiny kináz betaadrenergního receptoru, který se nachází na chromozomu 22q11 (Barrett et al, 2003). Kináza betaadrenergního receptoru spolupracuje s fosfatidylinositol 3-kinázou při koordinaci endocytózy receptoru závislé na klathrinu (Naga Prasad et al 2001, 2002). Naše výsledky ukazují, že abnormální regulace fosfoinositidových genů, například transkripčními faktory rodiny POU, může být etiologickým podkladem rozvoje bipolární poruchy a schizofrenie. Tato hypotéza dobře odpovídá různým aspektům patogeneze schizofrenie a bipolární poruchy, včetně terapeutického účinku lithia, studií genetické vazby, nedávno identifikovaných kandidátních genů a poznatkům o vývoji nervového systému.

45

9. Studie č. 4: PIK4CA - kandidátní gen pro psychiatrické poruchy s vazbou na chromozom 22q11.

Souhrn PIK4CA se nachází na 22q11, v oblasti, kde se pravděpodobně nachází gen predisponující k rozvoji psychiatrických poruch. Skríning dvou funkčních domén a promoterové oblasti PIK4CA vedl k identifikaci 15 různých polymorfizmů. Vzácné varianty na „consensus splice donor“ místě a v promoterové oblasti byly nalezeny celkem u 3 pacientů s bipolární poruchou, u 3 pacientů se schizofrenií a pouze jedné kontroly. Identifikovali jsme také několik běžných, nesynonymních záměn a v předpokládané promoterové oblasti běžný SNP. Pro tyto běžné polymorfizmy byl u pacientů s bipolární poruchou nalezen mírný rozdíl v distribuci promoterového SNP s trendem ke statistické významnosti. Úvod Fosfatidylinositol 4-kináza (PIK4CA) je kódována na chromozomu 22q11, v oblasti implikované v rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie v několika vazebných studiích (Pulver et al., 1994; Moises et al., 1995; Lachman et al., 1997) a katalyzuje první krok fosforylace při syntéze PIP2. Kromě výsledků vazebných studií podporují vztah oblasti 22q11 k duševním poruchám studie velokardiofaciálního syndromu (VCFS), poměrně běžné vrozené poruchy způsobené mikrodelecí 22q11, spojené s vysokým výskytem psychiatrických poruch (Papolos et al., 1996). PIK4CA nachází v oblasti deletované u zhruba 90 % pacientů s VCFS. Fosfatidylinositol 4-kinázy jsou exprimovány ve všech tkáních a ovlivňují mnoho různých buněčných procesů (přehled viz Gehrmann and Heilmeyer, 1998). Kromě toho se fosfatidylinositol 4-kinázy nacházejí na malých synaptických vezikulech a mají vliv na uvolňování transmiterů, regulují retrográdní transport nervového růstového faktoru a hrají roli v endocytóze receptorů (Searl and Silinsky, 2000, Sorensen et al., 1998; Reynolds et al., 1999). V této studii jsme skrínovali část genu PIK4CA na přítomnost polymorfizmů a provedli jsme předběžnou asociační studii srovnání frekvence alel polymorfních variant u kontrol a pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. Metody Pacienti Pacienti s bipolární poruchou byli diagnostikování buď na základě SADS-L interview nebo pomocí nestrukturovaného klinického interview upraveného podle SADS-L, které přineslo diagnostické informace dostatečné k diagnostikování bipolární poruchy podle RDC kritérií 46

(Spitzer et al., 1978). Do studie byli zahrnuti pacienti s bipolární poruchou typu I a II. Pacienti byli nabírání z klinik a soukromých ordinací přidružených k Albert Einstein College of Medicine a dále byli získáni z Coriell Institute ve spolupráci s National Institutes of Mental Health Bipolar Genetics Initiative. Pacienti se schizofrenií byli do studie nabíráni v Bronx Psychiatric Center, Long Island Jewish Hillside Hospital a Rockland State Hospital. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas schválený odpovídající Etickou komisí. Kontrolní skupinu tvořili anonymní dárci krve. Ke skríningu přítomnosti psychiatrické poruchy nebyly použity žádné testovací metody. Všichni pacienti a kontroly byly bělošského původu. Detekce mutací a genotypování DNA byla izolována z celé krve buď pomocí izolačního kitu DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN) nebo standardní fenolovou extrakcí. Exony a přechody intronů a exonů byly mapovány porovnáváním sekvence cDNA s genomickou DNA chromozomu 22 (přístupová čísla GenBank 10879758, AC007308). Primery byly připraveny na základě intronových sekvencí tak, aby docházelo k amplifikaci exonů a přechodů exon-intron. K namnožení oblasti přiléhající k 5 - konci byly použity překrývající se primery. Primery použité v této studii jsou uvedeny v Tabulce 1. Fragmenty genomové DNA namnožené pomocí PCR byly skrínovány pro polymorfizmy pomocí modifikace analýzy SSCP (původní popis Orita et al. 1989). Pro skríning polymorfizmů bylo použito 24-45 vzorků DNA získaných od nepříbuzných pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. PCR reakce byla prováděna v reakční směsi o objemu 20 l, která obsahovala 50 ng genomické DNA, směs čtyř nukleotidů (konečná koncentrace 0,2 mM pro každý z nich), 1× reakční pufr, 20 pmol každého primeru a 1,25 U Taq polymerázy (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pro fragmenty PCR menší než 225 nukleotidů byl skríning metodou SSCP proveden pomocí systému minigelu Novex (Invitrogen). U vzorků o přibližné délce 225-300 nukleotidů byla analýza SSCP provedena použitím standardního dlouhého sekvenovacího zařízení s radioaktivně označeným produktem PCR. U většiny PRC produktů delších než 300 nukleotidů byly radioaktivně označené produkty PCR rozštěpeny vhodnou restrikční endonukleázou a vzniklé menší produkty byly analyzovány na dlouhém sekvenovacím zařízení. Toto se týkalo exonů 49/50 (HaeIII) a exonů 52/53 (BamHI). K analýze na dlouhých gelech byly produkty PCR označeny pomocí snížení konečně koncentrace dCTP z 200 M na 100 M a přidáním 0.25 l 32 P-dCTP (3,000 Ci/mmol). Vzorky byl denaturovány při teplotě 98°C po dobu 5 min v pufru, který obsahoval 80% formamid, 0,5× TBE, 0,02 N NaOH, 0,1% xylencyanolu, 0,1% bromokresolovou červeň (4 l produktu PCR a 16 l denaturujícího pufru). Alikvoty (3 l) byly podrobeny elektroforéze na 5% akrylamidovém gelu v 0,5× TBE s 5 % glycerolu v chladové místnosti při teplotě 4°C za stálého výkonu (5 wattů) po dobu přibližně 15-17 hodin, dokud se xylencyanolové barvivo neposunulo o 30-40 cm. Gely byly usušeny a za použití zesilovačů exponovány filmu citlivému na radioaktivní záření za teploty -70°C. Ke skríningu mutací metodou SSCP za použití systému minigelu byly neoznačené produkty naneseny na prefabrikovaný 4-20% nedenaturující akrylamidové minigely s obsahem 4% glycerolu v 1,25× TBE pufru. Vzorky byly podrobeny elektroforéze při 100-200 V za teploty 4°C, dokud xylencyalové barvivo nedosáhlo spodní části gelu. Po elektroforéze byl gel barven po dobu 15 min s barvivem SYBR II (10 l ve 100 ml 1× TBE) a vyfotografován v UV světle. Všechny reakce PCR byly provedeny za standardních podmínek s výjimkou dvou (pro1 and pro2), které byly amplifikovány pomocí enhancerového systému (Gibco BRL-Invitrogen) (3 l enhanceru v reakčním objemu PCR 20 l). 47

U vzorků DNA s SSCP posunem pruhu byla provedena sekvenční analýza DNA. Ta byla provedena na purifikovaných templátech PCR použitím fluorescenčně značeného dideoxy sekvenování na sekvenátoru Applied Biosystems model 377. Analýzou SSCP byly vyhodnoceny všechny vzorky. Hodnocení bylo prováděno nezávisle dvěma výzkumníky. Pokud nedošlo ke shodě, gely byly přehodnoceny a pokud nebyla dosažena shoda, analýza byla zopakována. Tabulka I. Primery použité k amplifikaci exonů, přechodů intronů a exonů a promoterové oblasti PI4K pro skríning analýzou SSCP „Forward“ primer

„Reverse“ primer

Velikost

pro1

ctcaagttatttgcctgcctc

gtgtctgctgttcccttctg

220

pro2

gacgatctcgctctgtcacc tggccaggtatggtggcctc

280

38

agtcctgactccagacact

taactgcttttccgtccctac

280

39

gctttatctctggtgaatagtag atagcttgcatgtgatggcc

252

40

gaatctcagggcagacaggt aggtgtcgtacaggcaggtg

197

41

gfgfgfgggcactcacagaa ctctggtgaggcctgtgtca

293

42

agagtgcaggttccctggcg tttctgggtgcagtgtgcta

210

43

acctggtatttccagaggtc

gtgcctctcaccaggtaaga

302

44

tggctctgctctcagaagtc

caagctggtgtggaacacac

161

45

agtcagcagctgctgacaag ggcagtgcactgaagacagt 248

46

tctcgccagcctgcact

47

atactctgggcactgccagt tggaaggagatcccagaag

278

48

agttcctccaggagacaaag aagccactgtgtccacatc

226

Promoter

Exon

ggacctcaataaacatttctgac 312

49/50 ctctggctcacctgtggtga actggcattagcaaggaaaagc 360 51

atgtgagaggactcatccct ggagcagcaagcccagtccc 242

52/53 gcatgagccagaagagctgc tggagcacacacgacctccc 427 54

gtgtgggaccagggagaagt atccctatccacccctgggt

255

55

aacagaccacttgtccttgc tctggaaccggattcccttc

318

56

agccagtccacaggactaca atggcctgcgtgtccaccaa

196

57

tggctctcagctgaagtccg tgcaggtgcccagtggcca

246

58

cctgctggctcctcgaatct

197

tccactgcatgtggcggcag

48

Počítačová analýza Sekvenční údaje byly porovnány s publikovanými sekvencemi pomocí BLASTN ze sítě BLAST při National Center for Biotechnology Information. K identifikaci možných míst pro vazbu proteinů na DNA byly použity programy MatInspector V2.250 a TFSEARCH. Statistická analýza Asociace SNP PI4KCA byla testována pomocí Pearsonova 2 test (tabulka 2 × 2 pro frekvenci alel) a 2 testu pro nezávislost (tabulka 3 × 2 pro genotypy). Ke spočítání hodnot byl použit statistický program StatXact-3. Všechny udávané hodnoty P jsou dvoustranné.

2

Výsledky Jako templát pro tuto studii byla použita cDNA PIK4CA, která obsahuje kódující oblast 7 277 nukleotidů. Skrínovali jsme předpokládanou 5 -promoterovou oblast a 20 distálních exonů, které kódují katalytickou doménu a plekstrinovou homologii. Primery byly navržené tak, aby docházelo k namnožení exonů a přechodů intronů a exonů, které obsahují důležitá funkční místa včetně konsenzuálních sekvencí „splice donor site“ a „splice acceptor site“ a polypyrimidinových úseků. Vzorky DNA byly skrínovány použitím analýzy SSCP. Celkem bylo identifikováno 15 polymorfizmů v 21 analyzovaných amplimerech (Tabulka 2), tedy průměrně 1 v každých 367 nukleotidech. Polymorfizmy, které jsme na základě analýzy sekvence DNA považovali s velkou pravděpodobností za funkčně signifikantní, jsme analyzovali v celém souboru vzorků. Dále jsme analyzovali několik zjevně nefunkčních polymorfizmů, pokud se nacházely ve stejném amplimeru jako potenciálně funkční varianty a proto mohly být snadno hodnoceny na stejném SSCP gelu. V předpokládané promoterové oblasti jsme analyzovali všechny nalezené polymorfizmy. Varianta identifikovaná v intronu 55 (-12GA) nebyla dále analyzovaná, protože žádná alela neměnila obsah pyrimidinů. Konzervativní polymorfizmy také nebyly dále zkoumány. Na základě těchto rozhodnutí bylo v celém souboru vzorků analyzováno 11 polymorfizmů. Z nich bylo 5 velmi vzácných: změna na kodonu 12 (AGCAGT) nalezená u 6 ze 134 pacientů s bipolární poruchou, 6 kontrol ze 133 a u 3 ze 100 pacientů se schizofrenií, promoterový polymorfizmus (-38CT) nalezený u jediného pacienta s bipolární poruchou, IVS47 - 22GC nalezená u jednoho pacienta s bipolární poruchou a u jedné kontroly, změna na kodonu 2252 (ACTACC), nalezená u jedné kontroly a u jednoho pacienta s bipolární poruchou, a polymorfizmus na 5 -splice donor consensus, IVS52 + 4AG, který byl zjištěn u 3 pacientů se schizofrenií, 2 pacientů s bipolární poruchou a jedné kontroly (Tabulka 3). Z těchto jsou nejpravděpodobněji funkčně signifikantní -38CT a IVS52 + 4AG. Polymorfizmus IVS52 vede k vytvoření „splice donor site“, ve kterém se 2 baze liší od konsenzuálního „splice donor site“ o 8 bazích (Obrázek 3) (Ketterling et al., 1999). Polymorfizmus -38T vytváří shodu 7/8 pro rodinu faktorů vážících cAMP (CREB) (Obrázek 3).

49

Obrázek 3. Polymorfizmus IVS52

Obrázek 3 – legenda: a. Sekvence DNA polymorfizmů -31AG a -38CT (tučně). Sekvence místa počátku translace ATG a další dva kodony znázorněny velkými písmeny. Podtržena je sekvence podobná vazebnému místu pro CREB (tgacgtca). b. Sekvence DNA polymorfizmu IVS52 + 4AG s konsensuálním 5 splice donor site (R je A nebo G).

Tabulka 2. Polymorfizmy detekované v genu PIK4CA Set primerů

Polymorfizmus

pro1

-31AG

pro1

-38CT

pro1

AGCAGT kodon 12 (synonymní změna)

exon 48

E2079Q

exon 48

IVS47-22GC

exon 49/50 I2110V (konzervativní změna) exon 49/50 GAGGAA kodon 2104 (synonymní změna) exon 52

ACTACC kodon 2252 (synonymní změna)

exon 52

IVS52 + 4AG

exon 54

GGTGGC kodon 2292 (synonymní změna)

exon 54

R2259C

exon 55

GGCGGG kodon 2300 (synonymní změna)

exon 56

IVS55-12GA PPT purinpurin

exon 56

V2356A (konzervativní změna)

exon 56

GATGAC kodon 2355 (synonymní změna)

50

Tabulka 3. Frekvence vzácných variant PIK4CA KONT BP

SZ

Pravděpodobně funkční pro1

-38CT

0/134 1/133 0/100

exon 52

IVS52(+4AG)

1/121 2/124 3/96

Pravděpodobně nefunkční pro1

AGCAGT kodon 12, synonymní

6/134 6/133 3/100

exon 48

IVS47(-22GC)

1/122 1/124 0/95

exon 52

ACTACC kodon 2252, synonymní

1/121 1/124 0/96

Tabulka 3 - legenda: Frekvence polymorfizmů je rozdělena na základě sekvence DNA na polymorfizmy potenciálně funkční a pravděpodobně nefunkční (podrobnosti viz Výsledky). KONT - kontroly; BP – bipolární porucha; SZ – schizofrenie. Celkem 3 pacienti se schizofrenií, tři pacienti s bipolární poruchou a pouze jedna kontrola měli jeden ze vzácných polymorfizmů, které jsou s největší pravděpodobností funkčně signifikantní. Polymorfizmy, které pravděpodobně nejsou funkčně signifikantní, byly nalezeny u 8 kontrol, 8 pacientů s bipolární poruchou a 3 pacientů se schizofrenií. Tři z variant, které jsme nalezli, byly běžné SNP, které mohou být funkčně signifikantní. Mezi tyto patří promoterový polymorfizmus -31A G a varianty E2079Q a R2259C. Obě varianty E2079Q a R2259C se nacházejí v katalytické doméně. Analýza těchto variant v celém souboru dat neukázala signifikantní rozdíl v distribuci alel u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií ve srovnání s kontrolami (Tabulka 4). V distribuci promoterové varianty na pozici 31 byl však nalezen trend k statistické významnosti u bipolárních pacientů, a to při porovnání homozygotů pro wild alelu se všemi ostatními genotypy (alely P = 0,144, 2 = 2,14; genotyp 1,1 vs. 1,2 + 2,2, P = 0,097, 2 = 2,75). Ačkoli pacienti se schizofrenií měli stejnou frekvenci -31A jako pacienti s bipolární poruchou, porovnání s kontrolami nebylo signifikantní kvůli menší velikosti souboru (alely P = 0,28, 2 = 1,19; genotyp 1,1 vs. 1,2 + 2,2, P = 0,21, 2 = 1,60). Diskuse Klinické studie pacientů s velokardiofaciálním syndromem a vazebné studie rodin s bipolární poruchou a schizofrenií dokládají oprávněnost hypotézy, že jeden nebo více genů na chromozómu 22 může hrát roli při rozvoji psychiatrických poruch. V oblasti chromozomu 22q, stejně jako v oblastech 10p, 18p a 13q, byla detekována vazba markerů k bipolární poruše a zároveň ke schizofrenii. To naznačuje, že v některých případech může mezi schizofrenií a bipolární poruchou přítomen genetický překryv (Berrettini, 2000; Gershon, 2000). Společná genetická vulnerabilita je konzistentní s oligogenním modelem, ve kterém se v podskupinách pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií na rozvoji nemoci účastní sdílené geny spolu s geny specifickými pro nemoc(Gershon, 2000). Je také konzistentní s nálezy vyšší prevalence poruch nálady u příbuzných prvního stupně pacientů se schizofrenií. 51

Tabulka 4. Frekvence polymorfizmů Kontroly -31(A

BP

SZ

G)

AA

57 (0,43) 70 (0,53) 52 (0,52)

AG

65 (0,48) 53 (0,40) 40 (0,40)

GG

11 (0,08) 9 (0,07)

A

179 (0,67) 193 (0,73) 144 (0,72)

G

87 (0,33) 71 (0,27) 56 (0,28)

8 (0,08)

E2079Q 1,1

67 (0,55) 73 (0,59) 49 (0,52)

1,2

47 (0,39) 46 (0,37) 43 (0,46)

2,2

8 (0,07)

5 (0,04)

2 (0,02)

1

181 (0,74) 192 (0,77) 141 (0,75)

2

63 (0,26) 56 (0,23) 47 (0,25)

R2259C 1,1

73 (0,52) 79 (0,58) 60 (0,60)

1,2

62 (0,44) 55 (0,40) 39 (0,39)

2,2

6 (0,04)

3 (0,02)

1 (0,01)

1

208 (0,74) 213 (0,78) 159 (0,80)

2

74 (0,26) 61 (0,22) 41 (0,21)

Tabulka 4 - legenda: Distribuce genotypů promotorového SNP -31 a nesynonymní varianty E2079Q (alela 1 je 2079E a alela 2 je 2079Q) a R2259C (alela 1 je 2259R a alela 2 je 2259C). U alel SNP -31, BP vs kontroly, P=0,144, 2=2,14; genotypy, P=0,25, 2 =2,75, genotyp 1.1 vs 1.2 + 2.2, P=0,097, 2=2,75: SZ vs kontroly, alely P=0,28, 2=1,19; genotypy, P=0,36, 2=2,02. U E2079Q, BP vs kontroly, P=0,4, 2=0,70; genotypy, P=0,62, 2 =0,94: SZ vs kontroly, alely P=0,85, 2=0,038; genotypy, P=0,22, 2=2,99. U R2259C, BP vs kontroly, P=0,27, 2=1,20; genotypy, P=0,45, 2=1,60: SZ vs kontroly, alely P=0,15, 2=2,12; genotypy (spojené 1.1 vs 1.2 + 2.2, P=0,21, 2=1,60).

Některé z genů, které se nacházejí v oblasti 22q11 deletované u pacientů s velokardiofaciálním syndromem, již byly zkoumány jako možní kandidáti pro rozvoj psychiatrických poruch. Patří mezi ně COMT, prolin dehydrogenáza, SNAP 29 a „Ubiquitin Fusion Degradation 1 Protein“. V naší současné studii jsme se věnovali skríningu polymorfizmů části genu PIK4CA. Předběžný skríning tohoto rozsáhlého genu byl omezen na předpokládanou promoterovou oblast a na 3’-konec, který obsahuje katalytickou doménu a plekstrinovou homologii. Ačkoli jsme nenalezli žádnou variantu PIK4CA, která by byla jednoznačně asociovaná s bipolární poruchou nebo schizofrenií, identifikovali jsme dvě vzácné varianty vyskytující se převážně u pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. Tyto varianty mohou být funkčně signifikantní. Jednou 52

z nich je IVS52+4AG, která by podle modelu navrženého Ketterlingem et al. (1999) mohla narušovat splicing exonů a intronů. Druhou variantou je -38CT, která se nachází v promoterové oblasti. Tato mutace by mohla vytvářet možnou vazebnou doménu pro transkripční faktory rodiny CREB. Kromě těchto vzácných alel byla na pozici -31 v předpokládané promoterové oblasti identifikována polymorfní varianta neznámé funkce. U bipolárních pacientů byl pro tuto mutaci zjištěn trend ke statistické významnosti. Žádná z alel A nebo G nevede k vytvoření vazebného místa ke známých faktorům. Vzhledem k blízkosti místa počátku translace a mírné nalezené asociaci bude na místě dále zkoumat její možnou funkci. Výsledky, které jsme získali analýzou genu PIK4CA, jsou velmi podobné výsledkům analýzy genu SYNJ1, která byla již dříve provedena ve stejné laboratoři. V obou studiích bylo nalezeno několik vzácných variant, které mohou být funkčně signifikantní a nacházejí se převážně u pacientů s psychiatrickými poruchami. V obou studiích dohromady bylo nalezeno celkem osm pacientů s bipolární poruchou a jedna kontrola se vzácným, možná funkčním polymorfizmem PIK4CA nebo SYNJ1. Běžné polymorfizmy v promoteru PIK4CA a v intronu 12 SYNJ1, které mohou být funkční, byly mírně častěji nalezeny u pacientů s bipolární poruchou ve srovnání s kontrolami. U obou genů bylo identifikováno několik běžných, nesynonymních mutací, které byly stejnoměrně distribuovány u pacientů a kontrol. U schizofrenie jsme SYNJ1 dosud neanalyzovali, protože nejsou podklady o vazbě této nemoci k oblasti 21q22. Přestože jsou výsledky analýzy PIK4CA a SYNJ1 poměrně skromné, jsou v souladu s výsledky, které se očekávají při analýze komplexních psychiatrických fenotypů v relativně malých souborech jedinců, jaké jsme měli k dispozici. Nepříliš signifikantní nálezy mohou být také vysvětleny stratifikační chybou, a hlavně vzhledem k heterogenitě analyzované populace. Další možností je falešná pozitivita našich výsledků jako následek artefaktu vzniklého při opakovaném testování. Geny PIK4CA a SYNJ1 nebyly jako kandidátní geny pro analýzu vybrány náhodně, ale na základě přesvědčivých výsledků vazebných studií a teoretických úvah. Mnoho genů, které se podílejí na syntéze nebo defosforylaci PIP2 a dalších fosfoinositidů se nachází v oblastech s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii. Patří mezi ně např. synaptojanin 1 (SYNJ1) (21q22), PIK4CA - člen rodiny fosfatidylinositol 4-kináz (22q11), PIP5K2A – fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza (10p) a PIK3C3, fosfatidylinositol 3-kináza (18q12) (Berrettini et al., 1994; Straub et al., 1994; Moises et al., 1995; Detera-Wadleigh et al., 1997; Ewald et al., 1997; Lachman et al., 1997; Schwab et al., 1998; Faraone et al., 1998; Foroud et al., 2000; Liu et al., 2001). Tato skutečnost je spolu s účinkem lithia na fosfoinositidovou dráhu a roli, jakou hraje PIP2 ve funkci synaptického váčku a v přenosu signálu, poměrně přesvědčivá. Kromě možnosti statistické chyby typu I a II patří mezi další omezení této studie analýza pouze třetiny kódující oblasti. V současné databázi SNP je možné v 5‘- oblasti PIK4CA najít několik sekvenčních variant. Tyto varianty budou předmětem dalšího zkoumání v dalších studiích. Model, sestavený na základě našich pozorování, považuje abnormalitu v homeostáze PIP2 v mozku způsobenou funkčními mutacemi genů zapojených v jeho syntéze a fosforylaci za základní problém v podskupině pacientů s bipolární poruchou a schizofrenií. Na základě této hypotézy je nezbytné pokračovat v širším zkoumání PIK4CA a dalších genů fosfoinositidové dráhy na přítomnost funkčních variant, které mohou být kandidáty pro psychiatrické poruchy.

53

10. Studie č. 5: Analýza SYNJ1 jako kandidátního genu pro bipolární poruchu s vazbou na 21q22 – replikační studie

Souhrn Podle výsledků vazebných studií se může na chromozomu 21q22 nacházet kandidátní gen pro rozvoj bipolární poruchy. V předchozí studii jsme analyzovali jeden z takových genů, SYNJ1, který kóduje synaptojanin 1, inositol 5-fosfatázu. Při skríningu mutací SYNJ1 jsme identifikovali 3 vzácné funkční varianty, z nichž jedna se nacházela poblíž rozhraní intronu 12exonu 12. Vzácné varianty byly celkově nalezeny u 4 pacientů s bipolární poruchou a žádné kontroly a pro polymorfizmus intronu 12 byl zjištěn trend ke statistické významnosti. Naším záměrem bylo zopakovat analýzu SYNJ1 v novém souboru 84 pacientů z České republiky, který byl vytvořen v letech 2001-2003 na Psychiatrické klinice v Praze. Podobně jako v předchozí studii jsme našli nárůst počtu homozygotů pro alelu 2 polymorfizmu intronu 12, ale výsledek nebyl statisticky signifikantní. Při sloučení údajů z obou studií se pro homozygoty alely 2 stále projevuje trend ke statistické významnosti . Úvod Synaptické váčky jsou tvořené lipidovou dvojvrstvou, která obsahuje mnoho různých regulačních proteinů. K zajištění dostupného zdroje synaptických vezikulů je nutná jejich recyklace endocytózou (de Camilli a Takei, 1996). Endocytóza se skládá z několika kroků — sestavení klathrinového obalu, pučení (budding), odštěpování a odstranění klathrinového obalu (Cremona a de Camilli, 1997). Podle některých studií jsou synaptické proteiny zapojeny při rozvoji bipolární poruchy a schizofrenie. V mozcích pacientů se schizofrenií a bipolární poruchou byla zjištěna změněná exprese několika presynaptických regulačních proteinů ( Young et al., 1998; Honer et al., 1999; Karson et al., 1999; Vawter et al., 1999; Eastwood and Harrison, 2000 a Mirnics et al., 2001). Fosfoinositidy regulují exocytózu i endocytóze synaptického váčku (Eberhardet al., 1990; Cremona and de Camilli, 2001). Fosfoinositidová dráha je také pravděpodobným cílem terapeutického působení lithia (Hallcher and Sherman, 1980; Berridge and Irvine, 1989; Williams and Harwood , 2000). Kritickým fosfoinositidem, který reguluje funkci synaptického vezikulu, je PIP2, který se váže na membránové proteiny váčku, které regulují exocytózu a endocytózu. Mezi tyto proteiny patří synaptotagmin, dynamin I, amfifysin a synaptojanin 1 (de Camilli a Takei, 1996; McPherson et al., 1996; Cremona and de Camilli, 1997). SYNJ1 je inositol 5-fosfatáza exprimovaná v synaptických zakončeních, která defosforyluje PIP2 a fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfát na 5. pozici inositolového kruhu a tím 54

reguluje funkci synaptického vezikulu (McPherson et al., 1996 a Cremona and de Camilli, 1997). Defosforylace PIP2 je nezbytná pro odstranění klathrinového obalu, které představuje poslední krok v recyklaci synaptického váčku. SYNJ1, kódující synaptojanin, se nachází na chromozomu 21q22.2 v oblasti vzdálené 2.4–11.6 miliónů nukleotidů od markerů s vazbou k bipolární poruše, zjištěnou v několika různých studiích (Straub et al., 1994; Gurling et al., 1995; Smyth et al., 1997; Detera-Wadleigh et al., 1996; Curtis, 1999; Cremona et al., 2000 a Hattori et al., 2000). Předchozí analýza SYNJ1 v naší laboratoři odhalila 11 mutací. Dvě z nich mohou ovlivňovat vazbu transkripčního faktoru a další dvě mohou obsahovat regulační domény pro splicing. Tyto vzácné, pravděpodobně funkční mutace byly nalezeny pouze u pacientů s bipolární poruchou a v distribuci alel pro běžnou variantu byl zjištěn trend k signifikaci (Saito et al., 2001). Vzhledem k těmto nálezům jsme provedli replikační studii v novém souboru českých pacientů s bipolární poruchou a v souboru odpovídajících kontrol. Metody Pacienti Pacienti byli nabíráni z Psychiatrické kliniky 1. LF UK v Praze. Navzájem nepříbuzní pacienti (N=81) s bipolární poruchou typu I nebo II byli diagnostikováni na základě strukturovaného klinického interview Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI), (česká verze, DMS IV kritéria). Kontrolní skupinu (N=102) tvořili pacienti hospitalizovaní na interním oddělení fakultní nemocnice 1. LF UK (45 % kontrolního souboru), dobrovolní dárci krve (30 %) a zaměstnanci 1. LF UK (25 %). Všechny kontroly byly skrínovány na přítomnost psychiatrické poruchy pomocí krátkého psychiatrického interview. Všichni pacienti a kontroly byli běloši a občané České republiky. Všichni pacienti a kontroly podepsali informovaný souhlas schválený příslušnou etickou komisí. Detekce polymorfizmů a genotypování DNA byla izolována z celé krve buď pomocí izolačního kitu DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN). V tabulce 1 jsou uvedeny primery použité k amplifikaci exonů 1, 7, 12 a části oblasti přiléhající k 5′- konci SYNJ1. Vzorky byly genotypovány pomocí modifikace analýzy single strand conformation polymorphism (SSCP). U exonu 12 byl produkt PCR po denaturaci nanesen na 4–20% nedenaturující akrylamidový minigel (Invitrogen). Po elektroforéze (200 V, 4 °C) byl gel obarven SYBR II barvivem (Novex) a vyfotografován pod UV světlem. U exonu 1 a 7 a v promoterové oblasti 5 byla analýza SSCP provedena na standardním dlouhém zařízení s radioaktivně označeným produktem PCR, s použitím 5% akrylamidového gelu s 5 % glycerolu. Vzorky byly podrobeny elektroforéze při teplotě 4 °C s použitím 5 W po 17 hodin a gely byly potom usušeny a exponovány filmu citlivému na radioaktivní záření. Všechny genotypy byly hodnoceny nezávisle dvěma výzkumníky. Statistická analýza K počítání 2 a hodnot P byl použit statistický program XSTAT. Asociace k polymorfizmům SYNJ1 byla testována pomocí Pearsonova 2 testu (tabulka 2×2 pro frekvenci alel) a 2 testu pro nezávislost (pro tabulky 3×2).

55

Tabulka 1. Primery použité k amplifikaci exonů a přechodů intron-exon SYNJ1 Exon 1 7 12 Oblast přiléhající k 5‘- konci pro 5

„Forward“ primer ggcgcaatgcggaagagatg gtgtgttcagcaaagaaatt aaaacctaatgagtaaaatcag

„Reverse“ primer gacgctgcggaggcagagac gaagtgaatcagtaaataca gtttacatttacctcttggcc

Velikost 200 240 291

gcagaaatctatgggacacg

cgaagaatgcttaggtgtat

240

Výsledky Gen SYNJ1 má rozpětí 70 kb a obsahuje více než 30 exonů. Při předchozím skríningu všech kódujících exonů a části oblasti přilehlé k 5′ - konci u pacientů s bipolární poruchou ve stejné laboratoři bylo nalezeno 11 mutací, z nichž 4 byly analyzovány v celém souboru vzorků. Tři vzácné varianty, které budou na základě své sekvence DNA pravděpodobně funkční, byly nalezeny v celkovém počtu 4 pacientů ze 149 s bipolární poruchou a u žádné ze 148 kontrol. Další pravděpodobně funkční mutací byla běžná varianta zjištěná v intronu 12, v distribuci alel mezi pacienty s bipolární poruchou a schizofrenií byl nalezen trend k významnosti (Saito et al., 2001). Tyto 4 varianty byly analyzovány v nové skupině pacientů. Mezi vzácné varianty, které byly ve stejné laboratoři již dříve identifikovány, patří −1898TC, zasahující potenciální konsenzus E-boxu, IVS1+58CA, která se nachází konsensuálním vazebném místě pro transkripční faktor Sp1, IVS6-49GA, který může vytvářet kryptické místo větvení. V původní studii 143 pacientů s bipolární poruchou byl identifikován pouze 1 pacient s −1898C a jeden s IVS1+58A, a stejný počet kontrol. Varianta IVS6-49A byla nalezena u dvou pacientů s bipolární poruchou a u žádné kontroly, IVS7+43G byla zjištěna u 6 pacientů s bipolární poruchou a 5 kontrol. U českém souboru 84 pacientů s bipolární poruchou však nebyla zjištěna žádná vzácná, potenciálně funkční mutace. Polymorfizmus intronu 12 (IVS12+15delT,+17delT) vede ke ztrátě dvou thymidinových nukleotidů v polyAT úseku, který začíná 11 nukleotidů od rozhraní exonu 12 a intronu 12. Alela 1 obsahuje 25/26 a alela 2 obsahuje 23/24 adeninových nebo thymidinových nukleotidů v polyAT oblasti. Alela 2 vzniká delecí pátého a sedmého thymidinového zbytku v polyAT oblasti, 15 a 17 nukleotidů od 5′ „splice donor site“. V původní analýze byl zjištěn mírný nárůst alely 2 u pacientů s bipolární poruchou, který těsně nebyl statisticky signifikantní. Variantu 12 jsme genotypovali u 84 českých bipolárních vzorků a 105 odpovídajících kontrol (Tabulka 2). Ačkoli byl podobně jako v předchozí studii přítomen nárůst homozygotů pro alelu 2, výsledky nebyly statisticky signifikantní (alely: 2=0,16, P=0,69; genotypy: 2=1,06, P=0,59). Rozdělení kontrolních a bipolárních genotypů se neodchylovalo od předpokládaného Hardy–Weinbergova ekvilibria. Při sloučení údajů z obou souborů byl stále přítomen trend ke statistické významnosti pro homozygoty 2/2 (frekvence alel: 2=2,05, P=0,15; genotypy: 2=1,06, P=0,29; homozygoté 2/2 vs. všechny ostatní genotypy: 2=2,27, P=0,13).

56

Tabulka 2. Asociační studie polymorfizmu intronu 12 Genotypy 11 12 22 Alely 1 2

Český soubor Kontroly 23 (0,23) 53 (0,52) 26 (0,25) 76 (0,49) 79 (0,509)

BP 18 (0,22) 37 (0,46) 26 (0,32)

Sloučený soubor Kontroly 73 (0,29) 119 (0,48) 58 (0,23)

BP 58 (0,25) 104 (0,45) 67 (0,29)

55 (0,466) 63 (0,533)

242 (0,536) 209 (0,463)

202 (0,487) 212 (0,512)

Tabulka 2 – legenda: Genotypy a alely pro polymorfizmus exonu 12 – údaje českého souboru a údaje sloučeného souboru českých a amerických vzorků. Počet jedinců s každým genotypem a počet alel jsou uvedeny s frekvencí v závorkách. (český soubor: frekvence alel 2=0,16, P=0,69, genotypy 2=1,06, P=0,59. Sloučený soubor: frekvence alel 2=2,05, P=0,15, genotypy 2=1,06, P=0,29, homozygoté 2/2 vs. všechny ostatní genotypy: 2=2,27, P=0,13). Diskuse SYNJ1 se nachází na chromozomu 21q22.2, v oblasti s vazbou bipolární poruše u podskupiny rodin s bipolární porucho a schizofrenií v několika studiích. Jako první identifikoval markery na 21q22.2 s vaznou k bipolární poruše Straub et al. (1994), s nejvíce signifikantním výsledkem pro marker v oblasti 21q22.3, která je asi 11,6 milionů nukleotidů směrem k teloméře vzdálená od SYNJ1. Pozitivní lod skóre nalezl ve stejné oblasti také Gurling et al. (1995) a Smyth et al (1997). Skupina Detera-Wadleigh et al. (1997) identifikovala několik markerů v širší oblasti 21q22. Nejvýraznější výsledek jejich analýzy se týkal setu markerů, které jsou od SYNJ1 2,4 miliony nukleotidů směrem k centroméře. Relativní blízkost SYNJ1 k markerům s vazbou ukazuje, že tento gen může být považován za přijatelný kandidát gen pro bipolární poruchu s vazbou na 21q22. Pro tuto oblast bylo také publikováno několik negativních výsledků, což je možné mj. vysvětlit genetickou heterogenitou (Byerley et al., 1995; Ewaldet al., 1996). Zájem o SYNJ1 je dále podpořen pozorováním, že se mnoho dalších genů zapojených ve fosfoinositidové dráze nachází v oblastech s vazbou k bipolární poruše a schizofrenii. Předchozí analýza SYNJ1 ve stejné laboratoři byla provedena v souboru 149 bělošských jedinců s bipolární poruchou ze Spojených Států. Tato analýza odhalila několik vzácných a běžných mutací, z nichž některé mohou mít funkční význam. Tato studie byla zaměřena na replikaci těchto výsledků v novém souboru 84 pacientů s bipolární poruchou pocházejících z homogennější populace v České republice. V analýze 84 bipolárních jedinců nebyla detekována žádná se tří vzácných alel původně nalezených pomocí setů primerů pro exony 1 a 7 a pro oblast přilehlou k 5‘-konci. Pro běžnou mutaci intronu 12 nebyl rozdíl ve frekvenci alel mezi kontrolami a pacienty s bipolární poruchou signifikantní. V českém souboru však byl podobně jako v původní práci zjištěn nárůst v počtu 2/2 homozygotů. To, že se výsledky nepodařilo v českých vzorcích zopakovat, může mít několik příčin. Zaprvé jsme mohli neuspět v odhalení vzácných mutací kvůli malé velikosti souboru. Relativně malá velikost souboru může také vysvětlovat nedostatek signifikantního rozdílu ve frekvenci alel 57

u polymorfizmu intronu 12. Zadruhé, soubor pochází z jiné populace, ve které může být predispozice k rozvoji bipolární poruchy podložena odlišným souborem genů než v původních vzorcích z USA. Zatřetí je možné, že SYNJ1 přispívá k predispozici k bipolární poruše pouze unikátními vzácnými mutacemi, které jsou specifické pro jednotlivé rodiny. V tom případě by kompletní analýza genu SYNJ1 v českém souboru mohla identifikovat vzácné mutace, které jsou jedinečné pro několik rodin v této populaci. Přestože jsme nezopakovali náš původní nález, roli SYNJ1 v patogenezi bipolární poruchy není možné vyloučit a je nezbytný další výzkum.

58

11. Seznam publikací autorky 1. Publikace in extenso s impakt faktorem, vztahující se k předkládané disertační práci: Stopkova P, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Papolos DF, Saito T., Lachman HM. Screening of PIP5K2A promoter region for mutations in bipolar disorder and schizophrenia. Psychiatr Genet. 2005 Sep;15(3):223-7. IF 2.366 Stopkova P, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Lachman HM. Analysis of SYNJ1, a candidate gene for 21q22 linked bipolar disorder: A replication study. Psychiatry Res. 2004 Jun 30;127(1-2):157-61.

IF 1.989

Stopkova P, Saito T, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Papolos DF, Bersson YB, Margolis BA, Strous RD, Lachman HM. PIK3C3 promoter variant in psychiatric disorders. Biol Psych. 2004 May 15;55(10):981-8.

IF 6.159

Stopkova P, Saito T, Fann CSJ, Papolos DF, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Stryjer R, Strous RD, Lachman HM. Polymorphism screening of PIP5K2A: A candidate gene for chromosome 10p-linked psychiatric disorders. Am J Med Genet. Part B: Neuropsych Genetics 2003 Nov 15;123B(1):50-8.

IF 2.603

Saito T, Stopkova P, Diaz L, Papolos DF, Boussemart L, Lachman HM. Polymorphism screening of PIK4CA: Possible candidate gene for chromosome 22q11-linked psychiatric disorders. Am J Med Genet. Part B: Neuropsych Genetics 2003 Jan 1;116 (Suppl. 1):77-83.

IF 2.603

2. Abstrakty přednášek a posterů, vztahující se k předkládané disertační práci: Stopková P, Vevera J, Žukov I, Paclt I, Lachman HM. Model patogeneze bipolární afektivní poruchy a schizofrenie na základě analýzy genů fosfoinositidové signální dráhy. 46. československá neuropsychofarmakologická konference, leden 2004. Poster. Stopkova P, Saito T, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Strous RD, Lachman HM. Identification of PIK3C3 and PIP5K2A promoter variants associated with bipolar disorder and schizophrenia. Abstracts for the XIth World Congress of Psychiatric Genetics. American Journal of Medical Genetics. 2003 122B(1):1-190. Oral presentation. Stopkova P, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Lachman HM. PI5K2A: A candidate gene for 10plinked psychiatric disorders. American Psychiatric Association 156th Annual Meeting, New Research Abstracts, 2003 May: p. 56. Oral presentation. Stopkova P, Saito T, Papolos DF, Stryjer R, Strous RD, Lachman HM. Polymorphism screening of PIP5K2A: A candidate gene for 10p-linked psychiatric disorders. Abstracts for the Xth World Congress of Psychiatric Genetics. American Journal of Medical Genetics. 2002 114(7):697-890. Oral presentation. Stopková P, Saito T, Papolos DF, Stryjer R, Strous RD, Lachman HM. Mutace genu PIP5K2A u pacientů s bipolární afektivní poruchou a schizofrenií. IV. sjezd Psychiatrické společnosti ČSL JEP, červen 2002. Poster.

59

3. Další publikace in extenso s IF či bez něj: Lachman HM, Pedrosa E, Petruolo OA, Cockerham M, Papolos A, Novak T, Papolos DF, Stopkova P. Increase in GSK3beta gene copy number variation in bipolar disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2007; 144 (3):259-265. IF 3.521 (2005) Bares M, Brunovsky M, Kopecek M, Stopkova P, Novak T, Kozeny J, Hoschl C. Changes in QEEG prefrontal cordance as a predictor of response to antidepressants in patients with treatment resistant depressive disorder: A pilot study. J Psychiatr Res. 2007 Apr-Jun;41(34):319-25 IF 3.301 (2005) Stopková, P. Léčba bipolární afektivní poruchy na začátku třetího tisíciletí. Bipolární afektivní porucha: jak zastavit kyvadlo? Bulletin Academia Medica Pragensis, 2006, roč. 3, č. 5, s. 15-18. Stopková, P. Farmakoterapie bipolární afektivní poruchy. Referátový výběr z psychiatrie, 2006, roč. 5, č. 1, s. 3-7. Lachman, HM, Stopkova P, Pedrosa E, Margolis B, Aghalar MR, Saito T. Analysis of synapsin III -196 promoter mutation in schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychobiology 2006;53:57-62. IF 1.788 (2005) Bareš, M., Brunovský, M., Kopeček, M., Stopková, P., Novák, T., Kožený, J., Čermák, J., Šóš, P., Höschl, C. EEG v predikci odpovědi na antidepresiva u pacientů s depresivní poruchou: přehled a rozšířená pilotní data. Psychiatrie, 2006, roč. 10, č. 4, s. 1-6. Bareš, M., Brunovský, M., Kopeček, M., Stopková, P., Novák, T., Kožený, J., Vonásková, K., Čermák, J., Höschl, C. Změny prefrontální aktivity jako prediktor odpovědi na různá antidepresiva u pacientů s rezistentní depresí. In Nemocná duše - nemocný mozek: klinická zkušenost a fakta. Praha: Galén, 2006, s. 1-3. Komárek V, Stopková P, Suchopár J, Zahradníková L, Vendulka O, Kučera Z. Acidum valproicum/natrii valproas. Remedia 2006, 16: 14-26. Lachman HM, Stopkova P, Aghalar-Rafael MA, Saito T: Association of schizophrenia in African Americans to polymorphism in synapsin III gene. Psychiatr Genet. 2005 Jun 15(2):127-32. IF 2.366 Simová, M., Preiss, M., Bareš, M., Kopeček, M., Ježková, T., Stopková, P., Klose, J. Změny osobnostních rysů v průběhu psychiatrické hospitalizace. Pilotní studie s Cloningerovým dotazníkem temperamentu a charakteru (TCI). Psychiatrie, 2004, roč. 8, č. 4, s. 286-292. Stopka T, Zivny JH, Stopkova P, Prchal JF, Prchal JT. Human hematopoietic progenitors express erythropoietin. Blood. 1998 May 15;91(10):3766-72. 4. Další vybrané abstrakty přednášek a posterů: Novák, T., Stopková, P., Fridrichová, H. Registr klinických dat pacientů s bipolární afektivní poruchou. Psychiatrie, 2006, roč. 10, č. Suppl. 3, s. 60-62.

60

Höschl, C., Stopková, P. Diskrétní a spojité v konceptualizaci psychóz. In Sborník přednášek sympozia Academia Medica Pragensis "Pokroky v péči o nezávažnější duševní onemocnění", III. ročník. neuveden: Academia Medica Pragensis - Amepra, 2006, s. 87-107. Stopková P, Novák T, Růžičková M, Fridrichová H, Höschl C: Registr pacientů s bipolární afektivní poruchou. Psychiatrie, 2006, roč. 10, č. Suppl. 1, s. 69. Bareš, M., Kopeček, M., Stopková, P., Preiss, M., Vonásková, K., Seifertová, D., Hösch, C. Centrum pro léčbu rezistentní deprese Psychiatrického centra Praha: Od klinické praxe k výzkumu. Psychiatrie, 2006, roč. 10, č. Suppl. 1, s. 56. Bareš, M., Brunovský, M., Kopeček, M., Stopková, P., Novák, T., Vonásková, K., Kožený, J. Changes in prefrontal activity as a predictor of response to antidepressive medication in patients with treatment resistant depressive disorder: a pilot study. European Psychiatry, 2006, vol. 21, no. Suppl. 1, p. S162. Bareš M, Kopeček M, Stopková P, Preiss M, Vonásková K, Seifertová D, Höschl C: The Center for Treatment of Resistant Depression in Psychiatric Center Prague: from clinical practice to research. Česko-Slovenská psychofarmakologická konference, 2006. Psychiatrie. Suppl. 1: 56 Bareš M, Brunovský M, Kopeček M, Stopková P, Novák T, Kožený J, Vonásková K: Prefrontal activity changes as a predictor of response to antidepressive treatment in patients with resistant depression: A pilot study. Česko-Slovenská psychofarmakologická konference, 2006. Psychiatrie. Suppl. 1: 57 Kopeček M, Bareš M, Brunovský M, Novák T, Stopková P, Kožený J: EEG cordance as a predictor of antidepressive treatment – summary of 3 studies. Česko-Slovenská psychofarmakologická konference, 2006. Psychiatrie. Suppl.1: 61

61

12. Literatura 1) Acharya JK, Labarca P, Delgado R, Jalink K, Zuker CS. 1998. Synaptic defects and compensatory regulation of inositol metabolism in inositol polyphosphate 1-phosphatase mutants. Neuron 20(6):1219-29. 2) Badenhop RF, Moses MJ, Scimone A, Mitchell PB, Ewen-White KR, Donald JA, Adams LJ, Schofeld PR (2002). A genome screen of 13 bipolar affective disorder pedigrees provides evidence for susceptibility loci on chromosome 3 was well as chromosomes 9, 13, and 19. Molecular Psych 7:851-859. 3) Badner JA, Gershon ES. Meta-analysis of whole-genome linkage scans of bipolar disorder and schizophrenia. Mol Psychiatry. 2002;7(4):405-11. 4) Baron M. Manic-depression genes and the new millennium: poised for discovery. Mol Psychiatry. 2002;7(4):342-58. Review. 5) Barrett TB, Hauger RL, Kennedy JL, Sadounick AD, Remnick RA, Keck PE, McElroy SL, Alexander M, Shaw SH, Kelsoe JR (2003). Evidence for a single nucleotide polymorphism in the promoter of the G protein receptor kinase 3 gene is associated with bipolar disorder. Mol Psychiatry 8(5):546-557. 6) Bellivier F, Leboyer M, Courtet P, Buresi C, Beaufils B, Samolyk D, Allilaire JF, Feingold J, Mallet J, Malafosse A. Association between the tryptophan hydroxylase gene and manic-depressive illness. Arch Gen Psychiatry. 1998 Jan;55(1):33-7. 7) Berrettini WH. 2000. Susceptibility loci for bipolar disorder: overlap with inherited vulnerability to schizophrenia. Biol Psychiatry 47: 245-251. 8) Berrettini WH, Ferraro TN, Goldin LR, Weeks DE, Detera-Wadleigh S, Nurnberger JI Jr, Gershon ES. 1994. Chromosome 18 DNA markers and manic-depressive illness: evidence for a susceptibility gene. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5918-5921. 9) Berridge MJ, Irvine RF. 1989. Inositol phosphates and cell signaling. Nature 341: 197205. 10) Breen G, Prata D, Osborne S, Munro J, Sinclair M, Li T, Staddon S, Dempster D, Sainz R, Arroyo B, Kerwin RW, St Clair D, Collier D. Association of the dysbindin gene with bipolar affective disorder. Am J Psychiatry. 2006 Sep;163(9):1636-8. 11) Brzustowicz LM, Hodgkinson K, Chow EW, Honer WG, Bassett AS. 2000. Location of a major susceptibility locus for familial schizophrenia on chromosome 1q21-q22. Science 288: 678-682. 12) Byerley, W., Holik, J., Hoff, M. and Coon, H., 1995. Search for a gene predisposing to manic-depression on chromosome 21. American Journal of Medical Genetics 60, pp. 231– 233.

62

13) Casebolt TL, Jope RS. 1991. Effects of chronic lithium treatment on protein kinase C and cyclic AMP-dependent protein phosphorylation Biol Psychiatry 29(3):233-43. 14) Castellino AM, Chao MV (1999). Differential association of phosphatidylinositol-5phosphate 4-kinase with the EGF/ErbB family of receptors. Cell Signal 11(3):171-177. 15) Chatah NE, Abrams CS. 2001. G-protein-coupled receptor activation induces the membrane translocation and activation of phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase I alpha by a Rac- and Rho-dependent pathway. J Biol Chem 276(36): 34059-34065. 16) Chen YS, Akula N, Detera-Wadleigh SD, Schulze TG, Thomas J, Potash JB, DePaulo JR, McInnis MG, Cox NJ, McMahon FJ. Findings in an independent sample support an association between bipolar affective disorder and the G72/G30 locus on chromosome 13q33. Mol Psychiatry. 2004 Jan;9(1):87-92 17) Chumakov I, Blumenfeld M, Guerassimenko O, et al. Genetic and physiological data implicating the new human gene G72 and the gene for D-amino acid oxidase in schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 15;99(21):13675-80. 18) Cockcroft S, De Matteis MA. 2001. Inositol lipids as spacial regulators of membrane traffic. J Membr Biol 180: 187-194. 19) Corfas G, Roy K, Buxbaum JD. Neuregulin 1-erbB signaling and the molecular/cellular basis of schizophrenia. Nat Neurosci. 2004 Jun;7(6):575-80. Review. 20) Craddock N, O'Donovan MC, Owen MJ. Genes for schizophrenia and bipolar disorder? Implications for psychiatric nosology. Schizophr Bull. 2006a Jan;32(1):9-16. Review. 21) Craddock N, Owen MJ, O'Donovan MC. The catechol-O-methyl transferase (COMT) gene as a candidate for psychiatric phenotypes: evidence and lessons. Mol Psychiatry. 2006b May;11(5):446-58. Review. 22) Craddock N, O'Donovan MC, Owen MJ. The genetics of schizophrenia and bipolar disorder: dissecting psychosis. J Med Genet. 2005 Mar;42(3):193-204. Review. 23) Cremona, O. de Camilli, P., 1997. Synaptic vesicle endocytosis. Current Opinion in Neurobiology 7, 323–330. 24) Cremona O, Di Paolo G, Wenk MR, Luthi A, Kim WT, Takei K, et al. 1999. Essential role of phosphoinositide metabolism in synaptic vesicle recycling. Cell 99: 179-188. 25) Cremona, O., Nimmakayalu, M., Haffner, C., Bray-Ward, P., Ward, D.C. and de Camilli, P., 2000. Assignment of SYNJ1 to human chromosome 21q22.2 and Synj12 to the murine homologous region on chromosome 16C3-4 by in situ hybridization. Cytogenetics and Cell Genetics 88, 89–90. 26) Cremona, O. and de Camilli, P., 2001. Phosphoinositides in membrane traffic at the synapse. Journal of Cellular Science 114 Pt 6, 1041–1052. 27) Daw MI, Bortolotto ZA, Saulle E, Zaman S, Collingridge GL, Isaac JTR (2002). Phosphatidylinositol 3 kinase regulates synaptic specificity of hippocampal long-term depression. Nature Neuroscience 5 (9):835-836.

63

28) de Camilli, P. Takei, K., 1996. Molecular mechanisms in synaptic vesicle endocytosis and recycling. Neuron 16, 481–486. 29) Detera-Wadleigh, S.D., Badner, J.A., Goldin, L.R., Berrettini, W.H., Sanders, A.R. and Rollins, D.Y., 1996. Affected sib-pair analyses reveal support for a susceptibility locus for bipolar disorder on chromosome 21q. American Journal of Human Genetics 58, 1279– 1285. 30) Detera-Wadleigh SD, Badner JA, Yoshikawa T, Sanders AR, Goldin LR, Turner G, Rollins DY, Moses T, Guroff JJ, Kazuba D, Maxwell ME, Edenberg HJ, Foroud T, Lahiri D, Nurnberger JI, Stine OC, McMahon F, Meyers DA, MacKinnon D, Simpson S, McInnis M, dePaulo JR, Rice J, Goate A, Gershon ES. 1997. Initial genome scan of the NIMH genetics initiative bipolar pedigrees: chromosomes 4, 7, 9, 18, 19, 20, and 21q. Am J Med Genet 74: 254-262. 31) Detera-Wadleigh SD, Badner JA, Berrettini WH, Yoshikawa T, Goldin LR, Turner G, Rollins DY, Moses T, Sanders AR, Karkera JD, Esterling LE, Zeng J, Ferraro TN, Guroff JJ, Kazuba D, Maxwell ME, Nurnberger JI Jr, Gershon ES (1999). A high-density genome scan detects evidence for a bipolar-disorder susceptibility locus on 13q32 and other potential loci on 1q32 and 18p11.2. Proc Natl Acad Sci USA 96:5604-5609. 32) Detera-Wadleigh SD, McMahon FJ. G72/G30 in schizophrenia and bipolar disorder: review and meta-analysis. Biol Psychiatry. 2006 Jul 15;60(2):106-14. Review. 33) Eastwood, S.L. and Harrison, P.J., 2000. Hippocampal synaptic pathology in schizophrenia, bipolar disorder and major depression: a study of complexin mRNAs. Molecular Psychiatry 5, 425–432. 34) Egeland JA. An epidemiologic and genetic study of affective disorders among the Old Order Amish. In: Papolos DF, Lachman HM, eds. Genetic studies in affective disorders: overview of basic methods, current directions, and critical research issues. John Wiley, New York, 70-90. 35) Egeland JA, Gerhard DS, Pauls DL, Sussex JN, Kidd KK, Allen CR, Hostetter AM, Housman DE. Bipolar affective disorders linked to DNA markers on chromosome 11. Nature. 1987 Feb 26-Mar 4;325(6107):783-7. Review. 36) Ekelund J, Hovatta I, Parker A, Paunio T, Varilo T, Martin R, Suhonen J, Ellonen P, Chan G, Sinsheimer JS, Sobel E, Juvonen H, Arajarvi R, Partonen T, Suvisaari J, Lonnqvist J, Meyer J, Peltonen L. 2001. Chromosome 1 loci in Finnish schizophrenia families. Hum Mol Genet 10(15): 1611-1617. 37) Escamillia MA, McInnes LA, Service SK, Spesny M, Reus VI, Gallegos A, et al. 2001. Genome screening for linkage disequilibrium in a Costa Rican sample of patients with bipolar-I disorder: a follow-up study on chromosome 18. Am J Med Genet (Neuropsychiatr Genet) 105:207–213. 38) Ewald, H., Eiberg, H., Mors, E., Flint, T., Kruse, T.A., 1996. Linkage study between manic-depressive illness and chromosome 21. American Journal of Medical Genetics 67, 218–224.

64

39) Ewald H, Mors O, Koed K, Eiberg H, Kruse TA. 1997. Susceptibility loci for bipolar affective disorder on chromosome 18? A review and a study of Danish families. Psychiatr Genet 7: 1-12. 40) Ewald H, Flint TJ, Jorgensen TH, Wang AG, Jensen P, Vang M, Mors O, Kruse TA (2002). Search for a shared segment on chromosome 10q26 in patients with bipolar affective disorder or schizophrenia from the Faroe Islands. Am J Med Genet 114(2):196204. 41) Faraone SV, Matise T, Svrakic D, Pepple J, Malaspina D, Suarez B, Hampe C, Zambuto CT, Schmitt K, Meyer J, Markel P, Lee H, HarKavy-Friedman J, Friedman J, Kaufmann C, Cloninger CR, Tsuang MT. 1998. Genome scan of European-American schizophrenia pedigrees: results of the NIMH Genetics Initiative and Millennium Consortium. Am J Med Genet 81: 290-295. 42) Faraone SV, Meyer J, Matise T, Svrakic D, Pepple J, Malaspina D, et al. 1999. Suggestive linkage of chromosome 10p to schizophrenia is not due to transmission ratio distortion. Am J Med Genet (Neuropsychiatr Genet) 88:607–608. 43) Foroud T, Castelluccio PF, Koller DL, Edenberg HJ, Miller M, Bowman E, Rau NL, Smiley C, Rice JP, Goate A, Armstrong C, Bierut LJ, Reich T, Detera-Wadleigh SD, Goldin LR, Badner JA, Guroff JJ, Gershon ES, McMahon FJ, Simpson S, MacKinnon D, McInnis M, Stine OC, DePaulo JR, Blehar MC, Nurnberger JI Jr. 2000. Suggestive evidence of a locus on chromosome 10p using the NIMH genetics initiative bipolar affective disorder pedigrees. Am J Med Genet 96: 18-23. 44) Funaki M, Katagiri H, Inukai K, Kikuchi M, Asano T. 2000. Structure and function of phosphatidylinositol-3,4 kinase. Cell Signal 12(3): 135-142. 45) Gehrmann T, Heilmeyer LMG. 1998. Phosphatidylinositol 4-kinases. Eur J Biochem 253: 357-370. 46) Gershon ES. 2000. Bipolar illness and schizophrenia as oligogenic diseases: implications for the future. Biol Psychiatry 47: 240-247. 47) Ginns EI, St. Jean P, Philibert RA, Galdzicka M, et al.1998. A genome-wide search for chromosomal loci linked to mental wellness in relatives at high risk for bipolar disorder among old order Amish. Proc Natl Acad Sci 95: 15531-15536. 48) Goldberg TE, Straub RE, Callicott JH, Hariri A, Mattay VS, Bigelow L, Coppola R, Egan MF, Weinberger DR. The G72/G30 gene complex and cognitive abnormalities in schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 2006 Sep;31(9):2022-32. Epub 2006 Mar 22. 49) Green EK, Raybould R, Macgregor S, Gordon-Smith K, Heron J, Hyde S, Grozeva D, Hamshere M, Williams N, Owen MJ, O'Donovan MC, Jones L, Jones I, Kirov G, Craddock N. Operation of the schizophrenia susceptibility gene, neuregulin 1, across traditional diagnostic boundaries to increase risk for bipolar disorder. Arch Gen Psychiatry. 2005 Jun;62(6):642-8. 50) Grimes CA, Jope RS. 2001. CREB DNA binding activity is inhibited by glycogen synthase kinase-3 beta and facilitated by lithium. J Neurochem 78(6): 1219-1232.

65

51) Hallcher L, Sherman WR. 1980. The effects of lithium and other agents on the activity of myo-inositiol-1-phosphatase from bovine brain. J Biol Chem 261: 8100-8130. 52) Hashimoto R, Straub RE, Weickert CS, Hyde TM, Kleinman JE, Weinberger DR. Expression analysis of neuregulin-1 in the dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia. Mol Psychiatry. 2004 Mar;9(3):299-307. 53) Hashimoto R, Takei N, Shimazu K, Christ L, Lu B, Chuang DM. Lithium induces brainderived neurotrophic factor and activates TrkB in rodent cortical neurons: an essential step for neuroprotection against glutamate excitotoxicity. Neuropharmacology. 2002 Dec;43(7):1173-9. 54) Hattori, M., Fujiyama, A., Taylor, T.D. and the chromosome 21 mapping and sequencing consortium, 2000. The DNA sequence of human chromosome 21. Nature, 405, 311–319 55) Hattori E, Liu C, Badner JA, Bonner TI, Christian SL, Maheshwari M, Detera-Wadleigh SD, Gibbs RA, Gershon ES. Polymorphisms at the G72/G30 gene locus, on 13q33, are associated with bipolar disorder in two independent pedigree series. Am J Hum Genet. 2003 May;72(5):1131-40. 56) Hennah W, Thomson P, Peltonen L, Porteous D. Genes and schizophrenia: beyond schizophrenia: the role of DISC1 in major mental illness. Schizophr Bull. 2006 Jul;32(3):409-16. Review. 57) Hilton JM, Plomann M, Ritter B, Mondregger J, Freeman HN, Falck JR, Krishna UM, Tobin AB (2001). Phosphorylation of a synaptic vesicle-associated protein by an inositol hexakisphosphate-regulated protein kinase. J Biol Chem 276:16341-16347. 58) Honer, W.G., Falkai, P., Chen, C., Arango, V., Mann, J.J. and Dwork, A.J., 1999. Synaptic and plasticity-associated proteins in anterior frontal cortex in severe mental illness. Neuroscience 91, 1247–1255. 59) Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994). Chronic electroconvulsive seizure (ECS) treatment results in expression of a long-lasting AP-1 complex in brain with altered composition and characteristics. J Neurosci 14:4318–4328. 60) Ilia M, Beasley C, Meijer D, Kerwin R, Cotter D, Everall I, Price J(2002). Expression of Oct-6, a POU III domain transcription factor, in schizophrenia. Am J Psychiatry 159:1174-1182. 61) Jope RS, Song L, Grimes C, Pacheco MA, Dilley GE, Li X, Meltzer HY, Overholser JC, Stockmeier CA. 1998. Selective increases in phosphoinositide signaling activity and G protein levels in postmortem brain from subjects with schizophrenia or alcohol dependence. J Neurochem 70: 763-771. 62) Jope RS, Bijur GN (2002). Mood stabilizers, glycogen synthase kinase-3 beta and cell survival. Mol Psychiatry 7 Suppl 1:S35-45. 63) Karson, C.N., Mrak, R.E., Schluterman, K.O., Sturner, W.Q., Sheng, J.G. and Griffin, W.S., 1999. Alterations in synaptic proteins and their encoding mRNAs in prefrontal cortex in schizophrenia: a possible neurochemical basis for hypofrontality. Mol Psychiatry 4, 39–45. 66

64) Katsel P, Davis KL, Haroutunian V. Variations in myelin and oligodendrocyte-related gene expression across multiple brain regions in schizophrenia: A gene ontology study. Schizophr Res 2005;79:157– 173 65) Ketterling RP, Drost JB, Scaringe WA, Liao D-Z, Liu J-Z, Kasper CK, Sommer SS. 1999. Reported in vivo splice-site mutations in the factor IX gene: severity of splicing defects and a hypothesis for predicting deleterious splice donor mutations. Hum Mutat 13: 221231. 66) Knable MB, Barci BM, Webster MJ, Meador-Woodruff J, Torrey EF; Stanley Neuropathology Consortium. Molecular abnormalities of the hippocampus in severe psychiatric illness: postmortem findings from the Stanley Neuropathology Consortium. Mol Psychiatry. 2004 Jun;9(6):609-20, 544. 67) Lachman HM, Kelsoe JR, Remick RA, Sadovnick AD, Rapaport MH, Lin M, Pazur BA, Roe AM, Saito T, Papolos DF. 1997. Linkage studies support a possible locus for bipolar disorder near the velo-cardio-facial syndrome region on chromosome. Am J Med Genet 74: 121-128. 68) Lachman HM, Papolos DF, Saito T, Yu YM, Szumlanski CL, Weinshilboum RM. Human catechol-O-methyltransferase pharmacogenetics: description of a functional polymorphism and its potential application to neuropsychiatric disorders. Pharmacogenetics. 1996 Jun;6(3):243-50. 69) Larocca JN, Rodriguez-Gabin AG, Rashbaum WK, Weidenheim KM, Lyman WD. 1995. Muscarinic receptor-dependent activation of phospholipase C in human fetal central nervous system organotypic tissue culture. Brain Res 701: 135-141. 70) Latchman DS (1999). POU family transcription factors in the nervous system.J Cellular Physiology 179:126-133. 71) Lenox RH, Wang L (2003). Molecular basis of lithium action: integration of lithiumresponsive signaling and gene expression networks Mol Psychiatry 8(2):135-44. 72) Levinson DF, Mahtani MM, Nancarrow DJ, Brown DM, Kruglyak L, Kirby A, Hayward NK, Crowe RR, Andreasen NC, Black BW, Silverman JM, Endicott J, Sharpe L, Mohs RC, Siever LJ, Walters MK, Lennon DP, Jones HL, Nertney DA, Daly MJ, Gladis M, Mowry BJ. 1998. Genome scan of schizophrenia. Am J Psychiatry 155: 741-750. 73) Levinson DF, Holmans P, Straub RE, Owen MJ, Wildenauer DB, Gejman PV, Pulver AE, Laurent C, Kendler KS, Walsh D, Norton N, Williams NM, Schwab SG, Lerer B, Mowry BJ, Sanders AR, Antonarakis SE, Blouin JL, DeLeuze JF, Mallet J. 2000. Multicenter linkage study of schizophrenia candidate regions on chromosomes 5q, 6q, 10p, and 13q: Schizophrenia linkage collaborative group III. Am J Hum Genet 67(3): 652-663. 74) Lewis CM, Levinson DF, Wise LH,et al. Genome scan meta-analysis of schizophrenia and bipolar disorder, part II: Schizophrenia. Am J Hum Genet. 2003;73(1):34-48. 75) Li B-S, Ma W, Jaffe H, Zheng Y, Takahashi S, Zhang L, Kulknarni AB, Pant HC (2003). Cyclin-dependent kinase-5 involved in neuregulin-dependent activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt activity mediated neuronal survival. J Biol Chem 278 (37):35702-35709. 67

76) Lin C-H,Yeh S-H, Lin C-H, Lu K-T, Leu T-H, Chang W-C, Gean P-W (2001) A role for the PI-3 kinase signaling pathway in fear conditioning and synaptic plasticity in the amygdala. Neuron 31:841-851. 77) Liu J, Juo SH, Terwilliger JD, Grunn A, Tong X, Brito M, Loth JE, Kanyas K, Lerer B, Endicott J, Penchaszadeh G, Gilliam TC, Baron M. 2001. A follow-up study supports evidence for a bipolar affective disorder locus on chromosome 21q22. Am J Med Genet 105: 189-194. 78) Lou H, Helfman DM, Gagel RF, Berget SM. 1999. Polypyrimidine tract-binding protein positively regulates inclusion of an alternative 3 -terminal exon. Mol Cell Bio 19: 78-85. 79) Lovlie R, Berle JO, Stordal E, Steen VM. The phospholipase C-gamma1 gene (PLCG1) and lithium-responsive bipolar disorder: re-examination of an intronic dinucleotide repeat polymorphism. Psychiatr Genet. 2001 Mar;11(1):41-3. 80) Malik KF, Jaffe H, Brady J, Young 3rd WS (1998). The class III POU factor Brn-4 interacts with other class III POU factors and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U. Brain Res Mol Brain Res 45(1):99-107. 81) Manji HK, Moore GJ, Chen G (2001). Bipolar disorder: leads from the molecular and cellular mechanisms of action of mood stabilizers. Br J Psych 41:107-109. 82) Manji HK, Chen G. 2002. PKC, MAP kinases and the bcl-2 family of proteins as longterm targets for mood stabilizers. Mol Psychiatry 7: 46-56. 83) Maziade M, Roy MA, Rouillard E, Bissonnette L, Fornier JP, Roy A, Garneau Y, Montgrain N, Potvin A, Cliche D, Dion C, Wallot H, Fournier A, Nicole L, Lavallee JC, Merette C (2001). A search for specific and common susceptibility loci for schizophrenia and bipolar disorder: a linkage study in 13 target chromosomes. Molecular Psychiatry 6(6):684-93. 84) McPherson PS, Garcia EP, Slepnev VI, David C, Zhang X, Grabs D, Sossin WS, Nemeto Y, DeCamilli P. 1996. A presynaptic inositol-5-phosphatase. Nature 379: 353-357. 85) Merlot S, Firtel RA (2003). Leading the way: directional sensing through phosphatidylinositol 3-kinase and other signaling pathways. J Cell Sci 116:3471-3478. 86) Millar JK, Wilson-Annan JC, Anderson S, Christie S, Taylor MS, Semple CA, Devon RS, Clair DM, Muir WJ, Blackwood DH, Porteous DJ. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 2000 May 22;9(9):1415-23. 87) Mirnics, K., Middleton, F.A., Lewis, D.A. and Levitt, P., 2001. Analysis of complex brain disorders with gene expression microarrays: schizophrenia as a disease of the synapse. Trends in Neuroscience 24 8, 479–486. 88) Mochida S, Fukuda M, Niinobe M, Kobayashi H, Mikoshiba K (1997). Roles of synaptotagmin C2 domains in neurotransmitter secretion and inositol high polyphosphate binding at mammalian cholinergic synapses. Neuroscience 77:937-943

68

89) Moises HW, Yang L, Li T, Havsteen B, Fimmers R, Baur MP, Liu X, Gottesman II. 1995. Potential linkage disequilibrium between schizophrenia and locus D22S278 on the long arm of chromosome 22. Am J Med Genet 60: 465-467. 90) Morrow B, Goldberg R, Carlson C, Gupta RD, Sirotkin H, Collins J, Dunham I, O'Donnell H, Scrambler P, Shprintzen RJ, Kucherlapati R. 1995. Molecular definition of the 22q11 deletions in velo-cardio facial syndrome. Am J Hum Genet 56: 1391-1403. 91) Mowry BJ, Ewen KR, Nancarrow DJ, Lennon DP, Nertney DA, Jones HL, O'Brien MS, Thornley CE, Walters MK, Crowe RR, Silverman JM, Endicott J, Sharpe L, Hayward NK, Gladis MM, Foote SJ, Levinson DF. 2000. Second stage of a genome scan of schizophrenia: Study of five positive regions in an expanded sample. Am J Med Genet (Neuropsych Genet) 96: 864-869. 92) Murphy KC. Annotation: velo-cardio-facial syndrome. J Child Psychol Psychiatry. 2005 Jun;46(6):563-71. Review. 93) Naga Prasad SV, Barak L, Rapacciuolo A, Caron MG, Rockman HA (2001). Agonist dependent recruitment of phosphoinositide 3-kinase to the membrane by beta adrenergic receptor kinase. A role in receptor sequestration. J Biol Chem 276 (22):18953-18959 94) Naga Prasad SV, Laporte SA, Chamberlain D, Caron MG, Barak L, Rockman HA (2002). Phosphoinositide 3-kinase regulates beta 2-adrenergic receptor endocytosis by AP-2 recruitment to the receptor/beta arrestin complex. J Cell Biol 158 (3):563-575. 95) Nishizuka Y. 1992. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science 258: 607-614. 96) Numata S, Ueno S, Iga J, Yamauchi K, Hongwei S, Ohta K, Kinouchi S, Shibuya-Tayoshi S, Tayoshi S, Aono M, Kameoka N, Sumitani S, Tomotake M, Kaneda Y, Taniguchi T, Ishimoto Y, Ohmori T. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Val66Met polymorphism in schizophrenia is associated with age at onset and symptoms. Neurosci Lett. 2006 Jun 19;401(1-2):1-5. 97) Nurnberger JI, Foroud T 1999. Chromosome 6 workshop report. Am J Med Genet (Neuropsychiatr Genet) 88:233–238. 98) O'Donnell T, Rotzinger S, Nakashima TT, Hanstock CC, Ulrich M, Silverstone PH. 2003 Chronic lithium and sodium valproate both decrease the concentration of myoinositol and increase the concentration of inositol monophosphates in rat brain. Eur Neuropsychopharmacol. 13(3):199-207. 99) Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA 86: 2766-2770. 100) Osborne SL, Meunier FA, Schiavo G. 2001. Phosphoinositides as key regulators of synaptic function. Neuron 32: 9-12. 101) Owen MJ, Craddock N, O'Donovan MC. Schizophrenia: genes at last? Trends Genet. 2005 Sep;21(9):518-25. Review.

69

102) Papolos DF, Faedda GL, Weit S, Goldberg R, Morrow B, Kucherlapati R, Shprintzen RJ. 1996. Bipolar spectrum disorders in patients diagnosed with velo-cario-facial syndrome: Does a hemizygous deletion of chromosome 22q11 result in bipolar affective disorder. Am J Psychiatry 153(12): 1541-1547. 103) Perez I, Lin CH, McAfee JG, Patton JG. 1997. Mutation of PTB binding sites causes misregulation of alternative 3 splice site selection in vivo. RNA 3: 764-778. 104) Perez-Juste G, Garcia-Silva S, Aranda A. 2000. An element in the region responsible for premature termination of transcription mediates repression of c-myc gene expression by thyroid hormone in neuroblastoma cells. J Biol Chem 275(2): 1307-1314. 105) Phillips K, Luisi B (2000). The virtuosity of versatility: POU proteins that flex and fit. J Molecular Biology 302 (5):1023-1039. 106) Preisig M, Ferrero F, Malafosse A. Monoamine oxidase a and tryptophan hydroxylase gene polymorphisms: are they associated with bipolar disorder? Am J Pharmacogenomics. 2005;5(1):45-52. Review. 107) Pulver AE, Karayiorgou M, Wolyniec PS, Lasseter VK, Kasch L, Nestadt G. 1994. Sequential strategy to identify a susceptibility gene for schizophrenia: report of potential linkage on chromosome 22q12-q13.1: Part 1. Am J Med Genet 54: 36-43. 108) Rice JP, Goate A, Williams JT, Bierut L, Dorr D, Wu W, Shears S, Gopalakrishnan G, Edenberg HJ, Foroud T, Nurnberger J, Gershon ES, Detera-Wadleigh SD, Goldin LR, Guroff JJ, McMahon FJ, Simpson S, MacKinnon D, McInnis M, Stine OC, DePaulo JR, Blehar MC, Reich T. 1997. Initial genome scan of the NIMH genetics initiative bipolar pedigrees: chromosomes 1, 6, 8, 10, and 12. Am J Med Genet (Neuropsych Genet) 74: 247-253. 109) Reynolds AJ, Heydon K, Bartlett SE, Hendry IA. 1999. Evidence for phosphatidylinositol 4-kinase and actin involving in the regulator of 121I be to active growth factor retrograde uronat trans. J Neuro Chem 73: 87-95. 110) Saito T, Guan F, Papolos DF, Lau S, Klein M, Fann CS, Lachman HM (2001). Mutation analysis of SYNJ1: a possible candidate gene for chromosome 21q22-linked bipolar disorder. Mol Psychiatry 6(4): 387-95. 111) Schumacher J, Jamra RA, Freudenberg J, Becker T, Ohlraun S, Otte AC, Tullius M, Kovalenko S, Bogaert AV, Maier W, Rietschel M, Propping P, Nothen MM, Cichon S. Examination of G72 and D-amino-acid oxidase as genetic risk factors for schizophrenia and bipolar affective disorder. Mol Psychiatry. 2004 Feb;9(2):203-7. 112) Schwab SG, Hallmayer J, Albus M, Lerer B, Hanses C, Kanyas K, Segman R, Borrman M, Dreikorn B, Lichtermann D, Rietschel M, Trixler M, Maier W, Wildenauer DB. 1998. Further evidence for a susceptibility locus on chromosome 10p14-p11 in 72 families with schizophrenia by nonparametric linkage analysis. Am J Med Genet 81: 302307. 113) Schwab SG, Sklar P, Hallmayer J, Albus M, Rietschel M, Lerer B, Wildenauer DB. 2001. Association of SNPs with schizophrenia on chromosome 10p, a region with previously detected linkage. Am J Med Genet 105(7): 562 (abstract). 70

114) Searl TJ, Silinsky EM. 2000. The phosphatidylinositol 4-kinase inhibitor phenylarsine oxide blocks evoked neurotransmitter release by reducing calcium entry through N-type calcium channels. Br J Pharmacol 130: 418-424. 115) Segurado R, Detera-Wadleigh SD, Levinson DF, et al. Genome scan meta-analysis of schizophrenia and bipolar disorder, part III: Bipolar disorder. Am J Hum Genet. 2003 Jul;73(1):49-62. 116) Shaw SH, Kelly M, Smith AB, Shields G, Hopkins PJ, Loftus J, Laval SH, Vita A, De Hert M, Cardon LR, Crow TJ, Sherrington R, DeLisi LE. 1998. A genome-wide search for schizophrenia susceptibility genes. Am J Med Genet (Neuropsych Genet) 81: 364-376. 117) Shprintzen RJ, Goldberg RB, Lewin ML, Sidoti EJ, Berkman MD, Argamaso RV, Young D. 1978. A new syndrome involving cleft palate, cardiac anomalies, typical facies, and learning disabilities: velo-cardio-facial syndrome. Cleft Palate J 15: 56-62. 118) Shifman S, Bronstein M, Sternfeld M, Pisante A, Weizman A, Reznik I, Spivak B, Grisaru N, Karp L, Schiffer R, Kotler M, Strous RD, Swartz-Vanetik M, Knobler HY, Shinar E, Yakir B, Zak NB, Darvasi A. COMT: a common susceptibility gene in bipolar disorder and schizophrenia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2004 Jul 1;128(1):61-4. 119) Shimon H, Sobolev Y, Davidson M, Haroutunian V, Belmaker R, Agam G. 1998. Inositol levels are decreased in post-mortem brain of schizophrenic patients. Biol Psychiatry 44: 428-432. 120) Shyng SL, Barbieri A, Gumusboga A, Cukras C, Pike L, Davis JN, Stahl PD, Nichols CG. 2000. Modulation of nucleotide sensitivity of ATP-sensitive potassium channels by phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase. Proc Natl Acad Sci 97(2): 937-941. 121) Silverstone PH, Wu RH, O'Donnell T, Ulrich M, Asghar SJ, Hanstock CC. 2002 Chronic treatment with both lithium and sodium valproate may normalize phosphoinositol cycle activity in bipolar patients. Hum Psychopharmacol. 17(7):321-7. 122) Singh H, Sen R, Baltimore D, Sharp PA (1986). A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature 319 (6049):154-8. 123) Sjoholt G, Ebstein RP, Lie RT, Berle JO, Mallet J, Deleuze JF, Levinson DF, Laurent C, Mujahed M, Bannoura I, Murad I, Molven A, Steen VM. Examination of IMPA1 and IMPA2 genes in manic-depressive patients: association between IMPA2 promoter polymorphisms and bipolar disorder. Mol Psychiatry. 2004 Jun;9(6):621-9. 124) Smyth, C., Kalsi, G., Curtis, D., Brynjolfsson, J., O'Neill, J. and Rifkin, L., 1997. Two-locus admixture linkage analysis of bipolar and unipolar affective disorder supports the presence of susceptibility loci on chromosomes 11p15 and 21q22. Genomics 39, 271– 278. 125) Sorensen SD, Linseman D, McEwen EL, Heacock AM, Fisher SK. 1998. A role for a Wortmannin-sensitive phosphatidylinositol 4-kinase in neurotransmitter release. J Neurosci 18: 5594-5602.

71

126) Spitzer RL, Endicott J, Robins E (1978). Research diagnostic criteria: Rationale and reliability. Arch Gen Psychiatry 35:773-782 127) Stefansson H, Sigurdsson E, Steinthorsdottir V, Bjornsdottir S, Sigmundsson T, Ghosh S, Brynjolfsson J, Gunnarsdottir S, Ivarsson O, Chou TT, Hjaltason O, Birgisdottir B, Jonsson H, Gudnadottir VG, Gudmundsdottir E, Bjornsson A, Ingvarsson B, Ingason A, Sigfusson S, Hardardottir H, Harvey RP, Lai D, Zhou M, Brunner D, Mutel V, Gonzalo A, Lemke G, Sainz J, Johannesson G, Andresson T, Gudbjartsson D, Manolescu A, Frigge ML, Gurney ME, Kong A, Gulcher JR, Petursson H, Stefansson K (2002) Neuregulin 1 and susceptibility to schizophrenia. Am J Hum Genet 71(4):877-92. 128) Stefansson H, Sarginson J, Kong A, Yates P, Steinthorsdottir V,Gudfinnsson E, Gunnarsdottir S, Walker N, Petursson H, Crombie C, Ingason A, Gulcher JR, Stefansson K, St Clair D (2003). Association of neuregulin 1 with schizophrenia confirmed in Scottish population Am J Hum Genet.72(1):83-7. 129) Stopkova P, Saito T, Fann CSJ, Papolos DF, Vevera J, Paclt I, et al. 2003. Polymorphism screening of PIP5K2A: a candidate gene for chromosome 10p-linked psychiatric disorders. Am J Med Genet (Neuropsychiatr Genet) 123B:50–58. 130) Stopkova P, Saito T, Papolos DF, Vevera J, Paclt I, Zukov I, et al. 2004. Identification of PIK3C3 promoter variant associated with bipolar disorder and schizophrenia. Biol Psychiatry 55:981–988. 131) Stopkova P, Vevera J, Paclt I, Zukov I, Papolos DF, Saito T., Lachman HM 2005. Screening of PIP5K2A promoter region for mutations in bipolar disorder and schizophrenia. Psychiatr Genet. Sep;15(3):223-7. 132) Straub RE, Lehner T, Luo Y, Loth JE, Shao W, Sharpe L, Alexander JR, Das K, Simon R, Fieve RR, Lerer B, Endicott J, Ott J, Gilliam TC, Baron M. 1994. A possible vulnerability locus for BP affective disorder on chromosome 21. Nat Genet 8: 291-296. 133) Straub RE, MacLean CJ, Myakishev MV, Harris-Kerr C, O'Neil FA, Walsh D, Kendler KS. 1998. A schizophrenia locus may be located in region 10p15.1. Am J Med Genet 81: 296-301. 134) Talbot K, Eidem WL, Tinsley CL, Benson MA, Thompson EW, Smith RJ, Hahn CG, Siegel SJ, Trojanowski JQ, Gur RE, Blake DJ, Arnold SE. Dysbindin-1 is reduced in intrinsic, glutamatergic terminals of the hippocampal formation in schizophrenia. J Clin Invest. 2004 May;113(9):1353-63. 135) Thomson PA, Christoforou A, Morris SW, Adie E, Pickard BS, Porteous DJ, Muir WJ, Blackwood DH, Evans KL. Association of Neuregulin 1 with schizophrenia and bipolar disorder in a second cohort from the Scottish population. Mol Psychiatry. 2007 Jan;12(1):94-104. Epub 2006 Aug 29. 136) Tkachev D, Mimmack ML, Ryan MM, Wayland M, Freeman T, Jones PB, Starkey M, Webster MJ, Yolken RH, Bahn S. Oligodendrocyte dysfunction in schizophrenia and bipolar disorder. Lancet. 2003;362(9386):798-805. 137) Toker A, Cantley LC (1997). Signalling through the lipid products of phosphoinositide-3-OH kinase. Nature 387:673-676. 72

138) Torrey EF. Epidemiological comparison of schizophrenia and bipolar disorder. Schizophr Res. 1999;39(2):101-6. Review. 139) Tsuang DW, Skol AD, Faraone SV, Bingham S, Young KA, Prabhudesai S, Haverstock SL, Mena F, Menon AS, Bisset D, Pepple J, Sauter F, Baldwin C, Weiss D, Collins J, Boehnke M, Schellenberg GD, Tsuang MT. 2001. Examination of genetic linkage of chromosome 15 to schizophrenia in a large veterens affairs cooperative study sample. Am J Med Genet (Neuropsych Genet) 105: 662-668. 140) Turecki G, Rouleau GA, Mari J, Joober R, Morgan K. Lack of association between bipolar disorder and tyrosine hydroxylase: a meta-analysis. Am J Med Genet. 1997 Jul 25;74(4):348-52. 141) Turecki G, Grof P, Cavazzoni P, Duffy A, Grof E, Ahrens B, Berghofer A, MullerOerlinghausen B, Dvorakova M, Libigerova E, Vojtechovsky M, Zvolsky P, Joober R, Nilsson A, Prochazka H, Licht RW, Rasmussen NA, Schou M, Vestergaard P, Holzinger A, Schumann C, Thau K, Rouleau GA, Alda M. Evidence for a role of phospholipase Cgamma1 in the pathogenesis of bipolar disorder. Mol Psychiatry. 1998 Nov;3(6):534-8. 142) Weickert CS, Straub RE, McClintock BW, Matsumoto M, Hashimoto R, Hyde TM, Herman MM, Weinberger DR, Kleinman JE. Human dysbindin (DTNBP1) gene expression in normal brain and in schizophrenic prefrontal cortex and midbrain. Arch Gen Psychiatry. 2004 Jun;61(6):544-55. 143) Wenk MR, Pellegrini L, Klenchin VA, Di Paolo G, Chang S, Daniell L, Arioka M, Martin TF, De Camilli P. 2001. PIP kinase Igamma is the major PI(4,5)P(2) synthesizing enzyme at the synapse. Neuron 32(1): 79-88. 144) Wiedemann C, Schafer T, Burger MM, Sihra TS. 1998. An essential role for a small vesicle-associated phosphatidylinositol 4-kinase in neurotransmitter release. J Neurosci 18: 5594-5602. 145) Williams, R.S., Harwood, A.J., 2000. Lithium therapy and signal transduction. Trends in Pharmacological Science 21 2, 61–64. 146) Williams NM, O'Donovan MC, Owen MJ.Is the dysbindin gene (DTNBP1) a susceptibility gene for schizophrenia? Schizophr Bull. 2005 Oct;31(4):800-5. Review. 147) Wymann MP, Pirola L (1998) Structure and function of phosphoinositide 3-kinases. Biochem Biophys Acta 1436:127-150. 148) Yang F, He X-P, Feng L, Mizuno K, Liu X-W, Russell J, Xiong W-C, Lu B (2001). PI-3 kinase and IP3 are both necessary and sufficient to mediate NT-3-induced synaptic potentiation. Neuron 4:19-28. 149) Yoshikawa T, Kikuchi M, Saito K, Watanabe A, Yamada K, Shibuya H, Nankai M, Kurumaji A, Hattori E, Ishiguro H, Shimizu H, Okubo Y, Toru M, Detera-Wadleigh SD. 2001. Evidence for association of the myo-inositol monophosphatase 2 (IMPA2) gene with schizophrenia in Japanese samples. Mol Psychiatry 6: 202-210.

73

150) Zhao FQ, Adachi K, Oka T (2002). Involvement of Oct-1 in transcriptional regulation beta-casein gene expression in mouse mammary gland. Biochim Biophys Acta 19;1577(1):27-37.

74

13. Přílohy

75