Molekuláris biológus M.Sc. Prokarióták élettana Sterilezés és dezinficiálás.
Alapfogalmak STERILEZÉS DEZINFICIÁLÁS DEZINFICIENS/FERTŐTLENÍTŐSZER ANTISZEPTIKUM TARTÓSÍTÓSZEREK CSÍRASZÁMCSÖKKENTŐ (SZANITÁCIÓS) HATÁS CID HATÁS SZTATIKUS HATÁS
1
A fertőtlenítő hatás fokozatai Biocid/germicid hatás Bakteriosztatikus hatás Baktericid hatás Sporosztatikus hatás Sporocid hatás Virucid hatás Fungisztatikus hatás Fungicid hatás Paraziticid hatás
A baktériumpusztulás kinetikája Pusztulási ráta:
Túlélő mikroorganizmusok száma/gram anyag (log skála)
1 N K = log 0 t N K = pusztulási ráta t = expozíciós idő N0 = kiindulási csíraszám N = a t expozíciós idő után túlélő mikrobák száma
Túlélő mikrobaszám:
N = N 0 × e − Kt Behatási idő: 85 °C-on töltött percek
N − log N 0 t= K
2
A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők I. A fertőtlenítendő anyag tulajdonsága, minősége – felület milyensége, szerkezete, víztaszító képessége A fertőtlenítendő anyag szennyezettsége – vér, szérum, nyák, genny, széklet, vizelet; barrier és direkt inaktiválás A letális ágens természete, tulajdonságai
fizikai hatások – természet és intenzitás dezinficiensek – kémiai összetétel, stabilitás, vízoldékonyság, stb.
A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők II.
A mikroorganizmusok ellenállóképessége
száma
és
nagyobb mikrobaszám – nagyobb intenzitás, hosszabb behatási idő intenzíven növekvő populációk fizikai hatások – hőenergia és ultraibolya sugárzás dezinficiensek – rezisztencia mechanizmusok; optimális koncentráció
Prionok (CJD, BSE) Protozoonok - Sporozoa (Cryptosporidium) Baktériumspórák (Bacillus, Clostridium) Mycobacteriumok (M. tuberculosis, M. avium) Protozoonok cisztái (Giardia) Kis méretű burok nélküli vírusok (poliovírusok) Protozoonok trophozoitái (Acanthamoeba) Gram-negatív baktériumok (Pseudomona, Provodencia) Gombák vegetatív sejtjei (Candida, Aspergillus) Nagy méretű burok nélküli vírusok (Adenovírusok) Gram-pozitív baktériumok (S. aureus, Enterococcus) Burokkal rendelkező vírusok (HIV, HBV)
3
A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők III.
Hőmérséklet
A behatási idő
A fertőtlenítőszer koncentrációja
C nt = k
C = fertőtlenítőszer koncentrációja t = egységnyi mikrobapopuláció elpusztításához szükséges idő k = mikrobától és dezinficienstől függő reakció-
konstans
n = konstans (0,8-1,2)
A környezeti pH mikrobák túlélése és növekedési aktivitása mikrobák felületi töltése dezinficiensek pH függő aktivitása
Kétértékű kationok (Mg2+, Ca2+) jelenléte
Magas hőmérséklet Jellemző értékek termális pusztulási pont (thermal death point) termális pusztulási idő (thermal death time) termális redukciós idő (thermal reduction time, Dérték) Mechanizmus fehérje denaturáció, koaguláció DNS károsodás – törések a DNS láncban (nukleázok) sejtmembránok károsodása ribonukleázok aktiválása – riboszóma degradáció száraz hő – sejtek „kiszáradása” fehérje denaturáció, oxidatív sérülések
4
Nedves hő
Pasztörizálás (tej, joghurt, gyümölcslevek) 30 perc, 63-66°C 15 sec, 72°C 1 sec, 134-140°C
Frakcionált hőkezelés (hőérzékeny folyadékok) 30 perc, 80°C, 3x ismételve
Kifőzés, áramló gőz 30 perc, 100°C
Túlnyomásos telített vízgőz – autokláv 1 atm, 121°C, 30 perc 2 atm, 134°C, 3 perc
5
Száraz hő
Hőlégsterilizálás 140-180°C, 2-3 óra
Direkt hőhatás – leégetés, elégetés
Indikátorok - mechanikai - kémiai - biológiai
6
Hideghatás,fagyasztás Sztatikus hatás Ismételt fagyasztás, olvasztás Intracelluláris jégkristályképzés elektrolitegyensúly felborulása, fehérje denaturáció membránkárosodás ribonukleázok, peptidázok aktiválása
Tenyészetek tartósítása, tartósítása Liofilizálás
Ultraibolya sugárzás 240-280 nm DNS abszorpciós maximuma 260 nm DNS károsító hatás pirimidin dimerek – lánctorzulás zavar a DNS replikációban keresztkötések fotohidrációja
Repair folyamatok fotoreaktiváció – hidrolitikus enzimek excíziós javító mechanizmusok
7
Alacsony energiatartam Kis áthatolóképesség Helyiségek, steril fülkék levegőjének fertőtlenítése
Ionizáló sugárzás
Részecske és energiasugárzás Nagyobb energiatartalom Jó penetrációs képesség Gamma-sugárzás alkalmazása – 60Co-izotóp Direkt hatás – a sejt makromolekuláin közvetlenül érvényesül Indirekt hatás – a víz fotolízisének következménye H2O → H2O+ + eH2O+ + H2O → H3O+ + •OH e- + H2O → OH- + H• H• + O2 → •HO2 2 •HO2 → H2O2 + O2
Az SH-csoportok védik a sejtet az ionizáló sugárzás károsító hatásától Varróanyagok, tűk, fecskendők sterilezése
8
IONIZÁLÓ SUGÁRZÁS H2O radiolízis SZABADGYÖKÖK
Membrán foszfolipidek károsítása
DNS sérülés
Membrán integritás elvesztése
Replikációs zavar Hibás fehérjeszintézis
SEJTHALÁL
Ultrahang és hanghullámok Nagyfrekvenciájú hullámok – 20-40 kHz Folyamatos nyomásváltozás „üregképződés” (10µm) a folyadékokban, majd a buborékok összeomlása Legérzékenyebbek a Gram-negatív baktériumok Sejtszerkezet megbontása H2O2 képződés makromolekulák depolimerizációja intramolekuláris csoportátrendeződés kettős szálú törések a DNS-ben
9
Szűrés Hőérzékeny oldatok (infúziós oldatok, injekciós készítmények) pirogén hatás kivédése Seitz-féle azbeszt szűrő porcelánszűrő diatomaföld szűrők üvegszűrők membránszűrők (cellulózacetát) – 14 - 0,023µm; (baktérium 0,22 µm; vírus 0,01 µm Levegő szűrése – HEPA szűrők Adszorpció Szűrés méret alapján
Gázsterilizálás
formaldehid glutáraldehid etilén-oxid béta-propiolakton orto-ftálaldehid alkiláló hatás ATTEST
10
Plazmasterilezés
hőérzékeny anyagok sterilezése alacsony hőmérsékletű H2O2 gáz plazmaállapotban alacsony hőmérséklet (46±4°C) alacsony páratartalom széles hatásspektrum nem toxikus, nem környezetszennyező nincs szükség szellőztetésre elektromos vagy mágneses erőtér alkalmazásával a H2O2 plazmaállapotba kerül szabadgyök és biológiailag aktív anyagok hatnak normál nyomáson és vákuumban működő rendszer hatásfokozás UV-sugárzás alkalmazásával lépései 1. vákuum kialakítása 2. felmelegítés 3. H2O2 és H2O befecskendezés, diffúzió, penetráció 4. plazmafázis létrehozása 5. nyomáskiegyenlítés
Módszer
Alkalmazási terület
Mechanikus hatások (fagyasztás-olvasztás, UH)
Speciális – elsősorban kísérletes felhasználás
Direkt hőhatás
Fémeszközök (szike, kés) sürgős sterilezése
Száraz hő
Üvegeszközök
Nedves hő
Textíliák, üvegeszközök, hőrezisztens gyógyszerkészítmények, folyadékok; fertőző inaktiválása
Szűrés
Hőérzékeny folyadékok, infúziós, injekciós készítmények, levegő
UV
Kisebb munkaterületek, boxok, légtér fertőtlenítése
Gamma-sugárzás
Egyszer használatos injekciós tűk)
Gázsterilezés
Ruhanemű, helyiségek, műanyag eszközök
Plazmasterilezés
Folyadékok, porok, textíliák, cellulóz- és lentartalmú anyagok, zárt konténerben lévő anyagok NEM sterilezhetők
orvosi
eszközök
porok, anyagok
(fecskendők,
11
Dezinficiálás
Dezinficiensek
Antiszeptikumok
Tartósítószerek
Hatásmód nem szelektív szerek több támadáspont koncentráció-függő hatás (támadáspont, sztatikus-cid hatás) Támadáspontok 1. sejtmembránt károsító szerek 2. fehérje denaturáló szerek 3. fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjait károsító szerek
Kiválasztás kritériumai széles spektrum kis koncentráció rövid behatási idő jó oldékonyság jó penetrációs képesség ne károsítsa a fertőtlenítendő anyagot ne legyen káros az alkalmazóra, felhasználóra nézve gazdaságos alkalmazás több szer együttes használatakor ne alakuljon ki káros interakció
12
Dezinficiensek hatékonyságának értékelése I. Fenol-koefficiens meghatározása Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi
Szuszpenzió teszt (Suspension test) Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa standard csíraszám több hígításban „piszkos” körülmények kétértékű kationok jelenlétében maradék dezinficiens neutralizálása BH
= logNK-logND
Dezinficiensek hatékonyságának értékelése II. Használati teszt (in-use test) mintavétel a fertőtlenítendő objektumról a rutinszerűen végzett dezinficiálás előtt és után a gyártó által előírt koncentrációban 32°C-on (3 nap) és szobahőn (7 nap) inkubálva
Szimulált használati teszt (Simulated-use test) felület direkt kontaminációja – „tiszta” és „piszkos” körülmények dezinficiens vizsgálata a gyártó által megadott munkahígításban
Használati hígítási vagy hordozó teszt (usedilution or carrier test) tesztelés alkalmazási hígításban Salmonella choleraesius Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Korongdiffúziós teszt
13
Sejtmembrán károsító szerek Sejtmembrán integritásának megbontása makromolekulák kiáramlása és az ozmotikus egyensúly felborulása transzportmechanizmusok károsodása energia metabolizmus károsodása (elektrontranszportlánc és ATPáz funkció kiesése szintetikus funkciók kiesése
Sejtmembránt károsító szerek – Felületaktív vegyületek
hidrofób és hidrofil csoportok kationaktív tenzidek anionaktív tenzidek nem ionos tenzidek amfoter tenzidek
Kationaktív detergensek kvaterner ammóniumvegyületek (+) töltésű kationaktív molekularész spektrum és hatáserősség az apoláros oldallánctól függ baktericid, virucid hatás fungicid, sporocid és paraziticid hatásuk nincs nagyobb koncentrációban fehérje denaturáló hatás neutrális vagy enyhén lúgos pH-n aktívak kevéssé toxikus, nem irritáló, nem korrozív szerek jó vízoldékonyság könnyen inaktiválódnak kombinációk (biguanidok, jódszármazékok) cetilpiridinium-klorid, benzalkonium-klorid, cetiltrimetil-ammónium-bromid, dimetilbenzil-ammóniumklorid, stb. egyes szerek tartósítószerként is alkalmazhatók
14
Sejtmembránt károsító szerek – Felületaktív vegyületek Anionaktív detergensek
szappanok anionos molekularész szennyoldó hatás gyengén savas pH-n hatékonyak Na-lauril-szulfát, Na-n-dodecilszulfonát, Na-palmitát
Nem-ionos tenzidek
nincs ionos csoport poláros rész alkohol-, éter- vagy észter-csoportokból áll szennyoldó hatás fokozzák a kationaktív tenzidek dezinficiáló hatását pentaeritril-palmitát, glicerol-monosztearát, PEG-lauril-éter, PEGsztearát
Amfoter tenzidek
bázikus és savas csoport neutrális pH jó fertőtlenítő és szennyoldó hatás baktericid és virucid hatás a szerves szennyeződésekre kevésbé érzékenyek alkil-betainok, alkil-amidopropil- betainok (alkil- amidopropilbetain)
Sejtmembránt károsító szerek – Alkoholok
lipidstruktúrák dezintegrációja fehérje denaturáció vízelvonó hatás hatáserősségük, penetrációs képességük, vízoldékonyságuk és toxicitásuk a lánchossztól függ baktericid, virucid, fungicid hatás sporosztatikus tartalmazhatnak spórákat - szűrés 60-90% etanol (70%) izopropil-alkohol (60-70%) kombinációban is alkalmazhatók (pl. jódszármazékokkal) egyes alkoholok tartósítószerként alkalmazhatók (klórbutanol, fenil- és fenoxi-etanol, fenoxipropán-2-ol)
15
Sejtmembránt károsító szerek – Fenol és fenolszármazékok
membrán dezintegráció membránhoz kötött enzimek (oxidázok, dehidrogenázok) károsítása fehérje denaturáló hatás baktericid, paraziticid hatás virucid hatás változatos fungisztatikus és sporosztatikus hatás
Fenol Alkilált fenolszármazékok alkil-lánc hossza > hatáserősség, toxicitás, oldékonyság, érzékenység a szerves szennyeződésekre emulgeáló szerek hozzáadása krezol Halogénezett bifenil-származékok triclosan, hexaklorofén kifejezett antibakteriális hatás a Gram-pozitívakkal szemben Gram-negatívakkal és gombákkal szembeni hatása fokozható EDTA hozzáadásával fogkrémek, szájöblítők
Sejtmembránt károsító szerek – Biguanidok Biguanidok baktericid és virucid spektrum klórhexidin-acetát, -glukonát, hidroklorid – Gram-pozitív spektrum – nem irritáló – aktivitásvesztés (szennyeződés, ionok, pH) – kézmosószerek, szájöblítők – enyhén lúgos közegben aktív alexidin - gyorsabb baktericid hatás biguanid-polimerek – vantocil – szemcseppek, élelmiszeripar – Gram-pozitív és –negatív spektrum membránkárosítás, enzimek inaktiválása NH
Diamidinek propamidin dibromopropamidin sebfertőtlenítés, szepcseppek inaktiválás – savas pH, szennyeződések
NH
( CH 2 ) 6
NH
C
NH NH
C
n
16
Fehérje denaturáló szerek Felületaktív vegyületek Fenol és fenolszármazékok Alkoholok Savak és lúgok baktericid, virucid, sporocid hatás környezeti pH változás szervetlen savak (HCl, H2SO4) és lúgok (NaOH) -
disszociációs képesség lúgoknál a fémionok toxikus hatása is érvényesül
szerves savak – ecetsav, tejsav, citromsav, propionsav, benzoesav és észterei; tartósítószerek
-
nem disszociált formában hatnak ozmotikus egyensúly felborítása egyes savak (pl. citromsav) kelátorként is működnek
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Nehézfém vegyületek
Higany, ezüst, arzén, réz … vízoldékony sói -SH oldalláncokkal inaktiválása, merkaptánok képzése reverzibilis károsítás
Higanyvegyületek -SH, karboxil-, foszfát-csoportok, aminok baktericid hatás irritáló és toxikus hatás Hg(II)-klorid szerves kötésű Hg-vegyületek – tiomerzál, fenilmerkuri-citrát és –acetát antiszeptikmok – bőrfertőtlenítés, tartósítószerek Ezüstvegyületek baktericid hatás szervetlen – AgNO3 szerves – Ag-acetát (1%) kolloidális Ag-vegyületek szemészet, bőrgyógyászat (antiszeptikum)
17
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek Halogén származékok
-SH-csoportok, amino- és indolcsoportok tirozin fenolgyűrűjének –OH-csoportja
Jódszármazékok – – – – – – –
baktericid, fungicid, virucid hatás; sporocid és paraziticid hatás enyhén savas pH elemi jód hatékony alkoholos jódoldat - jódtinktúra jodoforok – elemi jód detergensekkel alkotott komplexei bőr fertőtlenítése szerves szennyeződések
Klórszármazékok – – – – – – –
-SH csoportok oxidálása, amino- és indol-csoportok károsítása baktericid, fungicid, virucid, sporocid és paraziticid hatás makromolekulák klórozása (DNS stabilizáló poliaminok) mellett oxidatív hatás stabilitás - szerves anyagok, hőmérséklet, koncentráció, pH, fény irritáló és korrozív hatás hipokloritok – Na-, Ca-hipoklorit (klórmész) NaOCl + H2O HOCl + NaOH klóraminok – klóramin-B (Neomagnol), diklóramin-B, halazon
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Peroxidok Oxidáló hatás S-S kötések bontása, -SH-csoportok oxidálása baktericid, fungicid, virucid, sporocid és paraziticid hatás Hidrogén-peroxid -
3% oldat kataláz, peroxidáz inaktiválja nincs toxikus bomlástermék DNS törés kontaktlencse tisztítók, sebek, plazmasterilizátor
Peroxiecetsav -
< 0,3% oldatban hatásos plazmasterilizátor nincs toxikus bomlástermék peroxidázok nem inaktiválják irritáló és korrodáló hatású szinergista hatás
18
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Festékek Bakteriosztatikus és fungisztatikus hatás, ritkábban paraziticid Foszfát-csoportok Könnyen inaktiválódnak – szennyeződések Korlátozott alkalmazhatóság – karcinogén hatás Bőrgyógyászat, diagnosztika
Anilinfestékek – – – – – –
trifenil-metán származékok brillantzöld, malachitzöld, kristályibolya Gram-pozitívak gátlása Gram-negatívakkal szemben hatástalanok (külső membrán) citoplazmamembrán szemipermeabilitása interferálnak a sejtfal egységek szintézisével
Akridinfestékek vagy flavinok – – –
akriflavin baktericid és bakteriosztatikus hatás interkaláció - nukleinsav és fehérjeszintézis megzavarása
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Aldehidek Alkiláló szerek Legszélesebb hatásspektrum - baktericid, tuberculocid, fungicid, virucid, paraziticid és sporocid hatás Formaldehid
– – – – – – –
karboxil-, hidroxil-, SH-csoportok fehérje-DNS keresztkötések >>> gátolja a DNS replikációt formalin, paraformaldehid (aktiválás) 20°C, 60-80% páratartalom toxicitás, irritáló hatás, rossz penetráció, inaktiválódás felület fertőtlenítés, gázsterilezés formaldehid kondenzátumok (noxythiolin, polynoxylin, taurolidin)
Glutáraldehid – nagyobb hatékonyság, kevésbé toxikus, nem érzékeny szerves szennyeződésekre – alkalikus pH-n jobb aktivitás, stabilitás savas pH mellett - aktiválás
Orto-ftálaldehid – – – – –
még nagyobb hatékonyság kevéssé irritáló széles pH tartományban aktív nincs szükség aktiválásra endoszkópok fertőtlenítése
19
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek Etilén-oxid Béta-propiolakton Etilén-oxid – gázsterilizálás – speciális eszközigény, hőmérséklet és páratartalom – széles hatásspektrum – alkiláló hatás – fehérjék, nukleinsavak – robbanásveszélyes, irritáló és korrozív hatás – jól penetrál, alacsony hőmérsékleten is aktív – toxikus, mutagén és karcinogén hatás
Béta-propiolakton – nagyobb hatékonyság, kevésbé toxikus – speciális alkalmazási körülmények (magas páratartalom, 25ºC) – irritáló, instabil vegyület
Fertőtlenítőszer kombinációk
Alkohol + klórhexidin Alkohol + kvaterner ammóniumvegyületek Alkohol + Na-hipokorit Alkohol + jódszármazékok Kationaktív tenzidek + fenolszármazékok Kationaktív tenzidek + aldehidek Peroxid-származékok H2O2 + hangyasav Bioaktív felületek kialakítása – ezüst-sók, biguanidok, triclosan Aldehid + UH Biguanid + UH H2O2 + UV Szuperoxiddal kezelt víz oxidálószerekkel kombinálva
20
Rezisztencia mechanizmusok a fertőtlenítőszerekkel szemben 1. Természetes vagy intrinzik rezisztencia sejtfalstruktúra spóraképzés cisztaképzés aktív efflux mechanizmusok biofilmképző képesség 2. Szerzett rezisztencia mutáció mobilis genetikai elemek fenotípusos adaptációs képesség Jelentőség dezinficiensek, antiszeptikumok hatástalansága szelekció keresztrezisztencia korezisztencia
Prionok (CJD, BSE) Protozoonok - Sporozoa (Cryptosporidium) Baktériumspórák (Bacillus, Clostridium) Mycobacteriumok (M. tuberculosis, M. avium) Protozoonok cisztái (Giardia) Kis méretű burok nélküli vírusok (poliovírusok) Protozoonok trophozoitái (Acanthamoeba) Gram-negatív baktériumok (Pseudomona, Provodencia) Gombák vegetatív sejtjei (Candida, Aspergillus) Nagy méretű burok nélküli vírusok (Adenovírusok) Gram-pozitív baktériumok (S. aureus, Enterococcus) Burokkal rendelkező vírusok (HIV, HBV)
Baktériumok rezisztencia mechanizmusai 1.
Természetes rezisztencia
Gram-pozitív baktériumok jól átjárható sejtfal glikokalix-képzés Enterococcusok (VRE, VSE)
Gram-negatív baktériumok LPS – hidrofil porincsatornák Mg2+ és foszfát-tartalom intrinzik aktív efflux, pl. E. coli, Pseudomonas – Acr AB
Mycobacteriumok sejtfalstruktúra hidrofil szerek rossz penetrációja
Baktériumspórák cortex, köpeny, exosporium fokozatosan kialakuló és fokozódó rezisztencia small acid-soluble spore proteins (UV, peroxidok)
Biofilmképzés
21
Baktériumok rezisztencia mechanizmusai 2.
Szerzett rezisztencia
Mutáció – a több target miatt kevéssé jelentős szelekciós nyomás – fertőtlenítőszer szuboptimális koncentrációban történő alkalmazása target módosulás – E. coli enoil-acil-protein reduktáz (triclosan) efflux pumpa – Pseudomonas nfxB regulátorgén akridinfestékek
Mobilis genetikai elemek Ag-vegyületek – csökkent felvétel Hg-vegyületek – enzimatikus inaktiválás szűk spektrumú rezisztencia – Hg-sók és néhány szerves Hgvegyület (enzimatikus redukció) széles spektrumú rezisztencia – összes Hg-vegyülettel szemben (enzimatikus hidrolízis) kvaterner ammóniumvegyületek– efflux pumpák (qacA-D) biguanidok – aktív efflux és enzimatikus inaktiválás (klórhexidin) festékek –aktív efflux (qacA-D) formaldehid – enzimatikus inaktiválás
Fenotípusos adaptáció tápanyagellátottság – zsírsavak, fehérjék, tápanyaghiány stresszreakciók
22
Gombák rezisztencia mechanizmusai
fonalas gombák ellenállóbbak, mint a sarjadzó alakok intrinzik rezisztencia - sejtfal barrierképzése szaporodási fázistól függ >>> változó a sejtfal porozitása (log <> stacioner) mikrokörnyezet – zsírsavtartalom és citoplazmamembrán fluiditása (etanol) enzimatikus degradáció (formaldehid-dehidrogenáz) és neutralizálás (H2Stermelés, nehézfém-vegyületek)
intrinzik rezisztencia vírusburok jelenléte vagy hiánya vírusaggregátumok kialakulás – biofilmhez hasonló hatás mutáció?
intrinzik rezisztencia ciszta alak – cisztafal mint barrier biofilmképzés - Acanthamoeba
abnormális fehérjék
Vírusok rezisztencia mechanizmusai
Protozoonok rezisztencia mechanizmusai
Prionok rezisztencia mechanizmusai
23
