Molecular Biology of the Cell Fifth Edition

Membránový princip organizace buňky (kompartmenty). Třídění proteinů.

Alberts • Johnson • Lewis • Raff • Roberts • Walter

Molecular Biology of the Cell Fifth Edition

doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc

Chapter 12 Intracellular Compartments and Protein Sorting

[email protected]

Copyright © Garland Science 2008

1

2

Dnešní přednáška Název Membránový princip organizace buňky. Úvod. Buněčná teorie. Plazmatická membrána, buněčná stěna a mezibuněčná hmota. Membránový transport. Vezikulární transport. Energetické zajištění života buněk. Buněčná signalizace. Organizace a dynamika cytoskeletu. Buněčné jádro. Buněčný cyklus. Mitóza, meióza. Chromozómy a jejich alterace. Diferenciace buněk, stárnutí, apoptóza, nekróza. Buněčný stres, adaptace. Závěr.

Přednášející Jiří Drábek Marián Hajdúch Petr Džubák Petr Džubák Jiří Drábek Jiří Drábek Josef Srovnal Marta Dziechciarková Josef Srovnal Radek Trojanec Radek Trojanec Radek Trojanec Petr Džubák Marián Hajdúch

Termín 25.9. 29.9. 2.10. 9.10. 16.10. 23.10. 30.10. 6.11. 13.11. 20.11. 27.11. 4.12. 11.12. 18.12.

• Kompartmentalizace buněk • Transport molekul mezi jádrem a cytosolem • Transport proteinů do mitochondrií (mt) a chloroplastů (ct) • Peroxizómy • Endoplazmatické retikulum (ER)

3

4

Hlavní intracelulární kompartmenty živočišné buňky

Vlastnosti buňky 1. 2. 3. 4.

Informace, dědičnost Vnitřní prostředí Aktivita, odpověď, pohyb Energie (pro předchozí)

Figure 12-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Kompartmenty – organely (enzymy, specializované mlk, distribuční systém) Proteiny – strukturální a funkční vlastnosti, 20 000 druhů, 10na10 mlk Biochemické procesy na mb (lipidovvý metabolismus, oxidativní fosforylace, fotosyntéza Přes lipidovou dvouvrstvu neprojdou hydrofilní Cytoplazma – cytosol + organely

5

6

Na topologické vztahy membránových organel můžeme pohlížet z evolučního hlediska Jaterní buňka v elektronovém mikroskopu


Figure 12-3a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Lokalizace ER a Golgi závisí na neporušených mikrotubulích

Eukaryotická buňka a podíl povrch objem (1000 krát větší než E.coli) Specializace mb funkce Vnitřní mb mt a plastidů odpovídá původní plazmatické mb bct Proplastidy se dědí spolu s cytoplazmou rostlinného vajíčka Brambora, tuková semínka, okvětní lístek

7

8

Vývoj thylakoidu

Evoluce jádra a endoplazmatického retikula (ER)

Figure 12-3b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Invaginace, thylakoidy rostou a dělí se autonomně

Připojení, invaginace, obálka, komunikační kanály – nuclear pore complex Jaderný kompartment je ekvivalentní cytosolu 4 intracelulární kompartmenty: - jádro a cytosol - Sekretorní a endocytické (ER, Golgi, lyzo) - Mt - plastidy

9

10

Evoluce mitochondrií (mt) a plastidů

Sekretorní a endocytická dráha eukaryontní buňky



Pohlcení bct, autonomie

Proteiny procházejí kompartmenty různými způsoby Topologicky ekvivalentní kompartmenty červeně Modré šipky – transportní cesty

11

12

Cestování proteinů

Pučení a fůze vezikulů během vezikulárního transportu



Skoro všechny proteiny jsou syntetizovány na ribozomech v cytosolu – výjimka mt a plastidy

Červeně rozpustné látky z lumenu do lumenu Přenáší se také mb, proto je zachována asymetrická orientace proteinů a lipidů

Sorting signal – obsažen v sekvenci, pokud není – cytosol Gated – mezi topologicky ekvivalentními (aktivně přes jaderné póry, také pasívně) Transmb – mb translokátory, unfolded Vezikulární – mezi tpologicky ekvivalentními, mb intermediáty ER-Golgi

13

14

Signální sekvence a signální štítky fungují jako adresy

Table 12-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Page 704 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Štítek (patch) - 3D (degradace do lyzosomu) Signální sekvence – 15 až 60 ak, štěpení signální peptidázou Signály: Běž do ER: N konec hydrofobní ak Zůstaň v ER: 4 ak na C konci Mt – střídání pozitivní a hydrofobní Peroxizomy – 3 ak na C konci Rozpoznání pomocí sortovacích receptorů, které jsou katalytické (po použití recyklace) a rozpoznávají celou třídu proteinů Mb organely se vytvářejí z mb organel (epigenetická info)

15

16

Póry v jaderné membráně Jaderná membrána (schránka, obálka)



Jaderná mb (obálka) – 2 koncentrické mb penetrované póry Vnitřní mb – vazba k chromatinu

Jaderné pórové komplexy (125 mil Da, 50 různých proteinů nukleoporinů, oktagonální symetrie)

Vnější – propojená s ER

Průměr 4000 pórů na jaderné mb, při aktivní transkripci více

Perinukleární prostor mezi nimi (propojený s lumenem ER)

Každý pór přenese 100 histonů a 6 ribozomálních podjednotek za minutu

Histony, polymerázy, gene regulační proteiny, proteiny RNA sestřihu - do jádra z cytosolu

Annular - prstencový

tRNA a mRNA ven Ribozomální proteiny – z cytosolu do jádra a zpět

17

18

Průchod (difúze) jaderným pórem

Funkce jaderné signální sekvence



Zdánlivý rozpor: 26 nm protein, na mikroskopu jen 9 nm otvor

T antigen viru SV40

Malý protein 5 kDa volná difúze Jaderné proteiny procházejí pórem folded

19

20

Receptory jaderného importu

Aktivní transport jadernými póry



Koloidní zlaté kuličky (šipky)

Jaderný lokalizační signál musí být rozpoznaný jadernými importními receptory (rozpustné, v cytosolu, váží se zároveň k proteinu a k fibrilám nukleoporinu)

A) 10 min

Receptory se váží na FG repetice (F fenylalanin G glycin) na fibrilách – vazba odpojení posun vazba, někdy vazba zprostředkována dalším adaptorovým proteinem (strukturně podobný receptoru)

B) 30 min C) 40 min D) 50 min

Nukleární export – opak importu (signály exportu patřící spolu se signály importu do skupiny karyoferinů)

21

22

Jak GTP hydrolýza směruje transport přes jadernou mb?

Kompartmentalizace Ran-GDP a Ran-GTP



Energie přenosu je dodávána hydrolýzou GTP pomocí GTPázy Ran

Kompartmentalizací RanGTP a RanGDP

GAP - GTPáza aktivační protein (GTP na GDP) GEF – guanin exchange factor (RanGDP na RanGTP) Posun podél FG repetic

23

24

Kontrola vývoje muší larvy pomocí jaderného transportu

Nalodit v cytosolu, vylodit v jádře

Protein dorsal je v embryu uniformně exprimovaný, ale aktivní je jen pokud se nachází v jádře (spodní část embrya)



Proteiny, které mají zároveň signál pro jádro a signál pro export z jádra (např.receptory exportu a importu) – pendlovky, shuttle, steady state fosforylace může zapnout nebo vypnout signál, další regulace přes inhibiční cytosolické proteiny (exprese proteinů cholesterolového metabolismu)

25

26

Kontrola jaderného importu během aktivace lymfocytů T

Jaderná lamina oocytu Xenopus



Signál Ca2+ spustí defosforylaci NF-AT pomocí kalcineurinu (exponuje importní signály, blokuje exportní signály)

Jaderná lamina je tvořena proteinovými podjednotkami, intermediárními filamenty, které dávají jaderné mb tvar a interagují s chromatinem

Aktivace transkripce cytokinů Málo Ca2+ - uvolnění kalcineurinu, refosforylace Imunosupresiva cyklosporin A a FK506 inhibují kalcineurinovou defosforylaci

27

28

Jaderná mb za mitózy



Depolymerizace pomocí fosforylace cyklindependentními kinázami Prolomení bariéry mezi cytosolem a jádrem Anafáze – jaderná obálka se znovu vytváří na povrchu chromozomů, ER mb zabalí část, fúzuje s další částí, jaderné póry začínají přenášet dovnitř specifické proteiny Jaderné lokalizační signály nejsou odštěpeny – protože jsou potřebné při každém dělení buňky

29

30

Signální sekvence pro import do mt

Sub-kompartmenty mt a ct



Dvojitá mb

Mt – přenos proteinů do mt posttranslačním mechanismem

Většina proteinů je jaderných

Amfipatický alfa helix- kladně nabitý na jedné straně, bez náboje na druhé

Mt – matrix a mezimb prostor, vnitřní mb tvoří kristy Ct – navíc mají thylakoidní prostor jako další kompartment (není spojený s vnitřní mb)

31

32

Proteinové translokátory v mt

Během transportu proteiny procházejí skrz obě mb naráz



TOM Translocase of the outer mirochondrial mb TIM23 - prochází dvěma mb TIM22 – přenašeče ATP a ADP a fosfátu OXA pro proteiny syntetizované v mt Mt prekurzorové proteiny se přenášejí unfolded hsp 70 chaperony

33

34

Import proteinů do mt

Energie a import proteinů do mt



N terminální sekvence rozeznána TOM, přenos, odštěpení signální peptidázou, signální sekvence degradována

ATP hydrolýza (na dvou místech: mimo mt a v matrix mt) a elektrochemický H+ gradient pohánějí proteinový import do mt H+ : přenos signální sekvence do matrix Hsp70 dovnitř vtáhne, hydrolýza ATP uvolní hsp70 Vnější mb obsahuje porinové póry (jako Gram negativní bct), proto se zde nedá udržet gradient H+

35

36

Import z cytosolu do vnitřní mt mb nebo do mezimb prostoru

Role chaperonů při proteinovém importu do mt



Hsp70 předává hsp60

2 signální sekvence, hydrofobní oranžové V mt tvorba ATP, citrátový cyklus – transport malých metabolitů – vnější mb průchod, vnitřní mb má specifické přenášeče

37

38

Přenos prekurzorů do thylakoidů ct 1

Přenos prekurzorů do thylakoidů ct 2



Ct – přenos posttranslační jako u mt

Sec proteiny homologní bct

Ct nemají elektrochem gradient

SRP homolog signal recognition particle

Ne ATP ale GTP (konvergentní evoluce) v thylakoidech ATPsynthasa a fotosyntetický systém Matrix se nazývá stroma Odštěpením prvního signálu se odmaskuje druhý

39

40

Tři peroxizómy v krysím hepatocytu



Peroxizómy mají jen 1 mb, nemají DNA ani ribozómy Obsahují katalázu a urát oxidázu (inkluze) Využití kyslíku Evoluční příchod mt snížil důležitost některých fcí peroxizómů, protože mt dělají totéž a ještě produkují E

41

42

Peroxizóm v mezofylu tabákového listu

Reakce v peroxizomech • RH2 + O2 Æ R + H2O2 (oxidativní reakce) • H2O2 + R´H2 Æ R´+ 2H2O (kataláza, peroxidativní reakce, játra a ledviny) • 2H2O2 Æ 2H2O + O2 (kataláza při nadbytku peroxidu) • Beta oxidace tuků • Tvorba plazmalogenů (v myelinových pochvách neuronů, izolují axony) • Fotorespirace v rostlinách • Glyoxalátový cyklus v semíncích rostlin


Peroxidativní reakce: např. 25% ethanolu na acetaldehyd

3 ak na C konci – peroxizomový signál

Beta oxidace – zkracování alkylových řetězců až na acetylCoA (ten do cytosolu, kde použit)

Asociace s chloroplastem Peroxiny za účasti ATP se podílejí na transportu foldovaných (poskládaných do konečné konformace) proteinů do peroxizómu

Adaptace peroxizómů za změněných podmínek Fotorespirace – fixace CO2 na polysacharid (spotřeba O2)

Dědičný Zellwegerův syndrom – defekt importu do peroxizómů (prázdné peroxizómy) – smrt po narození

Glyoxalátový cyklus – přeměna tuků na cukry

43

44

Peroxizóm v kotyledonové buňce čtyřdenního rajčatového semínka

Vznik nových peroxizómů



Peroxizóm glyoxyzóm

Růst a dělení, peroxizóm z peroxizómu

glukoneogeneze

45

46

Endoplazmatické retikulum (ER) v savčí a rostlinné buňce

Figure 12-34b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Page 723 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Zabarvení pomocí protilátky

47

48

Drsné ER

Transport



Rozdíl mezi kotranslační a posttranslační translokací

Pankreatická exokrinní buňka

U ER je posttranslační transport výjimečný

49

50

Hladké a drsné ER v jaterní buňce

Hladké ER v Leydigových buňkách testes


Figure 12-36c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Hladké ER je ve specializovaných buňkách, zvláště lipidového metabolismu

3D rekonstrukce

Např.: -Leydigovy bb (sekrece testosteronu) -Hepatocyty (tvorba lipoproteinů, detoxifikace převodem na vodu rozpustnou formu pomocí enzymového systému cytochromu P450, ER indukováno podle potřeby a pak autofagocytováno) -Sarkoplastické retikulum – ER ve svalech, kde pomocí Ca2+ zabezpečuje signalizaci relaxace a kontrakce; sekvestrace Ca2+ je důležitou fcí ER

51

52

Drsné ER ve formě mikrozómů po centrifugaci

Centrifugační pokus



Izolace mikrozómů, na kterých se testovaly funkce ER

53

54

SRP: Signal Recognition Particle

Signální hypotéza



Vedoucí sekvence proteinu (sled prvních ak proteinu) nese signál pro ER

SRP nasměřuje protein k receptoru na drsném ER Kapsa vážící signální sekvenci obsahuje hodně methioninů, které zaručují flexibilitu (plasticitu)

55

56

Směrování ribozomů do ER pomocí signální sekvence a SRP

Vazba ribozomů na SRP



SRP a jeho receptor jsou synchronizováni: SRP se váže k ER signální sekvenci a k ribozómu a tím zastaví translaci Pak se váže SRP receptor a směruje protein k translokátoru Spotřeba GTP

57

58

Polyribozóm v mikroskopu

Cyklus volného a vázaného ribozómu



Robozomální podjednotky v cytosolu slouží pro vázaný i volný ribozóm

59

60

Ribozóm navázaný na translokátor Sec61

Šev a zátka



Protein se nedostane do styku s cytosolem – uzavření švem a zátkou

Translokátor Sec61 vytváří vodou naplněný pór

Uzavření nutné, aby neunikal Ca2+ do cytosolu

61

62

Strukturálně podobné translokátory

Přenos rozpustného proteinu přes mb ER



A) kotranslační, Sec61, není potřeba E, jediná cesta pro rostoucí řetězec je skrz mb

Ribozómy nejsou zobrazeny pro zjednodušení

B) posttranslační, Sec61 a další, E ATP, BiP binding protein vazba a uvolnění (podobnost s hsp70 u mt)

Po vazbě ER signální sekvence se otevře pór translokátoru, přenos

ER signální sekvence znamená „začni transport“ Po přenosu uzavření póru, signální sekvence difunduje do mb a degraduje se

C) posttranslační, SecA, ATP, jako pístem po 20 ak (podobnost s thylakoidem ct)

Proteiny, které zůstávají v mb (jednoprůchodové single pass, dvouprůchodové double pass nebo multipass) využívají navíc k ER signální sekvenci také stop transfer sekvence

63

64

Inzerce rhodopsinu do ER Připojení prekurzorového oligosacharidu na asparagin proteinu v drsném ER



Příklad multipass proteinu Rhodopsin je světločivný protein v fotoreceptorových čípcích v savčí sítnici

Většina proteinů v drsném ER je glykosylována připojením prekurzorového Nlinked oligosacharidu

Vlevo diagram hydrofobicity, který rozpozná 7 hydrofobních úseků

Prekurzorový oligosacharid je

Modře vyznačeny oligosacharidy

- za pomoci enzymu oligosacharyltransferázy připojován vcelku; sestává z Nacetylglukosaminu, manózy a glukózy

Šipky zobrazují části, vcházející do translokátoru

- vytvářen připojováním cukr po cukru a zaparkován v tukové mlk dolicholu (polyisoprenoid) a přenesen na cílový asparagin

65

66

Proteinová glykosylace v drsném ER

Role glykosylace ve skládání proteinů v ER



Jakmile polypeptid vstoupí do lumenu ER je gylkosylován na cílových Asn

Glykosylace je značkou pro nesložený protein

Ribozómy nejsou zobrazeny pro zjednodušení

Kalnexin se váže k nesprávně složenému proteinu, označenému terminální glukózou a N-linked oligosacharidem Pokud glukosyltransferáza odstraní koncovou glukózu, tak se kalnexin uvolní

67

68

Připojení glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy k proteinu v ER

Export a degradace špatně složených proteinů v ER



Návrat špatně složeného proteinu do cytosolu - retrotranslokace, dyslokace

Některé mb proteiny kovalentně připojují glykosylfosfatidylinositolovou kotvu, která upevňuje protein v mb a může být rychle uvolněna v odpovědi na stimul (Trypanosoma změní „kabát“ při rerakci s imunitním systémem)

Až 80% proteinů je špatně složených Využití Sec61 Deglykosylace, ubikvinace, degradace v proteasomu

69

70

Syntéza lecitinu

Děkuji vám za pozornost!


Hlavní fosfolipid fosfatidylcholin (lecitin) je syntetizován z acylkoenzymuA, glycerol3fosfátu a cytidinbifosfocholinu Další fosfolipidy (fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol) syntetizovány obdobně Přenos z vnitřní mb na vnější pomocí translokátoru skramblázy nebo flipázy ER vytváří také cholesterol a ceramid

71

72

Molecular Biology of the Cell Fifth Edition

Recommend Documents