Tudományos Diákköri Dolgozat
GÓBI SÁNDOR
Modellpeptid – víz komplexek vizsgálata mátrixizolációs IR és VCD spektroszkópiával
Dr. Tarczay György Dr. Vass Elemér
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007
1
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés.......................................................................................................................................... 3 2. Előzmények...................................................................................................................................... 4 2.1 Modellpeptidek szerkezetvizsgálata.......................................................................................... 4 2.2 Aminosavak komplexeinek vizsgálata.......................................................................................5 3. Vizsgálati módszerek........................................................................................................................7 3.1 Mátrixizolációs technika............................................................................................................7 3.2 Infravörös spektroszkópia........................................................................................................10 3.3 VCD spektroszkópia:............................................................................................................... 10 3.4 Kvantumkémiai számítások..................................................................................................... 12 4. Gyakorlati részletek........................................................................................................................13 4.1 Infravörös, és VCD mérések....................................................................................................13 4.2 A mátrix leválasztása............................................................................................................... 13 4.3 Számolások háttere.................................................................................................................. 14 5. Számolási eredmények................................................................................................................... 15 5.1 Ac-L-Pro-NH2......................................................................................................................... 15 5.2 Ac-L-Ala-NHMe..................................................................................................................... 21 6. Gyakorlati eredmények.................................................................................................................. 22 6.1 AcProNH2............................................................................................................................... 22 6.1.1 mátrixizolációs IR vizsgálatok.........................................................................................22 6.1.2 mátrixizolációs VCD vizsgálatok.................................................................................... 24 6.2 Ac-Ala-NHMe......................................................................................................................... 26 6.2.1 mátrixizolációs IR vizsgálatok.........................................................................................26 6.2.2 mátrixizolációs VCD vizsgálatok.................................................................................... 28 7. Összegzés....................................................................................................................................... 30 Irodalom............................................................................................................................................. 31
2
1. Bevezetés A fehérjék és peptidek szerkezetének pontos ismerete alapvető fontosságú biológiai funkciójuk megértéséhez. A nagyobb fehérjék szerkezetének teljes megismerése azonban nagy kihívás, amelyhez csak kevés gyakorati módszert hívhatunk segítségül, ilyen a röntgendiffrakció illetve a többdimenziós NMR spektroszkópia, elméleti számításokkal kiegészítve. Ez egy összetett, bonyolult feladat, amelyet leegyszerűsíthetünk, ha nem a teljes fehérjét tekintjük, hanem csak bizonyos részeit, a doméneket. Egy ismert szerkezetű fehérjével való hasonlóságok alapján más, eddig ismeretlen szerkezetű fehérjék térbeli elhelyezkedésének meghatározását lehet megkönnyíteni – amennyiben hasonló domének fordulnak elő az ismert és az ismeretlen fehérjében, úgy joggal feltételezhetjük, hogy bizonyos hasonlóságok lesznek térszerkezetükben is. A szerkezet ismeretében a fehérjék funkcióiról is következtetéseket lehet levonni, illetve a későbbiekben, elegendő számú ismert szerkezetű fehérje esetén akár fordítva is igaz lehet, azaz a funkció alapján bizonyos alapvető meggondolásokat levonhatunk majd a fehérje térszerkezetét illetően. Tovább egyszerűsíthető a feladat, ha a vizsgált molekula legkisebb alkotórészének konformációs viszonyait térképezzük fel, amely alapvetően meghatározza a fehérje szerkezetét. Ezért állnak az érdeklődés középpontjában az ún. modellpeptidek, melyek általában néhány aminosavból álló oligopeptidek két terminálison védett származékai, vagy esetleg maguk az aminosavak. Modellvegyületünket érdemes izolált állapotában vizsgálni, hiszen így kapjuk meg magáról a molekuláról az információt, amelyet még nem bonyolítanak a különböző intermolekuláris kölcsönhatások. További előny, hogy ezeket a méréseket jól össze lehet vetni egyszerű kvantumkémiai számításokkal. Ilyen vizsgálatok például a gázfázisú mérések, illetve az ún. mátrixizolációs (MI) technika használata. Sajnos azonban ez az állapot nem egyezik meg a vizsgált modellvegyület természetes közegével, mint például amilyen az élő sejtben található. Következő lépés tehát az kell legyen, hogy az izolált körülményeket felváltsa egy olyan környezet, amely már jobban hasonlít a biomolekulák természetes közegére. Ilyen környezetet teremthetünk, ha vízzel komplexáljuk a vizsgált vegyületet, hiszen a legtöbb biológiai mátrixnak a víz az alapja. Joggal feltételezhetjük, hogy a víz, mint aktív molekula nagymértékben fogja befolyásolni a molekula konformációs eloszlását. Munkánk célja az volt, hogy két modellpeptid, az N – acetil – N' – metil -
L
- alaninamid
(Ac-L-Ala-NHMe) illetve az N-acetil-L-prolinamid (Ac-L-Pro-NH2) vízzel alkotott komplexét vizsgáljuk mátrixizolációs infravörös (MI-IR), illetve rezgési cirkuláris dikroizmus (MI-VCD) spektroszkópia segítségével. Az így kapott mérési eredményeket összevetve a számolt eredményekkel vizsgálhatjuk a két modellvegyület lehetséges konformereit, és feltárhatjuk ezek eloszlását. Választásunk azért esett erre a két aminosavszármazékra, mert az alanin a legyegyszerűbb királis aminosav, a legkönnyebben értelmezhető spektrummal rendelkezik, és 3
tipikusan előfordul mind α, γ és β szerkezetben, a prolin pedig egy különleges, gyűrűs szerkezű aminosav, amely általában γ szerkezettel rendelkezik. Előzetes várakozásaink szerint spektroszkópiai úton észlelhető a komplexek jelének bizonyos mértékű elolódása az izolált molekuláéhoz képest. Ez pedig információt ad a komplex szerkezetéről, azaz, hogy a molekula mely részéhez kapcsolódott H-kötéssel, és milyen mértékben befolyásolta a vizsgált modellpeptid konformációját a vízmolekula. A spektrumok kiértékeléséhez nélkülözhetetlenek a kvantumkémiai számítások. A dolgozat felépítése röviden a következő: először a modellpeptidek szerkezetvizsgálatának gyakorlati,
illetve
elméleti
lehetőségeinek,
valamint
ezen
modellvegyületek
különböző
kismolekulákkal alkotott komplexeit foglalom össze röviden, különös tekintettel a vízre, mint a biológiai mátrixokban alapvető oldószerre. A komplexek kapcsán a kiralitás transzfer jelensége, a használt vizsgálati módszerek, a mátrixizolációs technika, az infravörös, és a VCD spektroszkópia, a használt kvantumkémiai számolások, a mérések során használt berendezések, és a számoláshoz használt programcsomagok kerülnek megemlítésre. Ezt követi a vizsgált két modellpeptid, az Ac-L-Ala-NHMe, illetve az Ac-L-Pro-NH2 vízzel történő komplexálásának elméleti illetve gyakorlati eredményei, és az ebből levont következtetések ismertetése.
2. Előzmények 2.1 Modellpeptidek szerkezetvizsgálata Az aminosavak megfigyelésének vannak bizonyos nehézségei, ami abból fakad, hogy szilárd állapotban ikerionos állapotban fordulnak elő, ami viszont nem érvényes a polipeptid láncok esetében. Semleges állapotú aminosavak egyik lehetséges megfigyelése a gázfázisban történő vizsgálat1-11, ez azonban csak a legegyszerűbb aminosavak vizsgálatát tette lehetővé (a glicinét, az alaninét és a prolinét), az aminosavak alacsony termális stabilitása miatt. Oldatfázisban történő vizsgálatuknak az szab gátat, hogy poláris oldószerben erős H-kötéseket létesítenek az oldószermolekulával, apoláris oldószerben viszont aggregálódnak, továbbá nagy valószínűséggel nem a természetes állapotában tapasztalható konformációs sajátságait veszi fel. Ha a molekulát izolált körülmények közt szeretnénk megfigyelni, ahol nem befolyásolja a környezet a molekula viselkedését, a mátrixizolációs infravörös spektroszkópiát alkalmazhatjuk. Az első ilyen mérést Greenie és munkatársai végezték el a glicinnel 1970-ben12, ezt számos további mérés követte a glicinre13-16, az alaninra17-19, valinra20, leucinra21, prolinra22,23, szerinre24,25, fenilalaninra26, tirozinra27, triptofánra28 és ciszteinre29. Védett aminosav típusú modellpeptidek alkalmazása esetén jelentkeznek bizonyos nehézségek, például a védőcsoportok miatt az infravörös spektrumuk bonyolultabbá válik. Ezzel szemben
4
számos előnnyel rendelkeznek, például könnyebben szublimálnak, emiatt könnyebb a minta bejuttatása a mérőtérbe, továbbá kevesebb stabil konformerrel rendelkeznek, amelyek beazonosítása is egyszerűbbé válik ezáltal. Legfontosabb, hogy a konformációs sajátságaik inkább hasonlítanak a polipeptidekére, mint az aminosavak esetében. Ezen előnyök miatt számos vizsgálatot végeztek el modellpeptidekekkel30-45.
A
vizsgálat
során,
mint
gyakorlati
módszer,
szóba
jöhet
a
lézerspektroszkópia, amelynek azonban nagy hátránya, hogy kromofórok, főleg aromás csoportok szükségesek a mérésekhez. Ilyenek például az N-terminálist védő benziloxikarbonil-, illetve a fenilalanin, tirozin, vagy triptofán esetében az aromás oldallánc. Az általunk alkalmazott MI-IR spektroszkópia nagy előnye a lézerspektroszkópiával szemben, hogy esetében nincs szükség kromofór csoportokra. Amennyiben nem a glicint vizsgáljuk, hanem valamelyik királis aminosavat, akkor hatékony vizsgálati módszer a VCD spektroszkópia, (l. később), amelyet a módszer megszületését követően szinte azonnal az aminosavak szerkezetének felderítésére is felhasználtak46-52. Utóbbi években előtérbe
került
a
modellpeptidek
vizsgálata.
Az
Ac-L-Ala-NHMe,
illetve
az
Ac-L-Pro-NH2 MI-IR és MI-VCD spektroszkópiás vizsgálata kutatócsoportunk egészen friss eredménye, melynek során ezen vegyületek konformációs eloszlását sikerült felderíteni53,54. Ezen modellvegyületek közül az alanin származékának hat stabil konformere van (növekvő energia szerint:βL, γL, δL, αD, γD, δD), amelyek közül a három legkisebb energiájú fordult elő detektálható mennyiségben az Ar/Kr mátrixban. Az N-acetil-L-prolinamidnak hat konformere van, két γ (γ+, γ−), két α (α+, α−), és két ε (ε+, ε−) szerkezettel rendelkezik. Ezekből kettő jeleit sikerült beazonosítani a VCD spektrumon, a legkisebb energiájú γ+ dominánsan (~99%), a harmadik legkisebb energiájú α+ nyomokban (~1%) volt jelen. A második legkisebb energiájú γfeltételezhetően átalakult γ+ szerkezetbe a mátrixizolációs kísérlet során.
2.2 Aminosavak komplexeinek vizsgálata Az aminosavak más molekulákkal való kölcsönhatásának molekuláris szinten történő megértése nagy fontossággal bír az elő szervezet működésének jobb megismerése okán. Ezek közül is különleges jelentőségű a vízmolekulával létrehozott intermolekuláris kölcsönhatások vizgálata, hiszen minden biológiai folyamat vizes közegben játszódik le. Az elméleti, illetve gyakorlati módszerek fejlődésével lehetőség nyílt arra, hogy a VCD spektroszkópiát hatékony spektroszkópiai eszközként
felhasználhassuk
királis
molekulák
intermolekuláris
kölcsönhatásainak
nyomonkövetésére. Így az infravörös mellett a VCD mérések is unikális információt nyújtanak a vizsgált királis vegyületek, illetve a számunkra különösen fontos aminosavak környezettel való kölcsönhatásáról.
5
A vizsgálatok során egy lehetséges megoldás, hogy inert oldószert használnak, mint pl. diklór-metánt, így a kölcsönhatás az oldószer – oldott anyag esetében gyakran elhanyagolható. Tekintettel kell azonban lenni arra, hogy ezeknél a méréseknél az élő szervezethez képest a vizsgált modellvegyület nem a természetes közegében van, más kölcsönhatások dominálnak, amelyek megváltoztathatják konformációját, a gyengébb oldószer – oldott anyag kölcsönhatás miatt nagyobb arányban fordulhat elő dimerképződés is. A szénhidrátok, aminosavak, peptidek vizsgálata esetében sok segítséget nyújthat a gyakorlatban a mátrixizolációs technikák használata. Aminosavak vizes közegben történt felvétele során figyeltek fel arra, hogy a számítási eredményekkel sokszor nem egyeznek a kapott VCD spektrumok előjelei, de amikor az aminosavat nemesgáz mátrixban vizsgálták, nem tapasztaltak eltérést a mért és a számított spektrum jeleinek előjelei között. Adott volt tehát a feltételezés, hogy a vízmolekula erős kölcsönhatást létesít a vizsgált vegyületekkel, és ezért került a figyelem középpontjába az aminosav és a víz közötti intermolekuláris kölcsönhatás vizsgálata. A mátrixizoláció és a VCD összekapcsolása megadja a lehetőséget erre, azáltal, hogy e technika segítségével elvégezhető és vizsgálható a modellpeptidek vízzel való komplexképződése, amely eredendően megváltoztatja vizsgált aminosavszármazék konformációját, ily módon bepillantást nyerve a peptidek vizes közegben tapasztalható viselkedésébe. Mindemellett a mátrixizolációt alkalmazva, a mért spektrum a számított VCD spektrummal jó egyezést mutat, mivel nincsenek jelen az oldatfázisban tapasztalható, dinamikusan változó hidrogén- illetve egyéb intermolekuláris kötések miatti eltolódások illetve sávszkiszélesedések, amelyek megnehezíthetik, szélsőséges esetben lehetetlenné tehetik a spektrumkiértékelést. A mátrixizoláció alkalmazásával az aminosavak egymás közti kölcsönhatása, így a dimerképződés mértéke is minimalizálható. Az első ilyen irányú elméleti vizsgálatot 1996-ban végezték el, egy alaninszármazék (Ac-L-AlaNHMe) vízzel alkotott komplexét55 illetve a H-kötés a rezgési sávokra gyakorolt hatását tanulmányozták. Egyéb szerves vegyületek esetében56 más komplexképző vegyületekkel is zajlottak vizsgálatok. A további vizsgálatok során57,58 észrevehető volt, hogy a monomer mellett nem csak a komplexált vegyület elnyelései jelennek meg, hanem a víz hajlítási rezgései is (amely jellemzően 1640 cm-1 körül jelenik meg az infravörös spektrumban). Azaz egy alapvetően akirális molekula, mint amilyen a víz is, viselkedhet királisként, azaz adhat jelet a VCD spektrumban, amennyiben egy királis molekulához H-kötéssel kapcsolódik, sőt, attól függően, hogy melyik enantiomerhez, ellentétes előjelű elnyelést mutat. Ezt a jelenséget nevezzük kiralitás transzfernek. A kölcsönhatásmentes állapothoz képest az elnyelési sávok kisebb eltolódást szenvednek, a karboxilcsoport, amelyhez a víz kapcsolódik, a C=O kötés gyengülése miatt jellemzően – öt – nyolc hullámszámmal – kisebb hullámszámértékek felé tolódik el. Ezzel szemben a δ(H-O-H), azaz a víz hajlítási rezgése ugyanilyen mértékben, de ellenkező irányba, azaz a nagyobb hullámszámok felé tolódik el. 6
Célkitűzésünk az volt, hogy az Ac-Pro-NH2 – víz illetve az Ac-Ala-NHMe – víz komplexeket vizsgáljuk. A két modellpeptid vízzel való kölcsönhatását MI-IR és MI-VCD spektroszkópiával eddig még nem vizsgálták.
3. Vizsgálati módszerek 3.1 Mátrixizolációs technika A mátrixizolációs (MI) technika azon az elgondoláson alapszik, miszerint a vizsgálandó anyag molekuláit egymástól elkülönítve, azaz a külső kölcsönhatásoktól, és az esetlegesen lezajló reakcióktól védve vizsgáljuk. Tehát az egyes, izolált specieszek szerkezeti tulajdonságairól 1. ábra: Sematikus rajz egy nemesgázmátrixba zárt anyagról
nyerhetünk információt, amely jól összevethető a kvantummechanikai számításokkal is. Ennek technikai megvalósítása úgy történik, hogy a vizsgált specieszt egy inert és merev mátrixba zárjuk. Amennyiben eléggé „híg” a vizsgált rendszerünk, azaz a specieszek eléggé távol helyezkednek el egymástól a mátrixban, akkor jó közelítéssel feltételezhetjük a közel kölcsönhatásmentes állapotot. Az alkalmazott alacsony hőmérséklet és kölcsönhatásmentes környezet miatt a spektrumok félértékszélessége lecsökken, így azok egyszerűsödhetnek, mivel az esetleges átfedések megszűnnek. A speciesz forgása a mátrixba ágyazva gátolt, így nem jelennek meg a forgási átmenetek az infravörös spektrumban, amely a gázfázisú spektrumokhoz képest egyszerűsödést jelent. A mátrix-speciesz kölcsönhatás miatt a gázfázisú mérésekhez képest eltolódás észlelhető, amely azonban igen kicsiny mértékű (ν/dν = 0.005 nagyságrendben van)59a. A kölcsönhatások hiányának eredménye, hogy a kvantumkémiai úton számolt spektrumokkal jó egyezést kapunk, ez nagymértékben megkönnyíti az asszignációt. Mivel a mátrix inert és gátolt benne a diffúzió, így például reakcióképes gyökök is tanulmányozhatóak benne. Mátrixként általában nemesgázokat alkalmaznak. Ezek előnye, hogy számos spektroszkópiai módszerrel történő vizsgálatot tesznek lehetővé, hiszen széles spektrális tartományban (és infravörös tartományban is) áteresztőek. Amennyiben mátrixként reaktív anyagot használnak (pl. metán, hidrogén, ammónia), akkor tanulmányozható a mátrix és a vizsgált speciesz reakciója is. Az 1. ábra egy nemesgázmátrixba zárt anyag sematikus rajzát mutatja be. A technika gyakorlati alkalmazásánál a legfontosabb szempont a megfelelő hűtés, illetve a kellően alacsony hőmérséklet megvalósítása. Ezt kezdetben, amikor szerves üvegeket használtak (az első ilyen folyadék az EPA volt, amely dietiléter, izopentán, és etilalkohol 5 : 5 : 2 arányú 7
elegyéből állt), folyékony nitrogén biztosította. Ez azonban nemesgázok esetében nem elégséges. Ebben az esetben kriosztátok segítségével érik el a megfelelő hőmérséklet (8 – 10 K). Másik fontos részegység a nagyvákuum-rendszer, amelynek kettős feladata van: a hőszigetelés, illetve megakadályozza, hogy a hidegpontokra a levegő nedvességtartalma kifagyjon. Ehhez 10 -4 mbar, vagy még ennél is alacsonyabb nyomás szükséges, amelyet diffúziós vagy turbómolekuláris szivattyú segítségével érhetünk el. Ilyen körülmények között engedjük rá a hidegpontra a vizsgált anyagot kis koncentrációban (általában 1:1000 – 1:10000 arányban) tartalmazó gázkeveréket. Ez történhet effúziós, jetes, vagy pirolízises mintabeeresztő segítségével. Ügyelni kell, hogy ne legyen túl nagy a beeresztés sebessége, mert ez esetben előfordulhat, hogy a mátrix anyaga lokálisan megolvad. További követelmény, hogy a hidegpont hőmérséklete nem lehet magasabb, mint a mátrixként használt anyag fagyáspontjának fele-harmada. (Ar esetében ez körülbelül 16 – 18 K hőmérsékletet jelent.) Ekkor ugyanis a mátrix nem lesz merev, szerkezete meglazul, és megindulhat a diffúzió, amely esetleg aggregátumok, komplexek nem kívánt képződéséhez vezethet. Adott esetben lehet, hogy pont ez a vizsgálatunk célja, ilyenkor a hőmérséklet megfelelő szabályozásával tarthatjuk kézben az aggregálódást, komplexképződést. A diffúzió megindultával akár reakciók is lejátszódhatnak, ezeket is megfigyelhetjük, ha a mintabeeresztés során a mátrixként használt gáz mellett reagenst is bejuttatunk a rendszerbe, majd melegítéssel beindítjuk a reakciót. Természetesen az is előfordulhat, hogy maga a mátrixalkotó anyag a reagens. Fotokémiai vizsgálatokkal gyökök in situ generálását végezhetjük el a mátrixban levő befagyasztott prekurzorból. A laboratóriumunkban található MI berendezés vázlatos képe a 2. ábrán látható. Fontos még megemlíteni a mátrix képzésével kapcsolatban a különféle szennyezők kérdését. A mátrixként használt nemesgáznak rendkívül tisztának kell lennie, főleg a nedvesség tekintetében, hiszen a víznek számos nemkívánatos hatása van, a komplexek képződésén át például az infravörös spektrumban megjelenő jellegzetes erős abszorbciójáig, amely esetleg zavaró lehet. További tényező az üregeffektus (site-splitting), amely abban nyilvánul meg, hogy a vizsgált speciesz spektrumvonalai felhasadnak. Ennek oka az, hogy a mátrixba zárt anyag molekulái különböző térbeli irányultságot vesznek fel a kristályrácsban, amely különböző energiákat is jelent. A MI technikának számos alkalmazása van, ezek közül néhányat, csak felsorolás szintjén emelnék ki. Konformerek illetve a különböző konformerek egyensúlyi eloszlása vizsgálható. Ez azon a tapasztalaton alapul, hogy az effúziós mintabeeresztés során a leválasztás olyan gyors, hogy az egyensúlyi eloszlás megmarad a konformerek közt. Hőkezeléssel új, az adott hőmérsékletre érvényes konformációs egyensúly áll be, amely nyomon követhető a spektrumvonalak intenzitásváltozásával, ez pedig az egyes konformerek asszignálásában is segít. Ahhoz azonban, hogy mindezt feltételezhessük, teljesülnie kell, hogy a különféle konformerek egymásba alakulásának energiagátja 1 – 2 kJ·mol-1 körüli legyen.
8
2. ábra: A mátrixizolációs berendezés vázlatos képe
Másik alkalmazási terület a gyökök vizsgálata. Alapvetően kétféleképpen juthatunk gyökökhöz: a mátrixban levő anyagot reagáltatjuk vagy fotolizáljuk (in situ módszerek), vagy a mintabeeresztés során előállított gyököt csapdázzuk (trapping). Az így kapott gyökök az inert mátrixban stabilisak, amíg lehetővé nem tesszük a diffúziót, addig szabadon tanulmányozhatóak. Ez semmilyen más ismert módszerrel nem tehető meg. A harmadik terület a különféle molekulakomplexek előállítása, és szerkezetük vizsgálata. Ennek során a két összetevőt együtt választják le, majd hőkezeléssel lehetővé tehető a komplexek kialakulása. A hőkezelés hátránya, hogy a folyamat kevéssé kontrollálható, a kialakult komplexek mellett homodimerek is kialakulhatnak, melyek erősen bonyolíthatják a spektrumot. Mindemellett a hőkezelt mátrix jobban szórja a fényt, amely az alapvonalat befolyásolja, illetve a túlságosan gyors fűtés, vagy visszahűtés esetén a mátrix akár le is válhat, megszűnhet a hőkontaktus a hűtőrendszerrel, így rosszabb esetben akár el is szublimálhat a leválasztott film anyaga. Egy másik lehetséges mód, ha a mintát többféle víztartalmú (például 1:1000, 1:500) mátrixba fagyasztva vizsgáljuk. Ekkor a kifagyasztás során statisztikus arányban egymás mellé kerül a vizsgált molekula és a víz. A vízkoncentráció növelésével a minta és a komplex jelei megkülönböztethetők. A MI technika számos spektroszkópiai módszerrel összeköthető, ezek közül legtöbbször használt az UV-VIS, infravörös (IR), és az ESR spektroszkópia. Csoportunkban újabban a VCD spektroszkópiával történő detektálást is megoldottuk, ezek a mérések világviszonylatban is az elsők közé számítanak53,54. A mátrixizolációs technika gyakorlatáról többet az Andrews és Moskovits által írt monográfiában lehet olvasni60. 9
3.2 Infravörös spektroszkópia Az infravörös spektroszkópia hosszú idők óta használatos rutin módszer a szerves vegyületek szerkezetkutatásában. Nagy előnyei közé tartozik a karakterisztikus kötési, és csoportfrekvenciák jelenléte, azaz, hogy bizonyos funkciós csoportok kisebb-nagyobb eltérésekkel mindig ugyanazon hullámszámtartományban nyelik el az infravörös sugárzást. Legismertebb példa erre a karbonil csoport, amely 1700 cm-1 környékén ad intenzív jelet, az ettől való eltérések pedig a csoport környezetéről adnak információt – például, hogy létesít-e H-kötést ez a csoport. Az infravörös spektrométerek kezdetben diszperziós felépítéssel működtek, amelyben egy monokromátor állította elő a monokromatikus sugárzást, manapság ezt kiszorították a fourier-transzformációs (FT-IR) készülékek, amelyek jobb jel-zaj viszonyt, gyorsabb mérést és jobb felbontást eredményeznek. A számunkra érdekes aminosavak és modellpeptidek vizsgálatában is hasznos módszer az infravörös spektroszkópia. A spektrumban könnyen azonosítható az NH2-csoport nyújtási rezgése (3400-3200 cm-1 körül), az amid-I (amely a karbonil nyújtási és az NH 2 hajlítási rezgésének csatolásából jön létre) és amid-II sávok (amely az NH2 hajlítási és a C-N nyújtási hibridrezgéséből származik). Előbbi 1650, utóbbi 1550 cm-1 körül mutat erős elnyelést. Amennyiben kvantumkémiai számításokat végzünk, a spektrum asszignáció gyorsabban és nagyobb biztonsággal elvégezhető, mindemellett a rendszerben előforduló konformerek geometriájáról is információt nyerhetünk.
3.3 VCD spektroszkópia: A
legtöbb,
számunkra
biológiai
szempontból érdekes anyag királis, azaz két, egymással tükörképi viszonyban levő, ún. enantiomer
formában
létezhet.
Az
entantiomerek egymástól eltérő hatása az élő szervezetekre egy tragikus esemény miatt az 1960-as évek óta jól ismert (l. Contergan eset), ezért fontos, hogy rendelkezésünkre 3. ábra: egy VCD mérőberendezés vázlatos rajza
álljon egy módszer, amellyel sikerrel meg tudjuk különböztetni egymástól az enantiomereket. Sokáig egyetlen módszert ismertek, ez pedig a röntgensugarak anomális szórásán alapuló mérés volt61. A módszer egyik nagy hátránya, hogy tökéletes egykristályokat igényel, ami éppen a makromolekulák esetében eléggé nehezen kivitelezhető feladat.
10
Egy másik lehetséges megoldás az abszolút konfiguráció meghatározásának problémájára a cirkuláris dikroizmus (circular dichroism, CD) spektroszkópia, amelyről magyar nyelven is megjelent néhány éve egy összefoglaló könyv62. A CD hátrányai közé tartozik, hogy a vizsgálandó molekulának kell tartalmaznia egy kromofór csoportot, például C=O, vagy C=C kötéseket. Sok esetben bizonytalan eredményet ad, mivel az alkalmazott UV-VIS tartományban széles elnyelési sávok vannak, amelyek egymással akár át is fedhetnek, bonyolítva a spektrumot. Továbbá a CD spektrumok számítása bonyolult, az alapállapot mellett az molekula gerjesztett elektronállapotát is figyelembe kell venni, ami nehezíti a kiértékelést. Ezzel szemben a VCD (vibrational circular dichroism) módszerénél kevésbé lépnek fel az előbb említett hátrányok. A rezgési spektrumokban sokkal ritkábbak a széles sávok, így kevesebb az átfedés, továbbá az átmenetek száma jóval nagyobb, mint az UV-VIS mérések esetében. A CD-hez hasonlóan ugyanúgy rendelkezik előjellel a kapott spektrum, ez viszont többletinfomációt jelent a klasszikus rezgési spektroszkópiákhoz képest. További előny, hogy a VCD spektrumok igen könnyen, és pontosan számolhatóak. Ez megkönnyíti a helyes asszignációt, illetve az abszolút konfiguráció meghatározását. Ez utóbbinál egyetlen dolgunk a számolt spektrum összevetése a mérttel, amennyiben azonosak, úgy valószínűleg ugyanarról az enantiomerről van szó, amennyiben tükörképei egymásnak, úgy a másikról. A módszer fő technikai nehézsége, hogy a kapott jelek gyengébbek, mint az optikai tartományban, de a jel/zaj viszony a készülékek érzékenységének fejlődésével egyre jobbá válik. A VCD spektroszkópia tulajdonképpen nem más, mint CD spektroszkópia az infravörös tartományban, azaz a jobbra- illetve balra cirkulárisan polarizált fény abszorbciójának különbségspektumát vesszük fel. ∆A(ν) = AL(ν) – AR(ν) A technikához elengedhetetlen cirkulárisan polarizált fényt egy fotoelasztikus modulátornak (PEM) nevezett egység állítja elő (részletes leírását l. itt59b). Az infravörös sugárforrásból kilépő, interferométeren áthaladó, nem polarizált sugarak hullámhosszát először egy optikai szűrő a kívánt spektrumtartományra korlátozza (a jobb jel-zaj viszony érdekében), majd egy polarizációs szűrő (általában KRS-5 hordozón igen finom rétegben felvitt fémrács) vízszintesen polarizálja a bejövő sugarakat. A kilépő polarizált fényből állítja elő a PEM (amely általában ZnSe kristály) a cirkulárisan polarizált fényt, ezután a modulátorral szinkronizált lock-in erősítő következik. Érdemes megemlíteni, hogy a PEM elvileg csak egyetlen hullámhosszra állít elő tökéletesen cirkulárisan polarizált fényt, erre a hullámhosszra kell kalibrálni a műszert, és ezt a kalibrációt mindig újra el kell végezni, amennyiben egy másik hullámszám-tartományra vagyunk kíváncsiak. Egy VCD berendezés vázlatos rajzát a 3. ábra mutatja be. A technika eléggé fiatalnak mondható, az első VCD spektrumot 1973-ban vette fel Holzwarth és Hsu63, amelyet követett néhány további kezdeti alkalmazás64,65. Az első FT-IR VCD spektrumot 11
Nafie és munkatársai vették fel 1979-ben66. A már tárgyalt mátrixizolációs technikával először 1986-ban kapcsolták össze67, amelynek során α-pinént vizsgáltak N2 mátrixban. Kereskedelmi forgalomba először az 1990-es évek végén kerültek rutin mérések elvégzésére alkalmas VCD berendezések. A VCD spektroszkópia fő alkalmazási területei az enantiomertisztaság, illetve a már említett abszolút konfiguráció meghatározása, aminosavak, peptidek és fehérjék konformációs sajátságait is vizsgálták46-52 Nem csak az IR, hanem a Raman méréseknek is van megfelelő CD spektroszkópiája, ez utóbbit Raman optikai aktivitásnak nevezik (Raman Optical Activity, ROA). Felhasználási területe ugyanaz, mint a VCD-nél, nagy előnye azzal szemben, hogy lehetővé tesz rutin méréseket vizes közegben is. Az első rutin célra felhasználható ROA-spektrométerek az évezred elején kerültek kereskedelmi forgalomba.
3.4 Kvantumkémiai számítások Közepes méretű molekulák geometriájának, illetve spektrális tulajdonságainak számolásánál gyakran használt a sűrűségfunkcionál elmélet (DFT). A B3LYP funkcionál egyszerű molekulák esetén a mérési eredmények kiértékelése szempontjából közel olyan jó eredményeket ad, mint az elektronkorrelációs módszerek esetén, de az utóbbiak sokkal időigényesebb módszerek. Laboratóriumunkban korábban a vizsgált modellpeptidek monomerjeinek spektrumára történtek számítások53,54, amelyek összhangban voltak a kísérleti adatokkal. Amennyiben a számítások által kapott eredményeket megfelelő módszerrel skálázzuk, még jobb eredménnyel kapjuk meg a kísérleti spektrumot. A skálázás legegyszerűbb módja, ha egységes skálázást alkalmazunk, azaz az összes kapott frekvenciát ugyanazzal az értékkel szorozzuk. Ez a faktor természetesen módszer- és bázisfüggő, értéke leggyakrabban 0,90 - 0,99 között van. A következő mód, ha a faktort nem csak a számítás módja, és a használt bázis határozza meg, hanem az adott kötés típusa is. Egy ilyen skálázási módszer az SQM (Scaled Quantum Mechanical)68,69 amely a Hess-mátrixokat skálázza belső koordinátákban, a következőképpen: FiiSQM = fii Fii FijSQM = √fiifi Fii ahol Fii és Fij a Hess-mátrix diagonális, illetve offdiagonális elemei, FiiSQM és FijSQM a skálázott értékek, fii és fij a skálafaktorok. Ez utóbbi módszer előnye, hogy nem csak a frekvenciákon, hanem az intenzitásokon is javít. VCD spektrumok számolásához legalább B3LYP hibrid funkcionált használva 6-31G* bázis szükséges, ennél alacsonyabb szintű számolások nem adnak kielégítő eredményt. A spektrumokhoz 12
rotátorerősségeket kell számolni a következő képlet segítségével: R01n = =ħ /2 (∂µ / ∂Qn )0 (∂m / ∂Pn)0, ahol R01n az n-edik normálmód rotátorerőssége, µ a dipólus, m a mágneses momentum, Qn az n-edik
normálkoordináta,
Pn
impulzusként
kifejezett,
n-edik
normálmódnak
megfelelő
magsebesség.
4. Gyakorlati részletek 4.1 Infravörös, és VCD mérések Az MI-VCD mérésekhez Bruker Equinox FT-IR spektrométer állt rendelkezésre, kiegészítve egy PMA37 VCD modullal, a jelek detektálásához MCT (mercury-cadmium-telluride, higanykadmium-tellurid) detektorral felszerelve. A cirkulárisan polarizált fény egy KRS5 polarizációs szűrő, és egy ZnSe fotoelasztikus modulátor segítségével állítható elő. Kalibrációhoz egy dikroikus CdS kristály használható. Az MI-VCD mérések 6-14 órán keresztül zajlottak, 2 cm-1-es felbontással. Oldatfázisú mérések során 1 mm fix vastagságú folyadékküvettában mértük a minta diklór-metános, 2 mg / dm-3 koncentrációjú oldatát.
4.2 A mátrix leválasztása Mind az Ac-Ala-NHMe, illetve az Ac-Pro-NH2 (tisztaságuk >99%) Bachem termék, melyek további tisztítására nem került sor, vízmentes mérések során a mintákat előzetesen 65°C-on 3 órán keresztül vákuumbepárlásnak vetettük alá. A mintákat a mérések során egy átalakított effúziós Knudsen-cella segítségével juttatuk be a mérőtérbe, 65°C-os hőmérsékletet alkalmazva, amely a lehető leggyorsabb beeresztési sebességet tette lehetővé anélkül, hogy a dimerizáció nagyobb mértékben végbement, és megjelent volna a spektrumban. Mátrixképző gázként argont használtunk (Messer, 99,996% tisztaságú). A minta és a nemesgáz keverékének leválasztása egy 8 K hőmérsékletűre lehűtött CsI ablakra történt az FT-IR, KBr-ra a VCD mérések során. Az ablak egy Janis CCS-350R hidegpontra volt erősítve, a kettő közti megfelelő hőkontaktust indium fólia szolgáltatta. A hidegpontot egy kétkörös CTI Cryogenics 22 típusú kriosztát hűtötte. A mérések során a mérőfejben – az artifaktumok minimalizálása céljából – a KBr ablak merőleges volt a fényútra, illetve a mérőfej elforgatása után a mintabeeresztés irányára. Ennek ára az, hogy a minta leválasztása illetve a mérések egyszerre nem végezhetőek el. A leválasztás ideje 3-4 óra az FT-IR esetében (a legintenzívebb elnyelésre A ≈ 0,3), 5-7 óra a VCD méréseknél (A ≈ 1 a legintenzívebb elnyelésre). A mátrix leválasztását követően, a hőkezelés során 1 – 2 K közökkel emeltük a hőmérsékletet, ezek közt végeztünk méréseket, 8 K-től egészen 30 K-ig. A hőkezelés során a mintában végbemenő változások MI-IR-rel jól követhetőek voltak. MI-VCD-vel kevésbé, mivel a 13
mátrix a hőkezelés után sokkal jobban szórta a fényt, amire a technika eléggé érzékeny. A mintát többféle víztartalmú (1:1000, illetve 1:500 arányban) mátrixban vizsgáltuk. A víztartalom növelésével a komplexek koncentrációja is növekedett.
4.3 Számolások háttere Az Ac-Ala-NHMe α- illetve β, valamint az Ac-Pro-NH2 γ−konfomerének geometriáját B3LYP /6-31+G** (Becke, Lee, Yang and Parr által elsőként használt, és nevük kezdőbetűiről elnevezett) bázison optimalizáltuk. A harmonikus rezgési frekvenciák, infravörös intenzitások, illetve rotátorerősségek számolása B3LYP /6-31G** bázison történt, skálázáshoz SQM erőtér került felhasználásra, amelynek skálafaktorait Baker és munktársai határozták meg69. A számolások a PQS (Parallel Quantum Solutions) 3.2 program70 hajtotta végre. A komplexek számítása során a monomer
molekula
lehetséges
kötőhelyeihez
irányultsággal.
14
tettünk
egy-egy
vízmolekulát
különböző
5. Számolási eredmények 5.1 Ac-L-Pro-NH2 A számítás végeredményeként kapott komplexek a 4. ábrán láthatóak.
1
4
7
2
5
3
6
8
15
9
10
11
4. ábra: az Ac-Pro-NH2 vízzel alkotott komplexei.
Látható, hogy alapvetően kétféle szerkezettel rendelkeznek a komplexek. Az egyik, amikor intramolekuláris hidrogénkötés jön létre, amely egy gyűrűs szerkezetet eredményez. A kötést az Ac-Pro-NH2 amidcsoportjának hidrogénje hozza létre az N-terminális karbonilcsoport oxigénjével. Ezen a csoporton belül is megkülönböztethető még három típus, aszerint, hogy a vízmolekula a monomer mely részletéhez kapcsolódik. Ez a három típus a következő: Az 1, illetve az 2 komplexnél a víz a modellpeptid C-terminális karbonilcsoport oxigénatomjához a hidrogénjével létesít kötést, a kettő közti különbséget a (C=)O-H(H2O)-O(H2O)-H'(H2O) torziós szög jelenti. Az 3-nál a monomer C-terminális karbonilcsoport oxigénatomjához a víz a hidrogénjével, amidcsoportjához oxigénjével kapcsolódik, így ott egy gyűrűs rendszer jön létre. Az 4 hasonló az 3hoz, de azzal összehasonlítva a már említett torziós szög kb. 180 fokkal eltér. Az 5, 6, 7 és 8 esetén a modellvegyület N-terminális karbonilcsoportjához a víz az oxigénjével kötődik, de a vízmolekula elhelyezkedése (az amidcsoport felé, vagy azzal ellentétesen irányul) illetve a torziós szög is kétféle lehet. A másik csoportnak két tagja van, az 9, a 10 és a 11. Ezek esetében a komplexek első csoportját meghatározó intermolekuláris H-kötés nincs jelen. A vízmolekula ugyanis az amidcsoport hidrogénjével az oxigénmolekuláján, az N-terminális karbonilcsoportjának oxigénatomjával a hidrogénjén át létesít hidrogénkötést, mintegy beékelődve az intramolekuláris hidrogénkötésbe felbontja azt, és létrejön egy nagyobb tagszámú gyűrű, intermolekuláris H-kötést létesítve. A számolt energiákat az 1. táblázatban foglaltuk össze: 1. táblázat: A komplexek számolt energiái kJ·mol-1-ban. E0 = -580,706 kJ*mol-1
konformer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -1 ∆E0 / kJ·mol 2,53 2,41 0,00 0,16 1,69 0,16 2,60 3,54 0,70 0,21 0,93
Észrevehető, hogy a konformerek energiái közt nincs jelentős különbség. Joggal várhatjuk tehát, hogy mindegyik jelen lehet a mátrixban, és a spektrumban is észlelhető jelet adhat. A számolt eredményekből (l. 2. táblázat) bizonyos tendenciák figyelhetőek meg, ezek a következők voltak. A komplexált víz OH nyújtási rezgéseinek frekvenciái minden esetben a vízre,
16
mint önálló molekulára kapott értékek alatt vannak, ez érthető is a kialakult H-kötések tudatában. Az eltolódás mértéke elég nagy (az aszimmetrikus nyújtásra is néhány tíz cm-1). A komplexált víz hajlítási rezgése ezzel szemben minden esetben magasabb hullámszámok felé tolódik el a szabad molekulához képest ez a hidrogénkötések létrejöttére utal. Az amidcsoportnál ez az eltolódás nem olyan egyértelmű, annak ellenére, hogy hidrogénkötés kialakításában minden esetben részt vesz, nem minden esetben adnak a számítások kisebb hullámszámértékek felé történő eltolódást. Az 3, 4, 10 illetve a 11 komplex esetében a szerkezet jól összeegyeztethető a negatív eltolódásokkal. Az amid-I sáv esetében az C-terminális karbonilcsoport eltolódása az 1, 2, 3, 4 komplexnél megint csak kisebb hullámszámok felé mutat, a vízzel történő H-kötés kialakítása miatt. Ugyanezen okból hasonló az N-terminális amid-I sávjának eltolódása az 5, 6, 7, 8-nál. Ebben az esetben a Cterminális karbonilcsoportjának frekvenciája gyakorlatilag nem változik a szabad molekulához képest, ez érthető is, hiszen nem vesz részt semmilyen kölcsönhatásban. Az első négy komplexnél kicsiny eltolódás észlelhető negatív irányba,
amely az intermolekuláris hidrogénkötés
következtében jön létre. A 10, 11 esetében a vízzel H-kötést létesítő N-terminális amidcsoport amid-I sávja kis eltolódást mutat kisebb frekvenciák felé, míg a másik karbonilcsoport változatlan a szabad monomeréhez képest, újfent a kölcsönhatások hiánya okán.
17
18
19
5.2 Ac-L-Ala-NHMe A számítás során kapott négy komplexet lásd az 5. ábrán.
1
2
3
4
5. ábra: az AcAlaNHMe komplexei
A modellpeptid – víz komplex egy β illetve három γ szerkezettel rendelkezik. A β szerkezet esetén (3) a vízmolekula hidrogénjével a modellvegyület N-terminális karbonilcsoportjának oxigénatomjához kapcsolódik. A γ szerkettel rendelkező komplexeknél az első a víz egyik hidrogénjével esetben az N-terminális karbonilcsoport oxigénjéhez, oxigénjével pedig a Cterminális amidcsoportjának hidrogénjéhez köt (1). Lehetséges, hogy a C-terminális karbonilcsoport oxigénjével hidrogénjén keresztül, az N-terminális amidcsoport hidrogénjéhez oxigénjén kereszül létesít hidrogénkötést. Aszerint, hogy a C(O)-H(H2O)-O(H2O)-H'(H2O) torziós szög mekkora értéket vesz fel, megkülönböztethető két konformer, ahol a két torziós szög különbsége 180° (2 ill. 4). A konformerek energiaértékeit a 4. táblázat foglalja össze. 4. táblázat: Az Ac-Ala-NHMe – víz komplexek energiái kJ·mol-1-ban
konformer ∆E0 / kJ·mol-1
1
2
3
4
1,44
2,70
0,00
2,10
Látható, hogy a legalacsonyabb energiájú a β szerkezettel rendelkező konfomer, de a γ szerkezetű komplexek is jelen lehetnek a spektrumban az számítások alapján.
20
A számolt frekvenciákat a 4. táblázat tartalmazza (l. 16. oldal). Itt is megfigyelhető néhány tendencia. A C-terminális Amid-I sávja a 2, 4 komplexnél kisebb hullámszámoknál található meg, mint a monomernél, ez H-kötések létrejöttére utal. Az N-terminális karbonilcsoport amid-I sávja az 3 komplex esetén tolódik el elég egyértelműen kisebb frekvenciák felé (de a többi komplexnél is észlelhető a jelenség), ez is az hozzákapcsolódó vízmolekula miatt figyelhető meg. A komplexált víz hajlítási rezgésének magasabb frekvenciák felé való eltolódása is az intramolekuláris hidrogénkötések kialakulására utal.
6. Gyakorlati eredmények Az oldatfázisban történő előzetes méréseket követően került sor a mátrixizolációs mérésekre. A mátrix leválasztása az amid-I és amid-II sáv vizsgálata esetén 3 – 4, az amid-A sáv vizsgálatakor 5 – 6 órát vett igénybe. A VCD mérések 6-14 órán keresztül zajlottak. A mérések során felvételre került a vízmentes modellvegyület, majd a víztartalmú mátrixok is 1 : 1000, illetve 1 : 500 víz – argon arányt alkalmazva. Utóbbinál a komplexképződést elősegítendő hőkezelést is véghezvittünk, amelyet követkően ugyancsak spektrumfelvétel készült. A gyakorlati eredmények ismertetésénél csak a vízmentes, az 1 : 500 hígítású, illetve a hőkezelt mátrixról készült spektrumot közöljük.
6.1 AcProNH2 6.1.1 mátrixizolációs IR vizsgálatok A monomerhez illetve a vízhez tartoznak a legnagyobb abszorbciók a mátrixban. Az elnyeléseik az 1. táblázatban találhatók meg. Általánosságban elmondható, hogy a A
monomer spektrumához képest a képződött AcProNH2
–
víz
komplexek
kisebb-
nagyobb eltolódást szenvednek a H-kötés kialakulásának helye, és erőssége szerint. A spektrumokból látható, hogy az amid-I 1750
1725
1700
1675
1650
ν / cm
1625
1600
1575
1550
-1
sávok általában kisebb, ezzel ellentétben a víz hajlítási rezgése a nagyobb frekvenciák
5. ábra: Az AcProNH2 IR spektruma az 1550 – 1750 cm-1 tartományban Az ábrán három felvétel van megjelenítve. Legalul a vízmentes AcProNH 2, felette a vizet tartalmazó komplex (Ar : víz arány 500 :1-hez), legfelül pedig a hőkezelés utáni komplex spektruma látható.
21
felé tolódik el. Ezek okai a kialakult hidrogénkötések, ezt láthattuk már az elméleti számítások
végeredményeinél
is.
A
felső
hullámszám tartományban is megfigyelhető a A
tendencia,
miszerint
a
nyújtási
rezgések
erőssége – így frekvenciája is – általában csökken a kialakuló intermolekuláris H-kötés miatt. Sorba véve a különböző rezgéseket, a számítások 3550 3525 3500 3475 3450 3425 3400 3375 3350 3325 3300 3275 3250 3225 -1
ν / cm
során
végeredményként
kapott
komplexekből többet is azonosítani lehet. Az asszignációhoz felhasznált számítási
6.ábra: Az AcProNH2 IR spektruma a 3250 – 3550 cm tartományban -1
Az ábrán három felvétel van megjelenítve. Legalul a vízmentes AcProNH 2, felette a vizet tartalmazó komplex (Ar : víz arány 500 :1-hez), legfelül pedig a hőkezelés utáni komplex spektruma látható.
eredményekért l. az 1. táblázatot. Az amid-I tartományban a monomer 1716 cm-1-nél található csúcsa mellett megfigyelhető 1738 cm-1-nél egy csúcs, ez egyik, a számítások során figyelembe vett komplexhez sem köthető, a legközelebbi elnyelése a számítások szerint az 5, és 8 komplexnek van, 1722, illetve 1723 cm-1-nél. Valószínűbb azonban, hogy ezek, csakúgy mint a 6, 7, 9, 10 és 11 komplexek (a számítások szerint 1720, 1719, 1717, 1715 és 1711 cm -1-nél adnak jelet), beleolvadnak a monomer csúcsába, kiszélesedést okozva. 1673 cm-1-nél található egy csúcs, amely egyetlen figyelembe vett komplex jelenlétével sem magyarázható, valószínűleg egy, a számítások során eddig meg nem határozott komplex jelenléte okozza ezt az elnyelést. Az N-terminális karbonilcsoport elnyelése 1654 cm -1-nél van, emellett észrevehető a csúcs jelentős kiszélesedése, amely komplexek jelenlétének tudható be. A számítások eredményei megerősítik ezt a feltételezést, ezek alapján az 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11 komplexek mind néhány cm-1-es eltéréssel adnak csúcsot a monomerhez képest. Az 5, 6, 7, 8 jele a számolási eredmények alapján pedig a víz hajlítási rezgésének csúcsába olvad bele (csúcsaik 1623 - 1626 cm1
-nél vannak). A 9 a számítások szerint 1642 cm-1-nél ad jelet, a kísérleti spektrumban egy széles
abszorbióban nyilvánul meg kb. 1638 cm-1-es középponttal, ez több kompex jelének összeolvadásából származhat. A víz elnyelése 1624 cm-1-nél található, a komplexált vízé a számítások szerint a legtöbb komplex esetén beleolvad az N-terminális amid-I sávjába (1648 – 1658 cm-1-ig találhatók az elnyelései a komplexált víznek). Ez alól kivétel a 2 komplex, amelynek a számított 1641 cm-1-es értéke elég közel van a kísérleti spektrum előbb említett 1638 cm-1-nél található széles abszorpciójához. Az amid-II sáv elnyelése a monomer esetén 1578 cm-1-nél van, a legtöbb számítás során kapott 22
komplexnél nem nagyon tér el ettől. Kivételt az 9, 10 illetve a 11 komplex jelent, melyek számított elnyelése 1633, 1624, illetve 1620 cm-1-nél van. Az első tehát – a már többször említett – 1638 cm 1
-es széles elnyelési sávban van, utóbbi kettőé pedig beleolvad a víz elnyelésébe. A tartományban
található 1612, 1608, 1593, 1590, és 1583 cm-1-nél is elnyelés, ezek egyértelműen komplexekhez tartoznak, mert a víz koncentrációjának növekedésével az intenzitások is növekednek (l. 6. ábra). Egyik számított komplex sem rendelhető azonban hozzá ezekhez a csúcsokhoz. Egyedül a 2 komplex számított 1587 cm-1-es csúcsa rendelhető az 1590 cm-1-es elnyeléshez. Mindenképpen további számításokat kell végezni, hogy az ezekhez a jelekhez tartozó komplexeket azonosítani tudjuk. A felső frekvenciatartományban felvett spektrumban a víz O – H nyújtási rezgései nem láthatók, mivel ennél magasabb tartományban van a csúcsuk. Az amid-A sávok megfigyelhetők 3502 illetve 3313 cm-1-nél. Előbbibe a számítások alapján beleolvadnak a 2, 5, 6, 8 komplexek. A számított értékek alapján oldalsávként megjelennek a 9, 10, 11 komplexek is 3475 cm-1 környékén. Észlelhető egy jel 3446 cm-1-nél is, ez a számítások alapján az 3, 4 komplexekhez rendelhető hozzá. Néhány csúcshoz nem sikerült a hozzátartozó komplexet azonosítani, ezek 3455, 3450, 3430, 3395, illetve 3373 cm-1-nél vannak. Található még komplexekhez tartozó abszorbció 3288, 3227, illetve 3144 cm-1-nél is. Az első a 2-é (számított érték: 3289 cm-1), a második és a harmadik elnyelést nem sikerült asszignálni. Összefoglalva az infravörös spektrumok alapján levonható következtetéseket, két komplexet lehet azonosítani a spektrum amid-I és amid-II tartományában, az 2-t és az 9-et, néhány, csak rájuk jellemző elnyelési frekvencia segítségével. A többi komplex jelei azonban a számítások alapján általában nem adnak önálló jeleket, nehezen különíthetőek el a nagyobb csúcsokétől, esetleg oldalsávként észlelhetők. Az amid-A tartományban a 2 jele 3289 cm-1-nél jól azonosítható, illetve az 9-é 3220-cm-1-nél is jól elkülönül a többi jeltől, utóbbi komplexnek ráadásul a másik jele is észlelhető ebben a tartományban (3476 cm-1 a számítások szerint). A többi komplex jelenlétét nem sikerült egyértelműen azonosítani.
6.1.2 mátrixizolációs VCD vizsgálatok Az alsó frekvenciatartományban az 1715 cm-1-nél található negatív csúcs a monomeré. Ez, amint látszik is a 7. ábrán, a víz koncentrációjának növekedésével eltűnik, és egy pozitív csúcs jelenik meg helyette. Ez a komplexek képződésének köszönhető. A számítások alapján az 5 illetve a 6 komplexek VCD jele pozitív 1719 illetve 1720 cm-1-nél. Valószínűsíthető, hogy ezeken kívül létezik több olyan komplex is, amely szerepet játszik ennek a csúcsnak a létrehozásában, de az
23
1650
1600
1550
1700
1650
1600
1550
1700
1650
1600
1550
3500 3450 3400 3350 3300 3250
∆A
∆A
1700
3500 3450 3400 3350 3300 3250
3500 3450 3400 3350 3300 3250
ν / cm-1
-1
ν / cm
7. ábra: az AcProNH2 spektruma 1550 – 1750 cm-1
8. ábra: AcProNH2 spektruma a 3050 – 3550 cm-1
között
között
Egy ábrán három felvétel van megjelenítve. Legalul a vízmentes AcProNH 2, felette a vizet tartalmazó komplex (Ar : víz arány 500 :1-hez), legfelül pedig a hőkezelés utáni komplex spektruma látható.
eddigi számítások során nem sikerült ezeket a komplexeket meghatározni. A többi komplex 1685 – 1689 cm-1 között, illetve az 2 1693 cm-1-nél negatív jelet ad, ez utóbbi látható is a spektrumban.Az N-terminális amid-I sávja erős negatív jelet ad 1654 cm-1-nél, amelynek a komplexképződés hatására egy oldalsávja jelenik meg. A számítások alapján az 1, 3, 4, 11 komplexek azok, amelyek ilyen hullámszám körül negatív VCD jelet adnak. Megjelenik egy negatív csúcs 1645 cm-1-nél, ez a 2 számított értékéhez áll közel. Található egy negatív csúcs 1623 cm-1-nél is, ez a számításk alapján az 5, 8 komplexé lehet, amelyek jelét az IR spektrummal ellentétben nem fedi el a VCD inaktív szabad víz. A komplexált víz hajlítási rezgései általában egybeesnek az N-terminális amid-I sávjának rezgéseivel, kivéve a 2, 7, 10 komplexét. Ezek 1645 cm-1 környékén adnak jelet a számítások szerint. Található egy negatív váll 1658 cm-1-nél, ez hozzárendelhető az 9 komplexált vizének rezgéséhez is. Azaz a jelek szerint sikerült a kiralitás transzfer jelenségét kimutatni. 1608 cm-1-nél található egy pozitív csúcs, ez egyetlen, a számítások során kapott komplexek rezgéséhez nem köthető. Az 1590 cm-1-nél található pozitív csúcsot az IR spektrumok értékelésénél a 2 komplexnek tulajdonítottuk, ezt a VCD spektrum is alátámasztja. Az amid-A tartományban észlelhető, hogy a monomer 3502 cm-1-nél levő pozitív csúcsa kiszélesedett, és körülbelül 3518, illetve 3498 cm-1-nél találhatóak benne kisebb elnyelések, amelyek ugyancsak pozitív jelet adnak a VCD spektrumban. Az előbbi csúcs előjele alapján hozzárendelhető az 5 komplexhez, utóbbi pedig 6-hoz. A monomer 3313 cm-1-nél levő csúcsa a VCD spektrumban nem látható. 3315 cm-1 környékén a hőkezelés hatására pozitív csúcs jött létre, azaz ez csak komplexé lehet. Azonban sem ez, sem pedig 3285 cm -1 környékén negatív jel nem egyeztethető össze a számított eredményekkel (a 2 számított értéke 3289 cm-1, de pozitív jel). Ebben 24
az esetben is számolnunk kell olyan komplexek jelenlétével, amelyek az eddigi számítások során nem jöttek ki végeredményként. Az 5. táblázat a kísérleti eredményeket összegzi. ν / cm-1 3518 3498 3475 3455 3450 3446 3430 3395 3373 3315 3288 3227 3220 3144 1738 1716 1693 1673 1658 1638 1623 1608 1587
VCD előjel + + n.a. + + n.a. + n.a. n.a. n.a. + + + +
asszignáció 5, amid-A ? 8, amid-A ? 9, amid-A n.a. n.a. 3,4, amid-A ? n.a. n.a. n.a. n.a. 2, amid-A n.a. 9, amid-A n.a. n.a. n.a. 2, amid-I n.a. 9, β(HOH) 2,9, amid-I 5,8? n.a. 2, amid-II
5. táblázat: Az Ac-Pro-NH2 kísérleti eredményei. A VCD előjelek megadásánál az n.a. azt mutatja, hogy az előjelet nem sikerült leolvasni. Az asszignációnál az n.a. a sikertelen asszignációt jelenti.
6.2 Ac-Ala-NHMe Az Ac-Ala-NHMe esetében csak az amid-I és amid-II sáv frekvenciatartományában történtek mérések, az amid-A rezgések tartományában nem, a monomer a VCD spektrumban ugyanis kis intenzitású jeleket adott, így a komplexek ennél sokkal kisebb intenzitású csúcsai a zajtól nem különböztethetők meg. A mérések az Ac-Pro-NH2-éhez hasonlóan történtek. A vízmentes spektrum mellett egy 1 : 500 víz – argon arányú minta is felvételre került, illetve ennek hőkezelése után újabb mérés zajlott le.
6.2.1 mátrixizolációs IR vizsgálatok A felvett MI-IR spektrumot a 9. ábra tartalmazza. Az asszignáció során két konformert sikerült egyértelműen azonosítani. Az 1704 cm-1-nél található monomer C-terminális amid-I elnyelésének van egy oldalsávja, ahol a számítások alapján az 1 illetve az 3 konformer elnyelése található (1691 illetve 1701 cm-1 a számítások szerint). A következő két nagy csúcs a γ illetve a β szerkezetű monomer N-terminális amid-I sávja (l. 2. táblázat), amelynek ugyancsak van oldalsávja, ez az 1 konformer számított értékéhez áll igen közel (1675 cm-1). Az 1665 cm-1-nél levő sáv az 3 konformer 25
elméleti úton kapott amid-I, és a komplexált víz rezgésének sávjához (1661 illetve 1663 cm-1) illetve az 1655 cm-1-nél látható kisebb csúcs pedig az 1 konfomer, a számítások szerint 1651 cm-1 értékéhez van közel, amely a komplexált víz hajlítási rezgésének elnyelése. Megjegyzendő, A
hogy a komplexált víz rezgésére a kapott értékek közel azonosak minden komplex esetén, tehát az IR spektrum alapján nem dönthető el, hogy ez a jel melyik komplexhez tartozik. Azonban, mint később látni fogjuk, a VCD spekrum alapján ez 1700
1675
1650
1625
1600
1575
1550
1525
1500
eldönthető. 1625 cm-1 környékén jól látható a
-1
ν / cm
szabad víz elnyelése, a jel intenzitása 9. ábra: AcAlaNHMe infravörös spektruma az 1750 – 1550 cm-1-ig terjedő tartományban Az ábrán három felvétel van megjelenítve. Legalul a vízmentes AcAlaNHMe, felette a vizet tartalmazó komplex (Ar : víz arány 500 :1-hez), legfelül pedig a hőkezelés utáni komplex spektruma látható.
nagymértékben változik a víz koncentrációjával. A „vízmentes” mintában is észlelhető igen kicsiny mennyiségben, a kis koncentrációjú vízszennyezés miatt. Legnagyobb elnyelés az 1 : 500 hígítású mintában látható, a hőkezelt mintában ennél kisebb, a komplexképződés következményeként. A monomer két konformere C-terminálisának 1515 illetve 1549, N-terminálisának amid-II csúcsa pedig 1495 illetve 1508 cm-1-nél található (a β illetve a γ szerkezetre). Az 1 konformer amid-II rezgései, amelyek a számítások szerint 1584 illetve 1522 cm-1-nél vannak, hozzárendelhetők a spektrum két jeléhez. Előbbi az 1594 cm-1-nél található csúcs oldalsávja, amely kb. 1588 cm-1-nél található. Utóbbi a monomer két konformerének amid-II sávjába 1700 1675 1650 1625 1600 1575 1550 1525 1500
olvad bele, oldalsávként észlelhető 1523 cm-1-nél. Az 3 konformer
∆ A
két amid-II sávja a számítások szerint 1520 illetve 1513 cm-1-nél van, ezek ugyancsak oldalsávként illetve kisebb csúcsként 1700 1675 1650 1625 1600 1575 1550 1525 1500
észlelhetőek 1520 illetve 1514 cm-1-nél. Nem sikerült azonosítani az 1716, 1641, 1637, 1613, 1608, 1600, 1574, 1557 illetve 1534 cm-1-nél levő jeleket. Mindez azt feltételezi, hogy a rendszerben
1700 1675 1650 1625 1600 1575 1550 1525 1500
jelen kell lenni egyéb komplexeknek is. Lehetséges, hogy a
-1
ν / cm
vegyülethez több
10.ábra: AcAlaNHMe infravörös spektruma a 3050 – 3550 cm-1 tartományban. Az ábrán három felvétel van megjelenítve. Legalul a vízmentes
AcAlaNHMe,
felette
a
vizet
tartalmazó komplex (Ar : víz arány 500 :1-hez), legfelül pedig a hőkezelés utáni komplex spektruma látható.
26
vízmolekula is kapcsolódik, amely kis valószínűségű ugyan, de nem zárható ki. A 2 és 4 konformer előfordulását nem sikerült minden kétséget kizáróan bizonyítani, mivel a számolás során kapott frekvenciáik nem sokkal térnek el a monomer jeleitől, így teljes mértékben beleolvadnak azokba.
6.2.2 mátrixizolációs VCD vizsgálatok A felvett VCD spektrumot a 10. ábra mutatja. A VCD spektrum megerősíti az infravörös spektrum alapján levont következtetéseket. Az 1 és a 3 konformernek a számítások során kapott VCD előjelei jól egyeznek a kísérleti spektrummal. Így a 3 konformer erős VCD jele 1701 cm-1 körül észlelhető, a monomer negatív elnyelése csökken, majd pozitívba megy át a komplexképzédés hatására. Az 1 konformer rezgése ebben a tartományban beleolvad a monomer nagy abszolút értékű negatív sávjába, azonban 1673 cm-1-nél észlelhető a számolt érték alapján várt pozitív jel, amely oldalsávként jelenik meg a monomer elnyelésében. 1655 cm-1-nél látható egy negatív sáv, ez a komplexált víz jele, azaz észlelhető a kiralitás transzfer. A számítások alapján az 1 és a 4 konformerhez kötött víz ad negatív jelet a VCD spektrumban. Az 1 konformernek azonosítható az N-terminális amidcsoportjához tartozó jele is, amely egy pozitív jel, 1520 cm-1-nél (a számolt érték 1522 cm-1). A mérési eredményeket a 6. táblázat foglalja össze. ν / cm-1
6.
VCD előjel 1716 + 1701 + 1691 1673 + 1665 1655 1641 n.a 1637 1613 + 1608 + 1600 + 1588 + 1574 + 1557 + 1534 + 1523 + 1520 + 1514 +
táblázat:
Az
Ac-Ala-NHMe
asszignáció n.a. 3, amid-I C-term. 1, amid-I C-term. 1, amid-I N-term. 3 b(HOH) 1 b(HOH) n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 1, amid-II n.a. n.a. n.a. 1, amid-II 3, amid-II 3, amid-II kísérleti
eredményeinek
összefoglalása A VCD előjelek megadásánál az n.a. azt mutatja, hogy az előjelet nem sikerült leolvasni. Az asszignációnál az n.a. a sikertelen asszignációt jelenti.
27
7. Összegzés Ezen munka keretében az N – acetil – N' – metil – L - alaninamid (Ac-L-Ala-NHMe) illetve az Nacetil-L-prolinamid (Ac-L-Pro-NH2), modellpeptidek vízzel való kölcsönhatását vizsgáltuk mátrixizolációs infravörös (MI-IR) és rezgési cirkuláris dikroizmus (MI-VCD) spektroszkópia segítségével. A két modellvegyület monomerjeinek konformációs viszonyait kutatócsoportunk korábbi vizsgálatai során már felderítette. Ezek alapján elmondható, hogy az Ac-L-Pro-NH2 monomernek egy, az Ac-L-Ala-NHMe monomernek két konformere van jelen észlelhető mennyiségben a mátrixban. Jelen vizsgálatok során a két modellvegyület vízzel történő komplexképzését hajtottuk végre és követtük nyomon mind elméleti, mind kísérleti módszerekkel. A vizsgálatok során kiderült, hogy mind az Ac-L-Pro-NH2 mind az Ac-L-Ala-NHMe esetén két komplexet sikerült azonosítani a komplex képzését követően. Ezek az Ac-L-Pro-NH2 esetében az 1ba illetve az 1h komplexek voltak. Az első komplexnél a vízmolekula a modellpeptid C-terminális karbonilcsoportjához kapcsolódik, illetve egy intramolekuláris hidrogénkötés is létrejön az N-terminális karbonilcsoport oxigénje és a C-terminális amidcsoport hidrogénje között, egy gyűrűs szerkezetet eredményezve. A másik komplex esetén a vízmolekula beékelődik a monomer intramolekuláris kötésébe, felbontva azt, az amidcsoport hidrogénjéhez oxigénatomján, az N-terminális karbonilcsoport oxigénatomjához pedig egyik hidrogénjével kötve egy gyűrűs szerkezetet hoz létre. Az Ac-L-Ala-NHMe esetében az 1 és az 5 komplexek voltak azonosíthatók a spektrumokban. Az első γ szerkezetű, ebben a vízmolekula az N-terminális karbonilcsoporttal illetve a C-terminális amidcsoporttal létesít hidrogénkötést hidrogénje illetve oxigénje útján, gyűrűs szerkezetet hozva létre. A második komplex β szerkezetű, a számítások során a legalacsonyabb energiájú, itt a víz az N-terminális karbonilcsoportjához kapcsolódik hidrogénjével. A számítások során végeredményként kapott másik két komplex jelenlétét nem sikerült minden kétséget kizáróan bizonyítani, illetve számos jel arra utal, hogy a rendszerben előfordulnak más, ismeretlen komplexek is. Mindkét vegyület esetében feltételezhető, hogy további, eddig azonosítatlan komplexek is jelen vannak a mátrixban. Modellpeptidek vízzel alkotott komplexeinek vizsgálata mindezidáig nem történt még meg MIVCD spektroszkópia segítségével. A vizsgálatok során mindkét esetben sikerült a komplexált vízmolekula jeleit azonosítani a VCD spektrumban, azaz a kiralitás transzfer jelenségét bizonyítani. Modellpeptidek akirális molekulákkal létesített komplexeinek MI-VCD vizsgálata során a kiralitás transzfert eddig csak kevés esetben sikerült kimutatni. A későbbiekben a spektrum azonosítatlan csúcsainak asszignálását tűztük ki célul, amely további modellvegyület - víz komplexekre történő elméleti számítások elvégzését teszi szükségessé. Ez magában foglalja a több vízmolekulával kialakult komplexeket is, amelyek jelenléte nem nagy 28
valószínűséggel ugyan, de lehetséges, csakúgy, mint a víz- illetve a modellvegyület dimerek jelenléte is a mátrixban. Távlati céljaink közé tartozik a nehézvízzel elvégzett komplexképződés vizsgálata. Ez amellett, hogy megerősítené az eddig elvégzett spektrum-asszignálások helyességét, nagymértékben elősegítené az eddig ismeretlen specieszektől származó csúcsok asszignálását.
Irodalom (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) (52) (53) (54) (55) (56) (57) (58)
Brown, R.D.; Gordfrey, P. D.; Storey, J. W. V.; Bassez, M. P. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1978, 547. Suenram, R. D.; Lovas, F. J. J. Mol. Spectrosc. 1978, 72, 372. (a) Suenram, R. D.; Lovas, F. J. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7180. (b) Schafer, L.; Sellers, H. L.; Lovas. F. J.; Suenram, R. D. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6566. Iijima, K.; Tanaka, K.; Onuma, S. J. Mol. Struct. 1991, 246, 257. Godfrey, P. D.; Brown, R. D. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2019. Lovas, F. J.; Kawashima, Y.; Grabow, J. U.; Suenram, R. D.; Freser, G. T.; Hirota, E. Astrophys J. 1995, 455, 201. McGlone, S. J.; Elmes, P. S.; Brown, R. D.; Godfrey, P. D. J. Mol. Struct. 1999, 486, 225. Iijima, K.; Beagley, B. J. Mol. Struct. 1991, 248, 133. Godfrey, P. D.; Firth, S.; Hatherley, L. D.; Brown, R. D.; Pierlot, A. P. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9687. Debies, T. P.; Rabalais, J. W. J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom. 1974, 3, 315. Klasinc, L. J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom. 1974, 3, 315. Greenie, Y.; Lassegues, J.-C.; Garrigou – Lagrange, C. J. Chem. Phys. 1970, 53, 2980. (a) Reva, I. D.; Plokhotnichenko, A. M.; Stephanian, S. G.; Ivanov, A.Yu.; Radachenko, E. D.; Sheina, G. G.; Blagoi, Yu. P. Chem. Phys. Lett. 1995, 232, 141. (b) Erratum, Chem. Phys. Lett. 1995, 235, 617. Stephanian, S. G.; Reva, I. D.; Radchenko, E. D.; Rosado, M. T. S.; Duarte, M. L. R. S.; Fausto, R.; Adamowicz, L. J. Phys Chem. A 1998, 102, 1041. Ivanov, A. Y.; Sheina, G. G.; Blogoi, Yu. P. Spectrochim. Acta Part A 1999, 55, 219. Huisken, F.; Werhahn, O.; Ivanov, A. Y.; Krasnokutski, S. A. J. Chem. Phys. 1999, 111, 9568. Tulio, M. T. S.; Duarte, M. L. R. S.; Fausto; R. J. Mol. Struct. 1997, 410, 343. Stephanian, S. G.; Reva, I. D.; Radchenko, E. D.; Adamowicz, L. J. Phys. Chem. A 1998, 102, 4623. Lambie, B.; Ramaekers, R.; Maes, G. Spectrochim. Acta Part A 2003, 59, 1387. Stephanian, S. G.; Reva, I. D.; Radchenko, E. D.; Adamowicz, L. J. Phys. Chem. A 1999, 103, 4404. Sheina, G. G.; Radchenko, E. D.; Ivanov, A. Y.; Stephanian, S. G.; Blagoi, Yu.P. Zh. Fiz. Khim. 1988, 62, 985. Reva, I. D.; Stephanian, S. G.; Plokhotnichenko, A. M.; Radchenko, E. D.; Sheina, G. G.; Blagoi, Yu. P. J. Mol. Struct. 1994, 318, 1. Stephanian, S. G.; Reva, I. D.; Radchenko, E. D.; Adamowicz, L. J. Phys. Chem. A 2001, 105, 10664. Lambie, B.; Ramaekers, R.; Maes, G J. Phys. Chem. A 2004, 108, 10426. Jarmelo, S.; Lapinski, L.; Nowak, M. J.; Carey, P. R.; Fausto, R. J. Phys. Chem. A 2005, 109, 5689. Kaczor, A.; Reva, I. D.; Proniewicz, L. M.; Fausto, R. J. Phys. Chem. A 2006, 110, 2360. Ramaekers, R.; Pajak, J.; Rospenk, M, Maes, M. Spectrochim. Acta Part A 2005, 61, 1347. Kaczor, A.; Reva, I. D.; Proniewicz, L. M.; Fausto, R. J. Phys. Chem. A 2007, 111, 2967. Dobrowolski, Cz.; Jamróz, M. H.; Kolos, R.; Rode, J. E.; Sadlej, J. ChemPhysChem 2007, 8 , 1085. Dian, B. C.; Longarte, A.; Mercier, S.; Evans, D. A.; Wales, D. J.; Zwier, T. S. J. Chem. Phys. 2002, 117, 10688. Dian, B. C.; Longarte, A.; Winter, P. R.; Zwier, T. S. J. Chem. Phys. 2004, 120, 133. Dian, B. C.; Florio, G. M.; Clarkson, J. R.; Longarte, A.; Zwier, T. S. J. Chem. Phys. 2004, 120, 9033. Gerhards, M.; Unterberg, C.; Gerlach, A.; Jansen, A.; Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 2682. Chin, W.; Mons, M.; Dognon, J. P.; Mirasol, R.; Chass, G.; Dimicoli, I.; Piuzi, F.; Butz, P.; Tardivel, B.; Compagnon, I.; von Helden, G.; Meijer, G. J. Phys. Chem. A 2005, 109, 5281. Compagnon, I.; Oomens, J.; Bakker, J.; Meijer, G.; von Helden, G. Phys. Chem. Chem. Phys. 2005, 7, 13. Chin. W.; Dognon, J. P.; Piuzzi, F.; Tardivel, B.; Dimicoli, I.; Mons, M. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 707. Unterberg, C.; Gerlach, A.; Schrader, T.; Gerhards, M. J. Chem. Phys. 2003, 118, 8296. Hünig, I.; Kleinermanns, K. Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 2650. Chin, W.; Dognon, J. P.; Piuzzi, F., Tardivel, B.; Dimicoli, I. Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 2700. Fricke, H.; Gerlach, A.; Unterberg, C, Rzepecki, P, Schrader, T.; Gerhards, M. Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 4636. Bakker, J. M.; Plützer, C.; Hünig, I.; Haber, T.; Compagnon, I.; von Helden, G.; Meijer, G., Kleinermanns, K. ChemPhysChem 2005, 6, 120. Chin, W.; Dognon, J. P.; Canuel, C.; Piuzzi, F.; Dimicoli, I.; Mons, M. J. Chem. Phys. 2005, 122, 054317. Chin, W.; Piuzzi, F.; Dognon, J. P.; Canuel, C.; Dimicoli, I.; Mons, M. J. Chem. Phys. 2005, 123, 084301. Fricke, H; Gerlach, A.; Gerhards, M. Phys. Chem. Chem. Phys. 2006, 14, 1660. Grenie, Y.; Garrigou – Lagrange, C.; J. Mol. Struct. 1975, 24, 293. Diem, M.; Gotkin, P. J.; Kupfer, J. M.; Tindall, A. P.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8103. Diem, M.; Gotkin, P. J.; Kupfer, J. M.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 5644. Diem, M.; Photos, E.; Khouri, H.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 6829. Diem, M.; Polavarapu, P. L.; Oboodi, M.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1982., 104, 3329. Lai, B. B.; Diem, M.; Polavarapu, P. L.; Oboodi, M.; Freedman, T. B.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 3336. Freedman, T. B.; Diem, M.; Polavarapu, P. L.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 3343. Nafie, L. A.; Oboodi, M. R.; Freedman, T. B. J. Am. Chem. Soc. 1983., 105, 7449. Pohl, G.; Perczel, A.; Vass, E.; Magyarfalvi, G.; Tarczay, Gy. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 4698. Pohl, G.; Perczel, A.; Vass, E.; Magyarfalvi, G.; Tarczay, Gy. 2007, beküldve Jalkanen, K.; Suhai, S. Chem. Phys. 1996, 208, 81. Rode, J. E.; Dobrowolski, J. Cz. J. Mol. Struct. (THEOCHEM) 2003, 637, 81. Losada, M.; Xu, Y. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 3127. Sadlej, J.; Dobrowolski, J. Cz.; Rode; J. E.; Jamróz, M. H. J. Phys. Chem. A 2007,
29
(59) (a) Schrader, B.: Infrared and Raman Spectroscopy – Methods and Applications, VCH Verlag GmbH, 1995, 298. (b) Schrader, B.: Infrared and Raman Spectroscopy – Methods and Applications, VCH Verlag GmbH, 1995, 544. (60) Andrews, L.; Moskovits, M.: Chemistry and Physics of Matrix-Isolated Species, North Holland, 1989 (61) Bijvoet, J. M.; Peerdeman, A. F.; Van Bommel, A. J. Nature 1951, 168, 271. (62) Hollósi, M.; Laczkó, I.; Majer, Zs.: A sztereokémia és kiroptikai spektroszkópia alapjai, Nemzeti Tankönykiadó, 2004 (63) Holzwarth, G.; Hsu, E. C.; Mosher, H. S.; Faulkner, T. R. Moscowitz, A. J. Am. Chem. Soc. 1974, 98, 251. (64) (a) Nafie, L. A.; Cheng, J. C.; Stephens, P. J. J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 3842. (b) Nafie, L. A.; Keiderling, T. A.; Stephens, P. J. J. Am. Chem. Soc. 1976, 98, 2715. (65) (a) Sugeta, H.; Marcott, C.; Faulker, T. R.; Overend, J.; Moscowitz, A. Chem Phys. Lett. 1976, 40, 397. (b) Keiderling, T. A.; Stephens, P. J. Chem. Phys. Lett. 1976, 41, 46. (c) Keiderling, T. A.; Stephens, P. J. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8061. (d) Diem, M.; Gotkin, P. J.; Kupfer, J. M.; Tindall, A. P.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8103. (e) Marcott, E.; Blackburn, C. C.; Faulkner, T. R.; Moscowitz, A.; Overend, J. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 5262. (f) Diem, M.; Gotkin, P. J.; Kupfer, J. M.; Nafie, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 5644.b (66) Yoshihiko, I.; Hirokazu, A.; Toshikazu, H.; Akira, M.; Takeo, S. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 496. (67) Henderson, D. O.; Polavarapu, P. L. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 7110. (68) Pulay, P.; Fogarasi, G.; Pongor, G.; Boggs, J. E.; Vargha, A. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 7037. (69) Baker, J.; Jarzecki, A. A.; Pulay, P. J. Phys. Chem. A 1998, 102, 1412. (70) PQS version 3.2, Parallel Quantum Solutions, 2013 Green Acres Rd., Fayetteville, AR. 72703.
30
