Model Indeks Peroksidatif dan Indeks Protein Teroksidasi Saliva Penderita Tuberkulosis Paru Berdasarkan Lama Pengobatan Eko Suhartono*, Bambang Setiawan Kelompok Studi Radikal Bebas dan Pemanfaatan Bahan Alam Bagian Kimia/Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru Abstract Mycobacterium tuberculosis in human may induce a variety of responses involving protective immunity to clinical manifestation of tuberculosis. Oxidative mechanism to infection controlling can happen not only in macrofag but also in all liquid compartments of the body. The objective of this study is to evaluate peroxidative index and Advanced Oxidation Protein Products (AOPPs) in tuberculosis patients’ saliva at a treatment period. The tuberculosis patients were grouped according to the length of treatment, P0=0-1 months, P1=1-3 months,, P2=3-5 months, and P3=5-6 months. Peroxidative index and Advanced Oxidation Protein Products (AOPPs) at P0 were very high but then they decreased progressively in P, P2, and P3. Peroxidative index and AOPPs are potential as detectors of oxidative mechanism in tuberculosis treatment. The correlation treatment period and peroxidative index model y=127,08x3 + 1651, 7x2 – 6692,6x + 8571 (R2 = 1). The correlation treatment period and AOPPs model y = -0,0398x + 0, 4479 (R2 = 0,8073). Key words : hydrogen peroxide, peroxidative, AOPPs, saliva
dapat disembuhkan baru mencapai 83,5% pada tahun 2006, dari 3.577 penderita, yang dapat disembuhkan sebanyak 2.564 orang. Penderita TB di Kalimantan Selatan pada tahun 2007, diperkirakan dapat mencapai 6.850 orang.3 Infeksi M. tuberculosis pada manusia akan menimbulkan respons perkembangan imunitas protektif, manifestasi klinis tuberkulosis. Kontrol infeksi M. tuberculosis melibatkan interaksi koordinasi antara sel dendritik, sel T, dan makrofag.4 Molekul efektor utama sebagai pertahanan antibakterial pada makrofag meliputi reactive oxygen intermediate (ROI) dan reactive nitrogen intermediate (RNI).5 Hidrogen peroksida (H2O2) merupakan salah satu ROI yang dihasilkan makrofag melalui reaksi yang dikatalisis NADPH oksidase. Molekul
Pendahuluan Mycobacterium tuberculosis merupakan mikroorganisme penyebab tuberkulosis (TB) paru. Organisasi kesehatan dunia (WHO), memperkirakan terjadi TB sebesar 20 juta kasus di seluruh dunia, dengan angka kematian sebesar 3 juta pertahun. Sebanyak 80% diantaranya, meninggal di negara berkembang, termasuk Indonesia.1 Di Indonesia TB paru menduduki peringkat kedua penyebab kematian setelah kardiovaskuler.2 Di Kalimantan Selatan, ditemukan 6.577 warga terkena TB paru dan umumnya dalam usia produktif, 15 hingga 50 tahun. Dari ribuan kasus TB paru, yang * Drs. Eko Suhartono, M.Si Bag. Kimia/Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Jl. A. Yani Km 36 Banjarbaru (70712). Hp. 081251126368 e-mail:
[email protected]
118
Model Indeks Peroksidatif dan Indeks Protein Teroksidasi Saliva Penderita Tuberkulosis Paru Berdasarkan Lama Pengobatan (Eko Suhartono, Bambang Setiawan)
ini adalah molekul efektor pertama sebagai mikobakterisidal fagosit mononuklear.6 H2O2 dapat merusak patogen melalui oksidasi yang mengakibatkan denaturasi protein patogen.7 Selain H2O2, nitrit oksida (NO) juga berperan dalam menghambat pertumbuhan M. tuberculosis. Nitrit oksida dapat memodifikasi komponen biomolekul bakteri meliputi DNA, lipid dan protein. NO juga dapat bereaksi dengan radikal superoksida (O2 -) membentuk peroksinitrit (ONOO-) dan memicu nitrosilasi gugus tirosin.8 Pemberian kemoterapi pada kultur makrofag peritoneal dapat merangsang pembentukan H2O2 dan NO, untuk meningkatkan efektifitas mekanisme oksidatif sebagai kontrol infeksi. 6 Aktivasi kontrol infeksi melalui mekanisme oksidatif sebagai respons, terjadi di dalam makrofag dan berbagai kompartemen cairan tubuh. Sistem peroksidase di dalam saliva terbukti memiliki peranan sebagai antimikrobakterial dan aktivitas peroksidase saliva penderita tuberkulosis paru lebih tinggi dibandingkan orang sehat. 9,10,11 Berdasarkan pemikiran di atas, diduga selama pengobatan tuberkulosis akan terjadi peningkatan produksi H2O2 dan aktivitas peroksidase (indeks peroksidatif). Peningkatan ROI dan RNI akan merusak komponen protein bakteri dan pembentukan Advanced Oxidation Protein Products (AOPPs). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengetahui pola perubahan indeks peroksidatif dan AOPPs di dalam saliva selama masa pengobatan tuberkulosis.
setelah setiap dua bulan selama enam bulan periode pengobatan. Metode penelitian yang digunakan adalah studi eksperimen dan pengambilan sampel dilakukan dengan teknik purposive. Penelitian dilaksanakan di SMF Paru RSUD Ulin dan Kelompok Studi Radikal Bebas dan Pemanfaatan Bahan Alam, Laboratorium Kimia/Biokimia Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat. Subyek penelitian meliputi pasien TB paru dengan kriteria inklusi : kasus baru, BTA (+), usia 15-40 tahun, dan tanpa penyakit penyerta. Subyek terbagi atas empat kelompok yakni kelompok pengobatan 0 bulan (0-1 bulan pengobatan), kelompok pengobatan 2 bulan (1-3 bulan pengobatan), kelompok pengobatan 4 bulan (3-5 bulan pengobatan), dan kelompok pengobatan 6 bulan (5-6 bulan pengobatan). Masingmasing kelompok penelitian berjumlah 10 orang. Varibel bebas penelitian ini adalah indeks peroksidatif (rasio antara kadar hidrogen peroksida dengan aktivitas peroksidase) dan AOPPs. Variabel pengganggu, yaitu kepatuhan pengobatan dan efek samping terapi. Alat bantu kendali dengan “kartu isa” dan monitoring efek samping. Bahan yang digunakan adalah H2O2, PBS pH 7,4, FeCl3, o-fenantrolin, KI, dan aquades. Pengambilan sampel saliva Saliva subjek penelitian yang telah mencuci mulut dengan akuades, di vorteks kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan bagian yang bening diambil dengan menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung.
Bahan dan Cara Penelitian menggunakan rancangan penelitian pre test follow up study design dengan follow up post test dilakukan
Penentuan indeks peroksidatif
119
JKM. Vol.9 No.2 Februari 2010:118-123
Indeks peroksidatif adalah rasio antara kadar peroksida dan aktivitas peroksidase.
diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang diukur kembali absorbansinya dengan panjang gelombang yang sama (A1).
Pengukuran kadar peroksida saliva Peroksida saliva diukur dengan menggunakan metode modifikasi FOX2. Pembuatan larutan standard sebanyak 1 M H2O2 200 L + 160 L PBS pH 7,4+160 L FeCl3 (251,5 mg FeCl3 dilarutkan dalam 250 ml akuades) + 160 L o-fenantrolin, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diukur absorbansinya pada =505 nm (As). Pembuatan larutan uji 200 L plasma + 160 L PBS pH 7,4+160 L FeCl3 + 160 L o-fenantrolin (120 mg o-fenantrolin dilarutkan dalam 100 ml akuades), diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diukur absorbansinya pada =505 nm (Au). Pembuatan blanko 200 L plasma + 160 L PBS pH 7,4+160 L akuades+ 160 L o-fenantrolin, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diukur absorbansinya pada =505 nm (Ab).12
Ao – A1 Aktivitas peroksidase = -------------- menit-1
5 Pengukuran kadar Advanced Oxidation Protein Products (AOPPs) Pengukuran kadar AOPPs berdasarkan metode Cakatay.14 Pembuatan larutan uji sebanyak 200 L sampel plasma + 600 L buffer fosfat + 100 L KI 1,16 M. Pembuatan larutan blanko sebanyak 800 L buffer fosfat + 100 L KI 1,16 M, larutan uji dan blanko dibiarkan 2 menit kemudian ditambahkan 200 L asam asetat, diukur absorbansi pada =340 nm. Konsentrasi AOPPs dinyatakan melalui A = b C dengan = 26 mM-1 x cm-1 dan b = 1 cm. Au - Ab kadar AOPPs = ------------- x mM-1 26 Dengan: Ab= absorbansi larutan blangko Au = absorbansi larutan uji
Analisis statistik Data yang diperoleh (indeks peroksidatif dan AOPPs) dianalisis menggunakan analisis regresi dan korelasi.
As - Ab kadar peroksida = ------------ x 1 mM H2O2 Au - Ab Dengan: As = absorbansi larutan standar Ab= absorbansi larutan blangko Au = absorbansi larutan uji
Hasil dan Pembahasan Berdasarkan hasil penelitian korelasi antara lama pengobatan dengan indeks peroksidatif dinyatakan dalam koefisien korelasi r=1 dengan model y=127,08x3 + 1651,7x2 – 6692,6x + 8571. Indeks peroksidatif selama periode pengobatan tuberkulosis disajikan pada Gambar 1.
Pengukuran aktivitas peroksidase Pengukuran aktivitas peroksidase berdasarkan metode Kanehira.13 Sebanyak 1 ml plasma subyek penelitian dicampurkan dengan 45 L FeCl3 +45 L buffer fosfat (pH 7) + 45 L ofenantrolin, kemudian diukur absorbansinya pada λ=505 nm (A0). Setelah diukur absorbansinya, campuran
120
Model Indeks Peroksidatif dan Indeks Protein Teroksidasi Saliva Penderita Tuberkulosis Paru Berdasarkan Lama Pengobatan (Eko Suhartono, Bambang Setiawan)
Indeks Peroksidatif
9000
8571
7000
y = -127.08x3 + 1651.7x2 - 6692.6x + 8571 R2 = 1
5000 776
94.878
3000
427.622
1000 -1000 0
2
4
6
Lama pengobatan (bulan) Gambar 1. Indeks Peroksidatif Selama Pengobatan Tuberkulosis Pada pengobatan tahap awal (0-2 bulan), indek peroksidatif sangat tinggi dan selanjutnya akan menurun sesuai lama pengobatan. Tingginya indeks peroksidatif pada tahap awal pengobatan disebabkan oleh dua hal, yakni: 1) respiratory burst yang diperankan oleh netrofil dan makrofag sedang berlangsung melalui pembentukan H2O2. Pada tahap ini jumlah kuman yang difagosit sangat tinggi sehingga membutuhkan H2O2 yang tinggi. Akibatnya, indeks peroksidatif berada pada nilai yang tinggi. 2) pada tahap ini mulai diberikan pengobatan sehingga tubuh melakukan mekanisme perubahan obat dari bentuk inaktif menjadi bentuk aktif. Isoniazid (INH) adalah obat antituberkulosis yang paling efektif. Aktivasi INH melibatkan hemoprotein katalase-peroksidase (KatG) yang membutuhkan molekul oksigen. Radikal superoksida dibentuk selama oksidasi INH pada proses aktivasi INH. Oksidasi melalui jalur ini melibatkan pathway
monooksigenase melalui pembentukan oxyferous KatG intermediate akibat ikatan dioksigen ke ferrous KatG atau ikatan superoksida ke ferric KatG. Pada tahap pengobatan selanjutnya (2-6 bulan), indeks peroksidatif akan mengalami penurunan. Hal ini diduga disebabkan oleh penurunan kepadatan M. tuberculosis sehingga respiratory burst juga akan berkurang. Pada infeksi M. tuberculosis, indeks peroksidatif merupakan parameter aktivasi imunitas seluler terhadap kuman. Indeks peroksidatif memcerminkan fase oksidatif pada respiratory burst dan respon genetik kuman melalui ekspresi berbagai protein enzimatik. M. tuberculosis mempunyai beberapa gen yang terlibat dalam aktivitas katalase-peroksidase, yaitu Mn(II)-dependent peroxidase, peroxynitritase, dan P450-like monooxygenase. Secara alamiah, enzim tersebut adalah enzim pertahanan terhadap molekul oksigen reaktif. Akan tetapi enzim tersebut juga terlibat dalam aktivasi obat antituberkulosis.
121
JKM. Vol.9 No.2 Februari 2010:118-123
Lama pengobatan tuberkulosis juga mempengaruhi nilai AOPP seperti
tersaji pada Gambar 2.
0.6 0.447
Kadar AOPPs
0.5
0.36
0.334
0.4 0.173 0.3 0.2
y = -0.0398x + 0.4479
0.1
R2 = 0.8073
0 0
2 4 Lama pengobatan (bulan)
6
Gambar 2. Kadar AOPPs Selama Pengobatan Tuberkulosis Hasil penelitian menunjukkan terdapat hubungan linier negatif antara lama pengobatan dengan kadar AOPPs. Semakin lama pengobatan maka kerusakan oksidatif dari protein semakin berkurang. AOPPs merupakan produk kerusakan oksidatif pada protein yang disebabkan oleh HOCl (radikal hipoklorit). Kadar AOPPs plasma berkorelasi dengan ditirosin dan advanced glycation end products (AGEs).12 Pada infeksi tuberkulosis, mekanisme antimikobakterial diperankan oleh sistem mieloperoksidase-hidrogen peroksida-sistem klorid. Mieloperoksidase merupakan hem peroksidase yang mengoksidasi berbagai senyawa aromatik (RH) membentuk radikal (•R). Mieloperoksidase mengkatalis perubahan klorid menjadi produk nonradikal kuat yaitu HOCl, yang berperan penting dalam aktivitas pembunuhan bakteri. Target pada struktur bakteri meliputi protein besisulfur, transpor protein membran,
sistem ATP, dan replikasi DNA. Selain membentuk HOCl, mieloperoksidase juga menghasilkan produk sampingan, yakni kloramin yang juga bersifat bakterisidal. Sel yang permeabel terhadap kloramin dapat meningkatkan efek HOCl dalam pembunuhan bakteri.15 Kadar AOPPs pada penelitian ini identik dengan kloramin yang menjadi produk fungsional mieloperoksidase. Pada tahap awal pengobatan, absorbansi AOPP sangat tinggi yang disebabkan oleh mekanisme mieloperoksidasehidrogen peroksida-sistem klorid yang sangat aktif sebagai antimikobakterial. Hal ini didukung oleh indeks peroksidatif yang juga sangat tinggi. Nampaknya, pada fase ini sistem antimikrobial yang bekerja lebih dominan melalui pembentukan kloramin, sehingga pembentukan AOPPs sangat besar. Kadar AOPPs akan menurun seiring dengan lama pengobatan dan mencapai nilai terendah pada enam
122
Model Indeks Peroksidatif dan Indeks Protein Teroksidasi Saliva Penderita Tuberkulosis Paru Berdasarkan Lama Pengobatan (Eko Suhartono, Bambang Setiawan)
bulan pengobatan. Penurunan ini disebabkan oleh aktifnya OAT sehingga mekanisme antimikrobial mieloperoksidase-hidrogen peroksida-sistem klorida menjadi tidak dominan.
7.
8.
Simpulan Model indeks peroksidatif dan AOPPs berpotensi sebagai parameter baru untuk deteksi perubahan mekanisme oksidatif selama pengobatan tuberkulosis paru. Lama pengobatan berpengaruh terhadap indeks peroksidatif dan kadar AOPPs. Semakin lama pengobatan, indeks peroksidatif dan AOPPs akan berkurang.
9.
10.
Daftar Pustaka 1.
2.
3.
4.
5.
6.
Subagyo A, Aditama TY, Siswarta DK, Partakusuma LG. Pemeriksaan interferon-gamma dalam darah untuk deteksi infeksi tuberkulosis. Jurnal Tuberkulosis Indonesia 2006; 3:1-7. Aditama TY. Situasi beberapa penyakit paru di masyarakat. Cermin Dunia Kedokteran 1999; 84: 11-13. Girsang M. Pengobatan standar penderita TBC. Cermin Dunia Kedokteran 2002; 137:5-7. Sawant KV, McMurray DN. Guinea pig neutrophils infected with Mycobacterium tuberculosis produce cytokines which activate alveolar macrophages in noncontact cultures. Infect Immun 2007; April:1870-7. Nathan C, Shiloh MU. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:8841-8. Lopes FCM, Placeres MCP, Junior CMJ, Higuchi CT, Rinaldo D, Vilegas W, Leite CQF, Carlos IZ. Immunological and microbiological activity of Davilla elliptica St. Hill. (Dilleniaceae) against
11.
12.
13.
14.
15.
123
Mycobacterium tuberculosis. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102(6):769-72. Hughes R, Andrew PW, Kilvington S. Enhanced killing of Acanthamoeba cysts with a plant peroxidase-hydrogen peroxide-halide antimicrobial system. Appl Environ Microbiol 2003; 69:2563-7. Linares E, Giorgio S, Mortara RA, Santos CXC, Yamada AT, Augusto O. Role of peroxynitrite in macrophage microbicidal mechanisms in vivo revealed by protein nitration and hydoxylation. Free Rad Biol Med 2001; 30:1234-42. Zelles T, Purushotham KR, Macauley SP, Oxford GE, Humphreys-Beher MG. Saliva and growth factors: the fountain of youth resides in us all. J Dent Res 1995; 74:1826-32. Boras VV, Brozovi´c S, Arambasin AC, Zadro R, Devcic T, Begovac J, Brailo V. Salivary peroxidase levels in patients with AIDS. Eur J Med Res 2003; 8:81-4. Setiawan B, Amalia R, Fiki A, Ayunashari I, Zulfarina G, Suhartono E. Efek paraimunitas jus pegagan (Centella asiatica) sebagai modulator system peroksidase saliva penderita tuberculosis paru. 2008. dalam proses terbit. Harma M, Harma M, Erel G. Measurement total antioxidant response in preeclampsia with a novel automated method. Eur J Obstet Gynaecol Reprod Biol 2004: 21:145-50. Kanehira T, Shibata K, Kashiwazaki H, Inoue N, Morita M. Comparison of antioxidant enzymes in saliva of elderly smokers and non-smokers. Gerodontology 2006; 23:38-42. Cakatay U, Telcy A, Kayali R, Tekeli F, Akcay T, Silvas A. Relation of aging with oxidative protein damage parameters in the rat skeletal muscle. Clin Biochem 2003; 36:51-5. Hampton MB, Kettle AJ, Winterbourn CC. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 1998; 92:3007-1.
