Miskolci Egyetem Műszaki Anyagtudományi Kar
Szakdolgozat
2015.
Igazolás
Alulírott Kiss Eszter (Neptun kód: NBHWS3, született: Miskolc, 1989.12.05.) Igazolom, hogy büntetőjogi felelősségem tudatában kijelentem, hogy a leadott szakdolgozat a saját munkám.
Miskolc, 2015. május 8.
……….……………………………….. Kiss Eszter, hallgató
Az igazolást átvettem. Miskolc, 2015. május 8.
……….……………………………….. Dr. Lakatos János, tanszékvezető
Miskolci Egyetem Műszaki Anyagtudományi Kar Kémia Tanszék
Minta-előkészítési módszerek vizsgálata herbicidek vízből történő kimutatása céljából …………………………………………………… SZAKDOLGOZAT
Készítette: Kiss Eszter, Anyagmérnök MSc Belső konzulensek: Dr. Muránszky Gábor Dr. Fejes Zsolt Külső konzulensek: Szemánné Dobrik Henriett Szitás Róbert
2015.
Köszönetnyilvánítás
Ezúton szeretném megköszönni mindazoknak, akik segítették munkámat és ezzel hozzájárultak diplomamunkám elkészítéséhez. Köszönöm témavezetőimnek Dr. Muránszky Gábornak és Dr. Fejes Zsoltnak a szakmai irányítást és segítséget, az emberi bátorítást, támogatást, amely nélkül nem születhetett volna meg a szakdolgozatom. Hálásan köszönöm a Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal Miskolci Növény védőszermaradék-analitikai Laboratóriumának és dolgozóinak, hogy a kutatásaimhoz szükséges eszközöket, anyagokat biztosították. Köszönettel tartozom Szemánné Dobrik Henriettnek és Szitás Róbertnek szakmai konzulenseimnek a kutatásomhoz nyújtott szakmai segítségért, türelemért. Köszönöm továbbá a Miskolci Egyetem Kémia Tanszékének, hogy hátteret nyújtottak tanulmányaimhoz.
Tartalomjegyzék I.
Irodalmi áttekintés ...................................................................................................................... - 1 I.1. Növény védőszerek jellemzése ................................................................................................ - 1 I.2. Herbicidek ................................................................................................................................. - 2 I.3. Növény védőszerek kimutatása vízből ...................................................................................... - 4 I.4.Kromatográfia ............................................................................................................................ - 5 I.4.1. Gázkromatográfia ............................................................................................................... - 7 I.4.2. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)............................................................ - 8 I.5. Tömegspektrometria ............................................................................................................... - 10 I.6. Minta-előkészítés .................................................................................................................... - 14 I.6.1. SPE eljárás ........................................................................................................................ - 14 I.6.2. Folyadék-folyadék extrakció ............................................................................................ - 16 I.7. Hibaforrások ............................................................................................................................ - 17 -
II.
Érdemi rész ................................................................................................................................ - 19 II.1. Ioncserélt vízhez hozzáadott hatóanyagok visszanyerése SPE oszlopon történő extrakcióval - 19 II.1.1. Felhasznált anyagok, eszközök ........................................................................................ - 19 II.1.2. A módszer végrehajtása .................................................................................................. - 20 II.2. Ioncserélt vízhez hozzáadott hatóanyagok visszanyerése folyadék-folyadék extrakcióval ... - 21 II.2.1. Felhasznált anyagok, eszközök ........................................................................................ - 21 II.2.2. A módszer végrehajtása .................................................................................................. - 22 II.3. A mérés műszeres paraméterei ............................................................................................. - 24 -
III. Eredmények ............................................................................................................................... - 26 III.1. GC-MS/MS-en végzett mérések eredményei és azok kiértékelése ...................................... - 28 III.2. LC-MS/MS-en végzett mérések eredményei és azok kiértékelése ....................................... - 33 IV. SPE eljárás alkalmazása tényleges mintákon ............................................................................ - 37 IV.1. Természetes vizek vizsgálata növény védőszerekre ............................................................. - 37 IV.1.1. Mintavevő helyszínek..................................................................................................... - 38 IV.1.2. Minta-előkészítés ........................................................................................................... - 40 IV.1.3. Eredmények ................................................................................................................... - 41 V.
Összefoglalás ............................................................................................................................. - 43 -
VI. Irodalomjegyzék ........................................................................................................................ - 45 -
Absztrakt
A mezőgazdaságban alkalmazott növényvédő szerek jelentős része herbicid, melyeket totális vagy szelektív gyomirtásra alkalmaznak. Hatásukat a gyomnövények elpusztításával vagy a növények növekedésének befolyásolásával fejtik ki. Ezeket a gyomirtó szereket vagy talajra vagy levélzetre juttatják ki, ahonnan számos úton eljuthatnak a vizekbe és ott toxikusságuknak megfelelően akár ökológiai károkat is okozhatnak. A különböző peszticid osztályokba sorolható, eltérő kémiai szerkezetű herbicidek vízben való jelenlétének vizsgálatához olyan analitikai módszerre van szükség, mellyel képesek lehetünk egyszerre több hatóanyag egyidejű, hatékony kinyerésére. A vízből való kivonásuk történhet szilárd fázisú és folyadék-folyadék extrakcióval egyaránt. Az így előkészített minták tovább vizsgálhatók
folyadék-
és
gázkromatográfiás
eljárással,
amelyek
segítségével
meghatározhatók a visszanyerési faktorok. Erre azért van szükség, hogy fényt derítsünk egyegy analitikai módszer hatékonyságára, alkalmazhatóságára. Diplomamunkám egyik részében kétféle minta előkészítési módszert vizsgáltam nagytisztaságú ioncserélt vízhez mesterségesen hozzáadott hatóanyagokkal, másik részében természetes vizeket elemeztem különböző peszticidekre. A kísérlet során ioncserélt vizet használtam, melyhez
eltérő mennyiségben
adagoltam a hatóanyagokat különböző
koncentrációban, először szilárd fázisú extrakcióval (SPE), majd folyadék-folyadék extrakcióval készítettem elő a mintákat a további LC-MS/MS és GC-MS/MS műszerekkel történő méréshez. A kapott eredmények összesítésre kerültek, melyből megállapítható, mennyire hatékony az egyik illetve a másik minta előkészítési módszer, továbbá felvázolhatók az esetlegesen fellépő hibaforrások. Az egyes módszerek alkalmasságának vizsgálata után úgynevezett éles mintákat gyűjtöttem természetes vizekből, leginkább olyan területekről, amelyek körül földművelés, növénytermesztés, műtrágyázás folyik. Ezáltal megállapítható, hogy a termesztett növények fejlődésére, ellenálló képességük javítására használt növény védőszerek milyen mértékben szivárognak, mosódnak be a környezetbe és lesznek kimutathatók. Erre azért van szükség, hogy megállapítsuk a toxicitás mértékét, ugyanis ezek a szerek negatív hatással is lehetnek a környezetre.
I.
Irodalmi áttekintés
I.1. Növény védőszerek jellemzése
Az ember a létfenntartásához elengedhetetlenül szükséges táplálék megszerzése és biztosítása közben állandó harcot folytat a környezetében létező és érdekeivel ellentétes ténykedést folytató élőlények, vírusok, baktériumok, gombák, rovarok, rágcsálók ellen. Azokat az eljárásokat, amelyeket a mezőgazdasági termelés mennyiségének, minőségének fokozása, a termelés biztonsága érdekében a különféle kártevők, növényi betegségek és gyomnövények ellen alkalmazunk, növényvédelemnek nevezzük. [1.] A kémiai növényvédelemben használatos egy vagy több peszticid hatóanyagot és rendszerint egyéb járulékos anyagot is tartalmazó készítményeket összefoglalóan növény védőszernek nevezzük. Több nagy csoportba oszthatók attól függően, hogy milyen kártevő típusra hatnak, ezek közül hármat említek: (a) gyomirtó szerek (herbicidek), (b) gombaölő szerek (fungicidek), (c) rovarölő szerek (inszekticidek). A peszticidek az embert és értékeit károsító állati, növényi és gomba szervezetek elleni védekezésre használt olyan anyagok és annak keverékei, melyek alkalmazásának a célja a növények, termények védelme, és a kártevő élőlények távol tartása, terméketlenné tétele és elpusztítása [2.]. A peszticidek alatt általánosan a növényvédő, kártevő, irtó és raktárkészlet védő szereket értjük. Ezeket az anyagokat a növénytermesztésben, az élelmiszerüzemekben, valamint növényi eredetű élelmiszerek és nyersanyagok tárolása során használják. A növény védőszerek és ezek bomlástermékei a tápláléklánc és a víz körforgása útján kerülnek az emberi szervezetbe. Napjainkra nyilvánvalóvá vált, hogy a növény védőszerek negatív hatással vannak a környezet biológiai egyensúlyára. Csoportosíthatók felhasználás szerint, vegyi struktúrájuk és fizikai állapotuk szerint, illetve más egyéb szempontok alapján. Például lehetnek szervetlenek, szintetikusak és biopeszticidek. A biopeszticidek közt megjelentek olyan készítmények, amelyek a kártevők és betegségek természetes ellenségeit tartalmazzák. A peszticidek ritkábban rendelkeznek csupán egyféle hasznosítható tulajdonsággal. Nagyobb részük többfajta kártevő egyidejű irtására használható. A növény védőszerek használata nagy odafigyelést és szakértelmet igényel, mivel az összes peszticid méreg. A környezet szempontjából is rendkívül károsak lehetnek, mivel még forgalomban vannak olyan szerek, amelyek lassan és nehezen bomlanak le.
-1-
Ezért is nagyon fontos, hogy szakemberek által meghatározott útmutatókat a gazdálkodók pontosan betartsák. Bekerülhetnek az élelmiszerláncba, az ökorendszerbe, a talajba és a vizekbe, ahol fel is halmozódhatnak, és komoly pusztítást okozhatnak. [3.]
I.2. Herbicidek Herbicideknek nevezzük a széles körben elterjedt gyomirtó szereket. Ezeknek a célja, hogy elpusztítsák, visszaszorítsák a gyomnövényeket. A mezőgazdasági termeléssel párhuzamosan
a
herbicidek
használata
is
fokozódott.
Alkalmazásuk
az
intenzív
növénytermesztés során a mezőgazdasági kultúrák termésátlagának jelentős növekedéséhez vezetett. Ezzel együtt a herbicidek alkalmazásának negatív hatása is van, hiszen ezeknek a vegyületeknek a talajba kerülése a talaj toxikus anyagokkal való elszennyeződéséhez vezethet. Ez nemcsak a későbbi, érzékeny kultúrákra lehet rossz hatással, de innen továbbjutva a környező vizekbe, a vízi élővilágot is károsan befolyásolhatja. A herbicidekkel fenntartott fő követelmény a gyomokkal szembeni hosszú hatástartam, de az azt követő lebonthatóság, a bomlástermékek nem toxikus volta és a minél kisebb dózisok alkalmazhatóságának kényszere is. A gyomirtó szerek hatóanyagainak a kémiai összetétele, hatásmechanizmusa eltérő. Csoportosításuk több féle szempontból lehetséges: 1. Hatás szerint: totális vagy szelektív 2. Alkalmazás helye szerint: talajherbicidek, levélherbicidek 3. Gyomirtási spektrum alapján: széles hatásspektrumú herbicid hatóanyagok, szűk hatásspektrumú herbicid hatóanyagok 4. Hatásmechanizmus szerint: - fotoszintézis gátlók - növekedési zavarokat okozók - bioszintézis gátlók - egyéb módon hatók
-2-
A herbicidek lehetővé teszik a gyomok szabályozását. Használatukkor csökkenthető a talajművelési eljárások száma. Előnyei, hogy gyorsan hatnak, nagymértékű gyomosodás esetén is hatékonyak és kis adagban alkalmazhatók. Hátránya, hogy a szelektív herbicidek széles körű használata miatt a gyompopulációkban ökológiai változások jönnek létre, amelyek rezisztens populációk kialakulását eredményezik. Általában jellemző a talajban történő gyors lebomlás, így hatásuk nem minden esetben terjed ki a teljes vegetációs időszakra. A herbicidek elsődleges fontossága rövid távú hatásukban van. A kultúrnövény és gyom bármely növekedési stádiumában alkalmazható. A herbicidek vízbe jutásának számos útja ismeretes. Ilyen közvetlen vízparti kezelés, a permetlé elsodródása kezelt területről, a bemosódás és a talajvíz szennyeződés. A gyomirtó szerek hatékonyságát és fennmaradását a talajban számos tényező befolyásolja: hőmérséklet, pH, nedvességtartalom, talaj szerkezete, napfény, stb. A talajok herbicid-megkötő képességét azok összetétele, tulajdonságai és a herbicidek kémiai szerkezete befolyásolja. Bekerülésük a talajba történhet közvetve vagy közvetlenül, például a bomló növényi maradványokkal. A növény védőszerek elterjedt használata fokozott környezetvédelmi gondot okoz a felszíni vizek és talajvíz szennyezése révén. Az alábbi ábra (I.2.1. ábra) a környezet és a növény védőszerek közötti kölcsönhatást mutatja be. A herbicidek sorsát a természetben a következő tényezők határozzák meg: felszívódás a növényekbe, fennmaradás a termésben, adszorbeálódás a talajon, atmoszférában történő mozgás (párolgás), oldódás,mozgás a talajon keresztül (erózió). Mivel ezeket a szereket intenzíven használják a mezőgazdaságban, ezért nagy erőfeszítéseket kell tennünk a környezetre gyakorolt káros hatásaik csökkentésére. [4.]
I.2.1.ábra Herbicidek a környezetben (Forrás: Lei ThiMy Hong, Doktori értekezés 2003.) [1.a]
-3-
I.3. Növény védőszerek kimutatása vízből
A szennyezett talajok, vizek állapotfelmérésére alkalmazott módszereknek három csoportja van: fizikai, kémiai és biológiai analízis. Fizikai analízis: -
Gravimetria: tömeg meghatározási módszer, ahol a meghatározandó komponenshez fokozatosan reagenst adunk, és a levált csapadék tömegét mérjük
-
pH
-
Kolorimetria: szín és zavarosság mérése
-
Oldott oxigén szint
-
Ionok jelenlétének mérése
Kémiai analízis: -
Kromatográfia
-
Spektroszkópia
-
Kémiai oxigénigény (KOI)
Biológiai analízis -
Sejtszám és sejttömeg meghatározás
-
Mikroflóra feltérképezése
-
Biológiai oxigénigény (BOI)
-
Bioindikátorok, bioszenzorok, biomarkerek
-
Biokémiai vizsgálatok
A kutatási munkám során kémiai analízissel határoztam meg vízben jelenlévő herbicideket. Ezekről a technikákról az alábbiakban részletes tájékoztatást adok.
-4-
I.4.Kromatográfia
A kromatográfia olyan elválasztás technikai eljárás, amelynél a vizsgálandó minta komponensei egy állófázis és azzal érintkező mozgófázis közötti megoszláson, valamint az egyes komponensek a két fázissal való eltérő kölcsönhatásán alapszik. A fázisok közötti anyagátmenet hajtóerejét az biztosítja, hogy a komponensek kémiai potenciálja különböző a két fázisban. Az elválasztandó minta komponensei az állófázissal és a mozgófázissal különböző típusú és mértékű kölcsönhatásokat tudnak kialakítani, és ennek következtében az állófázisban eltérő ideig tartózkodnak. Az eltérő visszatartás (retenció) miatt a vizsgálandó minta alkotóinak az átlagos előrehaladási sebessége különböző lesz, amely azt eredményezi, hogy az állófázist eltérő időben hagyják el. [5.] Az állófázis halmazállapotát tekintve lehet szilárd vagy folyadék, de fő jellegzetessége a helyhez kötöttség, illetve az, hogy kölcsönhatások jöhetnek létre a felületén. A mozgófázis szuperkritikus
fluidum,
gáz
és
folyékony
halmazállapotú
lehet.
A
mozgófázis
halmazállapotától függően csoportosítható a kromatográfia: -
gázkromatográfia (a mozgófázis gáz)
-
szuperkritikus fluidum kromatográfia (a mozgófázis szuperkritikus fluidum)
-
folyadékkromatográfia (a mozgófázis folyadék)
Fogalmak kifejtése: Kromatogram: idő vagy a mozgófázis térfogat függvényében ábrázolt detektor-jel. A kromatogram alapján minőségi és mennyiségi következtetéseket tudunk levonni. A minőségi információt a retenció adja. A mennyiségi információ a csúcsok idő szerinti integrálja által alkotott csúcs alatti területből kapjuk. A csúcs alatti terület arányos a vizsgálati minta komponenseinek mennyiségével.
-5-
I.4.1.ábra Kromatogram detektorjel-idő függvény (Forrás: PTE-TTK Kromatográfiás alapfogalmak) [1.b]
Retenció vagy visszatartás: az állófázis azon tulajdonsága, amely a komponenssel való kölcsönhatása eredményeként annak előrehaladását késlelteti, és ezért az adott komponens a mozgófázis áthaladásához szükséges időhöz képest jóval hosszabb időt tölt a kromatográfiás rendszerben. Retenciós idő: az az idő, amely a minta adagolásától az adott komponensnek a detektorban, maximális koncentrációban való megjelenéséig eltelik. A teljes retenciós idő függ a kromatográfiás készülék geometriai kialakításától is. Holtidő: egy elméletileg nem kötődő komponens retenciós ideje. Retenciós térfogat: az a mozgófázis térfogat, amely a mintaadagolástól a csúcsmaximum megjelenéséig a kromatográfiás rendszeren áthalad. Hatékonyság: a kromatográfiában azt jelenti, hogy az elválasztás ideje lehetőleg a legkisebb legyen, elválasztás során a legrövidebb idő alatt, minél több komponenst el lehessen választani. Elméleti tányérszám: a kromatográfiás oszlop tetszőlegesen elméleti tányérokra osztható, amelyeken az álló-és mozgófázisban lévő anyagok egyensúlyi megoszlás valósul meg. -6-
Elméleti tányérnak nevezzük az oszlopnak azt a kis részét, ahol az elválasztandó anyagok a két fázis között egyensúlyban vannak. Elméleti tányérmagasság: a kolonnának az a hosszúsága, amelyen kialakul egy egyensúlyi egység, az elméleti tányérral ekvivalens oszlopmagasság. Csúcsfelbontás: a kromatográfiás oszlop felbontása jellemzi az elválasztás hatékonyságát, és megadja, hogy milyen mértékben sikerült a két egymás után eluálódó komponenst a két különálló sáv formájában elválasztani. [6.]
I.4.1. Gázkromatográfia A gázkromatográfia termikusan stabil, elpárologtatható, szerves és szervetlen vegyületek elválasztására szolgáló eljárás. A mozgófázis gáz, az állófázis lehet szilárd vagy folyadék halmazállapotú. A gázkromatográfiában működés közben állandóan áramlik a vivőgáz, amely képes a gőz állapotú komponenseket áthajtani az oszlopon és eljuttatni az oszlop végéhez csatlakozó detektorba. A detektor jelzi a szétválasztott komponenseket, valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk mérésével. [7.]
I.4.1.1. ábra Gázkromatográf vázlatos felépítése (Forrás: PTE-TTK, Gázkromatográfia) [1.c]
-7-
I.4.2. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)
Az elválasztás technikai eljárások közül az egyik leggyakrabban alkalmazott analitikai módszer. Alkalmazási területei közül fontos szerepe van a gyógyszer analitikai vizsgálatokban, az élelmiszeripari vizsgálatokban, illetve toxikológiai és környezetanalitikai mérésekben. A HPLC készülékek használata során nagy nyomáson kényszerítjük át a folyadék mozgófázist (eluenst) a kis szemcseméretű állófázison, ahol megtörténik az elválasztás. A rendszerben uralkodó nyomásesés, valamint az elválasztás hatékonysága az alkalmazott álló-és mozgófázis minőségének függvénye.
HPLC módszerek csoportosítása -
Normál fázisú folyadékkromatográfia: az állófázis minden esetben polárisabb, mint a mozgófázis. Állófázisnak csak azok az abszorbensek felelnek meg, amelyek poláris felülettel és nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek (szilikagél, alumínium-oxid). Mozgófázisnak
azok
az
apoláros
oldószerek
felelnek
meg,
amelyek
kis
viszkozitással,jó UV áteresztő képességgel és kis forrásponttal rendelkeznek (szénhidrogének, éterek, alkoholok, vasak stb.).
-
Fordított fázisú folyadékkromatográfia: az állófázis polaritását tekintve apolárisabb, mint az alkalmazott mozgófázis. Az állófázis apoláris tulajdonsága mellett követelmény, hogy nagy legyen a mechanikai stabilitás. Napjainkban a szilikagél alapú állófázisok a legelterjedtebbek. A leginkább használt szilikagél alapú töltetek előállítása során a szilikagélt alkil csoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatják és így tudják módosítani a poláris fázist apolárissá.
-8-
A HPLC főbb részei -
Eluenstárolók: az eluensek tárolására általában üvegedényeket használunk.
-
Kigázosító egység: az eluensben oldott gázok eltávolítására szolgáló egység.
-
Szivattyú (eluens pumpa): a szivattyúval szembeni követelmény, hogy pulzálás nélkül, egyenletesen szállítsa a mozgófázist.
-
Keverőegység: az eluensek összekeverésére szolgáló egység
-
Mintaadagoló egység, injektor: feladata a minta bejuttatása a rendszerbe
-
Kromatográfiás oszlop: az állófázisok technikai kivitelezése függ az elválasztások technikai megvalósításától és az alkalmazott kromatográfiás módszertől.
-
Detektor: az elválasztandó vegyületek anyagi minősége és mennyisége jelentősen meghatározza, hogy milyen detektálási módszert kell alkalmazni. [8.]
I.4.2.2. ábra Folyadékkromatográf vázlatos felépítése (Forrás: College of Arts and Science, Waters HPLC/MS) [1.d]
-9-
I.5. Tömegspektrometria A tömegspektrometria vagy tömegspektroszkópia nagyműszeres analitikai módszer, töltött anyagi részecskék, ionok tömegének meghatározására szolgál. Az adott ionok elektromágneses térrel való kölcsönhatásra tömeg/töltés hányadosuk alapján szétválnak. A tömegspektrometria
legfőbb
felhasználási
területe,
a
tiszta
szerves
komponensek
molekulatömegének (összegképletének) és fragmentálódási folyamatok révén a vegyületek szerkezetének a meghatározása mellett analitikai vizsgálatokban is kiválóan alkalmazható. A tömegspektroszkópia nagy érzékenységű, széles tömegtartományú, jól reprodukálható, szelektív és igen alacsony a minta igénye. Elválasztás technikai módszerekkel, így például gázkromatográfiával, kombinálható
a
folyadékkromatográfiával
megfelelő
interface
vagy
hozzákapcsolásával.
kapilláris A
elektroforézissel
tömegspektrométernek
tartalmaznia kell: ionforrást, tömeganalizátort, detektort és vákuumrendszert. [9.]
I.5.1.ábra Tömegspektrométer vázlatos felépítése (Forrás: PTE-TTK, Tömegspektrometria) [1.e]
- 10 -
Ionizációs források (a két használt példa)
-
Elektronütköztetéses ionizáció (EI): a molekula nagy sebességű elektronokkal ütközve ionizálódik, közben páratlan elektronszámú molekulaionok képződnek. A molekulaion tömege gyakorlatilag megegyezik a molekuláéval. Az ütközéshez használt elektronokat izzó katódból nyerjük. Számukat az izzószál hőmérsékletével, energiájukat a feszültség változtatásával befolyásolhatjuk. A rugalmatlan ütközés során az elektronok energiájuk egy részét átadják a molekulának, ami nem csak a molekulák ionizációjára, hanem gerjesztésre is fordítódik. Az ionizáció során szerzett fölös energia hatására a molekulaionból a kötések hasadása miatt további kisebb ionok, ún. fragmensek képződnek. A molekulaion molekulatömeg információt, a fragmens ionok szerkezeti információt szolgáltatnak. Az elektron ionizáció alkalmazásához a mintát el kell párologtatni, ezért csak illékony anyagok vizsgálhatók ezzel a módszerrel.
I.5.2.ábra Elektronütköztetéses ionizáció vázlatos rajza (Forrás: PTE-TTK, Tömegspektrometria) [1.f]
- 11 -
-
Elektrospray ionizáció (ESI): A vizsgálandó nem illékony, ionos, poláros vegyületet valamilyen illékony oldószerben oldjuk. A minta oldatát egy nagyfeszültségű kapillárison át juttatjuk a légtérbe. Elektrosztatikus tér hatására a kapilláris végén lévő folyadék felszínén töltés többlet képződik, így a kapillárisból kilépő folyadék kúpszerűen csúcsosodik, és innen töltéssel rendelkező folyadékcseppek szakadnak le. Aerodinamikai porlasztással kombinálható. Ez azt jelenti, hogy külső csőben inert porlasztógázt alkalmaznak a töltött aeroszol létrehozásához. Mivel a töltött folyadékcseppek még tartalmaznak oldószert, ezek eltávolítására egy fűtött kapillárison vezetjük át, így a párolgás során a cseppek mérete folyamatosan csökken, a töltéssűrűség viszont nő. Hatására még kisebb cseppekre szakad, míg végül szolvatált protonált ionokra szakadnak (MH+). Legfőképpen könnyen protonálódó vegyületek esetén alkalmazzák, apoláris anyagok nem vizsgálhatók ezzel a módszerrel.
I.5.3.ábra Elektrospray ionizáció vázlatos rajza (Forrás: PTE-TTK Kémia, Elméleti háttér) [1.g]
Tömeganalizátorok A legújabb fejlesztések mellett
háromféle
tömeganalizátort
alkalmaznak a
legelterjedtebben napjainkban: kvadrupólt, ioncsapdát és repülési idő analizátort. Ezek közül részletesen a kvadrupólt jellemzem, ezzel voltak felszerelve a munkám során használt műszerek is.
- 12 -
A kvadrupól tömeganalizátor négy párhuzamosan elhelyezkedő elektródból áll. A rudakra egyen- és váltófeszültséget kapcsolnak egyszerre úgy, hogy az egymással szemben lévő rudak potenciálja megegyezik, az egymás mellettieké ellentétes polaritású. A rudak közötti térbe bekerült ionok fajlagos tömegüktől függő pályára állnak. A pozitív töltésűek a pozitív rudat taszítják és a negatív rudat vonzzák, annak irányába tartanak. Mielőtt elérné a rudat, ellentétes polaritásra kapcsolva megváltozik az ion haladási iránya is. Így a polaritás folyamatos változtatásával az ionok oszcilláló mozgása figyelhető meg. Az egyen- és váltófeszültség megválasztásával elérhető, hogy az analizátorban csak egy bizonyos tömeg/töltés értékkel rendelkező ionok jussanak át. [10.]
I.5.4.ábra Kvadrupóltömeganalizátor és az ionok oszcilláló mozgása(Forrás: PTE-TTK Kémia, Elméleti háttér) [1.h]
Vákuumrendszer A tömegspektrométerek jelentős részében vákuum van (kivételt képeznek a légköri nyomáson működő ionforrások), mivel a levegő jelenléte zavarná a tömeganalízist, csökkentené az ionok szabad úthosszát. Az ionoknak el kell jutniuk az ionforrástól a detektorig anélkül, hogy különféle gázmolekulákkal ütköznének. Az ütközés, kölcsönhatás energiaveszteséggel járhat, miközben a részecskék haladási iránya is megváltozik, ami azt eredményezi, hogy nem tudjuk a fajlagos tömegüket pontosan megmérni vagy nem érik el a detektort.
- 13 -
A tömegspektrométerekben a vákuumot a legalább kétfokozatú vákuumrendszer állítja elő. Általában rotációs szivattyú biztosítja az elő- és középvákuumnak megfelelő nyomásértéket. A nagyvákuum-szivattyúk előtti terekben, illetve a mintabeeresztő-rendszer külső részeiben jellemző ez az nyomástartomány. Nagyvákuumban megy végbe az EI ionizáció, a tömeganalízis és a detektálás, ezt diffúziós vagy turbómolekuláris szivattyúk segítségével érhetjük el. [11.]
I.6. Minta-előkészítés
Minden analitikai vizsgálat a minták előkészítésével kezdődik. Ennek megválasztása függ a vizsgálni kívánt hatóanyag tulajdonságától, a minta halmazállapotától, összetételétől, fizikai tulajdonságaitól, illetve a meghatározáshoz használt készülék típusától. A minta előkészítési eljárás alapvetően meghatározza az analízis pontosságát. Kidolgozása és alkalmazása számos esetben több szakmai és gyakorlati problémát vet fel, mint az azt követő, általában rutinszerűen használható analitikai módszer. Ezért a megfelelő technika kiválasztása nagy körültekintést és szakmai hozzáértést igényel és minden esetben igazolnunk kell, hogy a módszer alkalmas a célnak megfelelő pontosságú és megbízhatóságú mérések előkészítésére. Vízminták esetében két különböző extrakciós eljárást részletezek. Az egyik a szélesebb körben alkalmazott, korszerűbb úgy nevezett SPE módszer, a másik a folyadék-folyadék extrakciós módszer. Ezeket a későbbiekben hatékonyságuk szempontjából összehasonlítom.
I.6.1. SPE eljárás
Az SPE elnevezés a solid phase extraction angol kifejezés rövidítése, amely szilárd fázisú extrakciót jelent. Az eljárás során a mintát vákuum vagy gravitáció alkalmazásával átengedjük az adszorbens ágyon meghatározott sebességgel. Két eltérő módon viselkedhet az adott adszorbens. - 14 -
Az egyik esetben maga a vizsgálandó hatóanyag kötődik meg ezen a tölteten, amelyet megfelelő eluenssel lemoshatunk. A zavaró komponensek, illetve az oldószer maradéktalanul áthalad az oszlopon. A másik esetben fordítottan működik a folyamat, tehát a zavaró komponensek tapadnak meg az oszlopon, lényegében tisztító feladatot lát el azáltal, hogy „megszűri” a mintákat. A töltetek paraméterei eltérőek lehetnek, ilyen az anyagi minőség, szemcseméret, fajlagos felület, pórus méret. Ezek kiválasztása a vizsgálni kívánt anyag tulajdonságaitól függenek.
A technikai megvalósítás fő lépései: -
Kondicionálás: a töltet erős, szerves oldószerrel történő mosását, nedvesítését jelenti, melynek célja, hogy a gyártás során visszamaradt szennyezőket és a szemcsék közötti térben lévő levegőt eltávolítsák. Fontos, hogy a végső mosás olyan pH értékű oldószerrel történjen, amely megegyezik a minta oldat pH-jával. Mielőtt a mintát felvinnénk az oszlopra, el kell kerülni a töltet kiszáradását.
-
Mintafelvitel: a meghatározandó anyagok kvantitatív visszatartása az oszlopon, miközben a szennyezők megkötődése minimális. Figyelni kell, hogy a minta áramlása lassú legyen az oszlopon, mert a komponenseknek az oldószerből a felületre történő diffúziójához idő kell.
-
Mosás: az oszlopon gyengébben megkötődött szennyezők eltávolítása. Lényeges, hogy a mosó oldószer erőssége olyan legyen, ami nem indítja el a vizsgálandó komponensek elúcióját.
-
Elúció: a vizsgálandó komponensek leoldása az oszlopról valamilyen erős oldószerrel. Ennek fontos szerepe van a tisztításban is. Térfogatát tekintve érdemes minimumot tartani, mert két kisebb térfogatú eluáló lépés hatékonyabb, mint egy nagyobb. Ezek mellett figyelni kell arra is, hogy az áramlási sebesség lassú legyen, mert hatással lehet a visszanyerési értékekre. [12.]
- 15 -
I.6.1.1.ábra: SPE eljárás lépései (Forrás: Tölgyesi Ádám, Ph.D. doktori értekezés 2011.) [1.i]
I.6.2. Folyadék-folyadék extrakció Folyadék-folyadék extrakció során két egymással nem elegyedő folyadék fázis segítségével az egyik fázisban oldott anyagot a másik fázisba visszük át a többi jelenlévő anyag átvitele nélkül vagy annak minimálisan tartásával. Vízminták esetében jelen lesz egy vizes és egy szerves fázis. Cél, hogy a vízben lévő hatóanyagok átkerüljenek a vele nem elegyedő szerves fázisba. Az extrakció ezen fajtája többek között azért is kedvelt, mert egyszerű eszközökkel gyorsan, hatékonyan elvégezhető. Ennek egyik oka, hogy a két folyadékfázis közötti egyensúly a fázisok mozgékonysága, nagy felületen való keveredése miatt gyorsan, 1-2 perc alatt beáll. A műveletet megfelelő térfogatú rázótölcsérben hajtjuk végre. Lépései: -
Mintabevitel: a rázótölcsért maximum háromnegyedéig töltjük a vizsgálandó vízmintával, majd hozzáadjuk a megfelelő szerves oldószert.
-
Homogenizálás: a keveredést erőteljes rázással érjük el, melyhez hozzásegít a tölcsér csepp formája.
- 16 -
-
Fázisok szeparálása: összerázás után vaskarikára helyezzük a tölcsért és megvárjuk, amíg a két fázis el nem válik egymástól, majd külön-külön leengedjük a fázisokat, így elválasztva azokat egymástól a további mérésekhez [13]. A műveletet többször megismételhetjük az extrakció hatékonyságának növelése érdekében.
I.6.2.1.ábraFolyadék-folyadék extrakció vázlatos felépítése (Forrás: Tudásbázis, anyagok szétválasztása) [1.j]
I.7. Hibaforrások Egy módszer kézbentartásának alapvető eleme az eljárás egyes lépései rendszeres és véletlen hibáinak ismerete. Csak ezek figyelembevételével lehet a lehető legjobban megfelelő pontosságú eljárást kiválasztani, amely a vizsgálatban résztvevő szakemberek közös feladata. Ebben az esetben jómagam végeztem mind a minta előkészítést, mind az analízist. A rendszeres hiba legfőbb forrásai:
helytelen mintavétel: a mintavétel bizonytalansága a rendszeres hibával torzított értékek szórásában nyilvánul meg. Jelen mérési eredményekből kitűnik néhány olyan hatóanyag, melyek szórása egyszer megfelelő értékű (20% alatti), máskor jóval a megengedett érték felett van. Ennek oka adódhat a helytelen mintavételből, injektálásból.
- 17 -
helytelen mintatárolás: mivel legtöbb esetben szobahőmérsékleten illékony oldószerekben oldjuk a hatóanyagokat, ezért nagyon fontos tényező a mintatárolás. Ez alatt értjük a tároló edényt és a helyszínt. Minden esetben jól zárható kémcsőben vagy fiolában tároljuk a mintákat. Rövid idejű tárolás esetén hűtőszekrénybe helyezzük el, hosszabb időtartamra viszont célszerűbb fagyasztószekrénybe. Erre azért fontos odafigyelni, mert helytelen tárolás esetén elpárologhat az oldószer jelentős része, amely eltérő koncentrációt eredményez és valótlan eredményt kapunk.
helytelen minta előkészítés: a minta előkészítése az alapja egy vizsgálati eljárásnak, ezért nagyon fontos, hogy az utasításban leírtak pontos betartásával végezzünk el egyegy műveletet. Ezek hiányában szintén helytelen lesz a kiértékelés.
érvénytelen standard: lényeges, hogy érvényes, ellenőrzött, tiszta standardokkal dolgozzunk
eredmények helytelen kiértékelése: ez alatt értendő például az elektronikus kiértékelés számítógépes software segítségével akkor, ha nem ellenőrizzük az általa integrált csúcsok megfelelőségét (rossz csúcsot értékel), illetve a szerkesztett alapvonal helyességét. Megemlítendő továbbá, hogy ellenőrizzük a méréshez beállított paramétereket. [14.]
- 18 -
II.
Érdemi rész
II.1. Ioncserélt vízhez hozzáadott hatóanyagok visszanyerése SPE oszlopon történő extrakcióval
Ahogy az előbbiekben már említettem, a szilárd fázisú extrakció megfelelőnek bizonyuló minta előkészítési módszer a növény védőszerek kimutatásához vízből. Munkám során az eljárás hatékonyságát vizsgáltam különböző herbicid hatóanyagokra. Ennek lényege, hogy ioncserélt vízhez eltérő koncentrációjú oldatokat adtam a meglévő standard mixekből, amely alatt több mint száz hatóanyagot tartalmazó, 0,05 ng/l koncentrációjú mixet értek, majd megfelelő minta előkészítés után GC-MS/MS illetve LC-MS/MS műszereken mérést végeztem, hogy meghatározzam a visszanyerések mértékét, ezáltal ellenőrizve a módszer hatékonyságát. Egy készülékre nézve, 3 koncentráció szinten, 5 párhuzamos ismételt feldolgozással összesen 20 db mintát készítettem elő, amely magába foglal 5 db kontroll mintát is. Kifejtve: - 5 db 500 ml IV (ioncserélt víz) kontroll minta - 5 db 500 ml IV + 100 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,01 μg/l tesztoldat - 5 db 500 ml IV + 200 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,02 μg/l tesztoldat - 5 db 500 ml IV + 500 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,05 μg/l tesztoldat
II.1.1. Felhasznált anyagok, eszközök Vegyszerek: Minta-előkészítés során víztisztító berendezéssel ellátott tartályból vett ioncserélt vizet használtam, melyhez nagy tisztaságú LC-MS/MS és GC-MS/MS standardokat adagoltam. Az SPE oszlopok mosásához, a hatóanyagok leoldásához és az eszközök mosogatásához a VWR vegyszergyártó cég által forgalmazott metanol, aceton, acetonitril, aceton:etil-acetát=1:1 (v/v) oldatokat alkalmaztam. A pontos és hatékony mérés eléréséhez a mintáimhoz injektálási standardot és úgy nevezett Analyte Protectant oldatot adtam. - 19 -
Ez az oldat a vizsgálandó komponenseket védi a gázkromatográfiás rendszerben az aktív helyeken (pl. liner) való megtapadástól, ezáltal szép csúcsokat és pontosabb eredményeket kapunk. Berendezések, eszközök: A vizsgálatot kalibrált eszközök használatával hajtottam végre. Ezek a következők: 500 ml-es mérőlombik, 5 ml-es centrifuga cső, 25-500 µl-es mikrofecskendő. A pontos tömeg meghatározáshoz analitikai mérleget alkalmaztam. A szilárd fázisú extrakcióhoz200 mg töltetű és 6 ml űrtartalmú ISOLUTE-ENV+SPE patront használtam. Azért esett erre a választás, mert környezeti minták, elsősorban vízminták előkészítéséhez ez a legmegfelelőbb, leghatékonyabb. A további méréseket Varian CP-3800 GC + Varian 320-MS gázkromatográftömegspektrométeren
és
Varian
ProStar
+
Varian
320-MS
folyadékkromatográf-
tömegspektrométeren hajtottam végre.
II.1.2. A módszer végrehajtása Az elemzések során kizárólag nagy tisztaságú standardokat használtam, melyeket a mérés megkezdéséig hűtőszekrényben tároltam. A használt eszközök mindegyikét előzetesen acetonnal elmostam elkerülve a minták beszennyezését. Ioncserélt vízből 20 db 500 ml eltérő koncentrációjú tesztoldatot készítettem. Az első öt minta a kontroll, az azt követők más-más mennyiségben hatóanyagot tartalmaznak. Ezután lemértem az SPE patronok tömegét. Először 5 ml metanollal, majd 10 ml nagytisztaságú vízzel mostam, ezzel kondicionálva azt. Ezek átszívása vízsugár szivattyúval történt 5 ml/perc áramlási sebességgel. Az előkészített oszlopon a vizsgálandó, előkészített vízmintákat a vizsgálat céljának megfelelően 5 ml/perc sebességgel
átszívattam.
Ez
azért lényeges,
mert
a hatóanyagok töltethez
való
adszorbeálásához időre van szükség. Ezután 5 ml nagytisztaságú vízzel öblítettem az oszlopot, majd szárazra szívattam, amíg a tömege az eredeti értéket el nem érte. Az oszlopot 2x2 ml aceton:etil-acetát = 1:1 (v/v) elegyével eluáltam. Az első 2 ml-t hagytam beszivárogni az oszlopba, majd vártam két percet és hozzá adtam a második 2 ml-t. Az eluátumokat együttesen centrifugacsőben fogtam fel, bepároltam és a további meghatározásnak megfelelő minőségű és mennyiségű oldószerben oldottam, LC-MS/MS és GC-MS/MS vizsgálathoz 1 ml acetonitrilben.
- 20 -
Ahhoz, hogy pontos mérést tudjunk végezni, kalibráló oldatokat kell készíteni. A növény védőszer maradékok meghatározásához minimum három pontból álló kalibrációs egyenest kell felvenni. A műszerek érzékenységétől és az injektált mintahányadtól függően arra kell törekedni, hogy a standardok által lefedett linearitási tartományba essen a mintákban detektált hatóanyagok koncentrációja. Készítésükkor célszerű közbenső koncentrációjú munkaoldatokat készíteni. Ebben az esetben 2, 5, 10, 50 és 100 ng/ml-es kalibráló oldatokat készítettem. Az extraktumból a hatóanyagokat gázkromatográfiás és folyadékkromatográfiás módszerekkel határoztam meg. A következő kromatográfiás paraméterek alkalmazhatók annak érdekében, hogy azonosítsuk a minta extraktban jelenlévő hatóanyagot: -
a kérdéses hatóanyag retenciós ideje (RT)
-
MS spektrum
-
ionok tömege
A minta extraktban lévő hatóanyagok azonosításához használt paramétereket összehasonlítjuk a kalibrációs oldatokban talált anyagok paramétereivel. A talált hatóanyag magasabb bizonyossági fokkal való azonosításához további, konfirmációs mérések is szükségesek. A mennyiségi meghatározáshoz az analízist végző műszer műszervezérlő programját használtuk. A kalibrációs egyenes meghatározása: a szoftver az injektált kalibrációs pontok mennyiségét tömeg- vagy koncentrációegységben ábrázolja az injektált kalibrációs pontok területének függvényében, melyekre a legjobb illeszkedésű egyenest és annak egyenletét meghatározza. A kalibrációs egyeneseknek teljesíteniük kell az R² > 0,99 feltételt. R² = kalibráció korrelációs koefficiense.
- 20 -
II.2. Ioncserélt vízhez hozzáadott hatóanyagok visszanyerése folyadékfolyadék extrakcióval A fent említett SPE, szilárd fázisú extrakción kívül folyadék-folyadék extrakcióval is kísérleteztem annak érdekében, hogy meghatározzam a vízmintákban jelen lévő herbicid hatóanyagokat. A minták előkészítése annyiban különbözött az előző eljáráshoz képest, hogy ebben az esetben folyadék-folyadék extrakciót hajtottam végre, ahol egy szerves és egy vizes fázis volt jelen. Ezáltal elértem azt, hogy a vízhez előzetesen hozzáadott hatóanyagok kirázással átkerüljenek a szerves fázisba, melyet a későbbiek során felhasználtam a GC-MS/MS illetve LC-MS/MS műszereken történő méréshez. Egy készülékre nézve 20 db mintát készítettem elő, 5 párhuzamosan ismételt feldolgozással, 3 koncentrációs szinten, amely magába foglal 5 db kontroll mintát. A tesztoldatok elkészítéséhez ugyanolyan koncentrációjú és összetételű standard mixet alkalmaztam, mint II.1. esetben.
Kifejtve: - 5 db 500 ml IV (ioncserélt víz) kontroll minta - 5 db 500 ml IV + 100 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,01 μg/l tesztoldat - 5 db 500 ml IV + 200 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,02 μg/l tesztoldat - 5 db 500 ml IV + 500 μl standard mix (0,05 ng/l) = 0,05 μg/l tesztoldat
II.2.1. Felhasznált anyagok, eszközök Vegyszerek: Minta előkészítés során víztisztító berendezéssel ellátott tartályból vett ioncserélt vizet használtam, melyhez nagy tisztaságú LC-MS/MS és GC-MS/MS standardokat adagoltam. Az eszközök mosogatásához használt acetont, az extrakcióhoz szükséges n-hexánt és a hatóanyagok felvételére alkalmas acetonitrilt a VWR vegyszergyártó cégcsoport szolgáltatta.
- 21 -
A pontos és hatékony mérés eléréséhez a mintáimhoz injektálási és Analyte Protectant oldatot adtam, amely védi a vizsgálandó komponenst. Berendezések, eszközök: A vizsgálatot kalibrált eszközök használatával hajtottam végre. Ilyenek: 500 ml-es mérőlombik, 5 ml-es centrifuga cső, 25-500 µl-es mikrofecskendő. A pontos tömeg meghatározáshoz analitikai mérleget alkalmaztam. A folyadék fázisú extrakcióhoz 1000 ml-es rázótölcsért, szűrőkarikát, szűrőpapírt, üvegtölcsért, az oldószer elpárologtatásához vákuum bepárlót használtam. A
további
méréseket
tömegspektrométeren
és
Varian Varian
CP-3800 ProStar
GC +
+
Varian
Varian
320-MS
320-MS
gázkromatográf-
folyadékkromatográf-
tömegspektrométeren hajtottam végre.
II.2.2. A módszer végrehajtása Az elemzések során kizárólag nagy tisztaságú standardokat használtam, melyeket a mérés megkezdéséig hűtőszekrényben tároltam. A használt eszközök mindegyikét előzetesen acetonnal elmostam elkerülve a minták beszennyezését. Ultra desztillált vízből 20 db 500 ml eltérő koncentrációjú tesztoldat készítettem. Az első öt minta a kontroll, az azt követők másmás mennyiségben hatóanyagot tartalmaztak. Ezt követően előkészítettem az 500 ml-es gömblombikokat, melyekre üvegtölcsérbe helyezett szűrőpapírt tettem, benne 3-4 kis kanál vízmentes Na₂SO₄-al. Erre azért volt szükség, hogy a rázótölcsérből leengedett szerves fázisban lévő esetleges víz maradékot a vízmentes Na₂SO₄megkösse, ezáltal a mintánk kizárólag a szerves fázisban lévő hatóanyagokat tartalmazza. Ezután felszereltem a rázótölcséreket az állványra és előkészítettem a 20 db különböző koncentrációjú, 500 ml-es vizes tesztoldatokat. Ezek mindegyikét beletöltöttem a rázótölcsérekbe, majd 100 ml n-hexánt adagoltam hozzá, amely a szerves fázist jelentette az extrakcióban. Alapos összerázás után 12 percet állni hagytam annak érdekében, hogy a fázisok elváljanak egymástól, majd előbb az alsó vizes fázist engedtem le egy főzőpohárba a tölcsér csapján keresztül, végül az n-hexánt az elkészített gömblombikba. A folyamatot még egyszer megismételtem a hatékonyság növelése érdekében, tehát a főzőpohárban lévő vizet újra beletöltöttem a rázótölcsérbe 50 ml n-hexánnal együtt, összeráztam és külön-külön leengedtem. - 22 -
Az üvegtölcsérben lévő vízmentes Na₂SO₄-ot további n-hexánnal mostam az esetlegesen fennmaradó hatóanyagok bemosása érdekében. A gömblombikba vízmentes Na₂SO₄-on keresztül leengedett n-hexán fázist 2-3 ml-re bepároltam vákuum bepárló berendezés alkalmazásával, majd Pasteur pipetta segítségével átszedtem kalibrált centrifuga csövekbe. Az ezekben lévő 2-3 ml mintákat tovább fújattam N₂-el, ezáltal az oldószer, jelen esetben az n-hexán elpárolgott és a csőben a hatóanyagok maradtak. A további meghatározásnak megfelelő minőségű és mennyiségű oldószerben oldjuk, GC-MS/MS és LC-MS/MS mérésekhez 1 ml acetonitrilbe vettem fel a hatóanyagokat. Ahogy az előzőekben már említettem, ahhoz, hogy pontos mérést tudjunk végezni, kalibráló oldatokat kell készíteni a fentebb leírt utasítások alapján. Az extraktumból a hatóanyagokat szintén gáz- és folyadékkromatográfiás módszerrel határoztam meg.
- 23 -
II.3. A mérés műszeres paraméterei
II.3.1. táblázat GC-MS/MS kromatográfiás paraméterei
Készülék
Varian 3800 GC - 320-MS tömegspektrométer
Ionforrás hőmérséklet
200C
Transfer line hőmérséklet
300C
Manifold hőmérséklet
40C
Vivőgáz (és áramlási sebesség)
He 6.0 (1.2 ml/min)
Analitikai oszlop
Restek Rxi-1 ms30 m × 0.25 mm, df = 0.25μm
Kolonnatér hőmérsékletprogram
50C (1,5 min) 50-180°C: 25°C/min sebességgel (0 min); 180-295°C: 5°C/perc sebességgel (0,3 min), (összesen 30 min)
Injektor hőmérsékletprogram (PTV)
80C (0,5 min) 80-300°C: 200°C/min sebességgel (15 min) (összesen 16,6 min)
Split ratio
Splitless:
Injektált térfogat
3μl
Ionizációs mód
EI poz. (70 eV)
CID gáz (és nyomása)
Ar (1.8mTorr)
- 24 -
Initial ON ratio 40 0,45 min OFF ratio 4,00 min ON ratio 40 6,00 min ON ratio 20
II.3.2. táblázatLC-MS/MS kromatográfiás paraméterei
Készülék
Varian ProStar HPLC + 320-MS system
Előtét oszlop
Restek Ultra C18 10×2.1 mm, 3μm
Analitikai oszlop
Restek Ultra C18 100×2.1 mm, 3μm
Injektált térfogat
10 µL
’A’ eluens
90 v/v % (1 mMNH4COOH / 0.1 v/v% HCOOH vízben) 10 v/v % MeOH
’B’ eluens
MeOH
Áramlási sebesség
0.25 ml/min
Gradiens
0.00 min 1:00 min 2:30 min 9:00 min 17.00 min 18:00 min 24.00 min
0% eluens B 0% eluens B 45% eluens B 100% eluens B 100% eluens B 0% eluensB 0% eluens B
Oszloptermosztát hőmérséklete
40°C
MS határfelület
electrospray ionizáció (ESI)
Porlasztógáz nyomása
60 psi
Szárítógáz nyomása
20 psi
Szárítógáz hőmérséklete
250°C
CID gáz nyomása
1.85 mTorr
- 25 -
III.
Eredmények
A méréseket öt párhuzamban végeztem, tehát egy adott koncentrációjú mintából 5-5 db-ot készítettem. Az összesített eredményeket tüntettem fel az alábbiakban, majd mennyiségi meghatározás alapján összehasonlítottam a két módszert. A kromatográfiás vizsgálat a készülék paramétereinek beállításával kezdődött. Ilyenek: vivőgáz áramlási sebessége, hőmérsékleti paraméterek, égéshez szükséges gázok áramlási paraméterei, eluens összetétel.
Felhasznált képletek, számítási módok:
A hatóanyag koncentrációja a mintában:
hatóanyag maradék mennyisége (μg/l) =
A = csúcsterület T = kalibrációs egyenes tengelymetszete M = kalibrációs egyenes meredeksége I = a kolonnára injektált minta mennyisége
Visszanyerés: a módszerek megfelelő végrehajtásának, teljesítményének ellenőrzésére az egyik legfontosabb eljárás. A visszanyerési vizsgálatokat az analitikai mintához az extrakció megkezdésekor adott ismert mennyiségű analitikai standardokkal végezzük és a vizsgálati módszert végrehajtva meghatározzuk a visszanyert standard mennyiségét. A visszanyerési vizsgálatokat 0,01-0,05µg/l közötti szinten végeztem el.
- 26 -
Rā% = visszanyerési átlagok százalékban, amely akkor megfelelő, ha értéke 70 % és 120% közé esik. Ez a tartomány a laboratórium által meghatározott, ezen kísérletre alkalmazható. A módszer pontosságát, helyességét fejezi ki. A kapott érték és a valódi érték egyezésének mértéke, a módszer rendszeres hibájának jellemzője. Számítása kétféleképpen történhet:
R (%) =
* 100
C = mérések átlaga Cref= referencia anyag koncentrációja
R (%) =
*100
R = visszanyerés mértéke V = visszanyert mennyiség a hozzáadott mintában H = hozzáadási szint elvi mennyisége
RSD % = visszanyerések relatív szórása százalékban, értéke akkor megfelelő, ha 20% alatt van (szintén a mi esetünkben). Precizitást fejez ki, amely azt jellemzi, hogy hogyan szóródnak az előírt körülmények alatt végzett, ismételt mérések eredményei. A módszer véletlen hibáját jellemzi.
RSD% =
SD= tapasztalati szórás C= mérések átlaga
- 27 -
* 100
III.1. GC-MS/MS-en végzett mérések eredményei és azok kiértékelése
A GC-MS/MS az egyik leghatékonyabb műszer a különböző növény védőszerek kimutatására. A szermaradékok meghatározása több lépésből álló komplex feladat. Az analízis eredményének helyességét, ismételhetőségét, reprodukálhatóságát az alkalmazott módszer egyes lépéseinek végrehajtása befolyásolja. Az alábbi táblázat (III.1.1. táblázat) foglalja össze az SPE eljárás mérési eredményeit. Egy koncentrációs szinten belül öt párhuzamos mérést végeztem, ezt az öt eredményt átlagoltam és azt tüntettem fel az alábbiakban. Első ránézésre megállapíthatjuk, hogy az egyes hatóanyagok nem mindegyik koncentrációs szinten estek bele az elfogadott 70-120 % visszanyerési tartományba, illetve a 20 % alatti szórásba. Mivel a legalacsonyabb koncentráció, a 0,01 µg/l viszonylag kicsi érték, ezért ezen a szinten a megengedett szórás 30%. Vannak olyan komponensek, ahol a visszanyerési eredmények megfelelőek, de szórásuk kiesik a megengedett tartományból. Általánosságban az a következtetés vonható le ilyenkor, hogy a módszer nem elég megbízható azon az alacsony szinten (pl. metribuzin esetében). Némely esetben viszont nem a legalacsonyabb szinten jelentkezett az elvártnál nagyobb szórás, hanem magasabb szinten. Példaként az atrazint, fluorokloridont és a terbutilazint lehet említeni. Láthatjuk, hogy relatív szórásuk nem sokkal tér el a 20%-tól, illetve azt is, hogy a három szintből csupán egy olyan van, ahol ez az érték nem megfelelő. Ezeknél általában az alacsonyabb és magasabb visszanyerési szintek igazolják a módszer alkalmazhatóságát az adott komponensre, csupán az adott szinten valamely hibatényező nagyobb mértékű volt (ez eredhetett az alapminta addícionálásánál vétett hibából, a minták beméréséből, az elúció hatékonyságából, stb.) További következtetést lehet levonni a bifenox hatóanyagot tekintve. A kapott értékekből arra a megállapításra jutottam, hogy a koncentrációs szintek növelésével egyenes arányban nő a visszanyerési százalék is, tehát a legmagasabb szinten, jelen esetben 0,05 µg/kg koncentrációnál kaptam a legjobb visszanyerési átlagot. Erre a hatóanyagra tehát csak magasabb koncentráció szinten megbízható a módszer. Ellentétben az előző komponenssel, a cinidonetil, oxifluorfen és pendimetalin esetében ez az arányosság fordítottan nyilvánult meg. Meglepő, hogy a legmagasabb szinten alacsonyabb visszanyerési érték figyelhető meg, mint a kisebb szinteken. - 28 -
Összességében az ilyen csekély eltérések ellenére az SPE módszer még pozitívnak és megfelelőnek értékelhető a vizsgált hatóanyagokra, mint minta-előkészítési eljárás.
III.1.1. táblázatSPE eljárás eredményei a 3 koncentrációs szinten GC-MS/MS-en
Σ 0,01 µg/l
Σ 0,02 µg/l
Σ 0,05 µg/l
Hatóanyagok acetoklór alaklór atrazin aziprotrin bifenox cinidon etil cikloát dimetaklór dimeténamid fluorokloridon metazaklór metolaklór metribuzin molinát napropamid oxifluorfen pendimetalin simazin terbacil terbutilazin
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
114,7%
11,6%
117,8%
14,0%
113,6%
6,4%
109,5%
4,5%
93,6%
9,1%
98,7%
5,4%
79,0%
28,6%
78,0%
24,9%
100,6%
15,0%
113,5%
17,6%
112,5%
16,2%
96,8%
10,8%
67,4%
35,3%
69,5%
56,8%
92,3%
14,3%
95,6%
3,5%
81,5%
8,2%
64,8%
17,5%
88,6%
18,2%
98,5%
15,3%
86,8%
13,2%
149,0%
19,8%
94,6%
12,2%
104,8%
3,5%
80,9%
22,2%
97,2%
9,8%
101,3%
10,5%
113,3
15,3
95,7%
22,5%
116,1%
7,5%
102,7%
25,4%
89,0%
8,2%
102,7%
9,5%
106,8%
13,1%
100,8%
10,3%
108,9%
6,2%
96,2%
30,9%
88,5%
13,7%
104,6%
5,8%
79,6%
19,6%
110,7%
5,2%
100,9%
6,0%
118,9%
12,8%
106,3%
7,4%
109,7%
6,3%
86,4%
15,6%
72,9%
8,6%
48,2%
16,3%
100,3%
12,7%
82,1%
15,4%
66,1%
11,4%
119,8%
14,2%
76,9%
17,2%
92,1%
19,0%
103,9%
15,1%
89,0%
16,0%
90,6%
10,3%
120,4%
22,7%
75,5%
31,2%
99,3%
8,8%
A következő táblázatban (III.1.2. táblázat) foglaltam össze a folyadék-folyadék extrakciós eljárás mérési értékeit. Külön-külön látható a három eltérő koncentrációs szint, ezáltal megállapíthatjuk, hogy az egyes szinteken mennyire hatékony a módszer. Ha vetünk egy pillantást a táblázatra, azt a következtetést vonhatjuk le elsőre, hogy több olyan komponens szerepel, amelyek egyáltalán nem, vagy csak egy bizonyos szinten jött vissza, de ott sem megfelelő mennyiségben, például cikloát, molinát, simazin esetében.
- 29 -
III.1.2. táblázat Folyadék-folyadék extrakció eredményei a 3 koncentrációs szinten GC-MS/MS-en
Σ 0,01 µg/l
Σ 0,02 µg/l
Σ 0,05 µg/l
Hatóanyagok acetoklór alaklór atrazin aziprotrin bifenox cinidon etil cikloát dimetaklór dimeténamid fluorokloridon metazaklór metolaklór metribuzin molinát napropamid oxifluorfen pendimetalin simazin terbacil terbutilazin
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
71,8%
19,9%
71,5%
16,7%
87,5%
19,8%
104,0%
16,7%
85,5%
15,8%
94,4%
14,8%
55,9%
48,0%
61,4%
39,8%
46,3%
29,5%
108,9%
28,0%
97,5%
16,6%
92,1%
17,9%
101,3%
72,3%
109,2%
19,9%
106,5%
17,4%
96,0%
18,2%
99,2%
11,6%
88,1%
17,1%
-
-
-
-
60,6%
18,9%
89,3%
14,8%
81,8%
16,1%
91,7%
12,1%
78,5%
19,3%
77,5%
12,5%
94,9%
18,4%
110,3%
29,9%
135,1%
19,9%
108,6%
13,8%
86,0%
20,8%
89,9%
8,0%
79,6%
33,5%
106,3%
28,6%
100,7%
19,4%
99,5%
17,3%
41,7%
132,2%
24,9%
32,9%
18,7%
47,1%
-
-
-
-
47,6%
46,4%
90,7%
29,6%
100,1%
12,5%
105,7%
18,2%
101,7%
23,9%
117,1%
11,8%
97,5%
16,1%
104,4%
16,3%
111,0%
2,2%
84,7%
19,9%
-
-
-
-
31,4%
28,1%
28,4%
146,9%
-
-
4,6%
39,7%
82,9%
15,2%
93,1%
7,6%
94,9%
17,8%
Utolsó táblázatként (III.1.3. táblázat) összesítettem az eredményeket. Külön átlagoltam az egyik, majd másik módszer szerinti számértékeket, ezáltal tisztábban láthatjuk, melyik komponensre és mennyivel hatékonyabb egy-egy eljárás. Összességében elmondható, hogy az SPE minta-feldolgozásnál, 21 vizsgált hatóanyagból csupán kettő olyan van, amely kiugró értékeket tartalmaz, de azok sem nagymértékben térnek el a megengedett 20%-tól. Ellenben a folyadék-folyadék extrakciónál a 21 összetevő közül 7-et említhetünk, amelyekre az eljárás nem megfelelő. Bár mindkét minta-előkészítési eljárás hatékonynak bizonyult GC-MS/MS műszerre, az SPE szilárd fázisú extrakció nagyobb számú herbicid esetén produkált megbízható eredményeket.
- 30 -
III.1.3. táblázat A két módszer összesített eredményei GC-MS/MS-en
∑ (GC-MS/MS)
Hatóanyagok
1. 2. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.
acetoklór alaklór atrazin aziprotrin bifenox cinidon etil cikloát dimetaklór dimeténamid fluorokloridon metazaklór metolaklór metribuzin molinát napropamid oxifluorfen pendimetalin simazin terbacil terbutilazin
SPE eljárás
Folyadék-folyadék extrakció
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
115,4%
10,7%
76,9%
18,8%
100,6%
6,3%
94,6%
15,8%
85,9%
22,8%
54,5%
39,1%
107,6%
14,9%
99,5%
20,9%
76,4%
35,5%
105,6%
36,6%
80,6%
9,7%
94,4%
15,6%
91,3%
15,6%
60,6%
18,9%
116,2%
11,8%
87,6%
14,3%
93,1%
14,2%
83,6%
16,7%
113,7%
19,2%
118,0%
20,2%
98,1%
14,4%
85,2%
20,8%
105,5%
9,9%
102,2%
21,8%
96,4%
16,8%
28,4%
70,7%
97,0%
10,3%
47,6%
46,4%
111,7%
8,8%
98,8%
20,1%
70,2%
13,5%
105,4%
17,3%
82,8%
13,2%
100,0%
12,8%
96,3%
16,8%
31,4%
28,1%
94,5%
13,8%
16,5%
93,3%
98,8%
20,0%
90,3%
13,6%
A III.1.1. ábrán összesítettem a két módszer eredményeit hatóanyagokra lebontva. A fenti (III.1.3. táblázat) táblázat alapján készítettem el a diagramot, ahol X-tengelyen jelöltem számokkal a hatóanyagokat, Y-tengelyen pedig a visszanyerési átlagokat. Talán ez szemlélteti a legjobban számunkra, hogy amíg az SPE eljárás szerint előkészített mintákban a hatóanyagok visszanyerési faktorai nagyrészt 70 - 120% között mozognak, addig a folyadék extrakciós módszer értékei közül kevesebb éri el az elfogadható tartományt.
- 31 -
III.1.1. ábraÖsszesített eredmények, módszerhatékonyság GC-MS/MS-en, ahol X-tengely a hatóanyagokat jelöli, Y-tengely a visszanyerési átlagokat
Az alábbi ábra (III.1.2. ábra) a molinát nevű herbicid kromatogramját szemlélteti. Piros színnel az SPE eljárás szerint mért csúcsot láthatjuk, zölddel pedig a folyadék-folyadék extrakció szerintit. A táblázatban feltüntetett eredményből, és a kromatogramból is kitűnik, hogy a piros sokkal intenzívebb csúcsot mutat, közel 100%-os a visszanyerés, ellenben a zöld csúccsal. Ez az ábra is megerősíti számunkra, hogy melyik a hatékonyabb minta-előkészítési eljárás.
- 32 -
III.1.2. ábraMolinátkromatogramja a két eljárással
III.2. LC-MS/MS-en végzett mérések eredményei és azok kiértékelése A másik alkalmas műszer növény védőszerek kimutatására az LC-MS/MS. A fentiekhez hasonlóan, szintén táblázatban összesítve szemléltetem a kapott eredményeket. Elsőként az SPE módszert részletezném, amelyet a III.2.1. táblázat reprezentál. Piros színnel azok az értékek vannak, jelölve, amelyek kiesnek a megengedett tartományból. Visszanyerési átlagot tekintve 70-120%, szórásnál pedig 20% alatt, kivéve a legkisebb 0,01 µg/l szinten, ott 30% alatti az elfogadott. Zöld színnel azoknak a komponenseknek a neveit jelöltem, amelyek szerves savak. Ezt azért lényeges kiemelni, mert láthatjuk, hogy egyik esetben sem mondható el, hogy megfelelő a visszanyerés. Ennek az az oka, hogy a molekulák karboxil csoportot tartalmaznak, amely poláris tulajdonságú, ezért ionizálódik vízben, hidrofil jellegű. Kivételt képez az ioxynil, mert az fenol típusú, így –COOH csoport helyett szintén poláris –OH csoport van jelen.
- 33 -
Mivel a kísérlet során ioncserélt vizet használtam, és ehhez adtam a különböző koncentrációjú hatóanyag oldatot, így biztos, hogy a fent említett szerves sav típusú komponensek vízben jobban oldódnak, ezért sem az SPE oszlopon nem adszorbeálódnak, vagy csak igen kis mértékben, sem a folyadék-folyadék extrakció során nem oldódtak át a szerves fázisba, ezáltal magyarázhatók a táblázatban látható kedvezőtlen értékek. A jövőre nézve, ha ezeket a felépítésű komponenseket szeretnénk vizsgálni, kimutatni, akkor a víz pH értékét el kell tolni a savas tartományba, ezáltal a szerves savak nem adnak le protont, oldhatatlanná válnak vízben, és kimutathatóságuk hatékonyabb lesz. A lenacil hatóanyagot nézve megállapítható, hogy kis koncentrációs szinten alacsony visszanyerési értéket kaptam, de növelve a töménységet, ez az érték is növekedett, tehát erre az összetevőre a módszer csak a második és harmadik szinten alkalmas.
III.2.1. táblázatSPE eljárás eredményei a 3 koncentrációs szinten LC-MS/MS-en
Σ 0,01 µg/l
Σ 0,02 µg/l
Σ 0,05 µg/l
Hatóanyagok Diklórprop Diuron Etofumeszát Flufenacet Fluometuron Haloxifop Hexazinon Ioxynil Izorpoturon Izoxaflutole Lenacil Linuron Malaoxon Malation MCPA MCPB MCPP Metamitron Metobromuron Propakvizafop Tri-Allate
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
71,8% 105,4%
15,7% 13,7%
34,1% 96,4%
26,3% 14,9%
12,4% 97,2%
9,4% 10,0%
110,0%
10,9%
91,3%
16,2%
98,7%
15,3%
60,0% 100,2%
14,8% 5,5%
84,4% 91,4%
11,0% 11,7%
89,7% 101,4%
8,0% 8,0%
76,0%
21,3%
34,0%
9,1%
11,9%
57,1%
90,6%
7,4%
93,1%
3,8%
82,9%
9,6%
68,8%
4,9%
34,6%
21,9%
10,4%
56,1%
95,4%
5,2%
94,1%
8,7%
98,4%
7,0%
63,6% 54,6%
2,4% 23,8%
72,9% 78,6%
17,0% 14,3%
89,0% 88,3%
9,2% 10,6%
87,0%
18,1%
105,3%
11,3%
94,4%
14,6%
84,4% 90,6%
10,4% 14,8%
89,1% 99,5%
1,8% 1,4%
95,2% 97,2%
9,2% 9,8%
98,8% 105,4% 87,4%
11,6% 30,9% 16,4%
46,5% 84,0% 42,1%
16,6% 46,6% 31,8%
16,8% 45,0% 13,8%
4,2% 25,0% 7,4%
23,4% 93,6% 49,8%
223,6% 14,8% 19,8%
101,4% 100,9% 68,9%
21,0% 9,2% 25,8%
55,8% 94,5% 48,1%
8,2% 5,2% 25,2%
166,6%
26,9%
118,1%
30,0%
70,5%
16,3%
- 34 -
A GC-MS/MS műszert tekintve az előzőekben feltüntettem a folyadék extrakciós eljárás eredményeit is táblázatban. Ebben az esetben ez külön nem szerepel, mert nem kaptam olyan eredményt, amely megfelelő lett volna, ezért egy összesítő, összehasonlító táblázaton (III.2.2. táblázat) keresztül mutatom be a kétféle módszert. Jól látható, hogy nem szerepel olyan hatóanyag a listában, amelyre alkalmas lett volna a minta-előkészítés. Ennek az lehet az oka, hogy nem megfelelő extrahálószert választottam. A kísérlet során csupán egy féle oldószerrel, n-hexánnal dolgoztam az idő rövidsége miatt, amely nem bizonyult elég szelektívnek ahhoz, hogy a vizsgálandó komponensek kimutathatóak legyenek. A jövőben érdemes más extrahálószerekkel próbálkozni, például diklór-metánnal, etil-acetáttal. Tehát összességében megfogalmazható, hogy LC-MS/MS műszerre nézve a folyadék-folyadék extrakciós mintafeldolgozási eljárás egyelőre alkalmatlan a táblázatban felsorolt herbicid hatóanyagokra, további kísérletekre és fejlesztésre van szükség.
III.2.2. táblázatA két módszer összesített eredményi LC-MS/MS-en
∑ (LC-MS/MS)
Hatóanyagok
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
Diklórprop Diuron Etofumeszát Flufenacet Fluometuron Haloxifop Hexazinon Ioxinil Izorpoturon Izoxaflutol Lenacil Linuron Malaoxon Malation MCPA MCPB MCPP
SPE eljárás
Folyadék-folyadék extrakció
Rā%
RSD%
Rā%
RSD%
39,4%
17,1%
33,0%
4,5%
99,7%
12,9%
12,6%
39,0%
100,0%
14,1%
61,0%
39,6%
78,0%
11,3%
34,6%
20,8%
97,7%
8,4%
7,9%
55,9%
40,6%
29,2%
13,6%
123,6%
88,9%
6,9%
0,0%
0,0%
37,9%
27,6%
33,0%
24,7%
96,0%
7,0%
16,1%
69,2%
75,2%
9,5%
35,0%
37,2%
73,8%
16,2%
0,0%
0,0%
95,6%
14,7%
63,4%
35,7%
89,6%
7,1%
8,9%
49,0%
95,8%
8,6%
58,4%
37,5%
54,0%
10,8%
33,6%
64,9%
45,5%
34,2%
24,7%
68,0%
47,8%
18,5%
29,7%
56,0%
- 35 -
18. 19. 20. 21.
Metamitron Metobromuron Propakvizafop Tri-Allate
60,2%
84,2%
0,0%
0,0%
96,3%
9,7%
44,4%
38,9%
55,6%
23,6%
21,6%
72,0%
118,4%
24,4%
40,5%
27,6%
Az alábbi ábra (III.2.1. ábra) további megerősítésként szolgál, hogy az SPE eljárás lényegesen hatékonyabb, mint a folyadék extrakció. A fenti összefoglaló táblázat alapján készítettem a diagramot, ahol X-tengelyen a komponenseket láthatjuk számokkal kifejezve, Y-tengelyen a visszanyerési százalékot. Egyértelműen megfigyelhető, hogy a pirossal jelzett folyadék-extrakciós módszer komponensei közül egyik sem éri el a 70-120%-os tartományt.
III.2.1. ábraösszesített eredmények, módszerhatékonyság LC-MS/MS-en, ahol ahol X-tengely a hatóanyagokat jelöli, Y-tengely a visszanyerési átlagokat
- 36 -
IV.
SPE eljárás alkalmazása tényleges mintákon
IV.1. Természetes vizek vizsgálata növény védőszerekre
A növény védőszerek a kártevők pusztítására használatos anyagok. Hatásuk azonban az alacsonyabb rendű élőlényeken kívül a magasabb rendűekre, állatokra, emberre is káros lehet. A kémiai növényvédelemnek azon kívül, hogy számos előnye van, hátránya is. A különböző peszticidek, de különösen a herbicidek évről évre ismétlődő használata oly mértékű akkumulálódáshoz vezethet a talajban illetve a vízállásos területeken, hogy a kultúrnövények fejlődése gátolt lesz vagy helyenként rövidebb-hosszabb időre lehetetlenné is válik. A növény védőszerek használatának egészségügyi vonatkozásai is vannak. Ilyenek a növényvédőszer-maradékkal
szennyezett
élelmiszer,
takarmány,
melyek
mérgezést
idézhetnek elő akár emberben, akár haszonállatokban. A vegyszeres növényvédelem során a szerek a környező levegőbe jutnak, a talajba kerülnek, a csapadékvízzel a vízgyűjtőkbe sodródhatnak, illetve a talajvízbe szivároghatnak és ezzel az egész élővilágot különféle jellegű és jelentőségű mérgezési veszéllyel fenyegethetik. Annak kimutatására, hogy a kifejlesztett SPE szilárd fázisú extrakció mennyiben alkalmazható tényleges minták vizsgálatában, a módszert különféle környezeti mintákon is kipróbáltam. Diplomamunkám második részében a természetből általam gyűjtött vizeket vizsgáltam és készítettem elő kromatográfiás mérésekre, hogy megállapítsam, tartalmaznak-e növény védőszereket, illetve teszteltem az eljárás kivitelezhetőségét. A dolgozat első részében két féle minta-előkészítési módszert tanulmányoztam herbicidek kimutatására, az egyik szilárd fázisú extrakció volt, a másik folyadék-folyadék extrakció. Ezek közül az SPE szilárd fázisú extrakció bizonyult hatékonyabbnak, ezért a továbbiakban ezzel az eljárással készítettem elő éles mintáimat. Összesen nyolc különböző helyről, Borsod-Abaúj-Zemplén megye mezőgazdasági területeiről gyűjtöttem mintát, ezek közül négy kútból származó víz, a másik négy pedig természetes tavakból vett felszíni víz. Olyan terülteket kerestem leginkább, amelyek körül földművelés, növénytermesztés folyik, ahol nagy eséllyel használnak permetszereket, műtrágyákat. A kísérlet végrehajtásával megállapítható, hogy az alkalmazott permetszerek milyen mértékben szivárognak be a talajba és lesznek abból kimutathatók továbbá mennyire jelentenek veszélyt az élővilágra.
- 37 -
IV.1.1. Mintavevő helyszínek Az előbbiekben már említettem, hogy a kísérlethez szükséges víz mintákat olyan helyszínekről gyűjtöttem, ahol nagy valószínűséggel alkalmaznak növény védőszereket. Két olyan ásott kutat is választottam, amelyek saját tulajdonban vannak, saját kerthelyiségben, ahol nem történt rendszeres és nagymértékű permetezés.
A helyszínek a következők:
1. minta: kútvíz I. (Edelény, Széchenyi 4., saját kút) 2. minta: kútvíz II. (Edelény, Vörösmarty 10/b, saját kút) 3. minta: kútvíz III. (Edelény-Bilíz) 4. minta: tó víz IV. (Múcsony-Cseres bánya függőakna) 5. minta: tó víz III. (Múcsony nád-Minta II. tábla) 6. minta: tó víz II. (Múcsony nád-Cinere) 7. minta: tó víz I. (Boldvai bánya tó) 8. minta: kútvíz IV. (Sajólád-Gyömrőpuszta)
- 38 -
IV.1.1.1. ábraMintavevő helyszínek 1-6. (Forrás: Google maps)
IV.1.1.2. ábraMintavevő hely Boldvai bánya tó (Forrás: Google maps)
- 39 -
IV.1.1.3. Mintavevő hely Sajólád-Gyömrőpuszta (Forrás: Google maps)
IV.1.2. Minta-előkészítés
A minta-előkészítés a dolgozat első részében leírtak szerint történik. A vizsgálandó vizeket 1,5 literes üveg palackban gyűjtöttem össze. A méréshez 500 ml-re volt szükség, melyet
vákuum
szivattyú
és
szűrőpapír
segítségével
átszűrtem,
hogy a
lebegő
szennyeződéseket eltávolítsam. A kísérlethez használt eszközöket előzetesen acetonnal elmostam, hogy elkerüljem a mintáim beszennyezését. Az SPE patronokat előkészítettem, lemértem a tömegüket, először 5 cm³ metanollal majd 10 cm³ ioncserélt vízzel mostam, ezáltal kondicionálva azokat. Ezután az átszűrt 500 ml-es mennyiséget átszívattam az oszlopokon 5 cm³/perc sebességgel, hogy az esetlegesen jelen lévő hatóanyagoknak legyen ideje megtapadni a tölteten. Az oszlopot szárazra szívattam, amíg az eredeti oszloptömeget vissza nem kaptam. A hatóanyagok leoldását aceton:etilacetát= 1:1 elegyével végeztem, melyet kalibrált centrifugacsőbe fogtam fel, bepároltam és végül 1 ml acetonitrilbe oldottam a további LC-MS/MS és GC-MS/MS mérésekhez.
- 40 -
IV.1.3. Eredmények Az alábbi táblázat (IV.1.3.1.) szemlélteti a peszticid hatóanyagok mennyiségét az általam gyűjtött vízmintákban. Első ránézésre látható, hogy mindegyik tartalmaz növény védőszereket bizonyos mennyiségben. Ezek az értékek azonban jóval a megengedett határérték
alatt
vannak.
A
201/2001.
(X.25.)
Kormányrendelet
1.
mellékletében
megfogalmazottak szerint, amely a vízminőségi jellemzőket foglalja magában, 0,50 µg/l a jelenlévő összes peszticid határértéke, az egyes hatóanyagoké pedig 0,10 µg/l. Ezek az értékek az ivóvízben megengedett határszintek. Ebben az esetben a 100 ng/l határérték feletti mennyiség számít veszélyesnek ivóvíz szempontjából. Ez nem azt jelenti, hogy az előbb említett érték alatt az adott vízminta iható, ugyanis ahhoz, hogy egy vizet ivóvíz minőségűnek tituláljuk, több kritériumnak kell megfelelni. A peszticid hatóanyagok mennyisége csak egy közülük. A nyolc minta közül egy van, amely tartalmaz olyan hatóanyagot, amelynek mennyisége a megengedett érték felett van. A 4. minta Múcsony-Cseres bánya függőakna tó vízből származik, e körül erőteljes mezőgazdasági munkálatok folynak, minden oldalról szántóföld veszi körül. Nem véletlen, hogy ez a minta tartalmazza a legtöbb féle peszticid hatóanyagot, illetve az egyetlen határérték felettit. Összességében azonban elmondható, hogy ezek a hatóanyagok beoldódnak ugyan a természetes vizekbe, elérik a kimutatható tartományt, mégsem számítanak veszélyes mennyiségnek ivóvíz szempontjából. Ez persze nem azt jelenti, hogy nem károsítják az élővilágot. Környezeti mintáim vizsgálatával is sikerült alátámasztanom, hogy az SPE szilárd fázisú extrakció valóban megfelelő minta-előkészítési eljárás növény védőszerek kimutatására.
- 41 -
IV.1.3.1. táblázat Növény védőszerek jelenléte víz mintákban
Minták (ng/l) Hatóanyagok
1
2
3
4
5
azoxystrobin (fungicid)
-
-
-
22
-
ciprokonazol (fungicid)
-
-
-
114,9
-
dazomet (fungicid)
-
-
-
2,475
dimeténamid (herbicid)
-
-
-
fluzilazol (fungicid)
-
-
metazaklór (herbicid)
-
metolaklór (herbicid) paklobutrazol (fungicid)
7
8
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,655
-
-
-
-
-
2
-
-
-
-
-
-
3,03
-
0,011
-
-
-
-
-
0,152
-
-
-
0,037
-
-
-
29,5
-
-
-
-
propoxur (insecticid)
10,13
7,05
9,36
7,6
2,8
7,1
5,2
6,4
terbutilazin (herbicid)
0,098
-
-
0,094
-
-
-
-
- 42 -
6
V.
Összefoglalás
A magas szintű mezőgazdasági termeléshez nélkülözhetetlen növény védőszer felhasználás közismerten sokféle környezeti és egészségügyi problémát okoz. A veszélyek csökkentése és az újabb, környezetkímélőbb technológiák kifejlesztése érdekében szükség van a növényvédő szerek maradékainak pontos meghatározására. Diplomamunkámban ilyen rendszereket dolgoztam ki, illetve vizsgáltam különböző herbicid típusú növény védőszerekre víz mintákban. A dolgozat első részében kétféle minta-előkészítési módszert teszteltem ioncserélt vízhez mesterségesen adagolt növény védőszer oldatokkal. Erre azért volt szükség, hogy kiderítsem, melyik módszer a hatékonyabb, mivel ezek az eljárások eddig csak néhány hatóanyagra voltak érvényesítve. Munkám során leginkább herbicidekkel, gyomirtó szerekkel foglalkoztam. Mindkét minta-előkészítési módszer alapja az extrakció, a különbség annyi az eljárások között, hogy az egyik szilárd fázison megy végbe, a másik folyadék-folyadék megoszlatáson keresztül zajlik. Első lépésként 15-15 db 500 ml-es tesztoldatot készítettem ioncserélt vízből úgy, hogy eltérő mennyiségeket adagoltam a rendszerhez a meglévő standard mixekből, ezáltal eltérő koncentrációt értem el. Minden koncentrációs szintből 5-5 db készült, így három koncentrációs szinten öt párhuzamban végeztem el a kísérletet a validáláshoz. A három tesztelt szint a következő volt: 0,01 µg/l; 0,02µg/l és 0,05 µg/l Továbbá összehasonlítási alapként szükség volt 5-5 db kontroll mintára is (egyenként 500 ml hatóanyag mentes ioncserélt víz). A kísérlet második lépésében az elkészített tesztoldatokat először az egyik, majd a másik módszer szerint készítettem elő a további analitikai mérésekhez. A szilárd fázisú extrakcióhoz 6 ml-es, 200 mg töltet mennyiségű ISOLUTE ENV+ SPE patronokat használtam. A patronok feladata, hogy a rajtuk keresztül átszívatott 500 ml mennyiségű tesztoldatokban lévő hatóanyagok megtapadjanak a tölteten, melyeket megfelelő oldószerrel kalibrált centrifugacsőbe moshatunk le. Az így kapott eluátumot bepároltam és a további GC-MS/MS és LC-MS/MS vizsgálatokhoz 1 ml acetonitrilben oldottam. Folyadék-folyadék extrakció esetében az oldatokat rázótölcsérbe töltöttem n-hexánnal együtt, amely a szerves fázis szerepét töltötte be a rendszerben. - 43 -
A folyamat lényege, hogy a vízben lévő hatóanyagok intenzív rázás után átkerüljenek a szerves fázisba, melyet a hexán bepárlása után centrifuga csőbe szívtam át. További szárazra párlás után szintén 1 ml acetonitrilbe vettem fel a hatóanyagokat a mérésekhez. Az előkészített víz mintákat GC-MS/MS és LC-MS/MS analitikai műszereken vizsgáltam
tovább,
kizárólag
visszanyerési
eredményeket
rögzítettem.
Megfelelő
eredménynek számított a 70 – 120% értékek közötti visszanyerési érték illetve a 20% alatti relatív szórás. A számokból kiderült, hogy a szilárd fázisú extrakció jóval hatékonyabb mintaelőkészítési módszer, mint a folyadék-folyadék extrakció. Így megállapítottam, hogy a vízben lévő herbicid hatóanyagok kimutatására ez a legalkalmasabb eljárás. Miután közel 60 db herbicid hatóanyagra elvégeztem a validálási eljárást, tényleges mintákat is vizsgáltam a hatékonyabbnak bizonyuló minta-előkészítési módszerrel. BorsodAbaúj-Zemplén megye különböző területeiről gyűjtöttem vizeket, összesen 8 db-ot. Olyan helyszíneket választottam, ahol nagy eséllyel történik permetezés, műtrágyázás, földművelés, növénytermesztés. A kísérlet végeztével fény derült arra, hogy az SPE eljárás ténylegesen alkalmazható valódi víz minták vizsgálatára, illetve arra is, hogy ha nem is nagy mennyiségben, de mindegyik területről származó minta tartalmazott növény védőszereket. Megállapítható tehát, hogy a különböző rovar- és gombaölő szerek valamint gyomirtó szerek bemosódhatnak a talajba, vizekbe, károsítva azzal az élővilágot.
- 44 -
VI.
Irodalomjegyzék
[1.] Dr. Bordás Sándor; Veszélyes növény védőszerek, Mezőgazdasági Kiadó, 1967, Budapest (könyv) [2.] OcskóZ.; Molnár J.; Erdős Gy., Növényvédő szerek, termésnövelő anyagok I-II. Földművelődésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium, 2003, Budapest (könyv) [3.] Stefanovics P., Talajvédelem, környezetvédelem, Mezőgazdasági Kiadó, 1977, Budapest (könyv) [4.] Le ThiMy Hong; Enzimjelzéses immunanalitikai módszerek fejlesztése és alkalmazása fenoxikarb és atrazinnövény védőszer hatóanyagok kimutatására, Doktori értekezés, 2003, Budapest (doktori értekezés) [5.] Marta Pastor-Belda, IsabelGarrido, NataliaCampillo, José Fenoll; Dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of new generation pesticides in soils by liquid chromatography and tandem massspectrometry. Journal of Chromatography A, (2015) 1-8 (folyóirat) [6.]PTE-TTK; Elválasztástechnika-Kromatográfia TÁMOP http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch07.html#id409650 (2015.február 19.), (on-line hivatkozás) [7.] Dr. Balla József;A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Edison House Kft, 2006 (könyv) [8.] PTE-TTK; Elválasztástechnika-Kromatográfia TÁMOP http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch07s03.html
(2015.február 19.),
(on-line hivatkozás) [9.] Dinya Zoltán; Szerves tömegspektrometria, DE Kossuth Egyetemi Kiadó, 2001, Debrecen (könyv)
- 45 -
[10.]VictorianoBorau, FernandoLafont, Alberto Marinas, José M. Marinas, Francisco J. Urbano; Determination of herbicide residues in olive oil by gaschromatography-tandem massspectrometry. Food Chemistry(2007) 855-861 (folyóirat) [11.] PTE-TTK; Elválasztástechnika-Kromatográfia TÁMOP http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch09s02.html#id415507
(2015.február 19.),
(on-line hivatkozás)
[12.] E. Pocurull*, C. Aguilar, F. Borrull, R.M.Marce; On-line coupling of solid-phase extraction to gas chromatography with mass spectrometric detection to determine pesticides in water. Journal of Chromatography A, 1998. 818 (1998) 85–93 (folyóirat)
[13.] Csámpai A.; Jalsovszky I.; Majer Zs.; Orosz Gy.; Rábai J.; Ruff F.; Sebestyén F., Szerves Kémiai Praktikum, Nemzeti Tankönyvkiadó, 1998, Budapest (könyv) [14.] Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal; Minőségbiztosítási Kézikönyv, 2005. április 15., Miskolc (kézikönyv)
Ábrák [1.a] Lei ThiMy Hong; Doktori értekezés 2003. Felhasználva: 2015. 03. 04. [1.b] http://ttk.pte.hu/analitika/letoltesek/jegyzet/ch07s01.html Felhasználva: 2015. 02. 19. [1.c] http://tamop412a.ttk.pte.hu/files/kemia7/www/ch07s02.html Felhasználva: 2015. 02. 19.
[1.d] http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/Waters_HPLC_MS_TitlePg.html Felhasználva: 2015. 02. 19. [1.e] http://ttk.pte.hu/analitika/letoltesek/jegyzet/ch10s03.html Felhasználva 2015. 03. 10. [1.f] http://ttk.pte.hu/analitika/letoltesek/jegyzet/ch09s02.html Felhasználva: 2015. 02. 23. - 46 -
[1.g] http://ttk.pte.hu/analitika/letoltesek/jegyzet/ch09s02.html Felhasználva 2015. 02. 23. [1.h] http://ttk.pte.hu/analitika/letoltesek/jegyzet/ch09s02.html Felhasználva: 2015. 02. 23. [1.i] http://driverlayer.com/img/spe%20salvi/20/any Felhasználva: 2015. 03. 18.
[1.j]http://tudasbazis.sulinet.hu/hu/termeszettudomanyok/kemia/altalanos-kemia/anyagokszetvalasztasa/folyadekok-szetvalasztasa Felhasználva: 2015. 03. 18.
- 47 -
