Mgr. Eva Flodrová FN Brno,Oddělení lékařské genetiky Laboratoř molekulární diagnostiky
[email protected]
• • • •
• •
enzymy katalyzující oxidativní metabolické reakce xenobiotik provádějí redukci C-, N-, S-, hydroxylaci, dealkylaci, dehalogenaci a deaminaci molekul substrátů jsou zahrnuty v oxidativním metabolismu exogenních i endogenních molekul v první fázi je oxidací přeměňují na elektrofilní meziprodukty, které jsou dále enzymy druhé fáze konjugovány na hydrofilní deriváty vylučované močí jsou zapojeny v detoxikačních procesech hlavně v játrech, ale i jiných orgánech u člověka se jich náchází více jak 57 druhů
• • • •
enzym debrisoquin 4-hydroxyláza patří mezi nejvíce studované biotransformační enzymy aktivita enzymu se mezi jednotlivci liší rozdíly v aktivitě CYP2D6 vedou k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv
• •
zahrnut v metabolismu asi 100 léčiv antidepresiva, antipsychotika, beta blokátory, antiarytmika
• • • • • • • •
Betablokátory: Trimepranol, Karvedilol, Timolol.. Antidepresiva: Paroxetin, Citalopram, Amitriptylin, Sertralin.. Antipsychotika: Haloperidol, Zotepin, Risperidon.. Inhibitory protonové pumpy: Omeprazol,Lansoprazol.. Antiepileptika: Fenobarbital, Fenytoin.. Cytostatika: Tamoxifen, Paklitaxel, Vinblastin, Cyklofosfamid.. Antihypertenziva: Chinidin, Propafenon, Kaptopril.. Ostatní: Indometacin, Kodein, Tramadol, Lidokain, Oxykodon..
• • •
45 kb u člověka na dlouhém raménku chromozomu 22 (22q13.1) skládá se ze tří homologních genů - CYP2D8P, CYP2D7P, CYP2D6 – CYP2D8P - pravý pseudogen – delece, inzerce, terminační kodony, nemá otevřený čtecí rámec – CYP2D7P - sekvenční homologie je 97% s CYP2D6, obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, inzerci T138 v exonu 1 → mění čtecí rámec → předčasnou terminaci translace
• • •
9 exonů a 8 intronů 4 378 bp mRNA 1655 bp
•
4 hlavní skupiny - PM- pomalí metabolizátoři – žádná enzymová aktivita - IM- intermedierní metabolizátoři - snížená enzymová aktivita - EM - efektivní metabolizátoři - normální enzymová aktivita - UM - ultrarychlí metabolizátoři - extrémně zvýšená enzymová aktivita
•
Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004
UM 3-5%, EM 70-80%, IM 10-15%, PM 7-10%
• • • •
• •
•
rozdílná metabolická aktivita enzymu mezi jedinci je dána polymorfismem v genu cyp2d6 doposud popsáno více jak 100 alel alely se stejnou klíčovou mutací se označují číslem (např. *6) písmeny se rozlišují další varianty alel se stejnou klíčovou mutací, ale různými doplňkovými mutacemi s minoritním funkčním významem (např. *6A, *6B, *6C, *6D) nejčastější jsou alely *1, *2, *4, *5, *10, *17 a *41 CYP2D6*1 je alela se standardní sekvencí genu stejně jako další alely (*2, *33, *35) kóduje protein s normální enzymatickou funkcí gen CYP2D6 má značnou interetnickou variabilitu
• Nulové alely CYP2D6*0 - kódují nefunkční protein - v homozygotním stavu způsobují fenotyp pomalého metabolizátora bodové mutace (alely *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42) velké chromozomové delece (alely *5, *13, *16) mutace vedoucí ke ztrátě f-ce proteinu, ale délka zachována (alely *7, *12, *14, *18)
- alela *4 (12-21%) v kavkazské populaci nejčastější nulová alela 1846G>A - alela *5 (2-7%) dochází ke ztrátě celého genu CYP2D6 - alely *13 a *16 - 5´-CYP2D7P/CYP2D6-3´ hybridní geny, vznik delecí různých částí lokusu CYP2D •
Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí
•
Nulové alely
• Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí • • •
kódují enzym s redukovanou aktivitou v homozygotním stavu nebo spolu s nulovou alelou v heterozygotním stavu způsobují fenotyp IM např. CYP2D6*9, *10, *17, *36, *41
*10 (50-70% asiaté, 1-5% kavkazská populace) 100C>T (naruší místo nezbytné pro sbalení proteinu → enzym je velmi nestabilní a má sníženou afinitu k substrátu)
•
Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí
• •
Nulové alely CYP2D6*0 Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí
• Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí - zvýšený počet aktivních genových kopií - alely *1, 2*,35* - frekvence genové duplikace je v kavkazské populaci 15%
•
in vivo - metabolické schopnosti jedince se zjišťují po podání testovací látky (substráty pro CYP2D6 – dextrometorfan, spartein) na základě tzv. metabolického poměru (MR) - v ČR se MR definuje jako poměr koncentrace podaného léku (dextrometorfan) ke koncentraci jeho metabolitů (dextrorfan), které se objeví v moči během určité doby od podání testovací látky - koncentrace se stanovuje pomocí chromatografických metod
•
molekulárně genetická detekce alel cyp2d6 - metody analýzy délky restrikčních fragmentů (Skoda, 1988) - vyhledávací metody jednovláknového konformačního polymorfismu (Broly, 1995) - alelově specifická polymerázová řetězová reakce (Daly, 1995) - syntéza dlouhých úseků - long-PCR (Sachse, Daly,Løvlie, Panserat ) - real-time PCR (Stamer, 2002) - kvantitativní metody s TaqManovými sondami (Bodin, Beaune, Loriot ) - přímá sekvenace (James, 2004) - SNaPshot™ (Sistonen, 2005) - AmpliChip CYP450 (Roche, Affymetrix, 2004)
• •
• •
variabilita v aktivitě CYP2D6 vede k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv PM nejsou schopni metabolizovat substráty CYP2D6 → při běžně podávané dávce mají ve srovnání s EM vyšší koncentrace léku v plasmě → zvýšené riziko předávkování → výskyt vedlejších efektů. UM je koncentrace léku v plasmě mnohem nižší než je terapeuticky účinná koncentrace → nedochází k žádné terapeutické odpovědi klinický význam polymorfismu pro konkrétní léky není vždy jasný a závisí na několika faktorech
•
•
•
•
Psychiatrie - 50% běžně užívaných antipsychotik - 50% antidepresiv – vedlejší účinky u PM - schizofrenie Léčba rakoviny - tamoxifen → N-desmethyltamoxifen → endoxifen (antiestrogenní aktivita) Molekulární epidemiologie - PM jsou delší dobu vystaveni toxickým efektům přijatých sloučenin než EM → náchylnější ke vzniku rakoviny - naopak při metabolické aktivaci prokarcinogenů jsou většímu riziku vystaveni EM a UM Kardiovaskulární onemocnění
•
dlouhodobá mezioborová spolupráce
•
optimalizace stávajících metod detekce mutací - zavedení metody Real-Time PCR pro rychlou detekci PM - kvantifikace CYP2D6 genu – detekce delecí a duplikací (Müller, Zöpf, 2003) výzkumné účely vyšetření při neadekvátní odpovědi na léčbu (nedostatečná odpověď – UM, špatná snášenlivost – PM)
• •
•
=> individuální dávkování léčiv ??
• Frekvence 7-10% v kavkazské populaci • Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450 → zvýšené riziko předávkování → výskyt vedlejších efektů •
*3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18
• Frekvence 7-10% v kavkazské populaci • Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450 → zvýšené riziko předávkování → výskyt vedlejších efektů •
*3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18
4*1846 A>G 6*T1707del 8*1758G>T 3* A2549del 7*2935 A>C
3
4
T1707del 3
1846 A>G 4
1758G>T
*6 3
*8 4
*4
Filtr F2
4*wt Tm=52.0°C
6*wt Tm=71.5°C
4*1846G>A Tm=61.2°C
6*T1707del Tm=65.4°C
Filtr F3
8*wt Tm=55.0°C
8*1875G>T Tm=63.0°C
