Věra Chytilová, Karel Dušek
Metodika testování odolnosti brukvovitých plodin k nádorovitosti METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2007
ISBN 978-80-87011-23-2 © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007
Věra Chytilová, Karel Dušek
Metodika testování odolnosti brukvovitých plodin k nádorovitosti METODIKA PRO PRAXI
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Metodika testování odolnosti brukvovitých plodin k nádorovitosti Methods of testing brassica crops for resistance to clubroot disease V této publikaci jsou stručně shrnuty veškeré základní dostupné informace týkající se nádorovitosti brukvovitých plodin způsobené patogenem Plasmodiophora brassicae, její biologie, rozšíření, metody ochrany a prevence, které lze v současné době využít. Metodika poskytuje přehled dříve používaných testovacích metodik a některých dnešních moderních metodik. Podrobně je popsána příprava inokula, samotné provádění testů až po vyhodnocení dosažených výsledků.
Metodika vznikla za finanční podpory MZe ČR a je výstupem výzkumného záměru MZe ČR 0002700602
Metodika vznikla při řešení výzkumného záměru č. MZe ČR 0002700602 „Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agro-biodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství„. Metodika je určena vědeckým pracovníkům v oblasti výzkumu rezistence genetických zdrojů, fytopatologům a šlechtitelům zabývajících se problematikou nádorovitostí brukvovitých plodin.
Metodika byla schválena odborem komodit MZe pod č.j. 696/200817220. MZe ČR doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.
OBSAH ÚVOD…………………………………………………………….
1
Historie…………………………………………………………
1
Taxonomie……………………………………………………...
1
Životní cyklus…………………………………………………..
2
Hostitelské rostliny……………………………………………..
3
Příznaky napadení………………………………………………
3
Ochrana ………………………………………………………… 4 Preventivní (profylaktická) opatření …………………………. 4 Agrotechnická opatření……………………………….………. 4 Chemická ochrana…………………………………………….. 5 Fyzikální metody……………………………………………… 5 Půdní solarizace………………………………………………. 5 Biologický způsob ochrany…………………………………… 5 Supresivní půdy………………………………………….……. 6 Využití rezistence a tolerance………………………………… 6 VLASTNÍ METODIKA TESTOVÁNÍ…………………………..
7
Příprava inokula………………………………………………… 7 Metody inokulace……………………………………………….
8
Inokulace pomocí mikropipety……………………………….. 8 Inokulace namáčením kořenů………………………………… 9 Inokulace zapracováním suspenze spor do půdy……………..
9
„Slurry“ metoda inokulace……………………………………
9
Inokulace zakořeněných listů…………………………………
9
Inokulace „spodem“………………………………………….
10
Polní testování………………………………………………….
10
Způsob hodnocení……………………………………………… 11
ZÁVĚR ………………………………………………………….. 12 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY…………………………… 13 SEZNAM PŘÍLOH………………………………………………
14
1. ÚVOD V dnešní době jsou v zemědělské výrobě kladeny stále větší nároky na kvalitu vyrobené produkce. Ta je ovlivněna mnoha činiteli jakož i škůdci a chorobami, mezi které můžeme zařadit i nádorovitost brukvovitých plodin. Nádorovitost (boulovitost, plasmodiofora) je jednou z nejstarších, nejzávažnějších a nejrozšířenějších chorob brukvovitých plodin, jejímž původcem je mikroorganismus Plasmodiophora brassicae. Celkem napadá okolo 300 botanických druhů a variet patřících do 64 rodů, napadá jak kulturní tak i plané druhy brukvovitých rostlin. V současné době se nádorovitost vyskytuje na všech kontinentech mimo Antarktidu, hlavně v mírném pásu Evropy a Asie. V Evropě se vyskytuje téměř ve všech státech. V naší republice se vyskytuje nádorovitost na celém území. Nejsilněji se však vyskytuje v nejproduktivnějších zelinářských oblastech (okresy Mělník, Litoměřice, Pardubice, Hradec Králové, Olomouc, Prostějov, Brno). U nás i ve světě způsobuje obrovské výnosové ztráty nejen na brukvovité zelenině, ale i na krmných a olejnatých plodinách, hlavně na řepce olejné, jejíž plochy za poslední dobu značně vzrostly a neustále narůstají. Vlivem širokého zastoupení těchto plodin v osevním postupu dochází neustále k nárůstu půd zamořených touto chorobou a narůstá i intenzita jejich zamoření. V takových půdách je potom téměř nemožné pěstovat hostitelské plodiny a to i v jinak velmi vhodných půdních a klimatických podmínkách. Jedinou možností, jak s ohledem na ekologii pěstovat i na těchto půdách brukvovité plodiny, je využívání odolných odrůd. Cílem této metodiky je nejen poskytnout informace o P. brassicae, ale především poskytnout snadno dostupný návod k testování zejména genetických zdrojů brukvovitých plodin vedoucí k nalezení vhodného výchozího materiálu, využitelného k vyšlechtění nových rezistentních nebo tolerantních odrůd a k následnému ověření těchto vlastností. 1.1.Historie První zmínky o této chorobě se nachází v přírodovědné encyklopedii Pliniuse staršího „Naturalis historia“ a od Columnea z 1.století našeho letopočtu. Další historické záznamy o nádorovitosti v Evropě pochází ze 13.století. Později v 19. století silná epidemie nádorovitosti zničila úrodu zelí na obrovských plochách v St. Peteburgu v Rusku. Pravá příčina této choroby nebyla dlouho známa. Ve snaze získat co nejvíc informací o této chorobě Ruská zahradnická společnost nabídla odměnu komukoli, kdo objasní příčinu této choroby a navrhne ochranná opatření. To se podařilo v roce 1875 ruskému vědci Woroninovi, který zjistil, že původcem této závažné choroby na kořenech brukvovitých rostlin je mikroorganismus, který nazval Plasmodiophora brassicae Wor. a svých poznatků využil k návrhu cílevědomé ochrany. První zprávy o výskytu nádorovitosti v českých zemích pochází od jednoho ze zakladatelů české fytopatologie F. Sitevského, a to z okolí Veselí nad Lužnicí, kde se pěstovalo známé krajové kruhárenské zelí ‘Veselské‘. 1.2. Taxonomie Taxonomie je stále se vyvíjející obor a zařazení Plasmodiophora brassicae do systému není snadné. Původně byla Plasmodiophora brassicae podle Gaumannova systému zařazena mezi houby (Mycetes), třída Archimycetes, čeleď Plasmodiophoraceae. Později podle Arxova taxonomického systému byla Plasmodiophora brassicae zařazena do oddělení hlenek (Myxomycota), třídy Plasmodiophoromycetes (nádorovky). Ještě později podle systémů (např.Alexopoulos nebo Waterhouse) byla třída Plasmodiophoromycetes řazena paralelně s Oomycetes, Hyphochytridiomycetes, Traustochytridiomycetes a Chytridiomycetes do 1
oddělení Eumycota („pravé houby“) a to do pododdělení Zygomycotina, resp. Mastigomycotina. Podle nejnovější taxonomie je P. brassicae zařazena mezi Protozoa (prvoci), jež jsou považována za samostatnou říši. V rámci této říše je tento druh zařazen do třídy Plasmodiophoromycetes, řádu Plasmodiophorales. Řád Plasmodiophorales tvoří několik rodů, z nichž z hlediska fytopatologického jsou významné kromě rodu Plasmodiophora i rody Spongospora a Polymyxa. P. brassicae se vyskytuje v mnoha patotypech. Při hodnocení spektra patotypů v bývalém Československu bylo podle Williamsovy metody zjištěno 7 patotypů. Nejčastěji se vyskytovaly patotypy 7, 6, 4 a 10. Často se jednalo o směs dvou i tří patotypů. Při použití metody ECD (European Clubroot Diferencial set) bylo u nás identifikováno celkem 35 patotypů. Nejčastěji se vyskytoval patotyp označený jako 16/15/13 a to v 28% zkoumaných vzorků. V 9% vzorků byly zjištěny patotypy 16/02/28 a 16/14/31. Mezi patotypy a jednotlivými lokalitami nebyla však zjištěna žádná závislost. 1.3. Životní cyklus Životní cyklus P. brassicae tvoří 2 fáze – primární a sekundární. Začíná haploidními trvalými sporami, jejichž velikost je 2,4 – 3,2 µm. Trvalé spory se do půdy dostávají z rozpadlých nádorů. V jednom gramu nádorů je jich až několik miliard. V půdě zůstávají spory vitální 15 -20 let a i při průchodu zažívacím traktem zvířat nebo při procesu silážování je jejich vitalita zachována. Nejvíce trvalých spor se v půdě vyskytuje do hloubky 15 cm, maximálně do 40 cm. Trvalé spory jsou ke klíčení vyprovokovány půdní teplotou, vlhkostí a kyselostí, kořenovými výměšky a vlivem některých půdních mikroorganismů. Trvalé spory vyklíčí v primární zoospory hruškovitého tvaru se dvěma nestejně dlouhými bičíky umožňující zoosporám aktivní pohyb v půdě a vyhledávání kořenových vlásků, které napadají pomoci speciálního bodce a velmi rychle pronikají do jejich buněk. Před proniknutím do hostitele ztrácí bičíky a konce napadených kořenových vlásků získají kyjovitý tvar. V hostiteli pokračuje vývoj a proniklé zoospory se přemění v haploidní jednobuněčné primární plasmodium, které je zpočátku jednojaderné a je schopno pronikat z buňky do buňky. Toto plasmodium kumuluje v sobě tuková tělíska z buněk hostitele, postupně se zvětšuje, nastává mitotické dělení a diferencuje se v mnohojaderné primární plasmodium. Kolem jednotlivých jader se shlukuje plazma, jádra se osamostatňují a vytvářejí jednobuněčné gametangia (sporangia), v nichž se po mitóze diferencují gamety, vždy 4 až 8 v každé gametangii, opět získávají bičíky a vznikají z nich sekundární zoospory, které jsou zcela shodné s primárními. Opouštějí kořenové vlásky a dostávají se do půdy. Tímto je ukončen primární cyklus, který trvá 5 až 7 dní. Primární cyklus probíhá u všech brukvovitých rostlin, včetně rezistentních, dokonce i u některých rostlin z jiných čeledí. Následuje sekundární cyklus, který probíhá jen u citlivých rostlin a je ukončen tvorbou nádorů. Sekundární zoospory se pohybují v půdě a opět v omezeném množství pronikají do kořenových vlásků, čímž se primární cyklus opakuje. K tomuto může docházet i u odolných brukvovitých rostlin nebo i u rostlin z jiných čeledí. Častěji však zoospory splývají po dvou, třech nebo i čtyřech a vznikají dvou až čtyřbuněčné zygoty (plasmogamie). Ty pronikají do kořenů nebo do hypokotylu, případně do jiných nadzemních částí. Zygoty v buňkách kořenů ztrácejí bičíky, jádra splývají v jedno, diferencují se v sekundární plasmodia, která pronikají do dalších buněk a vodivými pletivy se dostávají i do vzdálenějších pletiv. Tato plasmodia produkují cytokininy a auxiny, ale indukují i tvorbu těchto látek v hostiteli. Vlivem těchto látek dochází k hypertrofii (zvětšení) a hyperplasii (zmnožení) buněk hostitele. Hypertrofované buňky jsou 5 až 10krát větší než buňky normální a následkem toho vznikají
2
na kořenech nádory. V napadených buňkách kořenů se zvyšuje aktivita nitrolázy a katalázy a následně pak obsah proteinů. Snižuje se obsah redukujících cukrů a celkově i sušiny. Po karyogamii se vytvářejí diploidní mnohojaderná sekundární plasmodia, brzy dochází k meiozi, po které se z plasmodia kolem haploidních jader vytvářejí vzájemně nespojené meiospory, neboli nové trvalé spory. Tím je vývojový cyklus P. brassicae uzavřen. (Schéma životního cyklu v příloze 1).
1.4. Hostitelské rostliny Plasmodiophora brassicae napadá více než 300 druhů patřící do 64 rodů z čeledi Brassicaceae (brukvovité) kromě křenu selského (Armoracia rusticana). K hospodářsky nejvýznamnějším poškozeným druhům patří Brassica oleracea, jež zahrnuje všechny variety patřící do košťálové zeleniny (zelí – var. capitata, květák – var. botrytis, brokolice - var. italica, (kedluben - var. gongyloides, kapusta růžičková – var. gemmifera, kapusta hlávková – var. sabauda, kadeřávek – var.sabellica) a Brassica napus (řepka olejná – var. oleifera, tuřín – convar. napobrassica). Dále Brassica rapa (vodnice – ssp. rapa, zelí čínské - ssp. chinensis, zelí pekingské – ssp. pekinensis), Brassica campestris (řepice olejná – var. oleifera). Významné škody jsou zaznamenány i u druhu Raphanus sativus (ředkev – var. major, ředkvička – var. radicula, ředkev olejná – var. oleiferus. Nádorovitost napadá i brukvovité plevele jako je kokoška pastuší tobolka (Capsella bursa-pastoris), penízek rolní (Thlaspi arvense), řeřicha ladní (Lepidium sativum), ředkev ohnice (Raphanus raphanistrum), vesnovka obecná (Cardia draba), lnička drobnokvětá (Camelina microcarpa), trýzel cheirovitý (Erisimum cheiranthoides), hulevník (Sisymbrium ssp.) a jiné. Zoosporangia a zoospory P. brassicae byly zjištěny i na kořenech jiných čeledí. Např. trav /medyněk vlnatý (Holcus lanatus), jílek vytrvalý (Lolium perenne), psineček výběžkatý (Agrostis stolonifera), srha říznačka (Dactylis glomerata)/, také na kořenech vlčího máku (Papaver rhoeas), jetele plazivého (Trifolium repens), šťovíku (Rumex spp.), jahodníku (Fragaria spp.). K tvorbě nádorů však u jiných čeledí nedochází, takže nemohou být zdrojem šíření nákazy. Naopak, donutí trvalé spory k vyklíčení, takže snižují koncentraci trvalých spor v půdě. 1.5. Příznaky napadení. Nejvýraznějším příznakem napadených rostlin nádorovitostí jsou abnormálně zvětšené a deformované kořeny. Nádory se tvoří na vedlejších i hlavních kořenech nebo dokonce na stonkové částí těsně pod povrchem půdy, případně i na listech (potočnice lékařská). U plodin, kde se využívají zdužnatělé kořeny (ředkev, ředkvička, tuřín, vodnice) se tvoří nádory na bočních i hlavních kořenech, často jsou však deformovány i bulvy. Tvar nádorů je do značné míry podmíněn vlastnostmi kořenového systému, u zelí a květáku se vyvíjí na hlavních i vedlejších kořenech většinou nádory vřetenovitého tvaru, u tuřínu a vodnice na postranních kořenech nádory perličkovité, u ředkviček a kedlubnů je tvar většinou kulovitý. Povrch nádorů je zpočátku šedavě žlutý, na průřezu bílý, bez dutin, dužnatý, později dřevnatí. Povrch starších nádorů hnědne a je drsnější. Později se nádory působením různých bakterií rozpadají. V napadených kořenech, které jsou deformovány nádory, dochází k destrukci vodivých pletiv a nadzemní části rostlin nejsou dostatečně zásobovány vodou a živinami. Rostliny vadnou, žloutnou, mohou mít i antokyanové zabarvení, krní v růstu, nevytvářejí žádné konzumní orgány (např. zelí vytváří jen zakrnělé listové růžice anebo jen nekvalitní (dřevnaté kedlubny, nechutné, atd.). Stupeň poškození závisí na intenzitě napadení. Při napadení v časných
3
vývojových fázích dochází k většímu poškození než při pozdější infekci, často dochází k předčasnému úhynu rostlin. Proto jsou porosty z přímých výsevů více poškozovány než porosty z výsadby. V důsledku poškození a rozkladu kořenů dochází ke špatnému ukotvení rostlin v půdě a ty se pak vlastní tíhou vyvracejí. Někdy se na kořenech vyskytují polokulovité nádorky (hálky) vyvolané krytonoscem zelným (Ceutorhynchus pleurostigma), které mohou být zaměňovány s nádorovitostí. Tyto hálky jsou však drobnější, jsou duté, uvnitř může být ještě larva a vyskytují se jen na kořenovém krčku. Některé druhy citlivé k nádorovitosti (např.tuřín, ředkvička, řepka) mohou z neznámých příčin tvořit neinfekční nádory a jsou snadno zaměnitelné s nádory způsobené P. brassicae. Poškození kořenů některými herbicidy, obzvláště dinitroanilinovýmí herbicidy jako je například trifluralin (Treflan), může na kořenech vyvolat tvorbu zduřenin podobných nádorům. Ve velmi omezené míře mohou nádory na kořenech brukvovitých rostlin způsobit bakterie Rhodoccocus fascians nebo Agrobacterium tumefaciens. 1.6. Ochrana Ochrana brukvovitých plodin proti nádorovitosti je poněkud složitá. Vzhledem k tomu, že způsobuje velké výnosové ztráty, ale i pro velmi snadné rozšiřování a vysokou perzistenci trvalých spor je jakékoliv ochranné opatření aplikované samostatně vždy neúčinné nebo nedostatečné. Proto by se preventivní opatření mělo stát základním předpokladem ochrany proti rozšiřování nádorovitosti na další nezamořené pozemky. A pokud už k zamoření došlo, je třeba provádět komplexní ochranu založenou na vhodné kombinaci agrotechnických, chemických, biologických a fyzikálních ochranných opatření. 1.6.1. Preventivní (profylaktická) opatření Preventivní opatření jsou založena na eliminaci veškerých možných způsobů dalšího rozšiřování nádorovitosti na dosud nezamořené pozemky. Nejčastěji se nádorovitost přenáší na zdravé pozemky výsadbou infikované sadby, která v době výsadby ještě nemá žádné viditelné symptomy napadení. Také použití infikovaných kompostů, substrátů, chlévské mrvy, kejdy nebo orničních skrývek je častou příčinou zamoření půd nádorovitostí. Dále je třeba věnovat pozornost přenosu infekce ulpělou půdou na zemědělské mechanizaci a nářadí, na obuvi, ale i na sadbovém materiálu ovocných a okrasných dřevin, jahodové sadbě, hlízách brambor apod. Rovněž je třeba zamezit používání závlahové vody z nádrží, kde se může dostávat voda ze zamořených pozemků. 1.6.2. Agrotechnická opatření Základním předpokladem pro snížení úrovně zamoření půdy by mělo být úplné vyřazení pěstování hostitelských rostlin v zamořených půdách, avšak dodržet toto opatření je často velmi problematické. Proto je nutno alespoň upravit osevní postup tak, aby časový odstup mezi jednotlivými brukvovitými plodinami byl minimálně 5 - 6 let. Na vlhčích pozemcích vznikají vhodné podmínky pro vývoj choroby, proto je třeba tyto pozemky odvodnit. Je třeba likvidovat brukvovité plevele, na kterých se patogen dobře vyvíjí, aby se zabránilo neustálému obnovování půdy trvalými sporami. Je třeba včas odstranit a zlikvidovat infikované zbytky rostlin ještě před rozpadem nádorů. Velký význam má na kyselejších půdách úprava půdní reakce vápněním na neutrální až slabě alkalickou . Plodiny s krátkou vegetační dobou (kedlubny, ředkvičky, pekingské zelí) jsou nádorovitostí méně poškozovány než plodiny s dlouhou vegetační dobou (zelí, květák). Výběr vhodných
4
tolerantních odrůd dokáže eliminovat nepříznivý vliv nádorovitosti na výnos, avšak v současné době je sortiment tolerantních odrůd velmi omezen. Správná a vyvážená výživa zvyšuje odolnost rostlin, které pak dokáží lépe vzdorovat všem chorobám a tudíž i nádorovitosti. Toleranci rostlin vůči nádorovitosti zvyšuje dostatečné zásobení dusíkem a vyšší dávky některých mikroprvků jako je bor, mangan, zinek, síra, měď a chlor. 1.6.3. Chemická ochrana Použití chemické ochrany je značně problematické. Většina testovaných fungicidních přípravků má malou nebo žádnou účinnost na omezení nádorovitosti. Fungicidy s dobrou účinností jsou často z důvodu fytotoxicity nebo hygienické nevhodnosti nepoužitelné. Ani velké finanční náklady u některých přípravků nejsou zanedbatelné, a proto se dají využít jen na malých plochách (skleníky, fóliovníky) a v omezené míře, např. desinfekce pěstebních substrátů při přípravě sadby. U nás je možno použít jen Basamid granulát, obsahující účinnou látku (úč. l.) dazomet - 97%, ale z ekonomických důvodů se dá využít jen velmi omezeně. Pro polní využití lze z praktického hlediska použít jen dusíkaté vápno, které je však účinné jen při vysokých dávkách 800 – 1000 kg.ha-1, což je při současné ceně okolo 2.260 Kč/100 kg velmi ekonomicky nákladné. Je zajímavé, že běžně používané herbicidy do brukvovitých plodin Treflan, Synfloran ( úč. l. trifluralin) vykazují určitou účinnost proti nádorovitosti. Na rozdíl od naší republiky jsou v některých státech povoleny k ochraně proti nádorovitosti i jiné fungicidy. Například v Kanadě jsou povoleny přípravky Terraclor 75 WP nebo Terraclor F (úč. l. quintozene), které redukují výskyt nádorů. V této zemi je rovněž povolen přípravek Omega (úč. l. fluazinam), který poskytuje dobrou ochranu květáku na organických půdách, avšak na minerálních půdách působí na květák fytotoxicky. V USA je povolena fumigace půdy přípravky Vapam nebo Sectagon (úč. l. metam sodium), kterým se provede postřik půdy a následně se zapraví rotavátorem. Vědci v Britské Kolumbii a Kanadě prokázali, že Ranman (úč. l. cyazofamid) je výborný k ochraně proti nádorovitosti a nevykazuje žádnou toxicitu vůči rostlinám. Zatím však nebyl povolen. U nás byly prováděny úspěšné pokusy s přípravkem Nebijin (úč. l. flusulfamide), který se zdál velmi nadějný, ale pro hygienickou závadnost nakonec nebyl povolen. 1.6.4. Fyzikální metody Jednou ze základních metod v ochraně proti nádorovitosti je propařování zeminy. Po dobu alespoň 30 minut je půda vystavena teplotě minimálně 90 oC. V praxi se většinou propařování provádí plošně pod plachtami. Pro pracnost a finanční náročnost lze propařování použít jen na omezených plochách. 1.6.5. Půdní solarizace Další možnou metodou je půdní solarizace, při které je využíváno sluneční záření. Tato metoda byla objevena v Izraeli a je stále používána např. v Kalifornii, Itálii, na Floridě a jiných oblastech s velkou intenzitou slunečního záření a dlouhým horkým létem. Volná půda je pokryta po dobu 3 – 4 týdnů transparentní folií a působením slunečního záření dochází pod folií k zvýšení teploty. Účinná není jen samotná vyšší teplota, ale zvýšením teploty dochází k fyzikálně-chemickým a následně biologickým procesům, které redukují výskyt některých patogenů v půdě. U nás tato metoda není příliš účinná pro volnou půdu kvůli menší intenzitě slunečního záření a dá se využít jen ve sklenících a fóliovnících. 1.6.6. Biologický způsob ochrany Pro omezení výskytu nádorovitosti byly ve světě testovány jako biologický agens Trichoderma spp., Streptomyces spp., Pythium oligandrum, Bacillus subtilis, Phytophthora
5
cactorum a Verticillium dahlie. Avšak výsledky testů nejsou příliš slibné, spíše rozporné. Pouze některé izoláty Trichoderma spp. se projevily jako dobří kandidáti pro biologickou ochranu a dokázaly omezit výskyt nádorovitosti na kořenech a tím zvýšit konečnou hmotnost rostliny. Naproti tomu jeden izolát Streptomyces spp. redukoval projev nádorovitosti na kořenech, ale nevedlo to ke zvýšení výnosu. K důležitým opatřením v biologickém způsobu ochrany patří použití předplodin inhibujících vitalitu trvalých spor v půdě. Mezi nejúčinnější patří máta peprná (Mentha piperita), saturejka zahradní (Satureja hortensis), tymián obecný (Thymus vulgaris). Jinou skupinu tvoří tzv. vylapávací plodiny, které stimulují vyklíčení trvalých spor. Ty infikují kořenové vlásky, proběhne první vývojový cyklus, ale druhý už neproběhne, takže nádory se nevyvinou. Za nejvhodnějšího vylapávače lze považovat ředkev olejnou (Raphanus sativus var. oleifera), která je rezistentní vůči všem patotypům P. brassicae. K vylapávání trvalých spor se dají použít i jiné nebrukvovité plodiny, např. jílek vytrvalý (Lolium perenne) nebo oves setý (Avena sativa ). 1.6.7. Supresivní půdy Jsou to takové půdy, kde se patogen není schopen usídlit a pokud se usídlí, choroba se nevyskytne vůbec nebo působí jen malé škody. Tato vlastnost je pravděpodobně dána souborem abiotických (fyzikálních, chemických) a biotických (antagonistické mikroorganismy) faktorů. V naší republice byl takový typ půdy nalezen v katastru obce Bolehošť (okr. Rychnov nad Kněžnou) a v Nahořanech (okr. Náchod). Podstata supresivního působení nebyla doposud objasněna. Supresivita zjištěná na našem území zůstává zachována i po termickém ošetření, takže nemůže být biologického původu. 1.6.8. Využití rezistence a tolerance Pod pojmem rezistentní odrůdy se myslí takové odrůdy (plodiny, rostliny), které jsou bez viditelných příznaků napadení chorobou. Tolerantní odrůda je potom taková, která má příznaky napadení (v našem případě nádory na kořenech), ale toto napadení nemá podstatný vliv na výnos a kvalitu produkce. Tolerance je vlastně odolnost rostliny k chorobě, v našem případě k nádorovitosti, kdežto rezistence je odolnost rostliny k patogenu, v našem případě k P. brassicae. Pojem tolerance nebo též snášenlivost je někdy slučován s pojmem polní rezistence. Mezi varietami rodu Brassica oleracea existují velké rozdíly v odolnosti vůči nádorovitosti. Například kapusta kadeřavá je nádorovitostí postižena jen velmi málo nebo vůbec. Některé staré odrůdy krajových zelí z německé strany Šumavy jako je ´Böhmerwaldkohl‘ nebo proslulé ´Křimické´ z oblasti Plzeňska, dále zelí ‘Plzeňské‘, ´Badger Shipper‘, ´Bindsachsener´ a některé staré krajové ruské odrůdy (např.´Kaporka městnaja‘, ´Kazanka‘, ´Kubiška městnaja‘, ´Ladožskaja 22‘, ´Losinoostrovskaja‘) vykazují určitou toleranci vůči nádorovitosti. Naproti tomu odrůdy hlávkové kapusty (s výjimkou odrůdy ´Ice Crown´), květáku a brokolice jsou všechny silně náchylné. Největší náchylnost k nádorovitosti vykazuje čínské a pekingské zelí (mimo odrůdu ´Michihili´) a velmi vnímavá odrůda ´Granaat´ je používána jako standarda při testování rezistence nebo tolerance. U druhu řepka (B. napus) se vyskytují některé odolné genotypy jako např. odrůdy ´Giant Rape´, ´Kiri´ nebo ´Moana´. I když se v současné době začínají objevovat hybridní tolerantní odrůdy (např. odrůda zelí českého původu ´Torpédo´, holandské pekingské zelí ´Bilko´ atd.) je jich zatím jen velmi málo. Výskyt tolerantních materiálů mezi odrůdami nebo v genetických zdrojích brukvovitých plodin lze úspěšně využít při šlechtění nových odrůd, i když je to poměrně velmi složitá záležitost, kterou se zabývají šlechtitelé u nás i v zahraničí.
6
2. VLASTNÍ METODIKA TESTOVÁNÍ Většina testovacích metod je určena pro laboratorní podmínky, pro polní podmínky existuje pouze jedna metoda. Než začneme pracovat s P. brassicae je nutno si uvědomit a mít stále na paměti v průběhu veškeré manipulace s tímto patogenem, že jde o velmi nebezpečného a lehce přenosného patogena, kterým si velmi snadno můžeme zamořit nejen vlastní pozemky, ale rozšířit ho i po celém širokém okolí. Je třeba zajistit maximální hygienická opatření. To znamená, že veškeré pomůcky a nářadí, které přijdou do styku s patogenem, musejí být důkladně vydesinfikovány, nejlépe 2% roztokem chlorového vápna nebo Chloraminu B. Veškeré zbytky inokula, napadených rostlin a kontaminované zeminy je nutno inaktivovat termicky nebo je uložit ve speciálních nepropustných jímkách vybudovaných na infekčním poli, viz kapitola polní testování.Veškeré prostory, ve kterých se pracuje s nádorovitostí (fytotrony, skleníky), musí být u výstupních dveří vybaveny nášlapnou nádobou opatřenou rohoží s desinfekčním roztokem, aby se zabránilo přenosu spor ulpělých na obuvi. Do těchto prostor musí být zamezen přístup nepovolaných osob. Pro polní testování je třeba mít infekční pole zamořené buď spontánní nebo umělou infekcí. I na infekčním poli je nutno dodržovat velmi přísná hygienická opatření zamezující rozšíření do okolí. Pozemek musí být zabezpečen oplocením a uzamčen proti vniknutí nepovolaným osobám, opatřen tabulí s upozorněním na tuto nebezpečnou chorobu a zákazem vstupu. Veškeré používané nářadí a stroje, včetně sekaček na trávu, je třeba uskladnit na tomto pozemku a nesmí být využívány k práci na jiných pozemcích. Žádné rostliny ani sklizené konzumní části není možno vynášet mimo tento areál. Vše musí být ukládáno do speciálně vybudované betonové jímky s nepropustným dnem. Pokud jde o obuv je nezbytné, aby se pracovníci při odchodu z infekčního pole přezuli a prošli zónou s desinfekčním roztokem. Je třeba si uvědomit nebezpečí této choroby a zvážit, zda jsme schopni na svém pracovišti zabezpečit veškerá opatření k zamezení šíření nádorovitosti, a zda by nebylo vhodnější přenechat tuto činnost specializovaným pracovištím, která mají s touto chorobou dlouholeté zkušenosti a jsou náležitě vybaveny a zabezpečeny proti jejímu přenosu. 2.1. Příprava inokula. Inokulum používané k testování na odolnost k brukvovitých plodin k nádorovitosti tvoří směs nejrazantnějších ras patogena P. brassicae získaných z celé České republiky, které byly soustředěny ve Světlé Hoře na Bruntálsku, kde dříve probíhalo toto testování. V současné době je možno získat tento materiál na pracovišti VÚRV, v.v.i., Odd. zelenin a speciálních plodin Olomouc, které se mimo jiné aktivity zabývá testováním genetických zdrojů brukvovitých plodin a rozpracovaných šlechtitelských materiálů pro semenářské firmy. Inokulum trvalých spor se získává z pevných nádorů infikovaných rostlin. Pokud se nádory skladují při teplotě – 18 oC zachovávají si životnost i několik let, lépe je však používat vždy čerstvé nádory nebo zmražené nejdéle po dobu jednoho až dvou let. Rozmrazením a opětovným zmražením dochází však ke snížení životnosti trvalých spor. Nádory se mixují s destilovanou vodou po dobu asi 3 minut v mixéru při nejvyšších rychlostních otáčkách. Vzniklá suspenze je filtrována přes mušelínové plátno a pak třikrát odstřeďována (1000g po dobu 7 minut), výsledné shluky spor jsou znovu suspendovány v destilované vodě a upraveny pomocí Bürkerovy komůrky na požadovanou koncentraci 107 spor v 1 ml inokula. Pro využití v praxi je používána zjednodušená metoda přípravy inokula, při které odpadá odstřeďování suspenze a pracné počítání spor v Bürkerově komůrce.
7
Avšak pokud má tato metoda spolehlivě fungovat, je nutno dodržet osvědčený a ověřený postup používaný na pracovišti VÚRV, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodin Olomouc. Inokulum je připravováno z čerstvých nebo nejdéle 1 rok zmražených nádorů z vyspělých rostlin odrůdy pekingského zelí ´Granaat´. Nádory v množství 100 g jsou spolu s 1 litrem destilované vody vloženy do mixéru a po dobu asi 3 minut homogenizovány při nejvyšších rychlostních otáčkách. Vzniklá suspenze je filtrována přes mušelínové plátno. Takto získané inokulum je výchozím základem téměř pro všechny následující testovací metody. Pokud dodržíme daný postup a stejné požadavky na kvalitu nádorů, výsledná koncentrace spor u takto připraveného inokula se pohybuje v rozmezí požadované hodnoty. Suspenze v destilované vodě si zachovává infekčnost po dobu jednoho roku i déle, je-li uskladněna při 5 oC. 2.2. Metody inokulace Přestože existuje několik odlišných inokulačních metod, z důvodu zajištění maximálního infekčního tlaku je třeba u všech metod dodržovat optimální hodnoty rozhodujících faktorů infekce. K nim patří zejména koncentrace spor v inokulačním mediu, teplota, vlhkost půdy a světlo. Jako kontrolu je vždy nutno ke všem testům použít velmi vnímavý genotyp k nádorovitosti, nejčastěji je používána odrůda pekingského zelí (Brassica rapa var. pekinensis) ´Granaat‘. K testování by mělo být použito nejméně 40 ks rostlin od jednoho testovaného genotypu. Některé zde uvedené metody jsou již zastaralé nebo jsou velmi pracné a v praxi se neprovádí, avšak jsou zde uvedeny alespoň pro přehled. 2.2.1. Inokulace pomocí mikropipety Tato je v praxi nejčastěji používána při testech ve fytotronu. Podmínkou je použití osiva s dobrou klíčivostí. Sadbovače s velikostí buněk 4 x 4 cm jsou naplněny směsí hrubého perlitu a běžného pěstebního substrátu pro zeleniny s pH okolo 6-7 v poměru 1:1. Do každé buňky jsou na povrch růstového substrátu vyseta 2 až 3 semena testovaného genotypu v rovnoměrné vzdálenosti od sebe. Na každé semeno je mikropipetou aplikováno 0,5 ml inokula koncentrace 107 spor.ml-1 a z důvodu omezení houbových chorob kořenového krčku jsou semena zasypána 1 cm vrstvou hrubozrnného perlitu. Jako standarda je použita silně vnímavá odrůda pekingského zelí ´Granaat ´. Takto připravené sadbovače jsou naskládány na podnosy, ve kterých je neustále udržována asi 1 cm vysoká hladina vody a jsou umístěny ve fytotronu při stálé teplotě v rozpětí 20 - 22 oC a nepřetržitém osvětlení 80 – 100 µE.m-2. s-1 po dobu 6-7 týdnů. Při dobré klíčivosti semena vzchází v průběhu 3 až 4 dnů. K infekci dochází již několik hodin po inokulaci, ale první příznaky napadení jsou zřejmé teprve po třetím týdnu infekce (chlorotické i antokyanózní zbarvení), avšak výskyt nádorů můžeme bezpečně pozorovat teprve po čtvrtém týdnu infekce. Po 3 týdnech je vhodné rostliny přihnojovat jednou týdně roztokem Kristalonu Start v koncentraci 0,5 g na 10 l vody. Je to obzvlášť nutné pokud máme v buňce 2 až 3 rostliny. Více rostlin výživu z růstového substrátu rychleji vyčerpá a rostliny by mohly předčasně uhynout, aniž by vytvořily dostatečně velké nádory. Za 6 až 7 týdnů po inokulaci mohou být rostliny vyhodnoceny. 2.2.2. Inokulace namáčením kořenů Použití této metody je většinou využíváno při velmi špatné klíčivosti semen, kdy přímý výsev semen do sadbovačů by způsoboval zbytečně prázdná místa, nebo při malém počtu semen testovaných genotypů. Semena jsou vyseta do plastových kontejnerů s perlitem a
8
umístěna do skleníku s teplotou okolo 18 až 20 oC. Ve stadiu děložních lístků, což je asi za 7 dnů od výsevu, jsou rostlinky vyjmuty z perlitu a kořeny jsou namáčeny do suspenze vytrvalých spor v koncentraci 107.ml-1. Po tomto ošetření jsou semenáčky vysázeny do plastových kontejnerů na podnosy a umístěny do fytotronu za stejných pěstebních, teplotních a světelných podmínek, včetně doby kultivace jako v předcházející metodě. 2.2.3. Inokulace zapracováním suspenze spor do půdy Při této metodě je suspenze vytrvalých spor důkladně promíchána s růstovým substrátem tak, aby koncentrace spor byla 107. g-1 suchého substrátu a semeno je pak vyseto přímo do této směsi. Směs připravíme tak, že 100 g nádorů rozmixujeme v 1 l destilované vody a smícháme s 10 l substrátu, vzniklého směsí pěstebního substrátu a perlitu v poměru 1:1. Jinou variantou této metody je přidání určitého množství suchého růstového substrátu do suspenze vytrvalých spor, umístěné v 7 centimetrových krystalizačních miskách. Substrát stačí absorbovat suspenzi, ale zůstává nasycen a dosahuje konečné koncentrace spor 107.g-1 suché hmotnosti substrátu. (např. 50 ml 6 x 106 spor.ml-1 přidaných do 30 g kompostu). Semena jsou vyseta na povrch substrátu. Aby se zabránilo ztrátám vlhkosti, je miska přikryta víčkem a umístěna do fytotronu s teplotou 25 oC a nepřetržitým osvětlením 100 µE.m-2.s-1 po dobu 7 dnů. Ke konci tohoto období dochází k vysoce uniformní primární infekci kořenového vlášení a semenáčky ve stadiu děložních lístků jsou přesazeny do plastových kontejnerů s růstovým substrátem a dále se pokračuje jako u předchozích metod. 2.2.4. „Slurry“ metoda inokulace Při této metodě se suspenze vytrvalých spor mísí s určitým množstvím substrátu a připraví se řídká kaše („slurry“), která obsahuje 107 spor.ml-1. Objemový poměr suspenze a substrátu je 1 : 1 a suspenze spor je připravována ve dvojnásobné koncentraci než je pro konečnou kaši požadováno. Kaše je aplikována v řádcích na miskách nebo v jamkách na povrchu substrátu v plastových kontejnerech a osivo je vysázeno přímo na kaši a lehce přihrnuto, aby nedocházelo k vysychání. Tato metoda se však už dnes nepoužívá. 2.2.5. Inokulace zakořeněných listů Většina brukvovitých rostlin tvoří snadno ve vhodných podmínkách sekundární kořeny ze stonkových částí a poměrně snadno zakořeňují i oddělené listy. Takto vzniklé kořeny jsou ve všech ohledech shodné s kořeny matečných rostlin a vykazují stejnou úroveň vnímavosti a odolnosti proti nádorovitosti. Tato metoda je vhodná pro opakované a paralelní testování perspektivních jedinců vůči dalším patogenům. Nepoškozené, plně rozvinuté vitální listy jsou odloupnuty (neodřezávat) těsně u stonku testované matečné rostliny. Listové řapíky se máčí v délce aspoň 3 cm po dobu 20 hodin ve směsi růstových regulátorů kyseliny indolylmáselné (10 mg.l-1 ) a kyseliny nikotinové (5 mg. l-1 . Poté jsou osušeny buničitou vatou a vysázeny do vhodných plastových kontejnerů s vlhkým perlitem, přičemž nejméně 5 cm řapíku musí být do perlitu ponořeno. Kontejnery jsou uloženy na podnosy s výškou vody asi 1 cm, zakryty netkanou textilií, kterou je nutno zpočátku často rosit a umístěny do fytotronu s teplotou 22 oC /18 oC den/noc, délka dne 16 hodin, při osvětlení 80 – 100 µE.m-2. s-1. Po týdnu se textilie sejme. Jednou týdně jsou listy přihnojovány roztokem Kristalon Start (5 g na 10 l vody) postřikem na list. Asi po třech týdnech má většina listů dobře vyvinuté kořeny. Kořeny se promyjí čistou vodou, odstraní se zbytky perlitu, namáčí se do suspenze spor vzniklé rozmixováním nádorů Plasmodiophora brassicae, v koncetraci spor 107 spor.ml-1 a vysazují se do plastových kontejnerů do směsi pěstebního substrátu s perlitem v poměru1 : 1, poté jsou vloženy na podnosy s vodou a opět umístěny do fytotronu za stejných pěstebních podmínek jako při zakořeňování listů. Ke kontrole je standardně použita odrůda pekinského zelí ´Granaat´. Asi po 8 týdnech jsou nádory plně vyvinuty k vyhodnocení.
9
2.2.6. Inokulace „spodem“ Pro snížení pracné inokulace mikropipetou byla na pracovišti VÚRV, v.v.i., Oddělení speciálních plodin a zelenin Olomouc tato metoda zkoumána a prověřena. Příprava inokula a výsev semen je stejný jako u mikropipetové metody. Připravené oseté plastové kontejnery jsou naskládány na podnosy rozměrů 15 x 47 cm tak, aby od jednoho okraje zbylo asi 5 cm prostoru na dolévání vody, a následně přeneseny do fytotronu. Do takto připravených podnosů je nalito 1 l destilované vody a 60 ml inokula koncentrace 107 spor.ml-1 . Během několika hodin je roztok inokula z velké části absorbován půdou. V podnosech je neustále doplňována hladina vody do výše asi 1 cm. Nadále jsou rostliny uchovávány za stejných pěstebních, teplotních a světelných podmínek jako v předcházejících metodách. Po 6-8 týdnech kultivace jsou rostliny vyhodnoceny. 2.2.7. Inokulace kořenového vlášení Při této metodě jsou naklíčená semínka kultivována v živném mediu ve zkumavkách o objemu 12 ml. Po naplnění 11 ml živného media a 1 ml roztoku inokula s koncentrací 107 spor.ml-1. jsou zkumavky uzavřeny zátkou s 2 mm otvorem, kterým je prostrčen kořínek naklíčených semínek. Semínka byla předem naklíčena na vlhkém papíru v Petriho miskách ve tmě při teplotě 18 oC po dobu 3 dnů. Zkumavky jsou naskládány do otvorů hlubokých stojanů, kde je kořínek ve tmě a rašící výhonek na světle a pak umístěny do fytotronu s teplotou 23 oC a osvětlením 16 hodin při 82 µE. m-2.s-1. Po 7 dnech jsou kořínky odřezány, obarveny v roztoku anilinové modři a pod mikroskopem při zvětšení 200x je možno počítat počet plasmodií na centimetr kořenové délky. Tato metoda je však velmi pracná a zatím se v praxi neprovádí. Dá se však využít při jiných vědeckých výzkumech. 2.3. Polní testování Na rozdíl od laboratorních podmínek, kde se testuje pouze rezistence rostlin vůči P.brassicae, při polním testování je možno testovat jak rezistenci, tak i toleranci rostlin k danému patogenu. Avšak při zjišťování rezistence nemůžeme zajistit konstantní pěstební podmínky tak jak je tomu ve fytotronu, což může mít za následek vznik určitých potíží při tvorbě nádorů. Ty se mohou v závislosti na půdních a klimatických podmínkách tvořit velmi brzy po výsadbě, což vede k předčasnému úhynu rostlin, a nebo se nevytváří vůbec. Z těchto důvodů je vhodnější a spolehlivější provádět testy na rezistenci v laboratořích (fytotronech) a polní testování uplatňovat jen pro zjišťování tolerance. Pro provádění testů tolerance je nutné použít infekční pole, které musí být dostatečně rovnoměrně zamořené spory P. brassicae buď spontánní nebo umělou infekcí. K rovnoměrnému zamoření půdy sporami P. brassicae je možno použít na podzim sklizené nádory z napadených kořenů brukvovitých plodin, ty se rozdrtí a v dávce nejméně 100 g/m2 jsou rovnoměrně zapraveny do ornice. Pro zvýšení zamořenosti je vhodné v následujícím roce pěstovat náchylnou odrůdu, nejlépe pekingské zelí odrůdy ´Granaat‘, na jejíž kořenech dojde k pomnožení nádorů, ty však nesklízíme, ale necháme přezimovat a na jaře příštího roku půdu zrotavátorujeme, čímž dojde k homogenizaci rozpadlých nádorů v půdě a jejich promísení s orniční vrstvou. K udržení vysoké zamořenosti infekčního pole je možno provést zálivku homogenátem 500 g nádorů do 10 l vody na plochu 5 m2. Infekčnost zamoření sporami by se měla pohybovat okolo 7 000 spor na 10 g zeminy a dá se zjistit počítáním spor ve výluhu pomocí Bürkerovy komůrky nebo pomocí imunofluorescenčních metod, které však
10
provádí jen specializovaná pracoviště, např. ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha-Ruzyně. Pro přípravu sadby jsou vyseta semena testovaných odrůd do perlitem naplněných plastových kontejnerů o průměru 8 cm a pokryta slabou vrstvou perlitu. Kontejnery jsou uloženy na podnosy se stálou výškou vodní hladiny okolo 2 cm a umístěny do skleníku při teplotě 18 – 20oC a při normálním denním osvětlení. Protože se sadba připravuje v jarních měsících, intenzita přirozeného osvětlení je dostačující. Asi po 3 dnech začínají semena vzcházet a za 5-7 dní od výsevu jsou semenáčky ve stadiu děložních lístků přesázeny do sadbovačů o velikosti buněk 4 x 4 nebo 3,5 x 3,5 cm naplněných pěstebním zahradnickým substrátem. Po 14 dnech začneme sazenice přihnojovat 1 x týdně roztokem Kristalonu Start v dávce 5 g na 10 l vody. Za 6 – 8 týdnů jsou rostliny připraveny k výsadbě na infekční pole, které bylo na podzim vyhnojeno běžnými dávkami průmyslových hnojiv. Od každého genotypu je vysázeno nejméně 50 ks rostlin do sponu 50 x 60 cm. Jako kontrolní standarda se obvykle používá vnímavá odrůda pekingského zelí ´Granaat‘. Z důvodu podchycení půdní nevyrovnanosti je vhodné uvedený počet rostlin vysadit ve 4 opakováních. Za 3 týdny po výsadbě jsou rostliny přihnojeny Cereritem v dávce 300 kg/1ha. V průběhu vegetace jsou porosty ošetřovány běžným způsobem (okopávka, závlaha, ošetření proti chorobám a škůdcům). Paralelně s infekčním polem je třeba založit ve stejném termínu totožný pokus na zdravém nezamořeném poli a během vegetace provádět stejná ošetření. Sklizeň testovaných genotypů na zamořeném a nezamořeném pozemku se provádí postupně podle dosažené konzumní zralosti jednotlivých genotypů. 2.4. Způsob hodnocení Vyhodnocení intenzity napadení v laboratorních podmínkách se provádí za 6-7 týdnů po inokulaci. Z kořenů je pod proudem tekoucí vody odstraněn růstový substrát a u každé rostlinky je stanovena intenzita napadení patogenem. Bylo navrženo několik stupnic pro stanovení intenzity napadení, ale v praxi se používá stupnice podle Buczacki a kol.(1975) v rozsahu 0 – 3, kde 0 = bez vizuálních příznaků napadení, 1 = nádory pouze na postranních kořenech, 2 = nádory na hlavním kořenu, 3 = deformovaná celá kořenová soustava. Je nutno, aby u jednoho genotypu bylo hodnoceno aspoň 40 ks rostlin. Pomocí získaných výsledků můžeme stanovit index napadení = DI (disease index), což je průměrný výsledek intenzity napadení pro populaci rostlin vyjádřený jako procento možného maxima (tj. 3). DI = index napadení =
∑(počet rostlin ve stupni napadení x číslo stupně) x 100 celkový počet hodnocených rostlin x 3
U vnímavých genotypů je DI většinou 80 – 100 %, kdežto vysoce rezistentní genotypy mají DI menší než 20 %. Jestliže se stupeň rezistence hodnotí intenzitou výskytu choroby, pak stupeň tolerance výší výnosů. Při polním testu na toleranci k nádorovitosti jsou rostliny na infekčním a na nezamořeném poli hodnoceny ve stadiu konzumní zralosti. Všechny rostliny u jednotlivých genotypů jsou vždy hodnoceny v jednom termínu. Je hodnocen výnos konzumních částí jednotlivých rostlin daného genotypu na infekčním poli v konfrontaci s výnosem na nezamořeném pozemku . Stupeň tolerance lze vyjádřit tzv. koeficientem tolerance (Kt). Kt= hmotnost konzumních částí napadených rostlin x 100 hmotnost konzumních částí zdravých rostlin
11
Výše Kt ve skutečnosti udává procento výnosu konzumních částí u genotypů pěstovaných na infekčním poli ve vztahu k výnosu genotypů pěstovaných na nezamořeném poli. Čím je koeficient vyšší tím je tolerance větší. Jestliže Kt = 100, je výnos tržních částí u genotypů pěstovaných na infekčním poli zcela shodný s výnosem genotypů pěstovaných na zdravém poli, což znamená, že genotyp je zcela tolerantní. Další možností vyjádření tolerance je stanovení procenta napadených rostlin v tržní kvalitě. V případě potřeby je možno při hodnocení použít běžně používané statistické metody. 3. ZÁVĚR V předložené publikaci jsou stručně shrnuty veškeré základní dostupné informace týkající se nádorovitosti brukvovitých plodin způsobené patogenem Plasmodiophora brassicae, její biologie, rozšíření, metody ochrany a prevence, které lze v současné době využít. Metodika poskytuje přehled dříve používaných testovacích metodik a některých dnešních moderních metodik, které umožňují detekci výchozích zdrojů rezistence a rezistentních materiálů v průběhu šlechtitelského procesu. Podrobně je popsána příprava inokula, samotné provádění testů až po vyhodnocení dosažených výsledků. Tato metodika je určena především vědeckým pracovníkům v oblasti výzkumu rezistence genetických zdrojů, specialistům- fytopatologům, šlechtitelům a pracovníkům zabývajících se problematikou nádorovitosti brukvovitých plodin. Pro její využití je uzavřena smlouva se šlechtitelsko-semenářskou firmou Moravoseed spol. s r.o. ze dne 16.11.2007
12
4. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BUCZACKI, S.T.: Plasmodiophora – an inter-relationship between biological and practical problem. In: Buczacki, S.T.: Zoosporic plant pathogens – a modern perspective. Academic Press, pp. 161-191, 1983. BUCZACKI, S.T., MOXHAM, S.E.: Structure of the resting spore wall of Plasmodiophora brassicae revealed by electron microscopy and chemical digestion. Trans. Br.Mycol. Soc., 81(2) : 221-231, 1983. CHEAH, L.H., VEERAKONE, S., KENT, G.: Biological control of clubroot on cauliflower with Trichoderma and Streptomyces spp. New Zealand Plant Protection 53, 2000. CRUTE, I.R.: Variation in Plasmodiophora brassicae and resistance to clubroot disease in brassicas and allied crops – a critical review. Pl. Bred. Abstract, 50 (2) : 91-104, 1960. DEVOS, S., VISSENBERG, K., VERBELEN, J.P., PRINSEN, E.: Stimulation of plant growth: impacts on cell wall metabolism and hormone balance. New Phytologist, 166, pp. 241-250, 2005. DIXON, G.R., BROKENSHIRE, T. : Chemical control of clubroot (Plasmodiophora brassicae). Proc. Crop Protection in Northern Britain, pp. 325-329, 1981. DOBSON, R.L., GABRIELSON, R.I., BAKER, A.S., BENNETT, L.: Effects of lime particle size and distribution and fertilizer formulation on clubroot disease caused by Plasmodiophora brassicae. Plant Diseases, 67 (1): 50-52, 1983. FRIBERG, H., LAGERLOF, B., RAMERT, B.: Usefulness of nonhost plants in managing Plasmodiophora brassicae. Plant Pathology 55 (5), 690-695, 2006. HEYN, F.W.: Studies on clubroot populations. Proc. Brassica Conference, Norway, pp. 2934, 1981. HORAL, J., HORALOVÁ, J., ROD, J.: Tolerance zelí hlávkového (Brassica oleracea var.capitata) a kapusty hlávkové (Brassica oleracea var.sabauda) k nádorovitosti (Plasmodiophora brassicae). Bulletin Výzkumného šlechtitelského ústavu zelinářského, Olomouc, 31: 19-25, 1987. MITHEN, R., MAGRATH, R.: A contribution to the life history of Plasmodiophora brassicae: secondary plasmodia development in root galls of Arabidopsis thaliana. Mycol. Res.96: 877-885, 1992. MYERS, D.F., CAMBELL, R.N., GREATHEAD, A.S.: Thermal inactivation of Plasmodiophora brassicae Woro. And its attempted control by solarization in the Salinas Walley of California. Crop. Protection, 2 (3) : 325-333, 1983. TAKASHI, H., ISHIKAWA, T., KAIDO, M., TAKITA, K.: Plasmodiophora brassicaeinduced Cell Death and Medium Alkazation in Clubroot-rezistant Cultured Roots of Brassica rapa. Journal of Phytopathology, volume 154, number 3, pp. 156-162, 2006. ROD, J., LÁSKA, P.: Choroby a škůdci košťálové zeleniny. SZN, 1986. ROD, J.: Tolerance forem a odrůd košťálovin k nádorovitosti. In: Zahradníctvo, (11), 418-420, 1992. ROD, J.: Zprávy UKÚZ, 37, květen: 1-52, 1996. WILLIAMS, P.H.: Clubroot disease, host – parazite relations. Proc. Woronin + 100 Confewrence, Madison, pp.16-23, 1977.
13
5. SEZNAM PŘÍLOH 1. Životní cyklus Plasmodiophora brassicae 2. Schematické znázornění stupňů napadení při bodovém hodnocení 3. Infekční pole - porost košťálovin za 30 dnů po výsadbě 4. Infekční pole - porost košťálovin za 80 dnů po výsadbě 5. Testování ve fytotronu - mladé infikované semenáčky 6. Testování ve fytotronu – nádory na kořenech hlávkového zelí 7. Testování ve fytotronu – nádory na kořenech pekingského zelí 8. Zakořeněné listy květáku odrůda ´Arktur´ s nádory 9. Pekingské zelí odrůda ´Granaat´ s nádory
14
1. Životní cyklus Plasmodiophora brassicae (Urban, Kalina, 1980)
15
2. Schematické znázornění stupňů napadení při bodovém hodnocení
16
3. Infekční pole - porost košťálovin za 30 dnů po výsadbě.
4. Infekční pole - porost košťálovin za 80 dnů po výsadbě.
17
5. Testování ve fytotronu - mladé infikované semenáčky.
6. Testování ve fytotronu – nádory na kořenech hlávkového zelí .
7.Testování ve fytotronu – nádory na kořenech pekingského zelí.
18
8. Zakořeněné listy květáku odrůda ´Arktur´ s nádory.
9. Pekingské zelí odrůda ´Granaat´ s nádory
19
Autor:
Věra Chytilová, Karel Dušek
Název:
Metodika testování odolnosti brukvovitých plodin k nádorovitosti
Vydal:
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
Náklad:
220 ks
Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy ISBN 978-80-87011-23-2 © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
