Metodika odběru vzorků u reprodukčních poruch a onemocnění skotu MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava Seminář ČBS, Brno, 14. listopadu 2015
Reprodukční poruchy a onemocnění skotu Neinfekční faktory: • toxická agens, otravy • metabolické poruchy • genetické abnormality • teplotní stres • trauma apod. Infekční faktory: • bakteriální patogeny • virové patogeny • parazitární (protozoální) patogeny • ostatní infekční agens – chlamydie, mykoplazmata apod. • plísně - mykotoxiny 2
Bakteriální původci reprodukčních poruch skotu Nákaza / původce
četnost zmetání
doba zmetání (stádium březosti)
opakování zmetání
vhodné vzorky
laboratorní diagnostika
6-9 měsíc
většinou pouze jednou
placenta, zmetek, krev matky
sérologie matky, izolace, kultivace, MALDI, PCR
5-8 měsíc
vzácné, rekonvalescentní krávy jsou rezistentní
placenta, obsah žaludku plodu (abomasum), výtěry, vaginální a prepuciální výplašky
izolace, kultivace mikroskopie, fenotypové testy MALDI, PCR
sporadicky
4-9 měsíc
vzácné, rekonvalescentní krávy jsou rezistentní
viz výše
viz výše
leptospiróza: Leptospira interrogans, L. hardjo, L.grippotyphosa, L. pomona, L. sejroe, atd.
5-40%
poslední trimestr (L. pomona), ostatní kdykoliv, aborty 2-5 týdnů po infekci
imunita k sérotypu, který způsobil zmetání ale vnímavost k dalším sétypům
placenta, zmetek, krev matky a dalších krav v chovu
mikroskopický aglutinační test (MAT) + sérotypizace, ELISA, kultivace, Real-time PCR (patogenní sérovary)
Listerióza: Listeria monocytogenes Listeria ivanovii
většinou sporadicky, ale může dosáhnout 50%
2. ale většinou 3. trimestr
může se opakovat
placenta, zmetek, obsah žaludku plodu (abomasum), krev matky
kultivace /izolace z placenty či z obsahu žaludku, PCR, sérologie matky
sporadicky
jakékoliv stádium
není známo
placenta, zmetek
kultivace /izolace z placenty či z obsahu 3 žaludku, MALDI, PCR
brucelóza Brucella abortus
Campylobacter fetus veneralis
Campylobacter fetus fetus, C. jejuni
Trueperella pyogenes
(syn. Arcanobacterium pyogenes)
do 80% inf. v 1. nebo 2. trimestru
>10%
Viry způsobující reprodukční poruchy skotu Nákaza / původce
bovinní virová diarrhoea (virus BVD-MD)
četnost zmetání
většinou nízká
BHV1 5-60% infekční bovinní rhinotracheitida (IBR) virus katarální horečky většinou ovcí - bluetongue (BT) nízká Schmallenberg virus (SBV)
většinou nízká
doba zmetání (stádium březosti)
opakování zmetání
vhodné vzorky
laboratorní diagnostika izolace, PCR, ELISA Ag, průkaz viru v plodu, průkaz virémie u matky či býka, prekolostrální protilátky u zmetaného plodu
variabilní, většinou do 4 měsíců
není běžné, vytvoří se imunita
placenta, zmetek (např. slezina), sérum matky, plodu, popř. býka
jakékoliv stádium, ale více od 4. měsíce
není běžné, vytvoří se imunita
PCR či IHC z tkání, placenta, plod, izolace viru, sérologie sérum matky párové vzorky (VNT)
variabilní
nepravděpodobné
placenta, plod, vzorky séra izolace viru, PCR matky
3. trimestr
není běžné, vytvoří se imunita
plod (mozek), prekolostrální krev plodu
PCR, sérologie krve plodu
4
Schmallenberg virus • rod Orthobunyavirus, čeleď Bunyaviridae • krátká virémie 1-5 dní • u skotu jsou kritické 70-120 dny březosti, kdy ještě imunitní systém není dodatečně vyvinutý, virus přestupuje přes placentu a může způsobovat zmetání a malformace telat. • virus postihuje nervový systém plodu - u telat nehybné neflexibilní klouby, opistotonus, torticollis - zvrácený krk a páteř, hydroencephalus, zkrácená čelist a další abnormality = „syndrom artrogrypózy a hydroencefalu“ (AG/HE syndrom) • postižená telata jsou od matek infikovaných před 5-7 měsíci • infikované matky nemusí mít žádné klinické příznaky • může být horečka, snížení dojivosti či průjem (vše max. 5 dní) 5
Schmallenberg virus
© MVDr. František Kostka
Schmallenberg virus Vhodné diagnostické vzorky Z živých zvířat na průkaz akutní infekce (PCR) • EDTA krev • sérum – min. 2 ml, transportovat chlazené Z předčasných porodů a malformovaných telat: detekce viru: • mozek a mozkový kmen • amniové tekutiny • z živých nově narozených - amniové tekutiny a placenta (popř. meconium)
detekce protilátek: • tekutina z perikardu • prekolostrální krev • sérologie (ELISA, VNT) matky je z hlediska abortu neprůkazná histopatologie - fixovaný mozek a mícha
© MVDr. František Kostka
Parazitární (protozoální) patogeny způsobující reprodukční poruchy skotu Nákaza / původce četnost zmetání
neosporóza Neospora caninum
Tritrichomonas foetus
© P.J: Dubey
doba zmetání (stádium březosti)
opakování zmetání
vhodné vzorky
vysoká u prvotelek a když se infekce dostane do naivního stáda - do 30% u prvního vzplanutí enzooticky: 5-10%
jakékoliv stádium, ale nejčastěji 5-6 měsíc
sporadické
zvířata první polovina získávají březosti (často imunitu, ale ne 2-4 měsíc) celoživotní
© B. Koudela
placenta, zmetek klesá s paritou, (mozek, srdce, ale vždy možné játra, těl. tekutiny), sérum (cca 5%) matky
laboratorní diagnostika
PCR, histologie mozek, IHC - tkáně, sérologie matky (ELISA, IFAT)
kultivace z placenty, placenta, plodové z obsahu žaludku, tekutiny, zmetek, plodových tekutin či z vaginální výtok vaginálních výplašků, /výplašek PCR
© B. Koudela
8
Další (méně časté) infekční faktory reprodukčních poruch a onemocnění skotu • • • • • • • • • • • •
Q horečka - Coxiella burnetii (QF) chlamydióza - Chlamydophila sp. (Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci) Mycoplasma spp. (M. bovigenitalium) Toxoplasma gondii Sarcocystis spp. Salmonella spp. Anaplasma phagocytophila Histophilus somni Ureaplasma diversum Staphylococcus spp., Streptococcus spp. bovinní herpesvirus typ 4 (BHV4) virus parainfluenzy 3 (PI3)
plísně – mykotoxiny (přímý účinek, kumulace účinků více toxinů, imunosuprese a následné závažnější projevy infekcí jako např. BVD, Neospora caninum apod.) • uvádí se, že mohou být důvodem 3-10 % abortů Ø námelové alkaloidy (Claviceps purpurea): ergotoxin, ergotamin Ø fusariotoxiny (rod Fusarium): DON (vomitoxin), T-2 toxin, zearaleon Ø aflatoxiny (Aspergillus flavus, A. parasiticus) 9
Správný odběr diagnostických vzorků u reprodukčních onemocnění skotu Matrice - biologický materiál k vyšetření: Ø ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY Ø PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠEK/SEŠKRAB Ø VÝTĚR Ø KREV/SÉRUM Ø KRMIVO
Obecná pravidla odběru vzorků u reprodukčních onemocnění skotu Je třeba brát v potaz, že např. infekční zmetání je výsledek infekce, která proběhla o několik týdnů či měsíců dříve něž nastal problém a pokud vůbec patogen byl v plodu, často už není v čase zmetání detekován.
Diagnostický úspěch v laboratoři bývá pouze v 25-30%
Proto u odběru vzorků na diagnostiku zmetání platí obecné pravidlo:
„čím více, tím lépe“
Vzhledem ke složitosti průkazu původce/důvodu zmetání je ideální odebrat k vyšetření všechny možné druhy vzorků (plod, placenta, plodové obaly, krev zmetalky, výplach či výtěr, popř. krmivo). 11
ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY JAK a KDY a DO ČEHO? Zásady: ü placentu či plodové obaly balíme individuálně, ne společně se zmetkem ü ideálně použijeme dvojitý / trojitý obal ü plod či placentu neřežeme či jinak nedělíme, ale zašleme celé ü plod ani placentu neomýváme ü vzorky nezamrazujeme! ü transport a uchování při chladničkové teplotě 2-8°C
ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY PRO JAKÁ VYŠETŘENÍ? Zmetek a placenta jsou vhodné pro o patologickoanatomické vyšetření a diagnostiku většiny bakteriálních, virových či parazitárních původců zmetání, ale i na diagnostiku zmetání jiného původu (např. mykotoxiny, alkaloidy apod.). Průkaz patogenů ze zmetka provádíme metodami: kultivace, izolace, PCR, IFA (imunofluorescence), IHC (imunohistochemie), ELISA Ag, histologie, mikroskopie apod. Pozn. zmetek slouží v diagnostice rovněž z hlediska signifikantních lézí a změn na plodu, či pro některé patogeny charakteristický stářím plodu apod.
www.teara.govt.nz
PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠKY/SEŠKRABY JAK a KDY a DO ČEHO? Výplašky/seškraby se používají zejména k diagnostice venerálních patogenů jako např. Tritrichomonas foetus a Campylobacter fetus: Výplašky plemenných býků se provádí: Ø před přesunem do OPB Ø pravidelně na OPB Ø pravidelně na inseminační stanici býků • •
nařízené preventivní vyšetření, které je součástí MKZ SVS ČR u krav resp. jalovic se odebírají výplašky pouze pro preventivní vyšetření (např. při exportech a prodeji) nebo při situacích s klinickými příznaky onemocnění.
Odběr vzorků se provádí ve všední dny, pokud možno ráno či dopoledne a to kvůli včasnému doručení do laboratoře a neprodlenému zpracování. Ve výjimečných případech lze po telefonické dohodě s laboratoří zajistit případné zpracování vzorků i po pracovní době.
ODBĚR VÝPLAŠKŮ U BÝKŮ • před odběrem provedeme sedaci zvířete a zevní očistu genitálu • k získání výplašku se zavedeme do prepucia až ke glans penis sterilní katetr (inseminační pipeta, sterilní hadička apod.) • vyústění prepucia pak manuálně zkomprimujeme a do prepucia se pozvolna vstřikneme stříkačkou 30-50 ml vlažného fyziol. roztoku • katetrem se následně provedeme mírný seškrab glans penis a masáž prepucia po dobu 2 minut. Pak se výplašek vypustí katetrem do sterilní nádoby (např. sterilní plastové kyvety dodávané po tel. domluvě z SVÚ). • jeden odběr se dá použít pro oba patogeny - Campylobacter f. a Tritrichomonas f.
TRICAMPER™SAMPLING DEVICE
© BonDurant, R.H. Diagnosis
Merck Manual
ODBĚR VÝPLAŠKŮ U KRAV • před odběrem se provede ev. sedace zvířete, zevní očista genitálu • k získání výplašku se zavede do vaginy sterilní katetr (inseminační pipeta, sterilní hadička apod.) • manuálně se uzavře vaginální otvor a pozvolna se vstříkne stříkačkou 30-50 ml vlažného fyziol. roztoku a provede se masáž • pak se výplašek vypustí katetrem do sterilní nádoby (např. sterilní plastové kyvety) ___________________________________________________________
VÝPAŠKY / SEŠKRABY: UCHOVÁNÍ A TRANSPORT VZORKŮ? • transport a uchování při teplotě v rozmezí 5°-38°C.
(do přepravek se vzorky je vhodné vložit PET láhev s teplou vodou) • uložení do temna (box, krabice apod.) nutné u vzorků na Tritrichomonas f. • vzorek co nejrychleji (nejlépe dopoledne) doručit do laboratoře, aby zde byla časová rezerva na zpracování vzorků (registrace, odstřeďování, kultivace). Vyšetření trvá 7 dní u Tritrichomonas f., resp. 5-7 dní Campylobacter f.
VÝTĚRY Výtěry/stěry mohou sloužit jako alternativa k výplaškům např. v situacích, kdy nelze výplašek z nějakého důvodu provést. Vaginální výtěr využíván k preventivnímu vyšetření na Campylobacter fetus (AMIES) či Tritrichomonas foetus (CAT SWAB). Výtěry lze využít i na diagnostiku dalších bakteriálních (AMIES) či virových původců abortů (Eswab). Vaginální výtěr není zcela vhodný na stanovení původců metritid. Výtěr z děložního krčku / z dělohy Je využíván na diagnostiku puerperálních onemocnění, metritid apod.
VÝTĚRY/STĚRY JAK A DO ČEHO? Výtěry se provádí nejčastěji do těchto odběrových souprav:
Vaginální výtěry Ø AMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoal Ø C.A.T. SWAB fi Dispolab na Tritrichomonas fetus
Výtěry z děložního krčku Ø Eswab - Copan Eswab™ Collection Kit Ø Odběrová souprava fi Labmediaservis
VAGINÁLNÍ VÝTĚRY AMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoal Cat. No. 114C (COPAN Italia) - bakteriologické vyšetření
• nevhodný pro virologickou diagnostiku (málo matrice, médium může způsobit inhibici PCR) • nejčastěji využíván na vaginální výtěr k prev. vyšetření na Campylobacter f. • stěr lze provést i z orgánů zmetka (ale lépe zaslat zmetka celého do laboratoře) Souprava obsahuje: odběrový tampon (plastová tyčinka se smotkem syntetické bavlny) a zkumavku s médiem obsahující aktivní uhlí. Tampon se se po odběru vloží do transportního media. Jedná se o universální transportní půdy zaručující přežití odebraných mikroorganismů (aerobních i anaerobních bakterií) po dobu nejméně 48 hodin, včetně náročných druhů. Tato media udržují mikroorganismy vitální při jejich sníženém metabolismu, nepomnožují se.
VAGINÁLNÍ VÝTĚRY C.A.T. SWAB fi Dispolab Doc. RNDr. Josef Reischig, CSc
•
na výtěr vaginy pro vyšetření na Tritrichomonas fetus
•
alternativa místo výplašku
•
dodává fi Dispolab nebo po telefonické domluvě SVÚ (Oddělení bakteriologie)
•
odběrový tampon se opatrně zasune do vaginy, provede se krouživým pohybem výtěr vaginální sliznice a tampon se vloží se do transportního media, které je součástí setu.
•
speciální odběrová souprava (plastová zkumavka s tamponem na konci opatřeným balónkem s kultivačním médiem)
•
skladování před transportem: max. 24 hodin při pokojové teplotě (15 30 °C)
Výtěry z děložního krčku Eswab - Copan Eswab™ Collection Kit – Cat. No 480CE (COPAN Italia) ü vhodný pro virol. i bakteriologické vyšetření (+Leptospira spp. Chlamydophila spp.) ü kapalné médium Eswabu uchovává jak nukleové kyseliny, tak antigeny bakterií, virů i chlamydií ü umožňuje přežití aerobních, anaerobních i jiných kultivačně náročných bakterií ü slouží pro odběr a transport stěru/výtěru z děložního krčku, vagíny, placenty, plodových obalů a plodových tekutin • lze použít i pro zamrazení a archivaci především pro vyšetření/screening metodou PCR Souprava obsahuje: • odběrový flokovaný tampon zalamovací tyčinkou • zkumavku s 1 ml tekutého čirého Amiesova média
Nový screeningový test pro detekci původců abortů u skotu SVÚ Jihlava – laboratoř molekulární biologie
PCR screeningový test
Cena: 2500,- Kč / 1 vzorek / 8 patogenů • • • • • • • •
Campylobacter fetus Leptospira spp. – patogenní sérovary Listeria monocytogenes Coxiella burnetii Chlamydophila spp. Salmonella spp. Anaplasma phagocytophila bovinní herpesvirus 4
23
Výtěry z děložního krčku Odběrová souprava - LabMediaServis s.r.o. „Souprava na odběr vzorku pro vyšetření endometritid u dojnic“ Souprava obsahuje: ü katetr s mandrenem a sterilní výtěrovkou ü sáček s dezinfekcí ü přepravní médium ve zkumavce (Amies) • tampon je na dostatečně dlouhé tyčce (59 cm) • opatřen speciální koncovkou, která zabraňuje kontaminaci vzorku z vaginy nebo z vnějšího prostředí • vzorek je po odběru uložen do transportního media • získává se takto čistá bakteriální kultura 24
Hodnocení soupravy pro mikrobiologické vyšetření endometritid u skotu (LabMediaServis s.r.o)
• 10/2014 – 3/2015 - SVÚ Jihlava (odd. bakteriologie) ve spolupráci s firmou Zoetis (MVDr. Borkovec) • 45 ks vzorků odebraných od dojnic z 32 chovů s reprodukčním onemocněním dojnic (popř. klinickými příznaky endometritid) • bakteriologické vyšetření popř. stanovena citlivost na ATB diskovou metodou. • vzorky ve většině případů nebyly kontaminovány mikrobiologickým osazením pochvy dojnic, nedocházelo k přerůstání bakteriemi jako např. Proteus sp., E. coli apod. • prokázalo se, že přepravní médium Amies je vhodné médium pro uchování a transport i těchto vzorků do laboratoře, k uchování aerobních i anaerobních bakterií, a to i v širokém rozmezí teplot při přepravě (5 – 22°C). 25
Hodnocení soupravy LabMediaServis pro endometritidy Běžnými kultivačními technikami byla izolována a metodou MALDI-TOF identifikována řada bakterií, a to přímých nebo potencionálních původců onemocnění reprodukčního aparátu dojnic. • většinou o oportunní, příležitostné patogeny, u kterých závisí na imunitě daného zvířete či stáda, jak se projeví. • již v primokultivaci většinou nárůst téměř čistých izolátů (usnadnění detekce bakteriálních patogenů)
• následný antibiogram u všech izolátů – ATB resistence • u zájem ÚSKVBL – kvůli používání ATB s indikačním omezením Z výsledků vyplývá, že odběrová souprava pro mikrobiologické vyšetření endometritid u skotu je vhodná pro použití ve vet. praxi a je přínosem pro bakteriologickou diagnostiku a následnou racionální léčbu antibiotiky.
DĚLOŽNÍ VÝTĚRY 2015 - SVÚ Jihlava Původce Acinetobacter pittii Acinetobacter sp Aerococcus viridans Bacillus sp. Bacteroides pyogenes Citrobacter braakii Clostridium perfringens Clostridium sp. Corynebacterium sp Enterococcus hirae Escherichia coli Escherichia coli var haemolytica Histophilus somni Klebsiella pneumoniae Mannheimia haemolytica Mannheimia varigena Pasteurella multocida Proteus mirabilis Proteus sp. Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus chromogenes Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus dysgalactiae Streptococcus lutetiensis Streptococcus pluranimalium Streptococcus sp. viridující Streptococcus uberis Trueperella pyogenes
Počet izolací 1 3 1 3 2 1 5 1 1 1 29 7 2 2 2 1 1 5 12 1 1 4 1 3 1 5 1 15 26 21
JAK UCHOVÁVAT A TRANSPORTOVAT VZORKY VÝTĚRŮ? AMIES Swab, Labmediaservis, C.A.T. SWAB - při teplotě 5 – 25°C - transport do laboratoře do 48 hodin Eswab Collection Kit - pro virologické i bakteriologické vyšetření - transport a uchování při teplotě 5 – 25°C , pro virologii 2 – 8°C (popř. zamrazit) - transport do laboratoře ideálně do 48 hodin Po odběru vzorek doručte co nejdříve do laboratoře! Nutno počítat s časovou rezervou (např. dodání vzorků ve večerních hodinách, před víkendem nebo před svátky) tak, aby se 48 hodinový interval zbytečně neprodlužoval.
Správný odběr a transport ovlivňuje výsledek bakteriologického a virologického vyšetření. 27
KREV / SÉRUM Sérum zmetalek (popř. sérum plodu) lze použít pro přímý i nepřímý průkaz některých patogenům způsobujících reprodukční problémy Nepřímý průkaz (sérologie) Ø kvalitativními testy (ELISA) Ø kvantitativními testy prokazujícími titr protilátek (IPMA, NPLA, VNT apod.)
Samotná kvantita protilátek recentní infekci neprokazuje - neexistuje něco jako „postinfekční“ titr protilátek.
Nutný průkaz sérokonverze z párových vzorků. • • •
ze stejných zvířat odebraných v intervalu min. 3-4 týdnů (sledování dynamiky titrů protilátek). první odběr co nejdříve po zmetání, druhý odběr za 3 týdny. signifikantní sérokonverze je potvrzena rozdílem v titrech mezi párovými vzorky a to minimálně o dva až tři řády (např. 20 → 80, nebo 80 → 320, apod.)
Párové vzorky je nutné testovat najednou za stejných podmínek a se stejnou šarží testu. Při odesílání prvního odběru, prosím upozorněte na žádance, že k těmto vzorkům přijdou časem další párové vzorky. Z prvního odběru pak séra zamrazí, archivují v laboratoři a vyšetřují se až současně se séry z druhého odběru.
KREV / SÉRUM PRO JAKÁ VYŠETŘENÍ je krev vhodná? Sérologické vyšetření na průkaz specifických protilátek v krvi zmetalek bakteriální původce abortů: • Leptospira spp., Brucella abortus, Listeria monocytogenes virové původce abortů: • BVD, IBR (BHV1), virus katarální horečky ovcí (BTV, bluetongue) parazitární (protozoální) původce abortů: • Neospora caninum, Toxoplasma gondii ostatní infekční původce abortů: • Chlamydophila abortus, Chlamydophila spp., Coxiella burnetii (Q horečka) Virologické vyšetření na přímý průkaz původce v krvi: • BVD (ELISA Ag nebo PCR)
29
ZÁVĚREM: Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe
Výsledek laboratorní diagnostiky ovlivněn mnoha faktory: • správným odběrem a transportem vzorků • zpracováním a uchováváním vzorků • výběrem laboratorních metod
KAVALITNÍ VZOREK = ZÁKLAD PRO KVALITNÍ DIAGNOSTIKU
Děkuji za pozornost
31
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie
