METODE PENELITIAN Desain, Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian quasi eksperimental dengan prepost test with control design (Bhisma 2003), karena analisis dilakukan sebelum dan setelah intervensi. Lokasi penelitian yaitu lingkungan Institut Pertanian Bogor. Analisis kadar MDA plasma dilakukan di Laboratorium Biokimia Departemen Gizi Masyarakat Institut Pertanian Bogor (IPB). Penelitian dilakukan dari bulan Mei hingga September 2011. Penelitian ini telah direview oleh tim Komisi
Etik
Penelitian
dikeluarkannya
Kedokteran
Ethical
dan
Approval
Kesehatan
atau
Indonesia
ethical
clearance
dengan No.
KE.01.07/EC/418/2011 yang diterbitkan di Jakarta pada tanggal 5 Juli 2011 (Lampiran 1). Jumlah dan Cara Pengambilan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah mahasiswi Alih Jenis Institut Pertanian Bogor. Teknik pemilihan dan pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling. Semua sampel, baik perlakuan maupun kontrol harus memenuhi persyaratan inklusi maupun eksklusi yang ditetapkan. Syarat inklusi yang harus dipenuhi oleh sampel adalah: 1. Memiliki rentang umur 16-29 tahun. 2. Belum pernah mendapatkan intervensi suplementasi serupa dalam waktu yang berdekatan, serta 3. Bersedia mengisi informed concent dan berpartisipasi dalam penelitian. 4. IMT tidak lebih dari 25 kg/m2. Syarat ekslusi yang harus dipenuhi oleh sampel adalah: 1. Hamil atau menyusui. 2. Merokok. 3. Menderita suatu penyakit yang mengharuskannya cek rutin, serta 4. Pindah atau berada di luar lokasi dalam jangka waktu lama, sehingga tidak dapat mengikuti perlakuan. Jumlah
sampel
ditetapkan
dengan
(Supranto 2000): (t-1) (r-1) ≥ 15
23
menggunakan
rumus
berikut
Keterangan: t = banyaknya kelompok r = jumlah replikasi per kelompok Berdasarkan rumus tersebut, dengan jumlah 4 kelompok (t=4), maka jumlah sampel minimal setiap kelompok (r) yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 6 orang. Dengan demikian jumlah sampel secara keseluruhan adalah 24 orang. Metode Intervensi Kelompok perlakuan dibagi menjadi 4, dengan masing-masing kelompok terdiri dari enam sampel. Kelompok perlakuan tersebut adalah : 1. Kelompok yang diberi vitamin C dosis 500 mg. 2. Kelompok yang diberi vitamin E dengan dosis 200IU (setara 133 mg). 3. Kelompok yang diberi multivitamin-mineral, yaitu vitamin C 500 mg, vitamin E 30 mg, Seng 15 mg, Tembaga 1,5 mg, serta 4. Kelompok kontrol (tidak mendapatkan suplemen). Dosis diberikan 8 kali dari AKG, untuk vitamin C kebutuhan wanita dewasa adalah 60 mg/orang/hari. Untuk perlakuan diberikan 8 kali AKG yaitu 500 mg. Sedangkan untuk vitamin E kebutuhan wanita dewasa adalah 15 mg/orang /hari, untuk perlakuan diberikan 8 kali AKG yaitu 200 IU, dikonversi dalam mg yaitu menjadi 133mg. Multivitamin-mineral yang digunakan adalah multivitamin dengan komposisi tiap kaplet yaitu vitamin B1 15 mg, vitamin B2 15 mg, vitamin B3 50 mg, vitamin B5 20 mg, vitamin B6 20 mg, vitamin B12 12 mcg, biotin 45 mcg, asam folat 400 mcg, vitamin C 500 mg, vitamin D 200 IU, vitamin E 30 mg, seng 15 mg, tembaga 1,5 mg dan calcium 100 mg. Tolerable Upper Intake Levels (ULs) atau angka tertinggi dari nilai zat gizi yang bila dikonsumsi tiap hati tidak membahayakan kesehatan untuk dewasa ≥ 19 tahun menurut food and nutrition Board-institute of Medicine (FNB-IOM) (2004) adalah 2000 mg/hari (WNPG 2004). Tolerable Upper Intake Levels (ULs) atau angka tertinggi dari nilai zat gizi yang bila dikonsumsi tiap hari tidak membahayakan kesehatan untuk dewasa ≥19 tahun menurut food and nutrition Board and Institute of medicine (IOM) (2000) adalah 1000 mg/hari, yang di dapatkan dari suplemen. Vitamin C, vitamin E dan multivitamin mineral diberikan secara oral.
Jenis dan Cara Pengambilan Data Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer yang terdiri dari data karakteristik, data konsumsi dan data kadar MDA plasma. a.
Data Identitas Data karekteristik keluarga sampel meliputi pendidikan dan pekerjaan.
Menurut Depkes 2008 klasifikasi tingkat pendidikan menjadi 6 golongan yaitu tidak pernah sekolah, tidak tamat SD, tamat SMP, tamat SMA dan tamat perguruan tinggi. Sedangkan pekerjaan diklasifikasikan menjadi swasta, PNS, wiraswasta, petani dan Ibu Rumah Tangga. Data karakteristik sampel meliputi nama, umur, departemen dan riwayat penyakit dilakukan dengan wawancara. Data berat badan, tinggi badan dilakukan dengan penimbangan dan pengukuran, lalu dihitung Indeks Massa Tubuh (IMT) didapatkan dari hasil perhitungan: IMT=
Berat badan (kg) [tinggi badan (cm)]2
b.
Data Konsumsi Data konsumsi didapatkan dari food record selama perlakuan (7 hari)
pada sampel dengan menggunakan form food record dengan mencatat jenis dan jumlah bahan makanan yang dikonsumsi setiap hari selama 24 jam, sedangkan untuk mengetahui data frekuensi konsumsi makanan sumber antioksidan selama 1 minggu terakhir sampel digunakan food frequency. Form food record dan food frequency dapat dilihat pada lampiran 4 dan lampiran 3. c.
Data Ketaatan Mengonsumsi Suplemen Sampel harus mengonsumsi suplemen selama satu minggu berturut-
turut. Ketaatan sampel dalam mengonsumsi suplemen diamati dengan mengisi form kepatuhan. d.
Data Kadar Malondialdehid (MDA) Plasma Data pengukuran radikal bebas didapatkan dengan menentukan kadar
lemak peroksida dengan menggunakan metode MDA (Malondialdehid), dilakukan sebelum dan setelah 7 hari intervensi dengan duplo.
Prinsip Penetapan MDA dengan metode uji asam tiobarbiturat (TBA) dapat diukur secara spektrofotometrik berdasarkan prinsip bahwa asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida
lipid
yang
kemudian
mengalami
dekomposisi
menjadi
malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam tiobarbituburat (thiobarbiriuric acid, TBA), akan membentuk senyawa berwarna merah muda yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid (Soewoto et al 2001). Bahan dan Alat Bahan yang dibutuhkan untuk analisis: Bahan analisis adalah Plasma yang diperoleh dari darah vena yang diambil dari vena mediana cubiti sebanyak 5 ml dan pemisahan dengan cara pemusingan menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Reagen yang digunakan adalah a. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 20 % ( 20 gram TCA dilarutkan dalam 100 ml Aquades bebas ion) b. Larutan asam tiobarbiturat (TBA) 0,67% (0,67 gram TBA dilarutkan dalam 100 ml Asam asetat) c. Larutan standar tetraetoksipropan d. Aquades bebas ion Alat yang digunakan dalam penelitian: Alat untuk pengambilan darah adalah a. Spuit b. Jarum suntik ukuran G23 c. Kapas d. Alkohol e. Tabung EDTA 5 ml Alat untuk analisis radikal bebas dengan analisis lemak peroksida (MDA) adalah a. Tabung reaksi ukuran 5 ml b. Labu ukur c. Gelas piala
d. Pipet mikro e. Sentrifuge f.
Vorteks
g. Penangas air h. Spektrofotometer Prosedur Pengambilan Darah Darah diambil dari vena cubiti dengan menggunakan spuit ukuran 5 ml dengan menggunakan jarum G 23. Darah dimasukkan ke dalam tabung EDTA agar darah tidak membeku dan ditempatkan dalam cool box sebelum disentrifuge. Darah disentrifugasi pada kecepatan
3000 rpm selama 15
menit. Cairan plasma darah yang telah terpisah dari bagian padat darah segera dipindahkan ke tabung fial kosong, untuk selanjutnya dianalisis MDA. Prosedur Analisis MDA Plasma Plasma diambil sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml TCA 20% dingin, kemudian divorteks dan disentifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatant diambil, dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain yang sudah berisi 2 ml TBA 0,67%, kemudian dimasukkan ke dalam penangas air dengan suhu 95-1000C selama 10 menit. Setelah itu tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan dalam bejana berisi air es. Hasil reaksi diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam kuvet dan dibaca serapannya pada pajang gelombang 532 nm (Marhaen 2004). Prosedur analisis kadar MDA plasma dapat dilihat pada Gambar 5, untuk alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.
Prosedur analisis MDA Plasma 1 ml plasma sampel
Tambahkan Larutan TCA 20%, dingin sebanyak 1 ml
Divorteks
Disentrifuge selama 10 menit (3000 rpm) Mengendap Ambil supernatan 1 ml
Tambahkan larutan TBA 0,67% sebanyak 2 ml
Divorteks
Masukkan ke penangas mendidih selama ± 15 menit
Dinginkan
Baca serapan pada panjang gelombang 532 nm
Gambar 5 Diagram alir analisis kadar MDA plasma
Merah muda
Alur Penelitian Populasi Mahasiswi alih jenis IPB yang masih aktif Kriteria eksklusi
Kriteria Inklusi
Contoh yang memenuhi kriteria Penetapan jumlah sampel berdasrakan rumus (t-1) (r-1) ≥ 15
Total sampel 24 orang
Kelompok Kontrol (6 orang) Tidak diberi intervensi suplemen antioksidan
Kelompok Intervensi Vitamin C (6 orang) Diberi Vit C dosis 500 mg
Kelompok Intervensi Vitamin E (6 orang) Diberi Vit E dosis 200 Iu atau setara 133 mg
Analisis MDA plasma sebelum intervensi
Intervensi selama 7 hari
Analisis MDA plasma setelah intervensi
Gambar 6 Diagram Alir Penelitian
Kelompok Intervensi Multivitaminmineral (6 orang) Diberi multivitaminmineral yg mgd : - vitamin C 500mg - vitamin E 35 mg, - Zn 15 mg dan - Cu 1,5 mg
Pengolahan Data Data-data yang dikumpulkan selama penelitian ini disajikan dalam bentuk tabel dan kemudian dianalisis secara deskriptif dan inferensial. Data yang dianalisis secara deskriptif meliputi data karakteristik sampel, data record kebiasaan makan, data food frequency dan Indeks Massa Tubuh (IMT). Konsumsi Data konsumsi pangan sumber antioksidan dikumpulkan dengan metode food frequency kemudian diolah untuk mendapatkan data frekuensi konsumsi pangan berapa kali per minggu. Data konsumsi pangan sehari sampel selama 7 hari didapatkan dengan metode food record. Data konsumsi pagan tersebut kemudian diolah dan dikonversi menggunakan nutri-survey menjadi data asupan energi dan zat gizi protein, vitamin A, vitamin C, vitamin E, kalsium, seng dan tembaga. Data asupan energi tersebut kemudian dibandingkan dengan AKG untuk mendapatkan nilai tingkat kecukupan energi dan zat gizi, dengan menggunakan rumus tingkat kecukupan zat gizi di bawah ini : TKG = (K/AKGi) x 100% Keterangan : TKG
: Tk. kecukupan zat gizi
K
: Konsumsi zat gizi
AKGi : Angka kecukupan zat gizi sampel yang dicari Menurut Supariasa 2002, Kategori tingkat kecukupan untuk Energi dan vitamin di bagi menjadi empat kategori yaitu defisit <70%; kurang 70-80%; sedang 80-99% dan baik ≥ 100%. Menurut Gibson (2005) tingkat kecukupan vitamin dan mineral dibagi menjadi dua kategori yaitu kurang ≤77% dan cukup >77%. Status Gizi Status gizi sampel dihitung dengan menghitung Indeks massa tubuh menggunakan indikator berat badan dan tinggi badan. Status gizi sampel dikategorikan menjadi 3 seperti terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Kategori indeks massa tubuh menurut Depkes (1999) Kategori Kekurangan BB Tingkat Berat Kekurangan BB Tingkat Ringan Normal Kelebihan BB Tingkat Ringan Kelebihan BB Tingkat Berat
Kurus Normal Gemuk
IMT < 17,0 kg/m2 17,0-18,5 kg/m2 >18,5-25,0 kg/m2 >25,0-27,0 kg/m2 >27,0 kg/m2
Sumber : Depkes (1994) dalam Supariasa et al (2002)
Penetapan MDA Data kadar MDA plasma sampel diukur sebelum dan setelah 7 hari intervensi, kemudian dihitung perubahan kadar MDA plasma yaitu selisih antara kadar MDA sebelum dan setelah 7 hari intervensi. Penetapan MDA dengan metode uji asam tiobarbiturat (TBA) diukur dengan spektrofotometer panjang gelombang 532 nm. Hasilnya dihitung dengan rumus Kadar MDA, membandingkan absorbansi dengan kurva standar memakai tetraetoksipropan, menggunakan persamaan Y = aX + b.
Keterangan
:
fp Faktor Pengenceran Penetapan Standar MDA Mengukur MDA sebagai produk peroksidasi lipid, dalam penelitian ini digunakan tetraetoksipropan (TEP) sebagai prekursor dari MDA, karena MDA merupakan senyawa yang tidak stabil. TEP dihidrolisis oleh air menjadi MDA dan alkohol. Prosedur Penetapan standar tersaji lengkap pada Lampiran 6. Pengenceran larutan tetraetoksipropan (TEP) adalah sebanyak 10000x, dengan konsentrasi 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, dan 0.5, yang direaksikan dengan TBA, diperoleh absorbansi secara berurutan 0, 0.198, 0.396, 0.573, 0.770 dan 0.953 nmol/mL (Lampiran 6). Persamaan kurva standar yang didapat yaitu Y=0.001x + 0.006 dengan R2=0,999, di mana y=absorbansi dan x=konsentrasi MDA (nmol/mL). Kurva standar dapat dilihat pada gambar 7.
A532
Kurva Standar TEP
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
200
400
600 nmol/ml
data asli
Linear (data asli)
Gambar 7 Kurva standar tetraetoksipropan (TEP) Analisis Data Data yang telah terkumpul diolah dan dianalisis secara deskriptif dan inferensial menggunakan Microsoft Excel 2007 dan program SPSS versi 16.0 for Windows. Untuk menganalisis perbedaan sebelum dan setelah intervensi pada setiap kelompok perlakuan dilakukan uji T. Sedangkan untuk melihat perbedaan perubahan kadar MDA plasma (antara setelah dan sebelum intervensi) antar kelompok perlakuan dilakukan uji beda ANOVA. Jika terdapat indikasi perbedaan yang signifikan, maka dilanjutkan dengan uji Beda Duncan dan Least Significant Different (LSD) untuk mengetahui kelompok mana yang sesungguhnya berbeda.
