Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
METODE MUDAH DAN EFEKTIF (METODE KIT) DETEKSI RESIDU HERBISIDA PARAQUAT (GRAMOXONE) DALAM AIR MINUM (An Easy and Effective Method (Kit Method) for Paraquat (Gramoxone) Herbicide Residue Detection in Drinking Water) YUNINGSIH Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114
ABSTRACT An easy and effective method have been improved for determination of paraquat herbicide residue in drinking water. Paraquat was reduced with glucose in an alkaline medium, and blue radical ion obtained was measured at 600 nm by using spectrofotometer. Validation of improved method was conducted by recovery, linearity, repeatability (precision) of 6 type concentration (5, 10, 20, 30, 40 and 50 ppm paraquat) and limit of detection (LOD). The result of recoveries after adding 0.5, 1,0 dan 2,0 µg paraquat standard solution (in duplo) in water sample were mean of recoveries are 106; 79 and 72% which its in range 70 – 110%. Linearity (correlation coefisient) r2: 0.9942 is nearly good result (0.999). All of validation result is in range of Validation Acceptance Criteria for Analysis Pesticide Residues, so this improved method is quite significant with LOD 0.25 0.015 µg/ml. Blue color intensity from 10 to 50 ppm paraquat standard solution can be applied as paraquat kit color chart (Kit Method) for praquat residue analysis in water sample without using spectrofotometer. Key Words: Paraquat Herbicidedetection, Water, Spectrofotometry, Kit Method ABSTRAK Telah dilakukan pengembangan metode analisis residu herbisida paraquat secara mudah dan efektif. Paraquat direduksi dengan glukosa dalam medium basa dan ion radikal warna biru diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Dilakukan uji validasi terhadap pengembangan metode: uji perolehan kembali dengan penambahan 0,50; 1,0 dan 2,0 µg larutan standar paraquat ke dalam sampel air (2 ulangan), linieritas, presisi dari 6 macam konsentrasi paraquat (5, 10, 20, 30, 40 dan 50) dan penetapan limit deteksi. Hasil uji validasi menunjukkan rata-rata uji perolehan kembali: 106, 79 dan 72% masuk dalam kisaran 70 – 110%. Linieritas dengan koefisien korelasi r2: 0,9942 mendekati nilai terbaik (0,999) dari 6 variasi konsentrasi (6 ulangan). Keseluruhan hasil uji validasi masuk dalam ketentuan kriteria uji validasi analisis residu pestisida yang diterima, maka pengembangan metode analisis residu herbisida paraquat dalam air cukup valid dengan limit deteksi: 0, 25 0,015 µg/ml. Hasil intensitas warna biru dari deret konsentrasi (10 sampai 50 ppm) paraquat cukup valid (telah divalidasi di atas) dan dapat dijadikan sebagai pembanding terhadap paraquat dalam sampel air (Metode Kit) atau tanpa menggunakan spektrofotometer. Kata Kunci: Deteksi Herbisida Paraquat, Air, Spektrofotometri, Metode Kit
PENDAHULUAN Herbisida paraquat atau dikenal dengan nama dagangnya Gramoxone, Paracol dan Herbatop merupakan herbisida yang paling toksik dibandingkan dengan herbisida lain (2,4 D, atrazine, glyphosate, dicamba, dsb.) (WIKIPEDIA, 2011) dan paling banyak
882
digunakan di dunia terutama di Asia Tenggara untuk pemusnah ilalang di perkebunan kelapa sawit (SARAGIH, 2005). Bentuk formulasinya berupa garam diklorida yang stabil dalam kondisi asam dan kondisis panas serta mudah larut dalam air sehingga memudahkan penyerapannya ke dalam daun yang seiring dengan tingginya kelembaban dan intensitas
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
cahaya. Kemudian penambahan non ionic adjuvant dalam formulasinya akan menjamin penyerapannya (membasahi) secara merata setelah penyemprotan (PARAQUAT INFORMATION CENTER, 2011). Paraquat direduksi oleh chloroplast dalam daun dan menjadi bentuk kation-kation radikal, kemudian terjadi oksidasi sendiri dari radikal bebas yang menghasilkan hydrogen peroxide dan beberapa radikal oksigen yang bersifat phytotoxic dan menyebabkan kerusakan chlorophyl dan lipid peroxidation (ASHTON dan CRAFTS, 1981). Sementara menurut CREMLYN (1978) bahwa bentuk hydrogen peroxide inilah yang bersifat penghancur jaringan tanaman. Di A.S. dan Mexico, herbisida paraquat dimanfaatkan untuk memusnahkan tanaman marijuana (GILBERT dan STEVEN, 2004). Metabolisme paraquat dalam tubuh manusia atau hewan sama seperti pada tanaman, yaitu terjadi pembentukan superoxide (peroxide) dan merusak jaringan, seperti jaringan organ paru-paru, otak, jantung, hati dan ginjal, kemudian kerusakan intensif pada organ paru-paru yang menyebabkan terjadinya kematian (sulit bernafas) (PARAQUAT DATA SHEET, 2011). Dilaporkan juga paraquat dapat menyebabkan Parkinsonism (SIMON dan TAYLOR, 1989; ANTARA NEWS, 2009; WIKIPEDIA, 2011). Salah satu contoh gejala keracunannya terjadi pada pekerja yang sehariharinya menyemprot pestisida di perkebunan kelapa sawit, yaitu terlihat mimisan, iritasi mata, infeksi kulit, iritasi kulit, kuku mudah copot dan luka daerah perut (POISONED and SILENCED, 2002). Kasus kerusakan kuku (perubahan warna dan bentuknya) atau pelepasan kuku yang terjadi pada 55 dari 296 pekerja penyemprot paraquat. Disamping itu efek toksik paraquat juga terlihat pada saluran reproduksi, misalnya fetal mortality pada tikus dan kenaikan persentase bentuk telur unggas yang tidak normal (EXTOXNET PIP, 2011). Dengan bahayanya efek toksik paraquat tersebut, maka di Indonesia telah ditetapkan peraturan pemerintah bahwa herbisida paraquat tidak boleh beredar bebas dan hanya orang-orang yang terlatih dan mendapatkan sertifikat yang diizinkan menggunakannya (DOWN TO EARTH, 2005). Sifatnya yang mudah larut dalam air berpotensi untuk menjadi kontaminan sumber
air sekitarnya. Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode analisisnya yang mudah dan efektif (tanpa menggunakan instrumen). Analisis residu paraquat yang sudah banyak dilakukan cukup sensitif tetapi biayanya cukup mahal (menggunakan instrumen), seperti alat liquid chromatography (WOROBEY, 1987), ionpair chromatography (KUO, 1987), ELISA (NIEWOLA et al., 1985), flow injection analysis (JAIN et al., 1993) dan spectrophotometry (SHIVHARE dan GUPTA, 1991). MATERI DAN METODE Terhadap bahan pemeriksaan yang berupa sampel air dilakukan analisis terhadap residu herbisida paraquat dengan metode residu paraquat dan hasil pengembangan metode dibuat menjadi metode kit. Tahapan analisis residu paraquat dalam air sebagai berikut: Pengembangan metode Metode analisis residu herbisida paraquat dalam air menurut KESARI et al. (1997), yaitu 20 ml sampel air diekstraksi cara penambahan 0,2 ml EDTA 5% dan pengocokan selama 5 menit (alat vortex). Kemudian hasil ekstraksi disentrifus dan filtratnya sebanyak 10 ml dimurnikan melalui kolom silika dan dielusi dengan 10 ml NH4Cl jenuh. Sebanyak 2 ml dari hasil eluat ditambahkan 2 ml glukosa 0,5%, 2 ml NaOH 2 M dan 4 ml H2O kemudian dihomogenkan. Setelah homogen dipanaskan pada water bath (70 – 100°C) selama 2 menit dan diukur absobansinya pada panjang gelombang 600 nm dan dilakukan pengukuran larutan standar paraquat sebagai pembanding validasi metode: 1. Uji linearitas: absorbansi diukur dari 6 variasi konsentrasi larutan standar paraquat mulai 5, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm setelah penambahan glukosa, NaOH dan pemanasan (seperti metode di atas) 2. Uji perolehan kembali: penambahan larutan standar paraquat 0,5; 1,0 dan 2,0 µg, ke dalam sampel air dan lakukan pemeriksaan residu paraquat sesuai dengan metode tersebut di atas dan dilakukan 2 ulangan
883
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
3. Penetapan limit deteksi: pengukuran absorbansi dari konsentrasi yang masih terdeteksi sebanyak 5 ulangan. Pembuatan kit Dibuat deret warna yang berdasarkan intensitas warna dari hasil pengamatan variasi konsentrasi paraquat (konsentrasi pada penetapan linieritas). Masing-masing konsentrasi paraquat (10 sampai 50 ppm) mempunyai intensitas warna biru spesifik. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengembangan metode Paraquat direduksi dengan glukosa dalam medium alkalin dan terbentuk ion radikal warna biru dan tingkat intensitasnya sebagai penunjuk tingkat konsentrasi paraquat yang berdasarkan hasil pengukuran absorbansinya dengan alat spektrofotometer (panjang gelombang 600 nm). Validasi metode Dalam evaluasi pengembangan metode diperlukan uji validasi, yaitu: Uji linearitas, diketahuinya kestabilan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi (korelasi) larutan standar. Telah dicoba pengukuran absorbansi dari 6 variasi konsentrasi larutan standar paraquat dari mulai 5, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm (6 ulangan). Hasil perhitungan nilai koefisien korelasi (r2) adalah: 0,9942 (lihat Tabel 1) mendekati nilai terbaik (r2: 0,999) yang menunjukkan adanya
hubungan yang linier antara konsentrasi standar paraquat dengan nilai absorbansinya, maka kondisi (kualitas) larutan standar paraquat cukup baik. Tabel 1. Hasil korelasi antara absorbansi dengan 6 variasi konsentrasi paraquat Konsentrasi paraquat (ppm)
Rata-rata absorbansi dan simpangannya (x SD)
0
0
5
0,048 0,001
10
0,093 0, 005
20
0,183 0,002
30
0,187 0,015
40
0,273 0,018
50
0,487 0,014
r2: 0,9942
Uji perolehan kembali: dengan diketahuinya nilai perolehan kembali dari hasil analisis setelah penambahan variasi konsentrasi larutan standar, maka dapat diketahui sejauhmana ketepatan metode. Setelah penambahan 0,5; 1,0 dan 2,0 µg larutan standar paraquat (masing-masing 2 ulangan) menunjukkan rata-rata hasil uji perolehan kembali: 106, 79 dan 72% (Tabel 2) yang masuk kisaran kriteria metode residu pestisida yang diterima (70 – 110%) (SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA, 2006). Limit deteksi (LD): untuk memperoleh ketepatan nilai konsentrasi standar paraquat yang masih dapat terdeteksi telah dilakukan 5 kali pengukuran konsentrasi paraquat yang terkecil yaitu 0,25 ppm (0,25 µg/ml).
Tabel 2. Hasil uji perolehan kembali setelah penambahan larutan standar paraquat Penambahan standar paraquat (µg)
Rata-rata hasil uji perolehan kembali x SD (µg)
Hasil uji perolehan kembali (%)
2
0,5
0,53 0,09
106
2
1,0
0,79 0,03
79
2
2,0
1,44 0,02
72
Blanko (1)
-
-
-
Ulangan (n)
884
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
Sementara rumus limit deteksi: LD 3SD, yaitu 0,25 0,015 µg/ml (lihat Tabel 3). Tabel 3. Limit deteksi larutan standar paraquat (5× pengukuran ulang dari konsentrasi terkecil) Rata-rata absorbansi dari 0,25 ppm (5 ulangan) 3 SD (µg/ml) LD (µg/ml)
yang mudah dan efektif (metode Kit) dan dapat dipergunakan di lapangan untuk mencegah secara dini akan terjadinya keracunan paraquat pada ternak. PARAQUAT KIT
x SD= 0,001 0,0002 3 × (0,0002 / 0, 001 × 0,25 µg/ml) = 0,015 0,25 0,015 10
Pembuatan kit Berdasarkan pengamatan intensitas warna biru dari deret konsentrasi pada uji linearitas menunjukkan intensitas warna biru yang stabil dan sesuai dengan hasil absorbansi dari masing-masing konsentrasinya (5, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm paraquat) dengan standar deviasinya yang cukup kecil (lihat Tabel 1). Maka dapat diambil kesimpulan bahwa deret warna biru tersebut dapat dijadikan sebagai pembanding konsentrasi paraquat dalam sampel (metode Kit). Cara pemakaian metode Kit, yaitu dengan cara melakukan preparasi ekstrak sampel yang sesuai dengan metode yang telah dikembangkan di atas (tanpa pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer). Hasil ekstrak akan diperoleh warna biru apabila positif paraquat dan tingkat intensitas warnanya dibandingkan dengan deret warna biru yang telah diketahui konsentrasi paraquat (kit). Di sini deret warna dibuat mulai konsentrasi 10 sampai 50 ppm paraquat, karena intensitas warna biru pada konsentrasi 5 ppm hampir sama dengan 10 ppm paraquat (Gambar 1). Menurut HAYES (1982), bahwa formulasi paraquat untuk pertanian biasanya bervariasi konsentrasi bahan aktifnya mulai 5 sampai 20% (20.000 – 50.000 mg/kg), sementara keracunan akut pada mamalia jauh lebih rendah (LD50: 50 – 150 mg/kg). Disamping itu sifat paraquat yang mudah larut dalam air sehingga dengan mudah tercampur dengan aliran air hujan sehingga paraquat menjadi dominan sebagai kontaminan sumber air minum sekitarnya. Oleh karena itu, perlu monitoring residu paraquat dalam air minum
20
30
40
50
ppm
Gambar 1. Kit Paraquat
KESIMPULAN Berdasarkan hasil evaluasi dari keseluruhan uji validasi metode menunjukkan rata-rata nilainya masuk dalam kisaran kriteria metode residu pestisida yang diterima maka dapat diambil kesimpulan bahwa pengembangan metode analisis residu herbisida paraquat dalam air cukup baik (valid) dengan limit deteksinya 0,25 0,015 µg/ml. Keberadaan intensitas warna dari deret variasi konsentrasi paraquat (10 – 50 ppm) cukup valid dan dapat dijadikan sebagai pembanding terhadap residu paraquat dalam sampel (metode Kit). DAFTAR PUSTAKA ANTARA NEWS. 2009. Penggunaan Pestisida Dapat Picu Parkinson. http://www.antaranews.com/ berita/1253022138/penggunaan-pestisidadapat. (22/3/2011). ASHTON, F.M. and A.S. CRAFTS. 1981. Mode of Action of Herbicides, 2nd ed. JohnWiley & Sons, Inc. New York. pp. 166 – 175. CREMLYN, R. 1978. Pesticides. Preparation and Mode of Action. JohnWiley & Sons, Inc. New York. pp. 159 – 162. EXTOXNET PIP. 2011. Paraquat. http://extoxnet.orst. edu/pips/paraquat.htm (24/1/2011). GILBERT dan A. STEVEN. 2004. A small Dose of Toxicology: the Health Effects of Common Chemicals. CRC Press. p. 78. HAYES, W.J. 1982. Herbicides. In Pesticides Studied in Man. Williams and Wilkins. Baltimore. pp. 543 – 562.
885
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
JAIN, A., K.K. VERMA and A. TOWNSHEND. 1993. Determination of paraquat by flow injection spectriphotometry. Anal. Chem. Acta. 284: 275 – 279.
SARAGIH, B. 2005. Penggunaan pestisida di perkebunan kelapa sawit. Down to Earth. No. 66. Agustus 2005. http://dte.gn.apc.org/66ipes .htm (23/03/2011).
KESARI, R., M. RAI and V.K. GUPTA. 1997. Spectrophotometric method for determination of paraquat in food and biological samples. J. AOAC Int. 80(2): 388 – 391.
SHIVHARE, P. and V.K. GUPTA. 1991. Spectrophotometric method for determination of paraquat in water, grain and plant material. Analyst 116: 391 – 393.
KUO, T.L. 1987. Determination of paraquat in tissue using ion pair chromatography in conjunction with spectrophotometry. Forensic Sci. Int. 33: 177 – 185.
SIMON, V.A. and A. TAYLOR. 1989. High sensitivity HPLC analysis of diquat and paraquat with confirmation. J. Chromatogr. 479: 153 – 158.
NIEWOLA, Z., C. HAYWARD, B.A. SYMINGTON and R.T. ROSAN. 1985. Quantitative estimation of paraquat by an Enzyme Linked Immunosorbent Assay using Monoclonal Antibody. Clin. Chim. Acta. 148: 149 – 156. PARAQUAT DATA SHEET. 2011. Paraquat. http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/i ntro/assignments/grm.htm (28/3/2011). PARAQUAT INFORMATION CENTER. 2011. The Science of paraquat. http://paraquat.com/ english/knowledge-bank/chemistry-andbiochemi. (30/3/2011). POISONED and SILENCED. 2002. The Study of Pesticides Poisoning in the Plantations. Pesticide Monitor 2(3), 6, July 2002. ISSN: 1394 – 7400.
886
SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA. 2006. Method Validation. http://www.aoac.org/diet suppl/dietarysupplement-web-site/slv-criteria-pdf. WIKIPEDIA. 2011. Paraquat. http://en.wikipedia.org/ wiki/Paraquat (22/03/2011). WOROBEY, B.L. 1987. Determination of diquat and paraquat in drinking water by Liquid Solid Extraction and High Performance Liquid Chromatography with ultra violet detection. Pestic. Sci. 18: 245 – 257.
