METABOLICKÁ STUDIE GENERICKÉHO LÉČIVA SIBUTRAMINU

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

METABOLICKÁ STUDIE GENERICKÉHO LÉČIVA SIBUTRAMINU

Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Doc. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D.

Hradec Králové 2006

Helena Reissová

Děkuji Doc. Ing. Vladimíru Wsólovi, Ph.D., a Ing. Marku Linkovi za cenné rady, ochotu a všestrannou pomoc při zpracování diplomové práce.

2

Obsah Obsah

3

1

Úvod

5

2

Teoretická část

6

2.1

Biotransformace xenobiotik

6

2.2

1. fáze metabolismu xenobiotik

6

2.2.1

Oxidace zahrnující cytochrom P-450

7

2.2.2

Flavinové monooxygenasy

8

2.2.3

Oxidace nekatalyzované cytochromem P450

8

2.2.4

Redukční enzymy

9

2.2.5

Hydrolytické enzymy

10

2.2.6

Hydratace

11

2.2.7

Ostatní reakce 1. fáze

11

2. fáze metabolismu xenobiotik

11

2.3

3

2.3.1

Glukuronidace

11

2.3.2

Sulfatace

12

2.3.3

Methylace

12

2.3.4

Acetylace

12

2.3.5

Konjugace s glutathionem

13

2.3.6

Konjugace s aminokyselinami

13

2.4

Stereochemické aspekty biotransformace xenobiotik

14

2.5

Kinetika enzymových reakcí

15

2.6

Metody studia metabolismu xenobiotik

17

2.7

Sibutramin

17

2.7.1

Zařazení

17

2.7.2

Mechanismus účinku

19

2.7.3

Farmakokinetika

19

2.7.4

Metabolismus

20

2.7.5

Lékové interakce

24

2.7.6

Vedlejší účinky

24

Cíl práce

25

3

4

Experimentální část Materiál a pomůcky

26

4.1.1

Chemikálie

26

4.1.2

Pomůcky a přístroje

26

4.1.3

Biologický materiál

27

4.1

Metodika práce

4.2

27

4.2.1

Optimalizace podmínek extrakce

27

4.2.2

Provedení inkubace

28

4.2.3

Kalibrační přímka

29

4.2.4

Extrakce a rozpouštění odparků

29

4.2.5

HPLC analýza

29

4.2.5.1

Achirální separace

29

4.2.5.2

Chirální separace

30

4.2.6 5

26

Vyhodnocení naměřených dat

30

Výsledky

31

5.1

Optimalizace podmínek extrakce

31

5.2

Stanovení rozsahu koncentrací pro měření enzymové kinetiky

32

5.3

Kalibrační přímka

32

5.4

Metabolismus po podání rac-, R-, S-sib

34

5.4.1

Inkubace rac-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně

34

5.4.2

Inkubace R-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně

35

5.4.3

Inkubace S-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně

36

5.5

Vyhodnocení kinetických dat

37

5.5.1

Tvorba rac-M1 při podání rac-sib

37

5.5.2

Tvorba R- a S- enantiomeru M1 při podání rac-sib

39

5.5.3

Tvorba R-M1 při podání R-sib

40

5.5.4

Tvorba S-M1 při podání S-sib

41

6

Diskuze

43

7

Závěr

48

Seznam použitých zkratek

49

Literatura

51

4

1 Úvod Již od počátku lidské existence se člověk snažil léčit nemoci. Postupem času zjistil, že některé rostliny z jeho okolí pomáhají při různých zdravotních potížích. Naučil se izolovat účinné látky z přírodních zdrojů, později identifikoval jejich strukturu. Dnes je možné získat většinu těchto látek chemickou syntézou. Zájem dnešních vědců se posouvá na osud těchto látek v živém organismu. Jak tyto látky působí a jaký je mechanismus jejich účinku, ale také jak působí živý organismus na podanou látku čili jakým změnám látka v těle podléhá. Odpovědi na tyto otázky hledá xenobiochemie. Xenobiochemie se zabývá biotransformacemi cizorodých látek a metabolickými a fyziologickými souvislostmi. Je to multidisciplinární obor s úzkým vztahem k biochemii, farmakologii, toxikologii a mikrobiologii (xenos = cizí, bios = život). Tato diplomová práce se zabývá studiem metabolismu sibutraminu, léčiva používaného k léčbě obezity. Sibutramin se v lidském těle metabolizuje na desmethylsibutramin, didesmethylsibutramin a jeho hydroxyderiváty. Desmethylsibutramin stejně jako výchozí látka obsahuje centrum chirality. Předmětem studie bylo sledování způsobu vzniku enantiomerů tohoto metabolitu z rac-sibutraminu, ale i z čistých enantiomerů, tedy R-(+)-sibutraminu a S-(-)-sibutraminu a posouzení zda je biotransformační přeměna těchto látek stereoselektivní.

5

2 Teoretická část 2.1

Biotransformace xenobiotik Biotransformace xenobiotik je hlavní mechanismus pro udržení homeostázy

během expozice organismu cizí látkou např. léčivem. Obvykle je biotransformace xenobiotik zprostředkována omezeným množstvím enzymů se širokou substrátovou specifitou. Syntéza některých z těchto enzymů je indukována xenobiotikem, ale ve většině případů jsou enzymy tvořeny nezávisle na přítomnosti substrátu. Specifita enzymů biotransformujících xenobiotika je široká, proto metabolizují i velké množství různých endogenních látek, např. ethanol, aceton, steroidní hormony, vitamin A a D, bilirubin, žlučové kyseliny a eikosanoidy. Reakce katalyzované enzymy biotransformující xenobiotika jsou zpravidla rozděleny do dvou skupin: do první a do druhé fáze (Parkinson 2001). Hydrolytické, redukční a oxidační enzymy řadíme do 1. fáze, kdy vzniká polárnější produkt zavedením nebo odkrytím substituentů, které jsou schopny reagovat s konjugačními enzymy účastnící se 2. fáze metabolismu. Vzniklý konjugát je zpravidla velmi polární, není schopen se resorbovat a proto je vyloučen z organismu. Ne každé xenobiotikum musí procházet 1. i 2. fází. Některá mají ve své molekule skupiny schopné přímé konjugace, nebo jsou produkty 1. fáze natolik polární, že mohou být vylučovány bez konjugace. V poslední době se nověji označuje transport substrátu a produktu přes cytoplasmatickou membránu pomocí přenašečů (transportérů) jako 0. a 3. fáze metabolismu.

2.2

1. fáze metabolismu xenobiotik 1. fáze metabolismu zahrnuje oxidační, redukční, hydrolytické a hydratační

reakce, ale také některé další různorodé reakce. Úkolem těchto reakcí je vznik polárnějšího produktu zavedením nebo odkrytím substituentů, které jsou schopny reagovat s konjugačními enzymy, které tvoří druhou fázi metabolismu. Produkty první fáze přeměny mohou být vylučovány přímo, jsou-li dostatečně polární.

6

2.2.1 Oxidace zahrnující cytochrom P-450 Cytochrom P-450 byl poprvé popsán Klingenbergem v roce 1948. Je to hemoprotein typu b, který je pevně vázán na membrány endoplasmatického retikula živočišných buněk, u bakterií se vyskytuje v rozpustné formě v cytosolu. P v jeho názvu znamená pigment a 450 je označení spektrálního maxima, které vykazuje cytochrom po redukci a vazbě s CO. Tato vlastnost byla využita pro stanovení jeho obsahu diferenční spektrofotometrií. V roce 1968 bylo zjištěno, že pro enzymovou aktivitu je nutný nejen cytochrom P-450, ale i další enzym NADPH-cytochrom P-450 reduktasa a fosfolipidová

frakce

membrán,

zvláště

fosfatidylcholin.

Tyto

součásti

tvoří

mikrosomální cytochromový monooxygenasový systém. Zatímco první dvě mají enzymovou aktivitu, fosfatidylcholin slouží k udržení jejich nativní konformace a usnadňuje jejich vzájemné interakce. Centrálním enzymem monooxygenace je cytochrom P-450, který obsahuje jako prostetickou skupinu Fe-protoporfyrin IX. Pátým ligandem Fe je síra cysteinu a šesté místo je určeno k navázání kyslíku. Substrát (RH) se váže na cytochrom (Fe3+) a vzniká komplex (RH)Fe3+. Dochází k jednoelektronové redukci železa za vzniku (RH)Fe2+, naváže se kyslík a vzniká ternární komplex (RH)Fe2+(O2) ↔ (RH)Fe3+(O2-), který je redukován dalším elektronem. Elektrony dodává NADPH. Následuje heterolytické rozštěpení vazby O-O za vzniku molekuly vody. Poté dojde k odštěpení produktu, hydroxylovaného substrátu, a k regeneraci cytochromu. Povaha reaktivního oxidantu není prozatím vyjasněna. Zdrojem kyslíku v monooxygenasové reakci mohou být i peroxidy, zvláště organické hydroperoxidy, pak je reakční mechanismus odlišný. V DNA živočišných buněk je řada genů, které kódují mnoho cytochromů P-450, které se od sebe liší v primární struktuře, některými fyzikálně chemickými vlastnostmi a substrátovou specifitou (Kvasničková 1995). U

člověka

bylo

do

nedávné

minulosti

izolováno,

identifikováno

a

charakterizováno přes 50 isoenzymů cytochromu P-450 (Gibson a Skett 2001). Všechny doposud popsané cytochromy P-450 tvoří nadrodinu enzymů, která zahrnuje několik rodin P-450, které se ještě dělí na podrodiny. O zařazení jednotlivých P-450 rozhoduje jejich sekvenční podobnost. Rodiny obsahují enzymy s větší než 39% sekvenční podobnosti, v podrodinách jsou formy enzymů, jejichž sekvenční podobnost je větší než 59% (Kvasničková 1995).

7

Mezi reakce katalyzované cytochromem P-450 patří: aromatická a alifatická hydroxylace, epoxidace, N-, S-, O-dealkylace, oxidativní deaminace, N-, S-oxidace, oxidace fosfothionátů, dehalogenace a oxidace alkoholu (Gibson a Skett 2001).

2.2.2 Flavinové monooxygenasy Flavinové monooxygenasy (FMO) jsou polymerní proteiny s molekulovou hmotností asi 65 000 Daltonů. Jejich koenzymem je flavinadenindinukleotid (FAD). Obsahují jeden mol FAD na mol monomeru proteinu. Enzym byl nalezen v mnoha tkáních s největší expresí v mikrosomální frakci jater. FMO využívají jako zdroj redukčních ekvivalentů NADH i NADPH, preferovaným kofaktorem je ale NADPH, neboť má přibližně desetkrát nižší Km než NADH. FMO

katalyzují

oxidaci

mnoha

nukleofilních

organických

sloučenin

obsahujících dusík nebo síru (Gibson a Skett 2001). Mechanismus účinku je následující: FAD je redukován pomocí NADPH na FADH, ten reaguje s kyslíkem a vzniká nejdůležitější meziprodukt 4a-hydroperoxid flavinu, který reaguje se substrátem (S) za vzniku oxygenovaného produktu S-OH. 4ahydroperoxid se mění na 4a-hydroxid flavinu, který se dále regeneruje na FAD (Kvasničková 1995). Stejně jako cytochrom P-450 jsou FMO multigenová rodina kódující různé enzymy. Klasifikované jsou do pěti rodin FMO 1-5 lišících se substrátovou specifitou. V lidské jaterní tkáni je exprimována převážně forma FMO 3, ale u většiny jiných druhů dominuje forma FMO 1 (v lidské jaterní tkáni exprimována jen minimálně) (Gibson a Skett 2001).

2.2.3 Oxidace nekatalyzované cytochromem P450 Xenobiotika jsou v organismu přeměňována i dalšími oxidačními enzymy, které jsou většinou rozpustné v cytosolu, ale byly nalezeny i v mitochondriích a mikrosomech. Katalyzují oxidace primárních a sekundárních alifatických alkoholů, cyklických alkoholů, oxidace aldehydů, poloacetalů, anorganického sulfidu, oxidace (aromatisace) alicyklického jádra. Substráty, které se často dostávají do kontaktu s lidským organismem jsou alkoholy. V organismu jsou metabolizovány oxidací na aldehyd a následně na odpovídající karboxylovou kyselinu nebo přímo vstupují do konjugačních reakcí

8

s kyselinou glukuronovou. Oxidaci alkoholů katalyzují enzymy alkoholdehydrogenasy, jejichž koenzymem je NADH. U člověka je tento enzym lokalizován v játrech, ledvinách, střevě a plicích, ale aktivita je největší v jaterní tkáni. Aldehydy alifatické,

aromatické

a aldehydické skupiny navázané na

heterocyklických jádrech se oxidují na odpovídající kyseliny aldehyddehydrogenasami, které mají nikotinaminové nebo flavinové koenzymy. Oxidace probíhá většinou přes meziprodukt, kterým je thiopoloacetal. Oxidační deaminace aminů na aldehydy katalyzuje monoaminooxidasa. Xantinoxidasa a aldehydoxidasa se účastní oxidační reakce tak, že inkorporují do substrátu atom kyslíku z molekuly vody. Substráty těchto enzymů jsou některé pyridiny, pyrimidiny, puriny, xantiny, theofylin, theobromin, kofein, pteridiny aj. Před toxicitou kyslíku chrání organismus superoxiddismutasa, přeměňující superoxidový radikál na peroxid vodíku, jenž je následně eliminován katalasami a peroxidasami. Na deaktivaci hydroperoxidů se podílí glutathionperoxidása, obsažená především v erytrotrocytech (Kvasničková 1995).

2.2.4 Redukční enzymy Redukční přeměny xenobiotik zahrnují redukce karbonylových skupin, dvojných vazeb, N-oxidů, sulfoxidů, disulfidů, redukce aromatických nitro- a azo-sloučenin, redukční dehalogenaci, redukce hydroxamových kyselin. Redukční enzymy jsou obsaženy v membránách endoplasmatického retikula buňky, v cytosolu a ve značné míře v bakteriích střevní flory. Jako koenzym vyžadují NADPH či NADH. Některé redukční reakce jsou v anaerobním prostředí katalyzovány cytochromem P-450. Reduktasy často katalyzují přeměnu produktů, které vznikly jinými enzymy 1. fáze metabolismu (Kvasničková 1995). Významnou skupinou redukčních enzymů jsou reduktasy karbonylové skupiny. Tvoří tři velké nadrodiny enzymů čítající několik tisíce enzymů: aldo-ketoreduktasy (AKR),

dehydrogenasy-reduktasy

se

středně

dlouhým

řetězcem

(MDR)

a

dehydrogenasy-reduktasy s krátkým řetězcem (SDR). AKR jsou monomerní i multimerní bílkoviny vyskytující se v těle savců, obojživelníků, rostlin i bakterií. Tyto enzymy mají širokou substrátovou specifitu, metabolizují alifatické i aromatické aldehydy, monosacharidy, steroidy, prostaglandiny, 9

polycyklické aromatické uhlovodíky a isoflavonoidy. Enzymy jsou zařazeny do 14 rodin (AKR1 – AKR14). Rodina AKR1 zahrnuje aldosoreduktasy, aldehydreduktasy, hydroxysteroiddehydrogenasy a steroid5-beta-reduktasy. Mezi další významné lidské AKR lze zařadit reduktasy z rodiny AKR6 a aflatoxinaldehydreduktasy z rodiny AKR7 (Jez se sp. 1997, Hyndman se sp. 2003). MDR tvoří širokou enzymovou nadrodinu čítající až tisíc zástupců. Enzymy této skupiny vykazují velmi rozdílnou enzymovou aktivitu. Účastní oxidace alkoholů, detoxikace aldehydů, alkoholů a metabolismu žlučových kyselin, což je charakteristické pro rodinu alkoholdehydrogenasy. Polyoldehydrogenasová aktivita byla objevena u enzymu sorbitoldehydrogenasy, který patří do rodiny polyoldehydrogenasy. Substráty této rodiny enzymů jsou v přírodě široce rozšířené, jsou to deriváty glukosy, fruktosy a další. Dalšími rodinami MDR jsou rodina cinnamylalkoholdehydrogenasy, chinonoxidoreduktasy, mitochondriálních proteinů dýchacího řetězce, leukotrienu B4 dehydrogenas, acyl-CoA reduktas a další. Všechny enzymy této i předchozí skupiny využívají NADH nebo NADPH jako kofaktor, U některých byl nalezen v aktivním místě zinkový ion s katalytickou funkcí (Nordling se sp. 2002). SDR je také velmi rozsáhlou skupinou enzymů, do které je řazeno kolem 3000 enzymů. Substráty těchto enzymů jsou alkoholy, cukry, steroidy, aromatické sloučeniny a další. V metabolických drahách redukce karbonylové skupiny byly nalezeny např. karbonylreduktasa, PG 9-ketoreduktasa, L-Xylulosareduktasa a mnoho dalších. Tyto enzymy katalyzují metabolickou přeměnu aromatických aldehydů, aromatických ketonů a dikarbonylových sloučenin s aromatickým kruhem (Kallberg se sp. 2002, Matsunaga se sp. 2006).

2.2.5 Hydrolytické enzymy Velkou skupinou substrátů, které podléhají hydrolýze, jsou estery, amidy, hydrazidy a karbamáty. Hydrolýza esterů může probíhat v plazmě (nespecifickými acetylcholinesterasami, pseudocholinesterasami a ostatními esterasami) nebo v játrech (specifickými esterasami pro jednotlivé skupiny sloučenin). Hydrolýza amidů probíhá rovněž v plazmě nespecifickými esterasami (pomaleji než hydrolýza esterů), ale více bývají amidy hydrolyzovány jaterními amidasami (Gibson a Skett 2001).

10

2.2.6 Hydratace Hydratace může být považována za zvláštní formu hydrolýzy, kdy je molekula vody připojena k molekule substrátu bez jejího rozštěpení. Epoxidy podléhají hydrataci epoxidickou hydrolasou (Gibson a Skett 2001).

2.2.7 Ostatní reakce 1. fáze Mnoho ostatních reakcí které nemohou být zařazeny do již zmíněných skupin, hrají

roli

v metabolismu

určitých

látek.

Katalyzují

transamidaci,

isomeraci,

dethioacetylaci, N-karboxylaci, dekarboxylaci aj. (Gibson a Skett 2001).

2.3

2. fáze metabolismu xenobiotik Druhá fáze biotransformace xenobiotik zahrnuje syntetické reakce. Metabolity

vzniklé v první fázi konjugují s endogenními činidly, které jsou produkty metabolismu buňky. Energie potřebná pro průběh konjugačních reakcí je dodávána dvěma způsoby. Buď je aktivováno činidlo nebo substrát. Výsledný konjugát je zpravidla v pH prostředí ionizován, není resorbován a je vylučován. Některá xenobiotika jsou schopná konjugace přímo. Substrátem pro konjugační reakce je rovněž řada eobiotik (Kvasničková 1995). Konjugační enzymy katalyzují glukuronidaci, sulfataci, acetylaci, methylaci a konjugaci s glutathionem či aminokyselinami.

2.3.1 Glukuronidace Tvorba glukuronidů je nejčastější konjugační reakce, pravděpodobně kvůli relativní dostupnosti kofaktoru, kterým je UDP–glukuronová kyselina. Je součástí intermediárního metabolismu, nachází se ve všech tkáních (Gibson a Skett 2001). Glukuronidaci podléhají xeno- i eobiotika. Enzymem glukuronidace je UDPglukuronosyltransferasa (UGT), která byla detekována u savců, ptáků i plazů. Největší aktivitu má v játrech, dále v ledvinách, gastrointestinálním traktu a kůži. Více než 90 % celkové aktivity UDP-glukuronosyltransferasy je lokalizováno na membránách hladkého a drsného endoplasmatického retikula (Kvasničková 1995). UGT katalyzuje přenos UDP-glukuronové kyseliny na vhodný nukleofilní substrát. Podle typu substrátu se rozlišují O-, N-, S- a C-glukuronidy. Při reakci dochází k inverzi na anomerním

11

uhlíku cukerného zbytku (C1 atom UDP-glukuronové kyseliny je v α-konfiguraci, zatímco u vzniklého konjugátu v β-konfiguraci). Vzniklý konjugát, glukuronid, je exkretován do moči nebo stolice. Způsob exkrece je závislý na molekulové hmotnosti vzniklého konjugátu: konjugáty s molekulovou hmotností vyšší než asi 400 Daltonů jsou exkretovány převážně do žluči, konjugáty s nižší hmotností převážně do moči. Ve střevě se nachází enzym β-glukuronidasa (především střevní mikrobiota) katalyzující hydrolýzu glukuronidů. Volný substrát se může ve střevě vstřebat, po transportu do jater je znovu konjugován a vyloučen. Tento cyklus se nazývá enterohepatální cirkulace. UGT není jediný enzym, ale řada isoforem zařazených do rodin a podrodin (u lidí rodiny UGT1 a 2). Jednotlivé isoformy se liší specifitou k substrátu a lokalizací (Gibson a Skett 2001).

2.3.2 Sulfatace Sulfátovou konjugací jsou metabolizovány alkoholy, fenoly, hydroxylaminy, alicyklické steroidy, arylaminy. Konjugačním činidlem je 3´-fosfoadenosin-5´fosfosulfát (PAPS), který vzniká reakcí mezi ATP a anorganickým sulfátem pomocí příslušné kinasy. Enzymem pro sulfátové konjugace jsou sulfotransferasy (SULT) (Kvasničková 1995). SULT se nachází v rozpustné formě v mnoha tkáních: játrech, ledvinách, střevě nebo trombocytech. Vzniklý konjugát, organický sulfát, je silně polární a snadno se vylučuje močí (Gibson a Skett 2001).

2.3.3 Methylace Enzymy katalyzují tyto konjugace jsou N-, O- a S-methyltransferasy, jejichž koenzymem je S-adenosylmethionin. N- a O-methylace je významná při metabolismu endogenních biogenních aminů (dopaminu, histaminu, adrenalinu, noradrenalinu), které se tak inaktivují. Bylo zjištěno, že některé methylované konjugáty mají malou rozpustnost a tím mohou nežádoucím způsobem zasahovat do metabolismu buňky (Kvasničková 1995).

2.3.4 Acetylace Acetylace hydroxyskupin a sulfhydrylových skupin probíhá u eobiotik (např. acetylace cholinu na acetylcholin, koenzymu A na acetyl-CoA). Xenobiotickými substráty jsou převážně aminy: arylaminy, alifatické aminy, hydraziny, sulfonamidy a

12

substráty, jejichž

metabolismem vzniká v molekule aminoskupina. Enzymem

katalyzující acetylace je acetyltransferasa a konjugačním činidlem je acetylkoenzym A. Acetyltransferasa je enzymem se širokou substrátovou specifitou a značnou rozdílností v enzymové aktivitě u různých druhů. Reakce probíhá ve dvou etapách. První zahrnuje přenos acetylu z acetylCoA na enzym, který je tak acetylován, druhým krokem je acetylace substrátu a regenerace enzymu (Kvasničková 1995). Acetylace probíhá zejména v Kupferových buňkách jater, retikuloendotelových buňkách sleziny, plic a tenkého střeva (Gibson a Skett 2001).

2.3.5 Konjugace s glutathionem Konjugaci s glutathionem (γ-glutamylcysteinylglycinem) katalyzují enzymy glutathion-S-transferasy, lokalizované v cytosolu jater, ledvin, střeva a jiných tkání. Substrátem pro tuto reakci jsou sloučeniny se silně elektrofilní skupinou: epoxidy, haloalkany, nitroalkany, alkeny, aromatické halo- a nitrosloučeniny. Konjugáty s glutathionem jsou pro svou vyšší molekulovou hmotnost převážně exkretovány do žluči. Většinou ale podléhají další enzymatické modifikaci peptidové části za vzniku merkapturových kyselin (N-acetylcystein S-konjugát) (Gibson a Skett 2001). Z konjugátu s glutathionem je nejprve odštěpen glutamát, v dalším stupni glycin a zbývá cystein S-konjugát, který je acetyltransferasou acetylován a vzniká příslušná merkapturová kyselina (Kvasničková 1995).

2.3.6 Konjugace s aminokyselinami Substrátem pro konjugaci s aminokyselinami jsou cyklické nebo polycyklické karboxylové kyseliny. Nejprve dochází k aktivaci substrátu – kyseliny tvorbou thioesteru s koenzymem A (CoA) v přítomnosti ATP. Enzymem pro tuto reakci je acylkoenzym

A

synthetasa.

Vzniklý

thioester

přenese

acyl

k aminoskupině

aminokyseliny pomocí enzymu aminoacidacylasy za vzniku amidu a regeneruje se CoA (Kvasničková 1995). Nejčastěji využívanými aminokyselinami jsou glycin, glutamin, taurin, ornitin, kyselina glutamová, kyselina asparagová, alanin a histidin (Gibson a Skett 2001).

13

Stereochemické aspekty biotransformace xenobiotik

2.4

Mnoho xenobiotik, hlavně léčiv, obsahuje jedno nebo více chirálních center. Existují tedy ve dvou zrcadlových formách nazývaných stereoisomery nebo enantiomery.

Biotransformace

některých

chirálních

xenobiotik

vykazuje

stereoselektivitu, což znamená, že jeden enantiomer (stereoisomer) je biotransformován rychleji než jeho antipod. Schopnost některých chirálních xenobiotik inhibovat enzymy přeměňující xenobiotika může být také považována za stereoselektivní. V některých případech může být achirální molekula přeměněna na směs enantiomerních metabolitů a přeměna může dále pokračovat stereoselektivně tak, že jeden enantiomer je metabolizován přednostně před ostatními antipody (Parkinson 2001). Osud jednotlivých enantiomerů v organismu se může lišit a mohou nastat následující situace: 

Enantiomery mohou vykazovat obdobný účinek, ale mohou se lišit v afinitě k receptorům.



Enantiomery mohou účinkovat jako kompetitivní antagonisté.



Enantiomery mohou vykazovat opačné účinky nezahrnující kompetitivní antagonismus.



Distomer může antagonizovat nežádoucí účinek eutomeru.



Jeden isomer může být přednostně odpovědný za požadovaný terapeutický účinek, zatímco druhý je zodpovědný za nežádoucí účinky.



Nežádoucí účinek může přednostně vykazovat pouze jeden enantiomer, zatímco terapeutický účinek vykazují oba isomery.



Mohou vykazovat odlišné typy účinku, z nichž oba mohou být v jistých případech žádoucí.



Distomer může být stereoselektivně biotransformován v toxický metabolit.



Enantiomery se mohou lišit rychlostí biodegradace a tím i délkou terapeutického účinku.



Jeden z izomerů může podléhat stereospecifické inverzi v druhý isomer.



Genetický polymorfismus stereoselektivních enzymů může způsobit rozdíly v metabolismu obou enantiomerů.

14

2.5

Kinetika enzymových reakcí Kinetika enzymových reakcí se zabývá studiem rychlostí, kterými probíhají

chemické reakce. Kinetická měření enzymově katalyzovaných reakcí patří mezi nejúčinnější techniky při objasňování enzymových katalytických mechanismů. Studium enzymové kinetiky začal v roce 1902 Adrian Brown. Brown předpokládal, že celková reakce je složena ze dvou elementárních reakcí, v nichž substrát (S) tvoří s enzymem (E) komplex (ES), který se pak rozkládá na produkty a enzym: k1

k2

E + S ↔ ES → E + produkty k -1

Podle tohoto modelu, když substrát dosáhne dostatečné koncentrace, aby zcela přeměnil enzym na formu ES, stává se druhý krok reakce krokem určujícím rychlost a rychlost celkové reakce se stává necitlivou vůči dalšímu zvyšování koncentrace substrátu. Obecný výraz pro rychlost této reakce je: v = d[P]/dt = k2[ES] Celková rychlost produkce [ES] je rozdílem mezi rychlostmi elementárních reakcí vedoucích ke vzniku [ES] a elementárních reakcí rozpadu [ES]: d[ES]/dt = k1[E][S] – k -1[ES] – k2[ES] Tato rovnice může být integrována explicitně, pokud platí: 1) Předpoklad rovnováhy V roce 1913 L. Michaelis a M. Mentenová navázali na práci V. Henriho a předpokládali, že k -1 » k2, takže první krok dosahuje rovnováhy. Ks = k -1/k1 = [E][S]/[ES] Zde Ks je disociační konstanta pro první krok v enzymové reakci. 2) Předpoklad ustáleného stavu S výjimkou počátečního stavu reakce, tzv. přechodné fáze, která obvykle proběhne během několika milisekund po smíchání enzymu a substrátu, zůstává [ES] přibližně konstantní, dokud není substrát téměř úplně vyčerpán. Proto se rychlost syntézy [ES] musí rovnat rychlosti jeho rozkladu během téměř celého průběhu reakce; tj. [ES] zůstává v ustáleném stavu. Můžeme proto předpokládat: d[ES]/dt = 0 Pro praktické použití musí být kinetické výrazy pro celkové reakce formulovány v termínech experimentálně měřitelných hodnot. Molekuly enzymu jsou přítomny buď

15

ve formě volného enzymu nebo komplexu enzym – substrát, takže celková koncentrace enzymu [E]T je rovna součtu [E] a [ES]. Rychlostní rovnici pro enzymovou reakci lze potom z výše uvedených rovnic odvodit ve tvaru: k1([E]T

– [ES])[S] = (k -1 + k2)[ES]

Po úpravě: [ES](k -1 + k2) = k1([E]T[S] Vydělením obou stran k1 a řešením rovnice pro [ES] dostaneme: [ES] = [E]T[S]/(Km + [S]) Kde Km je tzv. Michealisova konstanta a je definována jako: KM = (k -1 + k2)/k1 Počáteční rychlost reakce může být vyjádřena v termínech experimentálně měřitelných hodnot [E]T a [S]: v0 = (d[P]/dt)t=0 = k2[ES] = k2[E]T[S]/(Km + [S]) Maximální rychlost reakce Vmax nastává při vysokých koncentracích substrátu, kdy je enzym nasycen, tj. když je zcela ve formě [ES]: Vmax = k2[E]T Dosazením získáme konečnou podobu rovnice Michaelise a Mentenové: v0 = Vmax[S]/(Km + [S]) Maximální rychlost (Vmax) a Km jsou základní kinetické konstanty pro enzym a substrát. Michaelisova konstanta udává koncentraci substrátu, při které probíhá enzymová reakce rychlostí, která je ve srovnání s maximální rychlostí poloviční. Km je tedy reciprokou hodnotou afinity enzymu k substrátu. Pro určení hodnot těchto parametrů se používá metoda formulovaná H. Lineweaverem a D. Burkem, která používá reciprokého tvaru rovnice: 1/v0 = (Km/Vmax)(1/[S]) + 1/Vmax To je lineární rovnice s proměnnými 1/v0 a 1/[S]. Jestliže jsou tyto hodnoty vyneseny do grafu, je směrnice křivky rovna Km/Vmax, úsek na ose 1/v0 odpovídá 1/Vmax a extrapolovaný úsek na ose 1/[S] je roven -1/Km (Voet a Voetová 1995).

16

2.6

Metody studia metabolismu xenobiotik Metabolismus xenobiotik můžeme studovat in vivo nebo in vitro. Experimenty in

vivo a in vitro nám poskytují jiné informace o způsobu biotransformace a zúčastněných enzymech, a tak jsou oba dva typy pro hodnocení metabolismu důležité a vzájemně nezastupitelné. In vivo experimenty se využívají ke stanovení metabolitů podaného xenobiotika v krvi, trusu, moči nebo tkáních, studiu indukčního nebo inhibičního vlivu xenobiotik na biotransformační enzymy, k extrakci metabolitů pro určení jejich struktury či testování biologické aktivity nebo toxicity. K modelovým systémům používaných při in vitro experimentech patří: perfundované orgány, tkáňové řezy, izolované buňky, subcelulární frakce a izolované enzymy. Perfundované orgány poskytují výsledky nejbližší stavu in vivo. Je zde zachována integrita orgánu jako celku, nevýhodou je ovšem krátká životnost a náročná příprava. Běžnou a dostupnou metodou je příprava subcelulárních frakcí. Je možné dlouhodobé uchovávání, ovšem nevýhodou je porušená celistvost buňky – neprobíhá buněčný metabolismus, membránový transport a nedochází k tvorbě endogenních kofaktorů. Subcelulární frakce se připravují diferenční centrifugací. Dle hodnoty gravitačního zrychlení získáme příslušnou subcelulární frakci: stáčením při 1 000 g – zbytky buněčné membrány a buněčná jádra, při 20 000 g – mitochondrie, při 105 000 g – mikrosomy odvozené od endoplasmatického retikula a supernatant cytosol.

2.7

Sibutramin

2.7.1 Zařazení Sibutramin

(N-{1-[1-(4-chlorfenyl)cyklobutyl]-3-methylbutyl}-N,N-dimethyl-

amin (obr. 1) je inhibitor zpětného vychytávání serotoninu a noradrenalinu určen pro léčbu obezity (Hind se sp. 1999). Sibutramin byl původně vyvíjen jako antidepresivum a až v průběhu klinických studií byla zjištěna jeho schopnost snižovat tělesnou hmotnost (Doležal a Votava 2001).

17

Cl

CH3

CH3 N

CH3 CH3

Obr. 1. Chemická struktura léčiva sibutraminu Chemické a fyzikální vlastnosti Sumární vzorec: C17H26ClN (sibutramin), C17H29Cl2NO (sibutramin hydrochlorid monohydrát) Molekulová hmotnost: 279,855 (sibutramin), 334,33 (sibutramin hydrochlorid monohydrát) V lékových

formách

je

sibutramin

obsažen

ve

formě

hydrochloridu

monohydrátu. 10 mg sibutraminu hydrochloridu monohydrátu odpovídá 8,37 mg sibutraminu. Sibutramin hydrochlorid monohydrát je bílý až lehce krémový krystalický prášek slabě rozpustný ve vodě (nejlépe v mírně kyselém prostředí – 2,9 mg/ml při pH 5,2, disociační konstanta pKa = 9) a velmi dobře rozpustný v ethanolu (Doležal a Votava 2001). Indikace: Sibutramin je indikován jako přídatná terapie k programu snižování nadváhy pro: - obézní pacienty, BMI 30 kg/m2 a vyšší; - pacienty s nadváhou (BMI 27 kg/m2 a vyšší) a přítomnými rizikovými faktory jako jsou diabetes II. typu nebo dyslipidemie (AISLP). Dávkování: Sibutramin je podáván jednou denně v dávce 5-15 mg. Míra poklesu tělesné hmotnosti závisí jednak na podané dávce ale i na režimových opatřeních. Sibutramin snižuje váhu o více než 5% u více než 75% při podání 15 mg denně a nezávisle na režimových opatřeních průměrně o 5-8% (Ryan 2004).

18

2.7.2 Mechanismus účinku Sibutramin je centrálně působící látka, která na dávce závisle inhibuje zpětné vychytávání serotoninu a noradrenalinu (NA) (Doležal a Votava 2001). Jeho účinek je zprostředkován stimulací fyziologického pocitu nasycení (tj. snížením příjmu potravy) a současně zvýšením energetického výdeje (Luque se sp. 1999, Hind se sp. 1999, Ryan 2004). Studie prováděná na potkanech uvádí, že sice sibutramin inhibuje zpětné vychytávání NA in vivo, ale množství extracelulárního NA je omezováno adrenergní aktivací presynaptických α2-receptorů. Terminální α2-receptory v hypothalamu jevily větší inhibiční účinek v regulaci extracelulárního množství NA než receptory ve frontální kůře (Wortley se sp. 1999). Nejčastěji je terapeutický účinek sibutraminu přisuzován jeho farmakologicky účinnějším metabolitům – desmethylsibutraminu a didesmethylsibutraminu (metabolit 1 a metabolit 2), které jsou inhibitory zpětného vychytávání NA, serotoninu (5-hydroxytryptaminu; 5-HT) a dopaminu (Luque a Rey 2002). V lidské mozkové tkáni jsou metabolit 1 a metabolit 2 třikrát silnější jako in vitro inhibitory zpětného vychytávání NA a serotoninu než jako inhibitory zpětného vychytávání dopaminu. Ve vzorcích plasmy odebrané dobrovolníkům po podání sibutraminu byla zjištěna signifikantní inhibice zpětného vychytávání NA (73%) a serotoninu (54%) a nevýznamná inhibice zpětného vychytávání dopaminu (16%). Sibutramin a jeho metabolity

nejsou

látky

uvolňující

monoaminy

a

nejsou

ani

inhibitory

monoaminoxidázy. Nemají afinitu k širokému počtu neurotransmiterních receptorů, včetně receptorů serotonergních (5-HT1, 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2c), adrenergních (beta1, beta2, beta3, alfa1, alfa2), dopaminergních (D1, D2), muskarinových, histaminergních (H1), benzodiazepinu a NMDA receptorů (AISLP).

2.7.3 Farmakokinetika Absorpce Sibutramin je po perorálním podání rychle resorbován s výslednou biologickou dostupností 77 % a časem k dosažení maximální plazmatické koncentrace 1,2 hodiny viz tab. 1. Sibutramin je možné podávat s potravou, současný příjem potravy sice sníží maximální koncentraci Cmax a prodlouží čas k dosažení maximální plazmatické

19

koncentrace tmax, ale celková plocha pod křivkou zůstává nezměněna (Doležal a Votava 2001). Distribuce Studie na zvířatech využívající radioaktivně značený materiál konstatovaly strmě narůstající a značnou distribuci do tkání, nejvyšší koncentrace byla nalezena v eliminačních orgánech: v játrech a ledvinách. In vitro, sibutramin, M1, M2 se váží (97 %, 94 % a 94 %) na plazmatické bílkoviny, koncentrace v plazmě odpovídá podané dávce (FDA). Tab. 1.

Vybrané farmakokinetické parametry sibutraminu (Doležal a Votava 2001)

Parametr biologická dostupnost F [%] čas dosažení maximální plazmatické koncentrace tmax [h] čas dosažení maximální plazmatické koncentrace tmax metabolitů M1 a M2 [h] Vazba na plazmatické bílkoviny [%] maximální plazmatické koncentrace Cmax metabolit M1 metabolit M2 plocha pod křivkou AUC24 metabolit M1 metabolit M2

hodnota 77 1,2 2,5-3,6 97 (mg/l, dávka 15 mg) 3,2-4,0 6,4-8,1 (mg/h/l, dávka 15 mg) 22,5-25,5 22,1-148,0

Srovnáním farmakokinetiky sibutraminu u skupiny s průměrným věkem 24,0 a 70,3 let bylo zjištěno, že farmakokinetické parametry sibutraminu a metabolitů M1 a M2 se neliší signifikantně. Byl pozorován pouze nárůst t1/2 M2 starší věkové skupiny, a to o 17 %. Profily křivek plasmatická koncentrace-čas, stejně jako Cmax nebyly výrazně odlišné (Hind se sp. 1999).

2.7.4 Metabolismus Biotransformace Již při prvním průchodu játry je sibutramin extenzivně biotransformován na dva farmakologicky aktivní metabolity M1 (desmethylsibutramin) a M2 (didesmethylsibutramin). Tato reakce je katalyzována isoenzymem 3A4 cytochromu P450. Koncentrace metabolitu M2 je zhruba dvojnásobná vzhledem ke koncentraci metabolitu M1 (Doležal a Votava 2001). M1 a M2 jsou dále hydroxylovány a konjugovány za vzniku inaktivních metabolitů M5 a M6 (Luque a Rey 1999) viz obr. 2. 20

CH3

Cl

CH3 N

CH3

Cl

CH3

CH3 N

CYP450

CH3

CH3

CH3 M1

sibutramin H Cl

H N

CH3 CH3

M2

H Cl

H

H N

Cl

H N

CH3

CH3

OH CH3

M6

OH

M5

Obr. 2. Schéma metabolismu sibutraminu u člověka M1: N-{1-[1-(4-chlorfenyl)cyklobutyl]-3-methylbutyl}-N-methylamin M2: 1-[1-(4-chlorfenyl)cyklobutyl]-3-methylbutylamin M5: cis/trans-3-(1-amino-3-methylbutyl)-3-(4-chlorfenyl)-1-cyklobutanol (hydroxylová skupina je buď v cis nebo trans poloze k cyklu) M6: 4-amino-4-[1-(4-chlorfenyl)cyklobutyl]-2-methylbutan-1-ol Eliminace Metabolity M5 a M6 jsou vyloučeny převážně močí (77%) a stolicí (8%). Biologický poločas eliminace sibutraminu je 1,1 hodiny, aktivních metabolitů potom 14 až 16

21

hodin (Doležal a Votava 2001). Nepřeměněný sibutramin, metabolity M1 a M2 nebyly v moči detekovány. Primární směr exkrece M1 a M2 je jaterní metabolismus (FDA). Enantioselektivní chování metabolitů V molekule sibutraminu se nachází jedno chirální centrum, proto existují dva optické izomery, S- a R-sibutramin. Struktura obou enantiomerů je znázorněna na obr. 3.

Cl

CH3

CH3 N

CH3

Cl

CH3 N

CH3

CH3 CH3

CH3

H

H S-(-)-sibutramin

R-(+)-sibutramin

Obr. 3. Strukturní vzorce enantiomerů sibutraminu Sibutramin i jeho demethylací vzniklé metabolity desmethylsibutramin a didesmethylsibutramin jsou opticky aktivní látky. Byla stanovena účinnost zpětného vychytávání monoaminů in vitro u racemické směsi sibutraminu, R-, S-desmethylsibutraminu a R-, S-didesmethylsibutraminu (viz tab. 2). Tab. 2. Účinky S-, R-sibutraminu, R-desmethylsibutraminu, S-desmethylsibutraminu, R-didesmethylsibutraminu a S-didesmethylsibutraminu na vychytávání monoaminů (Glick se sp. 2000) Hodnoty IC50 zpětného vychytávání [nM] NA

Serotonin

Dopamin

350,0

2800,0

1200,0

R-desmethylsibutramin

4,0

44,0

12,0

S-desmethylsibutramin

870,0

9200,0

180,0

R-didesmethylsibutramin

13,0

140,0

8,9

S-didesmethylsibutramin

62,0

4300,0

12,0

R-,S-sibutramin

Bylo zjištěno, že R-enantiomery metabolitů a S-didesmethylsibutramin mají inhibiční účinek na zpětné vychytávání NA a dopaminu v nižších koncentracích než

22

S-desmethylsibutramin. Sledované látky inhibují zpětné vychytávání NA a dopaminu více než serotoninu. Dále bylo sledováno chování potkanů – příjem vody a potravy, ovlivnění pohybové aktivity a Porsoltův swim test.

R-enantiomery

byly

shledány účinnějšími než S-enantiomery. Dále se také R-desmethylsibutramin a R-didesmethylsibutramin ukázaly jako účinnější než sibutramin. S-didesmethylsibutramin

nevykazoval

žádné

snížení

přijmu

Naproti potravy.

tomu Avšak

S-didesmethylsibutramin je téměř stejně efektivním inhibitorem zpětného vychytávání NA a dopaminu jako R-didesmethylsibutramin, ale jeho účinek je daleko nižší ve všech testech. Lze předpokládat, že nejdůležitějším účinkem těchto látek je inhibice zpětného vychytávání serotoninu, zde působí R-enantiomery (200 a 40 krát) silněji. Nebo je možné, že R- a S-enantiomery jsou rozdílně metabolizovány, takže S-forma je inaktivována mnohem rychleji než R-forma didesmethylsibutraminu (Glick se sp. 2000). Metabolická studie sibutraminu provedená s potkaními mikrosomy a hepatocyty ukázala, že je první fáze metabolismu stereoselektivní. Inkubace R-sibutraminu poskytla pouze metabolity M1 a M2 zatímco inkubací S-sibutraminu byly získány čtyři hlavní metabolity: M1, M2, M3 (hydroxy derivát M2 přesná pozice OH-skupiny není známa) a M4 (struktura je studována) (Link se sp. 2005). S ohledem

na

tyto

výsledky

lze říci,

že R- desmethylsibutramin

a

R- didesmethylsibutramin by mohly představovat účinnější farmakoterapii než dosud používaný racemický sibutramin. Je však ještě třeba důkladně prostudovat problematiku farmakologických a vedlejších účinků enantiomerů sibutraminu i jejich metabolitů. Bylo již vyvinuto několik metod chemické syntézy těchto enantiomerních látek (Qun se sp. 1999, Dhileepkumar se sp. 2002, Zhengxu se sp. 2002). Klinické zkušenosti: Sibutramin v dávce 15 mg denně zvyšuje inzulinovou citlivost bez změny sérové hladiny adiponektinu u obézních pacientů s diabetes melitus 2. typu (Hung se sp. 2005). U diabetických pacientů po léčbě sibutraminem byl pozorován i významný pokles HbA1c. Při porovnání diabetiků a nediabetických pacientů, kterým byl podáván sibutramin, dochází u obou skupin k významnému snížení tělesné hmotnosti, BMI, obvodu pasu i boků, zlepšení citlivost na insulin, sekrece inzulínu, kontroly glykemie a lipidových parametrů (Lean 2001, Tankova se sp. 2004).

23

Ve srovnání s orlistatem je sibutramin lépe snášen, účinek obou je srovnatelný u obézních pacientů s hypertenzí (Derosa se sp. 2005). Avšak při porovnání orlistatu, sibutraminu a jejich kombinace podávané obézním ženám, nebyl pozorován rozdíl v účinnosti mezi sibutraminem a kombinací, ale orlistat byl vyhodnocen jako méně účinný (Sari se sp. 2004).

2.7.5 Lékové interakce Sibutramin je spolu s jeho aktivními metabolity eliminován jaterním cytochromem P450 3A4, za možného přispění CYP2C9 a CYP1A2 (AISPL), což by mohlo představovat možné riziko interakcí sibutraminu s jinými současně podávanými léčivy (Luque a Rey 1999). CYP3A4 inhibitory zahrnují ketokonazol, intrakonazol, erytromycin, klaritromycin, troleandomycin a cyklosporin. Rifampicin, fenytoin, karbamazepin, fenobarbital a dexametazon jsou induktory enzymů CYP3A4 a mohou zrychlovat metabolismus sibutraminu (nebylo experimentálně ověřeno) (AISPL). Současné podávání sibutraminu a inhibitorů monoaminoxidasy může vést ke zvýšené dostupnosti serotoninu v CNS s rizikem serotoninového syndromu. Pozornost by měla být věnována také kombinaci sibutraminu s látkami typu efedrinu, pseudoefedrinu a phenylpropanolaminu, existuje riziko sumace účinku v oblasti kardiovaskulárního systému (tachykardie, vzestup krevního tlaku). V klinických studiích neovlivňoval sibutramin účinnost perorálních kontraceptiv a beta-blokátorů (Doležal a Votava 2001).

2.7.6 Vedlejší účinky Nejzávažnějším vedlejším účinkem sibutraminu je mírné zvýšení krevního tlaku, které je však možné kompenzovat kombinací sibutraminu s antihypertenzivy (např. ACE-inhibitory, β-blokátory) nebo thiazidovými diuretiky (Luque se sp. 1999 ). Je tedy nutné, aby u pacientům užívajících sibutramin byl monitorován jak tlak krve tak i srdeční rytmus. Toto léčivo není vhodné pro pacienty s kardiovaskulárním onemocněním (Poston 2004) a se syndromem prodlouženého QT intervalu (HarrisonWoolrych se sp. 2006). Pacienti, kterým sibutramin vyvolal klinicky významné a trvalé zvýšení tlaku krve, by neměli pokračovat v této léčbě (Jordan se sp. 2005). Dále byly pro sibutramin popsány méně závažné vedlejší účinky jako sucho v ústech, nespavost, obstipace, nechutenství a bolest hlavy (Luque se sp. 1999).

24

3 Cíl práce Tato práce je zaměřena na studium chirálních aspektů biotransformace sibutraminu na jeho metabolit M1. Pro optimalizaci extrakce a inkubace byla modelově využita jaterní mikrosomální frakce potkana. Pro studium enzymové kinetiky dané reakce byl použit směsný vzorek mikrosomální frakce z lidské jaterní tkáně od šesti dárců. Cílem této práce bylo: 

optimalizovat podmínky extrakce a inkubace rac-sibutraminu, R-sibutraminu, S-sibutraminu a jejich metabolitů z mikrosomální jaterní frakce potkana



vytvořit kalibrační přímku pro hlavní metabolit sibutraminu (M1) z biologického materiálu mikrosomální jaterní frakce potkana



porovnat biotransformaci individuálních enantiomerů sibutraminu s racemickou směsí sibutraminu v mikrosomální frakci lidské jaterní tkáně s ohledem na tvorbu M1



vypočítat enzymově kinetické parametry této biotransformace u člověka

25

4 Experimentální část 4.1

Materiál a pomůcky

4.1.1 Chemikálie VÚFB Zentiva, a.s.: sibutramin ve formě racemické směsi R-sibutramin S-sibutramin racemická směs desmethylsibutraminu (M1) racemická směs didesmethylsibutraminu (M2) SIGMA Aldrich Chemie Gmbh, Germany: acetonitril LiChrosolv, pro kapalinovou chromatografii ethylacetát LiChrosolv, pro kapalinovou chromatografii methanol, pro kapalinovou chromatografii NADPH Kyselina octová 98%, pro kapalinovou chromatografii Merck KgaA, Germany: Octan ammoný p.a. Terc.-butylmethyleter pro chromatografii Lachema a.s., odštěpný závod Neratovice: hydroxid sodný destilovaná a redestilovaná voda

4.1.2 Pomůcky a přístroje POMŮCKY Automatické pipety a špičky, kádinky, odměrné válce, eppendorfky, navažovací kopist, odměrné baňky, vialky, inserty, láhve na mobilní fázi, míchadla PŘÍSTROJE Analytické váhy SCALTEC Digitální pH metr ORION model 410A

26

Centrifuga Heareus Biofuge pico Koncentrátor Eppendorf 5301 Vodní lázeň Julabo Ecotemp TW8 Laboratorní míchačka VARIOMAG Mono Vysokoúčinné filtrační zařízení Supelco, USA Třepačka VELP Scientifica Předvážky KB 500-2 Kern Ulrazvuková lázeň K2 Kraintek s.r.o. HPLC: Hewlett Packard Agilent 1100 Series sestávající z: kvarternární pumpy, autosampleru, kolonového termostatu, UV/VIS detektoru s diodovým polem a chromatografického softwaru Chemstation

4.1.3 Biologický materiál K experimentům

byla

používána

mikrosomální

frakce

jater

potkana

laboratorního (Rattus norvegicus varietas alba) kmene Wistar. Tento biologický materiál byl připraven diferenční centrifugací studenty při praktických cvičeních xenobiochemie. Lidská mikrosomální frakce byla připravena spojením a rozpipetování lidských mikrosomů: 55 let ♀, 69 let ♀, 65 let ♀, 49 let ♂, 64 let ♂, 56 let ♂. Vzorky byly rozmraženy ve studené vodě, z každého vzorku bylo odebráno po 1 ml, jejichž smísením vznikl směsný vzorek od 6-ti dárců. Směsný vzorek byl uchováván při -80 °C.

4.2

Metodika práce

4.2.1 Optimalizace podmínek extrakce Pro porovnání výtěžků extrakce byly použity kombinace dvou různých rozpouštědel spojené s kyselou nebo zásaditou hodnotou pH. Směs obsahovala vždy 250 l roztoku obsahujícího M2-OH, M2, M1 a sibutramin o výsledných koncentracích jednotlivých látek shodně 20 M nebo alternativně 500 M. Každá kombinace byla třikrát opakována. Do každého vzorku bylo připipetováno 50 l potkaních mikrosomů a směs byla protřepána. Dále bylo přidáno 35 l 0,03 M hydroxidu sodného a směs byla opět protřepána. Do poloviny vzorků bylo přidáno 0,7 ml ethylacetátu (EtAc) do druhé poloviny stejné množství terc.-butylmethyleteru (TME). Směsi byly intenzivně

27

protřepávány 7 min na třepačce a následně centrifugovány (6000 g, 6 min). Po oddělení organické vrstvy byla extrakce zopakována. Před odpařením rozpouštědla bylo do tří vzorků od každé koncentrace a rozpouštědla připipetováno 10 l konc. kyseliny octové. Spojené extrakty byly odpařeny při 45°C do sucha. Odparky byly rozpuštěny ve 150 l roztoku acetonitrilu v octanovém pufru. Roztok acetonitrilu v octanovém pufru byl připraven smísením roztoku A a roztoku B v poměru 7:3 (v/v). Roztok A: 20 % (v/v) acetonitril v octanovém pufru, pH výchozího pufru bylo 5,3, výsledná koncentrace octanu amonného v roztoku A byla 6 mM Roztok B: 70 % (v/v) acetonitril v octanovém pufru, pH výchozího pufru bylo 5,3, výsledná koncentrace octanu amonného v roztoku B byla 6 mM Pro úplné rozpuštění byly vzorky protřepány a přepipetovány do insertů a analyzovány pomocí HPLC.

4.2.2 Provedení inkubace Inkubační směs o celkovém objemu 300 l obsahovala: 150 l roztoku substrátu příslušné koncentrace 100 l roztoku NADPH o koncentraci 3 mM (výsledná koncentrace ve směsi 1 mM) 50 l enzymového přípravku Na přípravu roztoků substrátu byla použita redestilovaná voda. Byly připraveny roztoky rac-sibutraminu (rac-sib), R-sibutraminu (R-sib) a S-sibutraminu (S-sib) o koncentracích 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500 M. Pro každou koncentraci substrátu byly provedeny tři paralelní vzorky. Směs substrátu a NADPH byla preinkubována 5 minut při 37°C. Inkubace byla zahájena přidáním 50 l lidských mikrosomů a protřepáním. Inkubace probíhala 30 minut při 37°C. Inkubace byla zastavena přenosem vzorků do ledové lázně. K reakční směsi bylo přidáno 50 l 140 M M2-OH jako vnitřního standardu. Směs byla protřepána. Dále bylo k reakční směsi pro dosažení požadovaného pH 9,7 připipetováno 35 l 0,03 M hydroxidu sodného a směs byla opět protřepána.

28

4.2.3 Kalibrační přímka Pro každou látku (rac-M1, rac-sib, rac-M2) byly rozpuštěním v methanolu připraveny roztoky o koncentraci 5 mg/ml. Smícháním potřebných množství z daných roztoků byl získán výchozí roztok standardů o koncentracích 120 M rac-M1, 240 M rac-sib, 60 M, rac-M2 – roztok 1. Roztoky 2 až 6 byly připraveny postupným ředěním roztoku 1 redestilovanou vodou: 1:1 (v/v) roztok 1 a redestilovaná voda vzniká roztok 2 1:1 (v/v) roztok 2 a redestilovaná voda vzniká roztok 3 0,72:1,08 (v/v) roztok 3 a redestilovaná voda vzniká roztok 4 1:1 (v/v) roztok 4 a redestilovaná voda vzniká roztok 5 1:1 (v/v) roztok 5 a redestilovaná voda vzniká roztok 6 Řada výchozích roztoků pro kalibraci tedy obsahovala M1 v koncentraci 96,3, 48,2, 24,1, 9,6, 4,8, 2,4 M. Od každé koncentrace byly připraveny tři paralelky. Do jednotlivých eppendorfek bylo vždy napipetováno 250 l výchozího roztoku 1 až 6, připipetováno 50 l potkaních mikrosomů a přidáno 50 l vnitřního standardu 140 M M2-OH. Směs byla protřepána. Dále bylo k reakční směsi připipetováno 35 l 0,03 M hydroxidu sodného a směs byla opět protřepána. Extrakce, následující zpracování a vyhodnocení kalibračních vzorků bylo shodné s inkubovanými vzorky.

4.2.4 Extrakce a rozpouštění odparků Ke každému vzorku bylo přidáno 0,7 ml ethylacetátu a směs byla 7 minut intenzivně protřepávána na třepačce. Pro oddělení vodné a acetátové fáze byla použita centrifugace (7000 g; 7 min). Po odebrání vrchní acetátové vrstvy byla extrakce zopakována. Ke spojeným extraktům bylo napipetováno 10 l konc. kyseliny octové a extrakty byly odpařeny v koncentrátoru při 45°C do sucha. Následující postup je identický viz 4.2.1.

4.2.5 HPLC analýza

4.2.5.1 Achirální separace Octanový pufr byl připraven rozpuštěním octanu amonného v redestilované vodě, koncentrace octanu byla 20 mM. Roztok byl přefiltrován na filtračním zařízení.

29

Byla provedena úprava pH pomocí konc. kyseliny octové na hodnotu 5,3. Složky mobilní fáze byly připraveny příslušným ředěním redestilovanou vodou a smícháním s potřebným množstvím acetonitrilu. Mobilní fáze byla tvořena směsí roztoku A a roztoku B: Roztok A. 20mM octan amonný pufr pH 5,3/H2O/acetonitril, 30/50/20, v/v/v Roztok B. 20mM octan amonný pufr pH 5,3/acetonitril, 30/70, v/v Gradient: 0 min 30% B, 16 min 70% B, 19 min 70% B, 20 min 30%B, 26 min 30%B Byla použita kolona Zorbax Eclipse XDB C8 (4,6 x 150 mm, 5 m náplň), předkolona (4,6 x 12,5 mm, 5 m náplň). Průtok mobilní fáze byl nastaven na 1 ml/min. Hodnota tlaku na počátku analýzy byla 71 barů. Byl použit UV/VIS detektor s nastavenou vlnovou délkou 223 nm. Výstupy byly vyhodnoceny pomocí chromatografického programu Chemstation. Z chromatogramů byla patrná přítomnost nezreagovaného rac-, R-, S-sib a příslušných metabolitů M1 a M2. Byly jímány frakce rac-sib a rac-M1 určené pro chirální analýzu.

4.2.5.2 Chirální separace Pro chirální analýzu byla použita kolona Chiral AGP (150 x 4 mm, 5m náplň), chirální předkolona (10 x 4 mm, 5 µm) se stejnou stacionární fází jako použitá kolona. Průtok mobilní fáze byl nastaven na 0,9 ml/min. Mobilní fáze byla složena: 10 mM octan amonný pH 5.0/acetonitril, 90/10, v/v. Analýzy probíhaly při teplotě 25°C a tlaku 93 barů. Pro získání výsledků chromatografie byl použit UV/VIS detektor s vlnovou délkou 223nm. Výstupy byly zpracovány chromatografickým programem Chemstation. Na chromatogramu byly zachyceny píky S-, R-M1.

4.2.6 Vyhodnocení naměřených dat Nejprve proběhla předseparace metabolitů pomocí achirální analýzy. Pomocí kalibrační přímky bylo stanoveno množství metabolitů R-, S-, rac-M1. Chirální analýzou byl zjištěn poměr množství S-, R-M1 vzniklých inkubací rac-sib.

30

5 Výsledky Výsledky byly získány analýzou složení reakčních směsí po ukončení inkubace a upravení vzorků (viz Experimentální část) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

Výstupy

byly

vyhodnoceny

v chromatografickém

programu

Chemstation. K určení kinetických konstant byl použit program GraphPad Prism 4.

5.1 Optimalizace podmínek extrakce Z výsledků optimalizace podmínek extrakce, shrnutých v tab. 3 je patrné, že extrakce s nejvyššími výtěžky byla nalezena u ethylacetátu s přídavkem konc. kyseliny octové. Tab. 3. Výtěžnost extrakce M2-OH, M2 , M1, sibutraminu [%] v použitých extrakčních systémech Extrakční systém

M2-OH [%]

M2 [%]

M1 [%]

Sibutramin [%]

Koncentrace látek ve směsi 20 M 61 56 75

80

EtAc s konc. kys. octovou TME

71

70

83

88

53

43

66

62

TME s konc. kys. octovou

59

40

59

62

EtAc

Koncentrace látek ve směsi 500 M EtAc

60

47

66

61

EtAc s konc. kys. octovou TME

63

62

71

69

62

46

64

51

TME s konc. kys. octovou

66

57

69

60

31

5.2 Stanovení rozsahu koncentrací pro měření enzymové kinetiky Pro stanovení rozsahu koncentrace pro získání vhodných dat enzymové kinetiky sledované reakce byla provedena inkubace s mikrosomální jaterní frakcí potkana. Substrátem byl rac-sib o koncentracích v reakční směsi před inkubací: 5, 20, 50, 100, 300 a 500 M. Po inkubaci bylo ke vzorkům s koncentracemi 5, 20, 50 a 100 M, připipetováno 50 l vnitřního standardu (140 M M2-OH). Pro koncentraci 100 M byl připraven kontrolní vzorek bez vnitřního standardu, jenž byl nahrazen 50 l redestilované vody. Do směsí obsahujících koncentrace substrátu 300 a 500 M bylo přidáno 700 M roztoku vnitřního standardu. U získaných vzorků byla provedena achirální separace, při niž byly najímány frakce rac-sib a rac-M1, které byly dále analyzovány pomocí chirální kolony. Z výsledků této analýzy se dá předpokládat, že koncentrace substrátu byly zvoleny vhodně a obdobný rozsah koncentrací byl využit při dalších experimentech.

5.3

Kalibrační přímka Analýzou vzorků pro kalibraci byly naměřeny hodnoty uvedené v tab. 4.

32

Tab. 4.

Závislost koncentrace M1 a příslušné plochy píku

Označení vzorku AOOC0010 AOOC0011 AOOC0012 AOOC0001 AOOC0002 AOOC0003 AOOC0004 AOOC0005 AOOC0006 AOOC0007 AOOC0008 AOOC0009 AOOC0013 AOOC0014 AOOC0015 AOOC0016 AOOC0017 AOOC0018

Plocha píku M1 [mAU.min] 176 175 171 302 356 365 753 690 646 1661 1860 1827 3597 3434 3675 7181 7142 6655

Koncentrace M1 [M] 2,4

4,8

9,6

24,1

48,2

96,3

Ze získaných hodnot byla sestrojena kalibrační přímka lineární regresí v programu Microsoft Excel viz obr. 4.

kalibrace 5.5. 2005 8000 8000 y = 72,801x + 10,787 y = 72,801x + 10,787 2 R = 0,9999

M1 [mAU.min] Plochaplocha M1

7000 7000 6000 6000 5000 5000 4000 4000 3000 3000 2000 2000 1000 1000 00 -1000 00 -1000

20 20

40 40

60 60

80 80

100 100

120 120

konc. M 1 [M] Koncentrace M1 [M]

Obr. 4. Kalibrační přímka pro odečtení koncentrace M1 (závislost velikosti plochy píku na koncentraci M1) 33

Rovnice regrese získané přímky je y = 72,801x + 10,787 s hladinou spolehlivosti R2 = 0,9999. Zjištěná závislost byla využita pro výpočty koncentrací M1 z ploch získaných následujícími experimenty.

5.4 Metabolismus po podání rac-, R-, S-sib 5.4.1 Inkubace rac-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně Hodnoty získané analýzou vzorků inkubace rac-sibutraminu s lidskými mikrosomy jsou uvedeny v tab. 5. Tab. 5. Závislost plochy M1 a nezreagovaného sibutraminu na koncentraci sibutraminu před inkubací Označení vzorku AHMO0031 AHMO0032 AHMO0033 AHMO0034 AHMO0035 AHMO0036 AHMO0028 AHMO0029 AHMO0030 AHMO0037 AHMO0038 AHMO0039 AHMO0040 AHMO0041 AHMO0042 AHMO0043 AHMO0044 AHMO0045 AHMO0046 AHMO0047 AHMO0048

Koncentrace rac-sib [M] 10a 10b 10c 20a 20b 20c 50a 50b 50c 100a 100b 100c 200a 200b 200c 300a 300b 300c 500a 500b 500c

Plocha píku M1 304 313 333 571 610 598 1221 1409 1222 1932 1815 2075 2400 2703 2546 2999 3207 3142 3109 3529 3296

Plocha píku sibutraminu 237 233 250 556 536 574 1378 1948 1954 4596 4793 5264 10384 10976 10750 15047 16874 16824 29900 30345 32484

Naměřené hodnoty byly použity pro přepočet na koncentraci M1 podle kalibrační přímky, pomocí programu Microsoft Excel byly spočteny rychlosti pro jednotlivé paralelní vzorky a kinetické parametry byly získány nelineární regresí pomocí programu Graph Pad Prism 4.

34

Během HPLC analýzy byly najímány frakce M1, které byly následně analyzovány na chirální koloně. Získané hodnoty při této analýze jsou uvedeny v tab. 6 a 7. Tab. 6.

Najímané frakce M1 po inkubaci rac-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně

Označení vzorku CHMO0010 CHMO0011 CHMO0012 CHMO0013 CHMO0014 CHMO0015 CHMO0016 CHMO0017 CHMO0018 CHMO0019 CHMO0020 CHMO0021 CHMO0022 CHMO0023 CHMO0024

Koncentrace rac-sib [M] 10

20 50 100 200 300 500

Plocha píku SM1 83,3 68,8 66,7 154 133 182 262 298 302 261 326 307 448 488 401

Plocha píku RM1 70,6 51,7 56,3 110 101 117 165 152 157 125 151 142 207 219 173

Poměr S/R 1,18 1,33 1,18 1,4 1,32 1,56 1,59 1,96 1,92 2,09 2,16 2,16 2,16 2,23 2,32

Tab. 7. Najímané frakce sibutraminu po inkubaci rac-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně Označení vzorku CHMO0025 CHMO0026 CHMO0027 CHMO0028

Koncentrace rac-sib [M] 50 500

Plocha píku Ssib 163 400 856 898

Plocha píku Rsib 227 563 937 972

Poměr S/R 0,72 0,71 0,91 0,92

5.4.2 Inkubace R-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně Hodnoty získané analýzou vzorků inkubace R-sib s lidskými mikrosomy jsou uvedeny v tab. 8.

35

Tab. 8. Závislost plochy R-M1 a nezreagovaného R-sib na koncentraci R-sib před inkubací Označení vzorku AHMO0049 AHMO0050 AHMO0051 AHMO0052 AHMO0053 AHMO0054 AHMO0055 AHMO0056 AHMO0057 AHMO0058 AHMO0059 AHMO0060 AHMO0061 AHMO0062 AHMO0063 AHMO0064 AHMO0065 AHMO0066 AHMO0067 AHMO0068 AHMO0069

Koncentrace R-sib [M] 10a 10b 10c 20a 20b 20c 50a 50b 50c 100a 100b 100c 200a 200b 200c 300a 300b 300c 500a 500b 500c

Plocha píku R-M1

Plocha píku R-sib

197 224 220 323 460 296 795 554 639 1528 1489 1543 2117 2142 2122 2346 2257 2419 2758 2884 2811

224 227 203 415 578 400 1790 1195 1329 5814 5678 5363 4336 4741 4462 6814 6407 6701 12199 14272 14189

Naměřené hodnoty byly použity pro přepočet na koncentraci R-M1 podle kalibrační přímky, pomocí programu Microsoft Excel byly spočteny rychlosti pro jednotlivé paralelní vzorky a kinetické parametry byly získány nelineární regresí pomocí programu Graph Pad Prism 4.

5.4.3 Inkubace S-sib s mikrosomy lidské jaterní tkáně Hodnoty získané analýzou vzorků inkubace S-sib s lidskými mikrosomy jsou uvedeny v tab. 9.

36

Tab. 9. Závislost plochy S-M1 a nezreagovaného S-sib na koncentraci S-sib před inkubací Označení vzorku AHMO0070 AHMO0071 AHMO0072 AHMO0073 AHMO0074 AHMO0075 AHMO0076 AHMO0077 AHMO0078 AHMO0079 AHMO0080 AHMO0081 AHMO0082 AHMO0083 AHMO0084 AHMO0085 AHMO0086 AHMO0087 AHMO0088 AHMO0089

Koncentrace S-sib [M] 10a 10b 10c 20a 20b 20c 50a 50b 50c 100a 100b 100c 200a 200b 200c 300a 300b 300c 500a 500b

Plocha píku S-M1

Plocha píku S-sib

315 378 410 670 745 836 1418 1428 1517 1682 2421 2442 3284 3013 2923 3310 3660 3360 3186 3517

223 256 241 659 636 630 2028 2176 2173 3979 5440 5183 4010 4394 4212 6684 7112 6539 11510 12266

Naměřené hodnoty byly použity pro přepočet na koncentraci R-M1 podle kalibrační přímky, pomocí programu Microsoft Excel byly spočteny rychlosti pro jednotlivé paralelní vzorky a kinetické parametry byly získány nelineární regresí pomocí programu GraphPad Prism 4.

5.5 Vyhodnocení kinetických dat Rac-, R-, S-sib byl inkubován se suspenzí mikrosomů z lidské jaterní tkáně při teplotě 37°C po dobu 30 min, jako koenzym byl použit NADPH. Výsledkem je vždy střední hodnota z naměřených vzorků.

5.5.1 Tvorba rac-M1 při podání rac-sib Pro tvorbu rac-M1 z rac- sib byly vypočteny hodnoty rychlosti tvorby uvedené v tab. 10.

37

Tab. 10. Vypočtené hodnoty rychlosti tvorby metabolitů Rychlost tvorby rac-M1 [nmol.l-1.s-1]

Koncentrace rac-sib [M]

a

b

c

10

2,2

2,3

2,5

20

4,3

4,6

4,5

50

9,2

10,8

9,2

100

14,7

13,8

15,8

200

18,2

20,5

19,4

300

22,8

24,4

23,9

500

23,6

26,9

25,1

Z uvedených hodnot rychlostí reakce byly lineární regresí dle Lineweavera a Burka použitím programu GraphPad Prism 4 získány kinetické konstanty dané reakce uvedené v tab. 11 a byl sestrojen graf závislost rychlosti tvorby rac-M1 na koncentraci rac-sib viz obr.5.

Rychlost reakce [nmol.l -1.s-1]

Tab. 11. Vypočtené hodnoty rychlosti tvorby metabolitů metabolit

Km ± S.D [mol/l]

Vmax ± S.D [nmol.l-1.s-1]

rac-M1

115,0 ± 9,5

31,5 ± 0,9

30

rychlost tvorby rac-M1

20

10

0 0

100

200

300

400

500

600

Koncentrace rac-sib [M]

Obr. 5. Závislost rychlosti tvorby rac-M1 na koncentraci rac-sib

38

5.5.2 Tvorba R- a S- enantiomeru M1 při podání rac-sib Pro tvorbu R- a S-M1 z rac- sib byly vypočteny hodnoty rychlosti tvorby uvedené v tab. 12. Ze získaných dat byla sestrojena závislost rychlosti tvorby S-, R-M1 na koncentraci S-, R-sib v racemátu viz obr.6. Tab. 12. Vypočtené hodnoty rychlosti tvorby metabolitů Koncentrace rac-sib

Rychlost tvorby S-M1 [nmol.l-1.s-1]

Rychlost tvorby R-M1 [nmol.l-1.s-1]

[M]

a

b

c

a

b

c

10

1,2

1,3

1,4

1,0

1,0

1,1

20

2,5

2,6

2,6

1,8

1,9

1,9

50

5,7

6,5

5,7

3,6

4,1

3,6

100

9,7

9,1

10,4

5,0

4,7

5,4

200

12,4

14,0

13,2

5,8

6,6

6,2

300

15,6

16,7

16,3

7,2

7,7

7,6

500

16,4

18,7

17,4

7,2

8,2

7,7

Z uvedených hodnot rychlostí reakce byly lineární regresí dle Lineweavera a Burka použitím programu GraphPad Prism 4 získány kinetické konstanty sledované reakce uvedené v tab. 13. Tab. 13. Kinetické konstanty Km a Vmax metabolické přeměny rac-sib na S-, R-M1 Metabolit

Km ± S.D [mol/l]

Vmax ± S.D [nmol.l-1.s-1]

S-M1

140,5 ± 11,9

22,9 ± 0,7

R-M1

74,1 ± 6,5

8,9 ± 0,2

39

Rychlost reakce [nmol.l -1. s-1]

20

rychlost tvorby S-M1 rychlost tvorby R-M1

10

0 0

100 200 300 400 500 Koncentrace rac-sib [uM]

600

Obr. 6. Závislost rychlosti tvorby S-, R-M1 na koncentraci S-, R-sib v racemátu

5.5.3 Tvorba R-M1 při podání R-sib Pro tvorbu R-M1 z R-sib byly vypočteny hodnoty rychlosti tvorby uvedené v tab. 14. Z naměřených hodnot byl sestrojen graf závislosti rychlosti tvorby R-M1 na koncentraci R-sib viz obr.7. Tab. 14. Vypočtené hodnoty rychlosti tvorby metabolitu R-M1 Koncentrace R-sib

Rychlost tvorby R-M1 [nmol.l-1.s-1]

[M]

a

b

c

10

1,4

1,6

1,6

20

2,4

3,4

2,2

50

6,0

4,2

4,8

100

11,6

11,3

11,7

200

16,1

16,3

16,1

300

17,8

17,1

18,4

500

21,0

22,0

21,4

Z uvedených hodnot rychlostí reakce byly lineární regresí dle Lineweavera a Burka použitím programu GraphPad Prism 4 získány konstanty reakce viz tab.15.

40

Rychlost reakce [nmol.l -1.s-1]

Tab. 15. Kinetické konstanty Km a Vmax metabolické přeměny R-sib na R-M1 metabolit

Km ± S.D [mol/l]

Vmax ± S.D [nmol.l-1.s-1]

R-M1

177,9 ± 18,7

29,2 ± 1,3

25

rychlost tvorby R-M1

20 15 10 5 0 0

100

200

300

400

500

600

Koncentrace R-sib [M]

Obr. 7. Závislost rychlosti tvorby R-M1 na koncentraci R-sib

5.5.4 Tvorba S-M1 při podání S-sib Pro tvorbu S-M1 z S-sib byly vypočteny hodnoty rychlosti tvorby uvedené v tab. 16. Ze získaných hodnot byla sestrojena závislost rychlosti tvorby S-M1 na koncentraci S-sib viz obr. 8. Tab. 16. Vypočtené hodnoty rychlosti tvorby metabolitu S-M1 Rychlost tvorby S-M1 [nmol.l-1.s-1]

Koncentrace S-sib [M]

a

b

c

10

2,3

2,8

3,1

20

5,0

5,6

6,3

50

10,7

10,8

11,5

100

12,8

18,4

18,6

200

25,0

22,9

22,2

300

25,2

27,9

25,6

500

24,2

26,8

41

Z uvedených hodnot rychlostí reakce byly lineární regresí dle Lineweavera a Burka použitím programu GraphPad Prism 4 získány kinetické konstanty dané reakce uvedené v tab. 17.

Rychlost reakce [nmol.l -1.s-1]

Tab. 17. Kinetické konstanty Km a Vmax metabolismu S-sib na S-M1 Metabolit

Km ± S.D [mol/l]

Vmax ± S.D [nmol.l-1.s-1]

S-M1

93,4 ± 12,9

32,8 ± 1,6

30

rychlost tvorby S-M1

20

10

0 0

100

200

300

400

500

600

Koncentrace S-sib [M]

Obr. 8. Závislost rychlosti tvorby S-M1 na koncentraci S-sib

42

6 Diskuze Cílem této práce bylo porovnat biotransformaci jednotlivých enantiomerů sibutraminu s racemickou směsí s ohledem na tvorbu hlavního metabolitu M1. Sibutramin je v první fázi demethylován na M1 (desmethylsibutramin). Tato reakce je katalyzována isoenzymem 3A4 cytochromu P450 (Doležal a Votava 2001). Cytochromy P450 jsou lokalizovány na membránách hladkého endoplasmatického retikula, proto byla prováděna inkubace substrátů s mikrosomální jaterní frakcí. Předběžné

experimenty

sloužící

k optimalizaci

podmínek

byly

prováděny

s mikrosomální jaterní frakcí potkana, hlavní experimenty pro určení enzymověkinetických dat byly prováděny s mikrosomální jaterní frakcí člověka. Donorem redukčních ekvivalentů pro katalytický cyklus CYP450 je NADPH, který byl z tohoto důvodu použit jako koenzym. Pro určení rozsahu koncentrací substrátů vhodných pro hlavní experiment, byla provedena předběžná inkubace substrátu s potkaními mikrosomy. Na základě tohoto měření byl stanoven rozsah koncentrací nutný pro vyšetření průběhu závislosti rychlosti vzniku metabolitů na koncentraci substrátu. Při zvolených koncentracích byla zároveň splněna podmínka, že množství vzniklého produktu je daleko menší než množství substrátu v reakční směsi, nutná pro platnost rovnice Michaelise a Mentenové, která byla použita k matematickému vyhodnocení experimentálně získaných dat. Byly

porovnány

podmínky

extrakce

sibutraminu

a

jeho

metabolitů

z mikrosomální jaterní frakce potkana s rozpouštědlem použitým ve studii Chen se sp. (2003), kde byly tyto látky extrahovány z lidské plasmy do terc.-butyl etheru. Proto byly porovnány výtěžky extrakcí mezi tímto rozpouštědlem a ethylacetátem. Pro další práci byly vybrány podmínky extrakce, u kterých byly zjištěny nejvyšší výtěžky: ethylacetát s přídavkem konc. kyseliny octové. V literatuře (Ding se sp. 2003, Chen se sp. 2003) jsou uvedeny postupy využívající achirální separaci na reverzní fázi s polárním eluentem s UV- nebo MSdetekcí. Pro tuto práci musely být tyto metody modifikovány. Ve studii (Radhakrishna se sp. 2000) jsou popsány podmínky použití chirální stacionární fáze. Oba uvedené postupy v této studii (chirální i achirální separace sibutraminu a jeho metabolitů) byly modifikovány pro použití v této diplomové práci.

43

Analýzou

směsí

vzniklých

inkubací

jednotlivých

čistých

enantiomerů

sibutraminu, bylo potvrzeno, že nedochází k vzájemné konverzi těchto substrátů. Polohy píků R-, S-M1 byly vyhodnoceny analogicky k polohám R-, S-sib viz obr. 9. Před kvantitativním vyhodnocením analyzovaných směsí, byla ověřena linearita odezvy UV-detektoru v rozsahu koncentrací pro M1 uvedených v experimentální části s vypočteným korelačním koeficientem R2 = 0,9999. Na základě zjištěných hodnot koncentrací M1 v analyzovaných směsích po inkubaci, byla vypočtena rychlost tvorby příslušného metabolitu (podle vztahu uvedeného v teoretické části). Získané hodnoty rychlosti reakce byly využity pro stanovení kinetických parametrů (Km a Vmax) těchto reakcí a sestrojení grafu závislostí rychlosti tvorby M1 na koncentraci použitých substrátů (S-, R- a rac-sib) viz obr. 10. Při porovnání průběhu těchto závislostí a příslušných kinetických konstant viz tab. 18 je patrné, že oba enantiomery jsou metabolizovány rozdílně. Hodnoty Vmax pro tvorbu S-, R-, rac-M1 jsou přibližně stejné. Nejvyšší rychlostí běží metabolizace Sformy sibutraminu, o trochu pomaleji probíhá přeměna rac-sib. Nejpomaleji je metabolizována R-forma sibutraminu. Při porovnání rychlostí tvorby jednotlivých enantiomerů zjištěných analýzou rac-sibutraminu, je jasné, že S-sibutramin je metabolizován signifikantně rychleji (téměř třikrát) než jeho R-forma. Hodnoty Km jednotlivých reakcí se výrazně liší. Pro S-sib je hodnota Km zhruba poloviční než pro R-sib, z čehož vyplývá vyšší afinita enzymu (enzymů) k S-sib. Hodnota Km pro racemát je bližší hodnotě Km pro S-sib, což také svědčí o preferenci jednoho enantiomeru, a to S-sib. Zdánlivě nelogická situace nastává při porovnání hodnot Km jednotlivých enantiomerů vzniklých inkubací racemátu. Km pro tvorbu S-M1 je dvojnásobné oproti R-M1. Tato skutečnost může být vysvětlena výrazně vyšší rychlostí tvorby S-M1, což může způsobit i nárůst hodnoty Km. Je tedy patrné, že jsou jednotlivé enantiomery metabolizovány různě a můžeme se domnívat, že enzym (enzymy) mají vyšší afinitu k S-sib.

44

Tab. 18. Srovnání kinetických konstant Km a Vmax Substrát

Metabolit

Km ± S.D [mol/l]

rac-sib

rac-M1

115,0 ± 9,5

Vmax ± S.D [nmol.l-1.s-1] 31,5 ± 0,9

rac-sib

R-M1

74,1 ± 6,5

8,9 ± 0,2

rac-sib

S-M1

140,5 ± 11,9

22,9 ± 0,7

R-sib

R-M1

177,9 ± 18,7

29,2 ± 1,3

S-sib

S-M1

93,4 ± 12,9

32,8 ± 1,6

Z naměřených a následně vypočtených dat je tedy zřejmé, že S-sib je metabolizován přednostně a rychleji. Nabízí se tedy otázka, jaké důsledky bude mít rozdílný metabolismus těchto látek na jejich farmakologický účinek a zda by nebylo výhodnější podávat jen jeden enantiomer. Podle současných poznatků (Glick se sp. 2000, Link se sp. 2005) by bylo efektivnější podávat R-sib. V dalších studiích 1. fáze metabolismu sibutraminu by bylo přínosné objasnit, jaký enzym (enzymy) katalyzuje enantioselektivní přeměnu sibutraminu na opticky aktivní metabolity a studovat, zda by nebylo výhodnější podávat přímo tyto látky místo sibutraminu.

45

DAD1 A, Sig=223,4 Ref=360,100 (LINK\CHMO0044.D) mAU

a)

40

R-sib 8.029

30 20 10 0

4

5.401

0 2 DAD1 A, Sig=223,4 Ref=360,100 (LINK\CHMO0060.D) mAU

b)

50

6

8

10

min

6

8

10

min

10

min

S-sib

40 30 20 10 0 -10 0 2 DAD1 A, Sig=223,4 Ref=360,100 (LINK\C00S0030.D) mAU 50

4

c)

40 30

S-sib

10

R-sib 8.406

5.572

20

0

0

2

4

6

Obr. 9. Separace standardů, vodné roztoky (a) R-sibutraminu, (b) S-sibutraminu, (c) rac-sibutraminu

8

-1

Rychlost reakce [nmol.l .s ]

30

-1

rychlost tvorby S-M 1 z S-sib rychlost tvorby rac-M 1 z rac-sib

20

rychlost tvorby R-M 1 z R-sib rychlost tvorby S-M 1 z rac-sib rychlost tvorby R-M 1 z rac-sib 10

0

0

100

200

300

400

500

600

Koncentrace substrátu [ M]

Obr. 10. Graf závislosti rychlosti tvorby příslušného metabolitu M1 na koncentraci použitého substrátu (S-, R- a rac-sib) získaného inkubací substrátů s mikrosomy lidské jaterní tkáně

7 Závěr Po zpracování literárních poznatků a vyhodnocení získaných výsledků vyplynuly tyto závěry: Nejprve byly provedeny optimalizace podmínek extrakce sibutraminu z biologického materiálu, byl stanoven rozsah koncentrací substrátu pro sledování enzymové kinetiky dané reakce a sestrojena kalibrační přímka pro kvantifikaci metabolitu M1. Pro tyto účely byl sibutramin inkubován s mikrosomální jaterní frakcí potkana. Pro vlastní sledování průběhu metabolické přeměny sibutraminu na metabolit M1 byly k inkubaci substrátu použity mikrosomy lidské jaterní tkáně. Z výsledků těchto měření byly vypočítány kinetické parametry této metabolické přeměny (Km a Vmax) a byla sestrojena závislost rychlosti tvorby příslušného metabolitu M1 na podaném substrátu. Bylo zjištěno, že jednotlivé enantiomery substrátů jsou metabolizovány různě. Z experimentů vyplývá, že nejvyšší rychlostí probíhá tvorba S-M1 po podání čistého Ssib, při podání racemického substrátu je tvorba rac-M1 o trochu pomalejší a nejpomaleji probíhá přeměna R-formy. Na základě těchto skutečností je možné usoudit, že enzym (enzymy) metabolizující sibutramin nemají k oběma enantiomerům stejnou afinitu, což potvrzují i rozdílné hodnoty Km. Pokud je poskytnut pouze jeden enantiomer, probíhá metabolická přeměna v zásadě stejně, pokud jsou podány oba enantiomery současně, je patrné, že metabolizující enzym (enzymy) upřednostňují přeměnu S-formy před Rformou.

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 5-HT

serotonin (5-hydroxytryptamin)

AKR

aldo-ketoreduktasy

ATP

adenosintrifosfát

BMI

body mass index

Cmax

maximální plasmatická koncentrace

CoA

koenzym A

CYP450

cytochrom P450

EtAc

ethylacetát

FAD

flavinadenindinukleotid

FDA

Food and Drug Administration

FMO

flavinové monooxygenasy

HbA1c

glykovaný hemoglobin

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Km

Michaelisova konstanta

M1

desmethylsibutramin

M2

didesmethylsibutramin

M2-OH

hydroxy-derivát didesmethylsibutraminu

MDR

dehydrogenasy-reduktasy se středně dlouhým řetězcem

MS

hmotnostní spektroskopie

NA

noradrenalin

NADH

nikotinamidadenindinukleotid

NADPH

nikotinamidadenindinukleotidfosfát

NMDA

N-methyl-D-aspartát

PAPS

3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát

S.D.

standardní odchylka

SDR

dehydrogenasy-reduktasy s krátkým řetězcem

SULT

sulfotransferasy

tmax

biologický poločas

TME

terc.-butylmethyleter

UDP

uridindifosfát

UGT

UDP-glukuronyltransferasa 49

UV

UV spektroskopie

Vmax

maximální rychlost

50

LITERATURA  AISLP: SPC přípravku Meridia, Abbott GmbH and Co.KG. Wiesbaden, SRN 2004.  Derosa G., Cicero A.F., Murdolo G., Piccinni M. N. se sp.: Efficacy and safety comparative evaluation of orlistat and sibutramine treatment in hypertensive obese patients. (2005) Diabetes Obes. Metab. 7 (1): 47-55.  Dhileepkumar K., Zhengxu H., Wald S. A., Senanayake C. H.: First asymmetric synthesis of (R)-desmethylsibutramine. (2002) Tetrahedron Letters 25: 2331-2333.  Ding .L, Hao X., Huang X., Zhang S.: Simultaneous determination of sibutramine and its N-desmethyl metabolites in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Method and clinical applications. (2003) Analytica Chimica Acta 492 (1-2): 241-248.  Doležal T., Votava M.: Sibutraminum.(2001) Remedia 11: 239-244.  FDA : Informace o přípravku Meridia, Abbott Laboratories, North Chicago , USA 2004 (http://www.fda.gov/cder/foi/label/2001/20632s8s11LBL.pdf).  Gibson G. G., Skett P.: Introduction to drug metabolism. Nelson Thornes Publishers, Cheltenham, 3rd edition, 2001.  Glick S.D., Haskew R.E., Maisonneuve I.M., Carlson J.N., Jerussi T.P.: Enantioselective behavioral effects of sibutramine metabolites. (2000) Eur. J. Pharmacol. 397 (1): 93-102.  Harrison-Woolrych M., Clark D. W., Hill G.R., Rees M. I., Skinner J.R.: QT interval prolongation

associated

with

sibutramine

Pharmacol. 61(4): 464-9.

51

treatment.

(2006)

Br.

J.

Clin.

 Hind I. D., Mangham J. E., Ghani S. P.: Sibutramine pharmakokinetics in young and elderly healthy subjects. (1999) Eur. J. Clin. Pharmacol. 54 (11): 847-849.  Hung Y.J., Chen Y.C., Pei D., Kuo S.W., Hsieh C.H., Wu L.Y. se sp.: Sibutramine improves insulin sensitivity without alteration of serum adiponectin in obese subjects with Type 2 diabetes. (2005) Diabet. Med. 22 (8): 1024-30.  Hyndman D., Bauman D.R., Heredia V.V., Penning T.M.: The aldo-keto reductase superfamily homepage. (2003) Chem. Biol. Interact. 1 (143-144): 621-31.  Chen J., Lu W., Zhang Q.,Jiang X.: Determination of the active metabolite of sibutramine by liquid chromatography – electrospray ionization tandem mass spectrometry. (2003) Journal of Chromatography B 785, 197-203.  Jez J.M., Bennett M.J., Schlegel B.P., Lewis M., Penning T.M.: Comparative anatomy of the aldo-keto reductase superfamily. (1997) Biochem J. 15: 625-36.  Jordan J., Scholze J., Matiba B., Wirth A., Hauner H., Sharma A.M.: Influence of Sibutramine on blood pressure: evidence from placebo-controlled trials. (2005) Int. J. Obes. (Lond). 29 (5): 509-16.  Kallberg

Y.,

Oppermann

U.,

Jörnvall

H.,

Persson

B.:

Short-chain

dehydrogenase/reductase (SDR) relationships: A large family with eight clusters common to human, animal, and plant genomes. (2002) Protein Science 11: 636-641.  Kvasničková E.: Xenobiochemie. Karolinum, Praha, 1995.  Lean M.E.,: How does sibutramine work? (2001) Int. J. Obes. 25 (4): S8-S11.  Link M., Novotná R., Suchanová B., Skálová L., Wsól V., Szotaková B.: The stereoselective biotransformation of the anti-obesity drug sibutramine in rat liver microsomes and in primary cultures of rat hepatocytes. (2005) J. Pharm. Pharmacol. 57 (3): 405-10.

52

 Luque C.A., Rey J.A.: Sibutramine: a serotonin-norepinephrine reuptake-inhibitor for treatment of obesity. (1999) Ann. Pharmacother. 33: 968-78.  Luque C.A., Rey J.A.: The discovery and status of sibutramine as an anti-obesity drug. (2002) Eur. J. Pharmacol. 440: 119-128.  Luscombe G. P., Hopcroft R.H., Thomas P.C., Buckett W. R.: The contribution of metabolites to the rapid and potent down-regulation of rat cortical β-adrenoceptors by the putative antidepressant sibutramine hydrochloride. (1989) Neuropharmacology 28: 129-134.  Matsunaga T., Shintani S., Hara A.: Multiplicity of mammalian reductases for xenobiotic carbonyl compounds. (2006) Drug. Metab. Pharmacokinet. 21 (1): 1-18.  Nordling E., Jornvall H., Persson B.: Medium-chain dehydrogenases/reductases (MDR). Family characterizations including genome comparisons and active site modeling. (2002) Eur. J. Biochem. 269 (17): 4267-76.  Parkinson A.: Biotransformation of xenobiotics, The McGraw-Hill Companies, Inc., 2001.  Poston W.S., Foreyt J.P.: Sibutramine and the management of obesity. (2004) Expert. Opin. Pharmacother. 5 (3): 633-42.  Qun K. F., Senanayake C.H., Zhengxu H. se sp.: First preparation of enantiomerically pure sibutramine and its major metabolite, and determination of their absolute configuration by single crystal X-ray analysis. (1999) Tetrahedron: Asymmetry 10 (23): 4477-4480.  Radhakrishna T., Ch. Lakshmi Narayana, D. Sreenivas Rao, K. Vyas and G. Om Reddy: LC method for the determination of assay and purity of sibutramine hydrochloride and its enantiomers by chiral chromatography. (2000) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 22 (4): 627-639.

53

 Ryan D.H.: Clinical use of sibutramine. (2004) Drugs Today (Barc) 40 (1): 41-54.  Sari R., Balci M.K., Cakir M., Altunbas H., Karayalcin U.: Comparison of efficacy of sibutramine or orlistat versus their combination in obese women. (2004) Endocr. Res. 30 (2): 159-67.  Tankova T., Dakovska G., Lazarova M., Dakovska L., Kirilov G., Koev D.: Sibutramine in the treatment of obesity in type 2 diabetic patients and in nondiabetic subjects. (2004) Acta Diabetol. 41 (4): 146-53.  Voet D., Voetová J. G.: Biochemie, Victoria Publishing, a. s., Praha, 1995.  Wortley K.E., Heal D.J., Stanford S.C.: Modulation of sibutramine-induced increases in extracellular noradrenaline concentration in rat frontal cortex and hypothalamus by alpha2-adrenoceptors. (1999) Br. J. Pharmacol. 128 (3): 659-66.  Zhengxu H., Dhileepkumar K., Pflum D. se sp.: First practical synthesis of enantiomerically pure (R)- and (S)-desmethylsibutramine (DMS) and unambiguous determination of their absolute configuration by single-crystal X-ray analysis. (2002) Tetrahedron: Asymmetry 13 (2): 107-109.

54