1 Centrum biokatalýzy a biotransformací BIOTRANS Centra základního výzkumu – LC06010 Cíle projektu Vyvinout software (2007); Zavést techniky rekombinantní DNA (2008); Studovat ES komplexy (2009); Připravit knihovnu hydrolas (2009); Připravit knihovnu glykosidas (2009); Zorganizovat odborná a výuková setkání (2010)
Doba řešení 1.4.2006 - 31.12.2010 Řešitelská pracoviště
Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky - příjemce - koordinátor řešitelské pracoviště - Mikrobiologický ústav AV ČR
Křen Vladimír Prof. Ing. DrSc. - řešitel koordinátor
Masarykova univerzita v Brně - příjemce řešitelské pracoviště - Masarykova univerzita v Brně
Damborský Jiří Doc. Mgr. Ph.D. - řešitel
Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích - příjemce řešitelské pracoviště - Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích
Kutá Smatanová Ivana Mgr. PhD. - řešitel
Ústav systémové biologie a ekologie Akademie věd České republiky - příjemce řešitelské pracoviště - Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR
Ettrich Rüdiger Doc., RNDr. PhD. - řešitel
Termín zahájení činnosti Centra 1. 3. 2006
Postup plnění úkolů k 31.říjnu 2009: Materiál se předkládá Radě Centra – Praha 24. 11. 2009
2 Zpráva 2009 – MBÚ AV ČR Praha Studium bakteriální nitrilhydratasy a amidasy 1) Genové manipulace v chromosomu kmenů Rhodococcus erythropolis Technika manipulací v chromosomu Rhodococcus erythropolis (mutace, delece, inzerce), vyuţívající systém pozitivní selekce dvojité rekombinace a izolace modifikovaných kmenů bez vektorových sekvencí, byla v minulém období ověřena přípravou delecí a technikou klonování částí chromosomu (technika plasmid rescue). V dalších experimentech byly připraveny modifikované kmeny vloţením úseku DNA nesoucího promotor do zvoleného místa chromosomu R. erythropolis a současným provedením záměny (delece a inzerce) delšího úseku chromosomu. Tím byly umoţněny změny exprese a regulace genů pro metabolismus aromatických substrátů v R. erythropolis. Vzniklé kmeny jsou bezplazmidové a neobsahují ţádné cizorodé geny. Byly zjištěny rozdíly frekvence rekombinace u různých kmenů R. erythropolis. Kmen R. erythropolis CCM2595 je vhodný pro klonování s pouţitím plazmidů i chromosomu, zatímco kmen R. erythropolis A4 jen vhodný jen pro manipulace v chromosomu, vzhledem k velmi účinné rekombinaci plazmidových molekul. 2) Homologní a heterologní exprese genů pro nitrilhydratasu a amidasu Mapováním transkriptů bylo zjištěno, ţe geny ami (amidasa) a nha1+nha2 (nitrilhydratasa) jsou přepisovány do společného transkriptu. Technikou primer extension byl přesně stanoven transkripční start operonu ami-nha1-nha2 a identifikovány příslušné promotorové sekvence. Klíčové nukleotidové motivy promotoru P-ami v pozicích -35 a -10 jsou konformní s konsensus-sekvencemi dosud definovaných promotorů rhodokoků. U některých kmenů rhodokoků jsou geny ami a nha inducibilní, zatímco u jiných jsou exprimovány konstitutivně, přestoţe jejich sekvence se liší jen velmi málo. Měřením aktivity amidasy a nitrilhydratasy a kvantifikováním transkriptů za podmínek bez indukce a v přítomnosti předpokládaných induktorů (např. acetonitrilu) bylo prokázáno, ţe exprese genů metabolismu nitrilů a amidů je v kmeni R. erythropolis A4 konstitutivní. Gen pro amidasu byl klonován v expresním vektoru pEXT20 pro heterologní expresi v E. coli a pFEX16 pro homologní expresi v R. erythropolis. Geny ami a nha1+nha2 byly identifikovány i v kmeni R. erythropolis CCM2595, který je vhodný pro rutinní genové manipulace. Exprese genu pro amidasu, který je sekvenčně velmi podobný genu z kmene A4, však v tomto kmeni nebyla detegována. Pro snadnější manipulaci s genem pro amidasu byl připraven systém, v němţ neaktivní gen v kmeni R. erythropolis CCM2595 bude nahrazen homologním genem ami z kmene R. erythropolis A4. Studium fungálních nitrilas V heterologním hostiteli E. coli jsme exprimovali nitrilasy z rodů Aspergillus a Gibberella. Jedná se o první heterologně exprimované fungální nitrilasy. Heterologní exprese a charakterizace nitrilasy z Aspergillus niger Gen pro nitrilasu z Aspergillus niger K10 byl amplifikován z cDNA nativního producenta. Po optimalizaci exprese nitrilasy (na ca. 700 U/L) změnami kultivačního protokolu (koncentrace induktoru IPTG, čas indukce) jsme enzym purifikovali téměř do homogenity. Substrátová specifita rekombinantního enzymu byla odlišná ve srovnání s nativním enzymem – preferenčními substráty nativního enzymu byly 4-kyanopyridin (> 400 U/mg) a benzonitril
3 (90 U/mg), rekombinantního enzymu 2-kyanopyridin (ca. 10 U/mg). Rekombinantní enzym měl jen nízkou aktivitu k benzonitrilu (0.6 U/mg). Velikost podjednotky nitrilasy z A. niger byla metodou SDS-PAGE stanovena na ca. 43 kDa, tj. asi o 4 kDa více neţ u enzymu z nativního producenta. Rekombinantní enzym má tedy také sníţenou autokatalytickou schopnost odštěpovat C-koncový peptid – tato posttranslační úprava je předpokladem vzniku supermolekulárních struktur (trubic) s mol. hmotností přes 1 MDa, které se u rekombinantního enzymu tvoří jen v omezené míře, jak bylo potvrzeno elektronovou mikroskopií. Důvodem pro změněné katalytické vlastnosti můţe být odlišné skládání proteinu v heterologním hostiteli; koexprese chaperonů však neměla zatím na expresi této nitrilasy významnější vliv. Model fungální nitrilasy Sekvence nitrilasy z A. niger byla pouţita pro první model fungální nitrilasy, který byl konstruován na pracovišti Centra v Nových Hradech. Model (356 aminokyselin) byl vytvořen na základě její homologie s krystalizovanými proteiny rodiny nitrilas (s identitou aminokyselin 20-23 %). Vysoce konzervované elementy sekundární struktury umoţnily konstrukci modelu (Obr. 1A). Pomocí „dokování“ benzonitrilu do tohoto modelu bylo identifikováno místo s nejniţší vazebnou energií, které zahrnovalo triádu předpokládaných katalyticky aktivních aminokyselin Glu-Lys-Cys (Obr. 1B), coţ potvrzuje základní správnost A
B
C
Obr. 1 Model nitrilasy z Aspergillus niger (A – podjednotka, B- aktivní centrum (substrát benzonitril), C – oligomer)
modelu. Oligomerní struktura byla modelována na základě homologie s krystalizovanou myší nitrilasou-2 (dimer) a vyuţitím geometrických parametrů enzymu získaných elektronovou mikroskopií, které pomohly vytvořit návrh multimeru (spirály sloţené ze 16 podjednotek; Obr. 1C). C-terminální část proteinu se nachází v centru spirály a přístup k aktivnímu centru je umístěn na vnějším povrchu multimeru. Heterologní exprese nitrilasy z Gibberella moniliformis V případě nitrilasy z rodu Gibberella (anamorf – Fusarium) jsme postupovali metodou vyhledání genů hypotetických nitrilas v databasích, následné syntézy genu a jeho exprese v heterologním hostiteli. Expresí syntetického genu pro nitrilasu z Gibberella moniliformis v E. coli byl získán vysoký výtěţek enzymu (téměř 400 U/L). Navíc koexprese se chaperony GroES/EL (vybranými testováním různých typů komerčních chaperonů) dále zvýšila produkci enzymu aţ na více neţ 2000 U/L. Purifikovaný enzym měl vysokou specifickou aktivitu k benzonitrilu (52 U/mg) podobně jako nativní nitrilasy. Tyto výsledky podporují náš
4 předpoklad o funkci chaperonů při skládání nitrilas a pouţitelnosti tohoto postupu při jejich heterologní produkci. Hodnocení využitelnosti fungálních nitrilas v biokatalýze Testovali a srovnali jsme katalytické vlastnosti různých fungálních nitrilas z nativních i heterologních producentů (výše uvedené rekombinantní enzymy z A. niger a G. moniliformis, nativní nitrilasy z Fusarium solani, Penicillium multicolor a A. niger purifikované v předchozí etapě). Všechny tyto enzymy jsou aromatické nitrilasy. Vhodnými substráty jsou však vedle (hetero)aromatických substrátů zpravidla také nevětvené alifatické nitrily. Jednotlivé nitrilasy se mezi sebou liší hlavně v tendenci tvořit amid, v některých případech (nativní nitrilasa z A. niger) mohou být vyuţity místo nitrilhydratas k přípravě amidů, např. pikolinamidu z 2-kyanopyridinu (výhodou ve srovnání s nitrilhydratasami je vyšší teplotní stabilita). Naopak rekombinantní enzym z A. niger exprimovaný v E. coli nejeví výraznější tendenci k tvorbě vedlejšího produktu - amidu a můţe být tedy pouţit pro přípravu čistých karboxylových kyselin, např. kyseliny pikolinové z 2-kyanopyridinu. Některé z těchto nitrilas byly imobilizovány pomocí technologie CLEA a ve většině případů se stabilita enzymů zvýšila. V některých případech se takto rozšířil i rozsah pH nebo teplot vhodných pro funkci enzymů. Imobilizovaný enzym z F. solani byl pouţit pro kontinuální hydrolýzu 4kyanopyridinu na kyselinu isonikotinovou v laboratorním ultrafiltračním membránovém reaktoru. Studium glykosidas Nově izolované geny pro glykosidasy byly klonovány a sekvenovány a především sekvence -galaktosaminidasy a -galaktosidasy z A. niger poslouţí pro srovnání evolučních závislostí a téţ určení kritických míst pro vývoj jednotlivých aktivit. -NAcetylhexosaminidasa z T. flavus byla podrobena proteomické analýze a dále bude testována s modifikovanými substráty (6-aldehyd a 6-sulfát) pro vyuţití v syntéze imunoaktivních glykomimetik. Zásadním poznatkem je, ţe některé hexosaminidasy jsou schopné akceptovat značně modifikované substráty - kromě jiţ prokázaných aldehydu a kyseliny na C-6, ještě téţ sulfát a dále 4-deoxy a 4,5- substráty. Tyto poznatky byly predikovány pomocí molekulárního modelování na modelu hexosaminidasy z A. oryzae (R. Ettrich, N. Kulik). Dále byly připraveny 6-fosfáty hexosaminů a i u těch byla testována akceptace hexosaminidasami s positivním výsledkem. α-Galaktosaminidasa, která byla purifikována v předchozí části projektu byla vyuţita k syntetickým reakcím, zaloţeným na enzymově katalyzované kondenzaci Nacetylgalaktosaminu za vzniku α-N-acetylgalaktosaminidů (oligosacharidy a glykokonjugáty aminokyselin. Byla připravena serie nových glykokonjugátů, které byly spektrálně charakterizovány, v současnosti se připravuje publikace. Biotransformace flavonoidů Dále byla studována enzymová hydrolýza glykosidů flavonoidů pro získání některých biologicky aktivních a komerčně zajímavých glykosidů (např. štěpení rutinu na isoquercitrin). Enzymová příprava isoquercitrinu byla optimalizována a rozpracována ve čtvrtprovozním měřítku (30 l). Pro tyto objemy vyvinuty fermentační procedury přípravy enzymu a téţ separační a purifikační procedury a byla podána patentová přihláška. Dále byly vyvinuty dvě původní medody na diastereomerní diskriminaci silybinu, jedna pomocí glykosidas (viz. vyšlá publikace) a druhá pomocí lipas (publikace v přípravě, podána patentová přihláška). Obě tyto metody umoţní přípravu opticky aktivního silybinu
5 v multigramových mnoţstvím s moţností scale-up i do provozních podmínek, coţ má zásadní význam pro rozvoj dalšího výzkumu a aplikace této látky. Personální zajištění a vědecká výchova V r. 2009 nadále pracují na 100% pracovní úvazek v Centru LC06010 Ing. David Kubáč (PGS student, sepisuje disertační práci) a Ing. Petr Marhol – specialista na analytickou chemii a separační metody. Od 1. ledna byl přijat RNDr. David Biedermann, PhD. (organický chemik, biochemik) na 100 % úvazek po odchodu RNDr. Pavly Bojarové, PhD. na mateřskou dovolenou, dále Ing. Adam Pavlík na 100 % za Ing. Moniku Knoppovou, která ukončila PGS studium a Ing. Kristýna Slámová na místo Ing. Ondřeje Kaplana, který byl převeden na jinou práci v souvislosti s dokončováním PGS studia. Doktorandi: Ing. Kristýna Slámová (PGS - VŠCHT), Mgr. Anna Drozdová (PGS-UK), , Mgr. Alena Petříčková (PGS-UK), Ing. Jan Pavlík (PGS - VŠCHT), Olga Volkova (PGS-UK). Diplomanti a pregraduální studenti:, Kateřina Purchartová (UK), Klára Michálková (VŠCHT), Pavla Minksová (VŠCHT), Barbora Štěpánková (VŠCHT), Alţběta Davidová (VŠCHT), Michaela Novotná (VŠCHT), Daniela Gerstdorferová (VŠCHT), Ondřej Šveda (UK), Anna Rinágelová (VŠCHT), Zuzana Karásková (VŠCHT), Petra Kolářová (UK), Zuzana Jeţková (UK), a v rámci projektu „Otevřená věda“ studenti střední školy Ivan Kobelev a Monika Hasová (oba SPŠ Chemická). Na řešení úkolů Centra se podílejí téţ další pracovníci Laboratoře biotransformací Ing. Bronislava Uhnáková PhD, Ing. Lenka Weignerová, PhD a Ing. Anna Malandra (absolventka Univ. L´Aquila, It.), Ing. Karel Křenek, Dr. Radek Gaţák. V rámci tématik řešených v Centru byla v MBÚ v r. 2009 obhájeny tyto diplomové práce. Alena Petříčková: Biodegradace bromovaných aromatických látek (UK, školitelka: L. Martínková) Anna Drozdová: β-N-Acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae: produkce, purifikace a pouţití pro selektivní glykosylaci imunoaktivních látek. (UK, školitelka L. Weignerová) Klára Michálková: α-N-Acetylgalactosaminidasa z Aspergillus niger: Příprava enzymu , purifikace a pouţití (VŠCHT, školitelka L. Weignerová) Alţběta Davidová: Studium katalytických vlastností nitrilas z vláknitých hub z rodu Penicillium a Fusarium. (VŠCHT, školitelka: L. Martínková) Bakalářské práce Tereza Heringová: Mikrobiální degradace halogenovaných xenobiotik (VŠCHT, školitelka: L. Martínková) Daniela Gerstdorferová: Fungální α-L-rhamnosidasa - purifikace a charakterizace (VŠCHT, školitelka L. Weignerová) Rozvoj mezinárodních spoluprací: Evropské projekty Naše skupina pokračuje v práci na EU COST CM0602 projektu „Inhibitors of angiogenesis: design, synthesis and biological exploitation“ „Angiokem“ (2007-2011); 3.-4. dubna jsme na nasem pracovišti uspořádali dvoudenní workshop „Inhibitors of angiogenesis“, kterého se účastnilo celkem 31 účastníků, z toho 12 zahraničních (viz přiloţený program)..
6 Dále naše skupina pokračuje na spolupráci na COST projektu D34 “Molecular Targeting and Drug Design in Neurological and Bacterial Diseases” - v lednu pořádáme spolu s Prof. D. Haltrichem v Semmering (A) konferenci “Biocatalysis and Medicinal Chemistry: Crossroads and Synergies”, které se účastní celkem 64 účastníků a pozvání k plenárním přednáškám přijali význační odborníci jako M. Mihovilovic, Dan S. Tawfik, Don Hilvert a další. Pokračovala spolupráce Laboratoře biotransformací s ostatními účastníky akce ESF/COST CM0701(„Cascade chemoenzymatic processes...“). V pracovní skupině „Cascade reactions on the nitrile group“ jsme v tomto období spolupracovali hlavně s TU Graz (na konverzích aminonitrilů nitrilasami) a Univ. L´Aquila (na studiu stability nitrilas) a výsledkem byly společné publikace (viz níţe). V MBÚ byl 16.5.2009 uspořádán mezinárodní workshop uvedené prac. skupiny v rámci akce ESF/COST CM0701 (26 účastníků z 5 zemí; z toho 9 zahraničních hostů; 9 přednášek) – viz přiloţený program. Bilaterální projekty Pokračuje 3. rok bilaterální projekt s Italií (CNR Milano) „Enzymatic multistep modification of biologically active natural compounds” (návštěvy Sergio Riva, Mirko Fedrigo). Zahraniční hosté na pracovišti Na studijním pobytu v Laboratoři biotransformací je Ing. Anna Malandra, studentka PGS na Univ. L´Aquila, Itálie; od 1.7. do 31.12.2009). Vzhledem k tomu, ţe její domovské pracoviště (člen prac. skupiny akce COST CM0701) bylo na jaře tohoto roku postiţeno zemětřesením, bylo jí umoţněno pokračovat v disertační práci formou zmíněného studijního pobytu. Pobyt je financován převáţně ze zdrojů ESF-COST (jako „STSM, short-term scientific mission“) a částečně z finančních zdrojů laboratoře. Programem pobytu je testování vlastností fungálních nitrilas (substrátové specifity, reakčních podmínek, stability) a připravují se společné publikace na toto téma. Naše laboratoř byla přijata do dalšího evropského projektu, a to konkrétně COST CM0804 „Chemical Biology with Natural Products“ - kick-off meeting se koná na konci tohoto roku v Sieně. Předpokládáme, ţe zde budeme moci vyuţít naší expertisy v biotransformacích přírodních látek. V rámci studijních pobytů nebo námi pořádaných workshopů navštívili naše pracoviště následující zahraniční odborníci. Mirko Fedrigo (IT) Rajesh Agarwall (USA) Sergio Riva (IT) Nicola D´ANTONA (IT) Laura CANTARELLA (IT) Maria CANTARELLA (IT) Giovanni GAMBERA (IT) Linda G. OTTEN (NL) Sander van PELT (NL) Olga SOSEDOVA (D) Margit WINKLER (A) Bruno Botta (IT) Henryk Stepien (PL) Sandra Liekens (BE) Flavio Maina (FR)
7 Rosanna Dono (FR) Amiram Goldblum (IL) Jean-Louis Reymond (CH) Ruud van Deursen (CH) Rana Sanyal (TR) Charles Lambert (BE) Milan Remko (SK) Stáže našich pracovníků v zahraničí: Kateřina Purchartová 1. 10. - 14. 11. CNR Milano, Italie David Biedermann 28. 9. - 11. 10. Univ. of Liege, Belgie Kristýna Slámová 1. - 30. 4. Univ. of Aachen, Německo Stav financí: investiční prostředky nebyly pro letošní rok přiděleny mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem neinvestiční prostředky byly čerpány v souladu s návrhem, menší změny v čerpání jsou zdůvodněny Plán prací pro rok 2010: Zpracovat a vyhodnotit data a připravit publikace týkající se těchto témat: - exprese nitrilasy z A. niger v heterologním hostiteli (E. coli), studium katalytické aktivity, struktury a modelování tohoto enzymu - vliv kooexprese chaperonů na úroveň exprese a katalytické aktivity fungálních nitrilas v E. coli - exprese, purifikace, charakterizace a biokatalytické aplikace dalších fungálních nitrilas (z rodů Gibberella, Penicillium atd) z nativních a heterologních producentů - obhajovy 2 PhD prací (Kaplan, Kubáč) a prezentace na mezinárodních konferencích, V roce 2010 se budě pracoviště nadále podílet na výše uvedených akcích ESF COST a odborných a výukových aktivitách v jejich rámci (studijní pobyty (STSM) studentů a mladých pracovníků; setkání pracovních skupin). Dále se navrhuje nad rámec schváleného Cíle 007 (s ukončením k 31. 12. 2010) provést tyto experimentální práce, které povedou ke konsolidaci dříve získaných výsledků a jejich zhodnocení. 1. Purifikovat a charakterizovat rekombinantní nitrilasu z Gibberella moniliformis a srovnat její biochemické vlastnosti s vlastnostmi nitrilas z příbuzného rodu Fusarium (anamorf). 2. Exprimovat v E. coli, purifikovat a charakterizovat další fungální nitrilasy (z rodů Penicillium a Neurospora – u těchto rodů nebyly dosud ţádné nitrilasy charakterizovány). Srovnat vlastnosti enzymu exprimovaného ze syntetického genu (navrţeného podle sekvence z rodu Penicillium marneffei) s vlastnostmi enzymu purifikovaného z nativního producenta (Penicillium multicolor).
8 3. U výše uvedených fungálních nitrilas sledovat vliv koexprese chaperonů (bakteriálních, fungálních) na produkci a aktivitu enzymu. 4. Studium stability nitrilas a moţností jejího zvýšení přídavky různých osmolytů (proteinů, aminokyselin, sacharidů). 5. Studie směřující k řízené evoluci a racionálnímu návrhu mutantních nitrilas. Na základě nejnovějších literárních dat navrhnout takové mutace enzymů, které by vedly k ţádoucím změnám katalytických vlastností (specifická aktivita, selektivita, stabilita). Připravit mutantní enzymy a srovnat vliv genetických změn u fungálních nitrilas a arylacetonitrilas (publikovaná data). 6. Dokončení sekvenace hexosaminidasy z T. flavus, porovnání se dalšími sekvencemi a návrh mutačních zásahů přípravu odpovídající glykosynthasy. 7. Příprava substrátů hexosaminidas nesoucích fosfátovou a sulfátovou skupinu, studie substrátové specifity, modelování, syntetické aplikace. 8. Studie thiazolinových inhibitorů hexosaminidas na bázi 4-deoxy substrátů s cílem získání selektivních inhibitorů. 9. Diastereomerní enzymové separace flavonoidů skupiny silymarinu. 10. Konsolidace výsledků, dokončení publikací, obhajoby 2 PhD prací (Kaplan, Kubáč) prezentace na mezinárodních konferencích, závěrečná zpráva. Změny ve složení řešitelského týmu: V r. 2008 nedošlo k neplánovaným změnám v řešitelském týmu. Plánované změny jsou uvedeny výše. Publikace: 1. L. Weignerová, P. Simerská, V. Křen: α-Galactosidases and their applications in biotransformations. Biocat. Biotrans. 27 (2), 79-89 (2009). IF=1,17 2. B. Sauerzapfe, K. Křenek, J. Schmiedel, W.W. Wakarchuk, H. Pelantová, V. Křen, L. Elling: Chemo-enzymatic synthesis of poly-N-Acetyllactosamine (poly-LacNAc) structures and their characterization for galectin-mediated binding of ECM glycoproteins to biomaterial surfaces. Glycoconjugate J. 26, 141-159 (2009). IF=1,743 3. L. Martínková, B. Uhnáková, M. Pátek, J. Nešvera, V. Křen: Biodegradation potential of the genus Rhodococcus. Environ. Int. 35, 162-177 (2009). IF=3,516 4. K. J. Loft, P. Bojarová, K. Slámová, V. Křen, S. J. Williams: Synthesis of sulfated glucosaminides and use in studying the substrate specificity of sulfatases and fungal β-Nacetylhexosaminidases. ChemBioChem 10, 565-576 (2009). IF=3,322 5. P. Bojarová, V. Křen: Glycosidases: a key to tailored carbohydrates. Trends in Biotechnology. 27, 199-209 (2009). IF=6,624 6. P. Bojarová, K. Křenek, K. Wetjen, K. Adamiak, H. Pelantová, K. Bezouška, L. Elling, V. Křen: Synthesis of LacdiNAc-terminated glycoconjugates by mutant galactosyltransferase – way to new glycodrugs and materials. Glycobiology 19, 509-517 (2009). IF=4,446 7. M. Winkler, O. Kaplan, V. Vejvoda, N. Klempier, L. Martínková: Biocatalytic application of nitrilases from Fusarium solani O1 and Aspergillus niger K10. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 59, 243-247 (2009). IF=2,015
9 8. L. Martínková, V. Vejvoda, O. Kaplan, D. Kubáč, A. Malandra, M. Cantarella, K. Bezouška, V. Křen: Fungal nitrilases as biocatalysts: Recent developments. Biotechnol. Adv., 27, 661-670 (2009). IF=6,110 9. V. Křen, R. Gažák, K. Purchartová, P. Marhol, D. Biedermann, P. Sedmera: Chemoenzymatic preparative separation of silybin A and B. J.Mol. Catal. B: Enzymatic, 61, 247-251 (2009). IF=2,015 10. Malandra, M. Cantarella, O. Kaplan, V. Vejvoda, B. Uhnáková, B. Štěpánková, D. Kubáč, L. Martínková: Continuous hydrolysis of 4-cyanopyridine by nitrilases from Fusarium solani O1 and Aspergillus niger K10. Appl. Microbiol. Biotechnol., 85, 277284. IF=2,569
Kapitoly v knize: Weignerová L., Bojarová P., Křen V.: Glycosidases in synthesis. Carbohydrate chemistry. Chemical and Biological Approaches, RSC Publishing, Cambridge, UK, 35, 310-332 (2009). V. Křen, P. Bojarová: Glycosyl Azides – Novel Substrates for Enzymatic Transglycosylations. In Practical Methods in Biocatalysis and Biotransformations, (J. Whittall, P. Sutton, Eds.); Wiley-VCH: Weinheim, in press 2009. Martínková L.*, Pátek M., Veselá-Schlosserová A.B., Kaplan O., Uhnáková B., Nešvera J.: Catabolism of nitriles. V (Alvarez H.M., Steinbüchel A., ed.) Biology of Rhodococcus, Microbiology Monographs series, Springer Verlag, v tisku. Podané patentové přihlášky: V. Křen, R. Gažák, P. Marhol, D. Monti, S. Riva: Způsob výroby opticky čistých stereomerů silybinu A a silybinu B. PV 2009-687, 21. 10. 2009 V. Křen, L. Weignerová, P. Marhol, Způsob výroby quercetin-3-β-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy. PV 2009-720, 30. 10. 2009 Přednášky a postery: i. Kubáč D., Vejvoda V., Davidová A., Bhalla T.C., Martínková L.: Stabilization of nitrile transforming enzymes by immobilization in CLEAs. ProStab2009, 8th International Conference on Protein Stabilization, Graz (Austria), 14.-17.4.2009. Programme and Abstract Book, s. 64, poster 29. ii. Křen V., Weignerová L., Marhol P.: Processing of natural products with glycosidases, Cukrblik 2009, Brno (ČR), 16.4.2009. Book of abstracts: p.14, oral presentation. iii. Weignerová L., Marhol P., Gerstorferová D., Křen V.: Fungal α-L-rhamnosidase: Purification, characterization and its application, Cukrblik 2009, Brno (ČR), 16.4.2009. Book of abstracts: p.37, poster P17. iv. Křen V., Gaţák R., Bojarová P., Slámová K., Křenek K., Williams S.J.: Substrate engineering in β-N-acetylhexosaminidases, Cukrblik 2009, Brno (ČR), 16.4.2009. Book of abstracts: poster P18. v. Křen V., Gaţák R., Bojarová P., Slámová K., Křenek K., Williams S.J.: Substrate engineering in β-N-Acetylhexosaminidases, 8th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Ischia, Naples (Italy), 10.5.-13.5.2009. Book of abstracts: poster P 82.
10 vi. Weignerová L., Marhol P., Gerstorferová D., Křen V.: Fungal α-L-rhamnosidase: purification, characterization and its application, 8th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Ischia, Naples (Italy), 10.5.-13.5.2009. Book of abstracts: poster P 96. vii. Slámová K., Bojarová P., Gaţák R., Tramice A., Kulik N., Macková M., Křen V.: 4-deoxyN-acetylhexosaminidase are substrates of β-N-acetylhexosaminidase, 8th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Ischia, Naples (Italy), 10.5.-13.5.2009. Book of abstracts: poster P151. viii. Kaplan O., Martínková L., Bezouška K.: Heterologous expression of fungal nitrilases, COST Action CM0701 “CASCAT”, Praha (ČR), 16.5.2009. ix. Marhol P.: Monolitické kolony: rychlý a odolný pomocník v analytice (nejen) flavonoidů, Analytika ve farmaceutickém průmyslu 2009, Frymburk (ČR), 8.6.-9.6.2009. Přednáška. x. Křen V.: Výzkum přírodních látek v Centru biokatalýzy a biotransformací MBÚ AV ČR, Analytika ve farmaceutickém průmyslu 2009, Frymburk (ČR), 8.6.-9.6.2009. Přednáška. xi. Marhol P., Myjavcová R., Bednár P., Heinrich J., Ulrichová J., Šimánek V., Křen V.: Characterization of Anthocyanins and Pyranoanthocyanins in Lonicera caerulea L. Berries by HPLC-DAD-MS Analysis, 34th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, Dresden (Germany), 28.6.-2.7.2009. Book of abstracts: p. 83, poster MSN10-Th. xii. Davidová A., Kubáč D., Vejvoda V., Cantarella M., Martínková L.: Purification and characterization of a nitrilase from Penicillium multicolor CCF 2244, Biotrans 2009, 9th International Symposium on Biocatalysis, Bern (Švýcarsko), 5.7.-9.7.2009. Book of Abstracts: s. 26, poster 113. xiii. Martínková L., Kaplan O., Bezouška K., Benada O., Vejvoda V., Kubáč D., Křen V.: Potential of fungal nitrilases as biocatalysts, 34th FEBS Congress, Praha (ČR), 4.7.9.7.2009. Book of Abstracts: p. 284, poster P7-52. xiv. Křen V., Slámová K., Gaţák R., Bojarová P., Křenek K., Bezouška K.: Enzymes in the synthesis of new unique carbohydrate structures and their mimetics, 34th FEBS Congress, Praha (ČR), 4.7.-9.7.2009. Book of abstracts: p. 24, oral presentation IL3.3-5. xv. Slámová K., Bojarová P., Gaţák R., Tramice A., Kulik N., Macková M., Křen V.: Beta-NAcetylhexosaminidases accept 4-deoxy-N-acetylhexosaminides as substrates, 34th FEBS Congress, Praha (ČR), 4.7.-9.7.2009. Book of abstracts: p. 183, poster P3-27. xvi. Catelani G., D’Andrea F., Griselli A., Guazzelli L., Křen V.: Synthesis of β-D-Nacetylhexosaminyl-(1→4)-1-deoxynojirimycin disaccharides as potential activators of natural killer cells, EUROCARB 15, 15th European carbohydrate symposium, Vienna (Austria), 19.7.-24.7.2009. Book of abstracts: p. 216, poster PA 034. xvii. Křen V., Gaţák R., Bojarová P., Slámová K., Křenek K., Williams S.J.: Substrate promiscuity of β-N-acetylhexosaminidases: “How far can we go?!”, EUROCARB 15, 15th European carbohydrate symposium, Vienna (Austria), 19.7.-24.7.2009. Book of abstracts: p. 539, poster PC 123. xviii. Biedermann D., Weignerová L., Gaţák R., Křen V.: Silybin disulfate inhibits sulfatases, Vitamins, nutrition, diagnostics 2009, Brno (ČR), 31.8.-2.9.2009. Book of abstracts: p.184, poster P49. xix. Biedermann D., Weignerová L., Gaţák R., Křen V.: Synthesis and enzymatic cleavage of sulfated silybin derivatives, 13. Austrian Chemistry Days 2009, Vienna (Austria), 24.8.27.8.2009. Book of abstracts: OP-27.
11 xx. Marhol P., Myjavcová R., Bednář P., Ulrichová J., Šimánek V., Heinrich J., Křen V.: Anthocyanins and Pyranoanthocyanins in Lonicera caerulea L. Berries, IWA 2009, 5th International Workshop on Anthocyanins, Nagoya (Japan), 15.9.-18.9.2009. Book of abstracts: p. 41, oral presentation.. xxi. Biedermann D., Gaţák R., Lambert C., Křen V.: Synthesis and enzymatic cleavage of sulphated silybin derivatives, ANGIOKEM, 3rd Workshop, Favignana (Italy), 16.10.18.10.2009. Poster. xxii. Pátek M., Pavlík A., Kubáč D., Nešvera J.: Analysis of nitrile hydratase-amidase operon from Rhodococcus erythropolis. COST Action CM0701 „CASCAT“ Cascade reactions on the nitrile group, Prague May 16, 2009. xxiii. Pátek M.: Induction of phenol 2-monooxygenase and catechol 1,2-dioxygenase involved in phenol oxidation in Rhodococcus erythropolis. COST Action CM0701, Bern (Switzerland) July 5 – 7, 2009. xxiv. Pavlík A., Knoppová M., Volkova O., Kubáč D., Nešvera J., Martínková L., Pátek M.: Expression of the genes for conversions of aldoximes, nitriles and amides from Rhodococcus erythropolis A4. Biotrans 2009, Bern (Switzerland) 5-9 July 2009. xxv. Pátek M., Knoppová M., Volkova O., Pavlík A., Kubáč D., Nešvera J., Martínková L..: Organization, regulation and expression of nitrile degradation genes of Rhodococcus erythropolis. 14th European Congress on Biotechnology, Barcelona (Spain) 13-16 September 2009, New Biotechnology 25:S104, 2009 xxvi. Pavlík A., Volkova O., Knoppová M., Kaplan O., Nešvera J., Martínková L., Pátek M.: Transcription of the genes involved in aldoxime–nitrile–amide metabolic pathway in Rhodococcus erythropolis A4. RNA Club, Brno, 30.10. 2009, Abstract Book p. 21. xxvii. Pavlík A., Volkova O., Knoppová M., Nešvera J., Martínková L.:Exprese genů operonu pro konverzi aldoximů, nitrilů a amidů z Rhodococcus erythropolis A4, IX. Mezioborové setkání mladých biologů, biochemiků a chemiků, Devět skal 26.-29. 5. 2009, Chemické listy 103:446. Deponovaná sekvence: Kaplan O., Martínková L., Plíhal O., Bezouška K., Kavan D.: Nitrilase [Aspergillus niger]. GenBank: ABX75546.1
12 Zpráva 2009 – společné pracoviště ÚSBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady Postup plnění úkolů 2009: Předmětem výzkumné činnosti oddělení struktury a funkce proteinů, společné laboratoře Ústavu systémové biologie a ekologie Akademie věd ČR, v.v.i. a Ústavu fyzikální biologie Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích se sídlem v Nových Hradech, je vývoj a aplikace výpočetních metod, metod pro sledování změn v kvarterní struktuře ovlivňující enzymovou aktivitu, adaptace metod molekulární dynamiky a počítačového dokování pro předpověď katalytické aktivity enzymů a vývoj a zavedení nových nestandardních a pokročilých krystalizačních metod pro získání difraktujících krystalů enzymů pouţívaných v Centru. S tímto cílem jsou spojeny molekulárně biologické, biochemické a biomolekulární postupy vedoucí k získání definovaných a čistých vzorků proteinů vhodných pro krystalogenezi. Enzym DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064 patří do skupiny haloalkan dehalogenáz, které katalyzují hydrolýzu halogenovaných alkanů na příslušné alkoholy. Haloalkan dehalogenáza DhaA a její mutantní varianty mohou být pouţity k detoxikaci průmyslových polutantů, např. 1,2,3-trichloropropanu (TCP). Tři mutantní formy DhaA04, DhaA14 a DhaA15 byly připraveny z důvodu studia významu tunelů spojujících aktivní místo s okolním solventem. Všechny mutantní formy byly krystalizovány metodou difúze par v sedící kapce a následně byla naměřena difrakční data na synchrotronu DESY/EMBL (Hamburk, Německo) do vysokých rozlišení 1.30 Ǻ, 0.95 Å a 1.15 Å. V průběhu roku 2009 byly dorafinovány struktury všech tří mutantů DhaA04, DhaA14 a DhaA15 a byly deponovány v PDB. Nyní se dokončuje publikace obsahující detailní popis všech mutantních struktur a jejich porovnání. Z důvodu studia alkyl-enzymového meziproduktu při reakci DhaA13 s 1,2,3trichloropropanem a kumarinem byl připraven nový mutantní protein DhaA13 (DhaAH272F). Předpokládá se, ţe při reakci enzymu se substrátem vzniká kovalentní alkylenzymový meziprodukt, který nepodléhá další hydrolýze. Proto je DhaA13 mutant označován jako inaktivní, tedy dovoluje substrátu navázat se do aktivního místa za předpokladu, ţe další proměna substrátu není moţná. Byly zahájeny krystalizační experimenty s mutantní formou DhaA13 a zahájeny studie s navázanými substráty. Krystaly DhaA13 byly smáčeny se substrátem a naměřena kvalitní difrakční data. Struktury enzymu se substrátem jsou ve fázi upřesnění a budou dořešeny a deponovány nejpozději začátkem příštího roku. Projekt týkající se přípravy difraktujících monokrystalů membránového proteinu core komplexu fotosystému II izolovaného z hrachu setého (Pisum sativum) byl v letošním roce zaměřen na vylepšení purifikační strategie. Protoţe jsme schopni připravit krystaly tohoto fotosyntetického komplexu v měřitelné, ale nedifraktující kvalitě, zaměřili jsme se na přípravu proteinového komplexu pouţitím nových purifikačních protokolů. Paralelně byly zahájeny experimenty se stejným proteinovým komplexem izolovaným ze špenátu. Izolované BBY membrány budou dále zpracovány v Laboratoři krystalografických studií v Granadě, kde budou následně zahájeny krystalizační experimenty. Byly dokončeny krystalizační studie nového typu haloalkandehalogenázy DbeA izolované z Bradyrhizobium elkani USDA94. Tato haloalkandehalogenáza je podobná enzymu DbjA z Bradyrhizobium japonicum USDA110 (71% sequence identity), ale vykazuje
13 odlišné biochemické vlastnosti. K porozumění pozměněné aktivity a specifity enzymu DbeA, byla konstruována jeho mutantní verze DbeA1 obsahující unikátní sekvenci enzymu DbjA. Obě formy dehalogenázy - divoký typ DbeA a DbeA1, byly vykrystalizovány metodou difúze par v sedící kapce. Difrakční data byla naměřena do rozlišení 2.2 Å pro DbeA a DbeA1. Obě proteinové struktury se v současné době upřesňují. Bylo dokončeno studium apo a holo forem proteinu WrbA a výsledky publikovány v prestiţním časopise. Struktury slouţí k modelovacím studiím. Byly dokončeny proteolytické experimenty a zahájeny krystalizační experimenty uvedeného enzymu s různými substráty. Byly připraveny mutantní formy HsdR podjednotky bakteriálního restrikčního enzymu EcoR124I z E.coli., které by měly potvrdit souvislost mezi translokací a endonukleázovou aktivitou. Mutanty byly testovány in vitro, a to jejich ATPasovou i endonucleasovou aktivitou, a dále pomocí in vivo testu. Klíčový mutant K220R byl krystalizován a jeho struktura uloţena v PDB-databázi. Podařilo se nalézt začátek signalizační dráhy, přes kterou komunikují endonukleáza a translokáza uvnitř komplexu. V rámci tohoto projektu také pokračovala práce na rekombinantních proteinech rhsA, rhsB a Lhr, které se mohou podílet na mobilitě DNA fragmentu nesoucího geny pro restrikčně modifikační systém E.coli K12. Podařilo se vyřešit zásadní problémy na úrovni molekulární biologie a pokračuje optimalizace exprese. V oblasti výpočtů byly pouţívány GROMACS a YASARA pro širší spektrum substrátů i jiných ligandů a intenzivně se pracovalo na výpočtech komplexů substrátů a enzymů galaktosidázy, galaktosaminidázy a nitrilázy. V případě WrbA se pokračovalo screeningem substrátové databáze k nalezení optimálního substrátu, a výsledky ukzují na látky ze skupiny quinonů. V oblasti vývoje metodického postupu pro sledování aktivace proteinu změnami v kvartérní struktuře byla dokončena první etapa pozorování kooperativních efektů a změn kvartérní struktury pomocí metod molekulární dynamiky na modelových systémech hexamerického bakteriálního represoru argininového regulonu, a podařilo se vyřešit mechanismus allosterické vazby ligandů na c-terminální doméně represoru. Jde o první případ, v kterém se dá popsat negativní kooperativita pomocí symetrického MWC modelu a publikace je momentálně komunikována s Larrym Goldem, členem americké akademie věd , do časopisu PNAS. Dále byla metoda popsána v rukopisu kapitoly v kniţní řadě Methods in Enzymology a poslána do redakce. V případě tetrameru TRPA1 byly první výsledky publikovány, a pracuje se na mutantech, které mění distribuci nábojů v okolí gatu. Na enzymech z pracoviště v Brně byla dokončena první etapa projektu s cílem popisu vlivu různých solventů na enzymovou aktivitu dehalogenáz, a výsledky se momentálně vyhodnocují a konfrontují s experimentálními výsledky. FEBS komisi byl předloţen návrh projektu na uskutečnění 4. ročníku FEBS pokročilého kurzu „Advanced methods in macromolecular crystallization IV“, který by se měl konat v AUC na Nových Hradech od 25.6. 2010 do 2.7.2010. Akce pořádané v roce 2009: V době od 12. do 14.3.2009 se v AUC Nové Hrady uskutečnil jiţ sedmý ročník Setkání strukturních biologů s názvem „7th Discussions in Structural Molecular Biology“. Setkání se zúčastnilo 103 účastníků z českých a slovenských institucí.
14 Zahraniční styky –AUC Nové Hrady: Oddělení struktury a funkce proteinů v Nových Hradech aktivně spolupracuje s řadou významných zahraničních pracovišť zabývajících se biochemií, krystalogenezí, proteinovou krystalografií a strukturní bioinformatikou. Tyto spolupráce jsou aktivně rozvíjeny také v rámci Centra. Od roku 2002 spolupracujeme s Univerzitou v Princetonu (NJ, USA). Tato spolupráce se odehrává na úrovni vědecké – strukturní a proteolytické studie proteinů, a také na úrovni vzdělávací – díky projektu Kontakt ME640 (do roku konce 2006), Kontakt ME09016 (2009-2012) a také díky letním školám Schola ludus (od r. 2006) se kaţdoročně zúčastňují studenti z naší laboratoře a Laboratoře biochemie University v Princetonu výměnných 10-týdenních pobytů a pracují na vědeckých projektech. Do dnešní doby navštívilo AUC v Nových Hradech 15 studentů z Princetonu v celkové délce pobytu 14 měsíců a 5 našich studentů působilo na Univerzitě v Princetonu celkem 10 měsíců. Od roku 2003 spolupracujeme s Laboratoří krystalografických studií Univerzity (LEC) v Granadě (Španělsko) na výzkumu a způsobu aplikace pokročilých krystalizačních technik, které jsou rozvíjeny ve španělské laboratoři a v naší Laboratoři krystalogeneze a biomolekulární krystalografie jsou testovány na rozpustných i membránových proteinech. Od roku 1999 aktivně spolupracujeme s kolegy z Univerzity v Lübecku (Německo) (dříve působili na Ústavu molekulární biotechnologie v Jeně) při strukturních studiích a také organizování krystalizačních kurzů a FEBS Advanced kurzů, a také dlouhodobě s Univerzitou v Linci (Rakousko) a od r. 2005 s Univerzitou v Miláně (Itálie). V roce 2004 byla zahájena spolupráce s Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences (BRC) Szeged (Maďarsko). Za nejvýznamnější letošní návštěvu se dá povaţovat návštěva Prof. J. Carey z Princetonu, která v Nových Hradech byla 3 týdny v lednu a 5 týdnů v červenci a srpnu. V roce 2008 absolvovali studenti a postdoci centra v oddělení struktury a funkce proteinů v Nových Hradech tyto domácí/zahraniční stáţe: Milan Melicherčík (Prof. Jannette Carey, Princeton University, NJ, USA), 1 měsíc, Iryna Kishko (Prof. Jannette Carey, Princeton University, NJ, USA), 2 měsíce, Maryna Lahoda a Alena Stsiapanava (Doc. Jičí Damborský, Loschmidt laboratories MU Brno), 1 týden. Ekaterina Sviridova získala stipendium a mohla se zúčastnit EMBO / MAX-INF2 Practical Course: Structure determination in Macromolecular Crystallography, který se konal v Grenoblu (Francie) v době 15-19.6.2009. Změny ve složení řešitelského týmu: Babak Minofar získal institucionální úvazek na ÚSBE AV ČR a jeho místo v centru bylo obsazeno Magdou Sergejevovou. Nicméně pracuje plně dál na úkolech centra. Od září pracuje v oblasti molekulární biologie nový člen týmu na USBE, Mgr. Olga Ettrichová, která postupně převezme úkoly Mgr. Jaroslavy Kohoutové, která je od listopadu na mateřské dovolené. Její úvazek v rámci centra převezme do konce roku Mgr. Abdul Samad, který s ní spolupracoval a je schopen dokončit rozdělané projekty. Stav financí: pro rok 2009 nebyly investice plánovány mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem
15 neinvestiční prostředky jsou čerpány minimálně z 95% v souladu s návrhem Plán prací pro rok 2010 včetně odborných akcí: Zpracovat a vyhodnotit data a připravit publikace týkající se těchto témat: Pouţití alternativních krystalizačních technik vyvinutých v naší laboratoři a optimalizaci krystalizačních podmínek za účelem získat krystaly nových druhů proteinů v kvalitě a velikosti vhodné k difrakčním experimentům. Výsledky krystalizačních analýz budou vyhodnoceny, diskutovány a publikovány v průběhu následujícího roku. Výpočty komplexů substrátů a enzymů jako hexosaminidasy, galaktosidasy, galaktosaminidasy a dehalogenázy. Allosterická aktivace intaktního ArgRepressoru z e.coli. Mechanismus a reakční kinetika WrbA z e.coli. Souhra endonukleázové a ATPázové aktivity u EcoR124I z e.coli. obhajoby 6 PhD prací (Wolfová, Khabiri, Samad, Kohoutová, Prudniková, Kishko) a prezentace na mezinárodních konferencích, V roce 2010 se budě pracoviště nadále podílet na výše uvedených akcích letních škol, výměních pobytů a internshipů Princetonské univerzity, a odborných a výukových aktivitách v jejich rámci. FEBS komise schválila předloţený projekt na uskutečnění 4. ročníku FEBS praktického a přednáškového kurzu „Advanced methods in macromolecular crystallization IV“, kterého hlavním organizátorem je Ivana Kutá-Smatanová. Krystalizační kurz se bude konat v AUC na Nových Hradech od 25.6. do 2.7.2010. Dále se navrhuje nad rámec schváleného Cíle 7 (s ukončením k 31. 12. 2010) provést tyto experimentální práce, které povedou ke konsolidaci dříve získaných výsledků a jejich zhodnocení. 1) v aplikaci našich nejnovějších poznatků z krystalizace rozpustných a membránových proteinů na krystalizaci nových rozpustných a membránových proteinových komplexů pomocí standardních, pokročilých a alternativních technik, ve snaze získat monokrystaly proteinů v kvalitě vhodné k difrakčnímu měření, 2) pouţití nově vyvinutých GCB sad krystalizačních roztoků, které budou aplikovány konkrétně k studiu mutantních haloalkan dehalogenáz DhaA12, DhaA31, DhaA13 se substráty, DbeA a DbeA1 se substráty, nového Spur enzymu, membránových fotosyntetických komplexů a lipoproteinu (FrpD) izolovaného z Neisseria meningitidis, WrbA se substráty, HsdR podjednotky EcoA1 z e.coli, a mutantních HsdR podjednotek EcoR124I z e.coli. 3) Rozsáhly vypočty intaktního ArgRepressoru z e.coli. a jiných allosterických systémů jako CAP k ověření poznatků o symetrické allosterii podle MWC modelu pro připady záporné kooperace. 4) Vytvoření nového komplexního modelu pentamerických restrikčníchmodifikačních systémů Typu I na základě hodnocení experimentalních vysledků (bodové mutace a in vivo a in vitro testů) pro EcoR124I a EcoA1, a rozsáhlích vypočtů a simulací. Noví studenti: Noví studenti nebyli v letošním roce přijati.
16 Publikace 2009:
o Název publikace Martin Klvana; Martina Pavlova; Tana Koudelakova; Radka Chaloupkova; Pavel Dvorak; Alena Stsiapanava; Michal Kuty; Ivana Kuta-Smatanova; Jan Dohnalek; Petr Kulhanek; Rebecca C. Wade; Jiri Damborsky: Pathways and Mechanisms for Product Release in the Engineered Haloalkane Dehalogenases Explored using Classical and Random Acceleration Molecular Dynamics Simulations. J. Mol. Biol. 392, 1339-1356 (2009), doi:10.1016/j.jmb.2009.06.076
IF (2008) 4,146
Julie Wolfova, Ivana Kuta Smatanova, Jiri Brynda, Jeroen R. Mesters, Mikalai 2,233 Lapkouski, Michal Kuty, Antonino Natalello, Neal Chatterjee, Sy-Yeu Chern, Erin Ebbel, Angela Ricci, Rita Grandori, Rüdiger Ettrich, and Jannette Carey: Structural organization of WrbA in apo- and holo-protein crystals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1794, 1288-1298 (2009), doi: 10.1016/j.bbapap.2009.08.001. (The cover picture of this issue was selected from our paper) J. Wolfová, J. Brynda, J. R. Mesters, R. Ettrich, J. Carey, I. Kutá Smatanová: 0 Structural changes of tetrameric flavoprotein WrbA upon flavin binding. Materials Structure 16, 2a, k56-57 (2009). [abstract in paper format] Tatyana Prudnikova, Tomas Mozga, Pavlina Rezacova, Radka Chaloupkova, 0,645 Yukari Sato, Yuji Nagata, Jiri Brynda, Michal Kuty, Jiri Damborsky, and Ivana Kuta Smatanova: Crystallisation and preliminary X-ray analysis of a novel haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Acta Cryst. F65, 353-356 (2009). Mikalai Lapkouski, Santosh Panjikar, Pavel Janscak, Ivana Kuta Smatanova, 11,085 Jannette Carey, Rudiger Ettrich, Eva Csefalvay: Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I restriction-modification complex. Nature Structural & Molecular Biology 16(1), 94-5 (2009). Epub 2008 Dec 14. doi: 10.1038/nsmb.1523 J. Kohoutová, I. Kutá Smatanová, J. Brynda, M. Lapkouski, J. L. Revuelta, J. B. 0,645 Arellano, R. Ettrich: Crystallization and preliminary crystallographic characterization of the extrinsic PsbP protein of photosystem II from Spinacia oleracea. Acta Cryst. F65, 111-115 (2009). Palencar, Peter, Prudnikova, Tatyana), Vacha, Frantisek, Kuty, Michal The effects 2.02 of light-induced reduction of the photosystem II reaction center, JOURNAL OF MOLECULAR MODELING, Volume: 15 Issue: 8 Pages: 923-933 Harper, Kandice, Minofar, Babak, Sierra-Hernandez, M. Roxana, Casillas-Ituarte, 2.87 Nadia N., Roeselova, Martina, Allen, Heather C., Surface Residence and Uptake of Methyl Chloride and Methyl Alcohol at the Air/Water Interface Studied by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy and Molecular Dynamics, JOURNAL
17 OF PHYSICAL CHEMISTRY A
Volume: 113
Issue: 10 Pages: 2015-2024
Jan Benedikt, Abdul Samad, Rudiger Ettrich, Jan Teisinger, Viktorie Vlachova 4.89 (2009) Essential role for the putative S6 inner pore region in the activation gating of the human TRPA1 channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1793: 7. 1279-1288 Jul R Strawn, T Stockner, M Melichercik, L Jin, J Carey, R Ettrich Synergy of Book molecular dynamics and isothermal titration calorimetry in studies of allostery. series In: Methods in Enzymology, Biothermodynamics B Edited by:Michael L. Johnson, Jo M. Holt , Gary K. Ackers. In press R Strawn, M Melichercik, T Stockner, J Carey, R Ettrich: Concerted allosteric mechanism of hexameric E. coli arginine repressor exploits competition between L-arginine ligands and resident arginine residues., PNAS submitted
9.38
Přednášky: Rudiger Ettrich: Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I restriction-modification complex, 7th Discussions in Structural Molecular Biology, 2009, Nové Hrady, Czech Republic (invited plenary lecture) Rudiger Ettrich: Molecular mechanism of allostery in hexameric E. coli arginine repressor, Modeling interactiona in Biolomolecules IV, September 14-19 2009 at Hrubá Skála, Czech Republic (invited plenary lecture) Rudiger Ettrich: DNA translocation by type I restriction-modification enzymes, 7th International Life Science Meeting, Krems, Austria, Mai 2009 (invited plenary lecture) B. Minofar, Conference Talk, Molecular dynamics study of the effect of organic solvents on structure and activity of haloalkane dehalogenase, Modeling interactiona in Biolomolecules IV, September 14-19 2009 at Hrubá Skála, Czech Republic Rudiger Ettrich: Coupling of endonuclease and translocase functions in Type I restrictionmodification complexes, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA, 15.April 2009 (invited seminar talk, paid by NIDDK NIH) Rudiger Ettrich: Coupling of endonuclease and translocase functions in Type I restrictionmodification complexes, Jagellonian University, 3.11.2009, Krakow, Polsko (invited seminar talk, paid by Jagellonian University) Samad A., Benedikt J., Minofar B., Teisinger J., Stockner T., Vlachova V., Ettrich R.: Structural and functional study on vanilloid Structural and functional study on human TRPA1 receptor.11th International PhD EMBL Symposium on Puzzles in Biology, Putting the Pieces together, Heidelberg, Germany, 29-31 October 2009 (presented by AS) A. Stsiapanava, J.Dohnalek, M. Kuty, J. A. Gavira, T. Koudelakova, J. Damborsky and I. Kuta Smatanova: Structural changes of pathways in mutated DhaA proteins from
18 Rhodococcus rhodochrous. Materials Structure 16, 3a, h16 (2009). 12th Heart of Europe bioCrystallography Meeting (HEC12), Trest, Czech Republic Tatyana Prudnikova, Tomas Mozga, Pavlina Rezacova, Radka Chaloupkova, Yukari Sato, Michal Kuty, Tana Koudelakova, Yuji Nagata, Jiri Damborsky, Ivana Kuta Smatanova: Crystallization and structural analysis of a novel haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Materials Structure 16, 3a, h4 (2009). 12th Heart of Europe bio-Crystallography Meeting (HEC12), Trest, Czech Republic I. Kuta Smatanova, P. Rezacova, A. McPherson: How to perform vapour diffusion experiments: Hanging and sitting drops. ISBC2 Program, Abstract Book, Notebook 68 (2009). International School on Biological Crystallization 2nd Edition, Granada, Spain E. Sviridova, L. Bumba, P. Sebo and I. Kuta Smatanova: Crystallization study of the ironregulated outer membrane lipoprotein (FrpD) from Neisseria meningitidis. Materials Structure 16, 2a, k54-55 (2009). Colloquium of CSCA “Structure 2009”, Hluboká n/Vltavou, Czech Republic Kishko, I. Kutá Smatanová, J. Carey, R. Ettrich: Investigation of biochemical structure and functions of the E.coli protein WrbA. Materials Structure 16, 2a, k55 (2009). Colloquium of CSCA “Structure 2009”, Hluboká n/Vltavou, Czech Republic A. Stsiapanava, J. Dohnalek, M. Kuty, J. A. Gavira, T. Koudelakova, J. Damborsky and I. Kuta Smatanova: Structural characterization of the three DhaA mutants from Rhodococcus rhodochrous. Materials Structure 16, 2a, k58 (2009). Colloquium of CSCA “Structure 2009”, Hluboká n/Vltavou, Czech Republic J. Wolfová, J. Brynda, J. R. Mesters, R. Ettrich, J. Carey, I. Kutá Smatanová: Structural changes of tetrameric flavoprotein WrbA upon flavin binding. Materials Structure 16, 2a, k56-57 (2009). Colloquium of CSCA “Structure 2009”, Hluboká n/Vltavou, Czech Republic
Konferenční příspěvky publikovány ve vědeckých časopisech – prezentace formou posterů: Rebecca Strawn, Milan Melichercik, Michael Green, Thomas Stockner, Jannette Carey, Rudiger Ettrich: Allosteric Mechanism of Hexameric E. coli Arginine Repressor, Albany 2009 Conversation, Albany NY, USA, 16, June 16-20 2009 I.Kishko, B.Harish, R.Ettrich, J.Carey: Kinetic properties of WrbA, a novel flavodoxin-like protein. The 23rd Annual Gibbs Conference in Biothermodynamics, 3rd - 6th of October, Touch of Nature Conference Center Carbondale, Illinois, USA Vasilina Zayats, Abdul Samad, Rudiger Ettrich: STRUCTURE AND FUNCTIONS OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL A1: HOMOLOGY MODELLING. German Conference on Bioinformatics 2009 Halle (Saale), September 28-30, 2009, Martin Luther University Halle-Wittenberg. Milan Melicherčík, Rebecca Strawn, Thomas Stockner, Jannette Carey, Rüdiger Ettrich" Allosteric mechanism for hexameric E. coli arginine repressor based on competition between
19 resident arginine residues and L-arginine ligands, Modeling interactiona in Biolomolecules IV, Hrubá Skála, Czech republic, September 14-19 Abdul Samad, Jan Benedikt, Babak Minofar, Jan Teisinger, Thomas Stockner, Viktorie Vlachova, Rudiger Ettrich: Structural and functional study on vanilloid (TRPV1) and ankyrin (TRPA1) receptor. FEBS course on Sofia school of protein science 2009, Sofia, Bulgaria, September 20-26. Abdul Samad, Jan Benedikt, Babak Minofar, Jan Teisinger, Thomas Stockner, Viktorie Vlachova, Rudiger Ettrich. Structural and functional study on human TRPA1 receptor.11th International PhD EMBL Symposium on Puzzles in Biology, Putting the Pieces together, Heidelberg, Germany, October 29-31. T. Prudnikova, P. Rezacova, T. Mozga, J. Damborsky, M. Kuty, I. Kuta Smatanova: Structural analysis of a novel type of haloalkane dehalogenase DbeA and mutant DbeA1. 25ECM Abstracts s136-137 (2009). 25th European Crystallographic Meeting, Istanbul, Turecko T. Baikova, M. Lapkouski, I. Shevelev, P. Janscak, I. Kuta-Smatanova, J. Carey, M. Weiserova, R. Ettrich, E. Csefalvay: Coupling of endonuclease and translocase functions in EcoR124I. 25ECM Abstracts s135 (2009). 25th European Crystallographic Meeting, Istanbul, Turecko T. Prudnikova, T. Mozga, P. Rezacova, R. Chaloupkova, Y. Sato, Y. Nagata, J. Brynda, J. Damborsky, M. Kuty, Ivana Kuta Smatanova: Haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94 and its mutant DbeA1: Crystallization and preliminary Xray analysis. ISBC2 Program, Abstract Book, Notebook 132 (2009). International School on Biological Crystallization 2nd Edition, Granada, Spain J. Kohoutová, V. Kopecký Jr., M. Lapkouski, K. Hofbauerová, Ţ. Sovová, I. Kutá Smatanová, J.L. Revuelta, J.B. Arellano, R. Ettrich: Structural analysis of the spinach PsbP protein of PSII by X-ray crystallography, Raman spectroscopy and Bioinformatics. ISBC2 Program, Abstract Book, Notebook 128 (2009). International School on Biological Crystallization 2nd Edition, Granada, Spain E. Sviridova, L. Bumba, P. Sebo, I. Kuta Smatanova: Crystallization study of the ironregulated outer membrane lipoprotein (FrpD) from Neisseria meningitidis. ISBC2 Program, Abstract Book, Notebook 134 (2009). International School on Biological Crystallization 2nd Edition, Granada, Spain Rüdiger Ettrich, Mikalai Lapkouski, Santosh Panjikar, Pavel Janscak, Ivana Kuta Smatanova, Jannette Carey, Eva Csefalvay: Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I restiction-modification complex. Materials Structure 16, 1a, 3 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic Tatsiana Baikova, Ivana Kuta Smatanova, Eva Csefalvay: Preparation of HsdR subunit of EcoAI endonuclease. Materials Structure 16, 1a, 25 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic
20 Jaroslava Kohoutová, Vladimír Kopecký Jr., Mikalai Lapkouski, Kateřina Hofbauerová, Ţofie Sovová, Sergio González-Pérezc, Ivana Kutá Smatanová, José L. Revuelta, Juan B. Arellano, Rudiger Ettrich: Structural analysis of the extrinsic PsbP protein od PSII from Spinacea oleracea by X-ray crystallography, Raman spectroscopy and bioinformatics. Materials Structure 16, 1a, 32 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic Tomas Mozga, Tatyana Prudnikova, Radka Chaloupkova, Tana Koudelakova, Pavlina Rezacova, Yukari Sato, Eva Chovancova, Ivana Kuta Smatanova, Yuji Nagata and Jiri Damborsky: Structural and biochemical characterization of novel haloalkane dehalogenase BdeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Materials Structure 16, 1a, 37 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic K. Shamayeva, T. Prudnikova, J. A. Gavira, E. Pineda Molina, P. Rezacova, I. Hunalova, F. Vacha, M. Kuty, J. M. Garcia-Ruiz and I. Kuta Smatanova: Crystallization of photosystem II core complex of Pisum sativum. Materials Structure 16, 1a, 42-43 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic A. Stsiapanava, J. Dohnalek, M. Kuty, Jose A. Gavira, Tana Koudelakova, Jiri Damborsky and I. Kuta Smatanova: Crystallization and preliminary structure analysis of several DhaA mutants from Rhodococcus rhodochrous. Materials Structure 16, 1a, 44 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic Maryna Sviatlova, Monika Strakova, Radka Chaloupkova, Jiri Damborsky and Ivana Kuta Smatanova: Crystallization study of Rhodococcus rhodochrous mutant protein DhaA31. Materials Structure 16, 1a, 45 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic Ekaterina Sviridova, Ladislav Bumba, Peter Sebo, Ivana Kuta Smatanova: Crystallization study of the iron-regulated outer membrane lipoprotein (FrpD) from Neisseria meningitidis. Materials Structure 16, 1a, 46 (2009). 7th Discussions in Structural Molecular Biology, Nové Hrady, Czech Republic Struktury proteinů deponované do PDB-database: 2W74 MUTANT (K220R) OF THE HSDR SUBUNIT OF THE ECOR124I RESTRICTION ENZYME IN COMPLEX WITH ATP Authors Lapkouski, M., Csefalvay, E., Shevelev, I., Janscak, P., Kuta-Smatanova, I., Carey, J., Ettrich, R. 3G9X Structure of haloalkane dehalogenase DhaA14 mutant I135F from Rhodococcus rhodochrous Authors Gavira, J.A., Stsiapanava, A., Kuty, M., Lapkouski, M., Dohnalek, J., Kuta Smatanova, I. 3FBW Structure of Rhodococcus rhodochrous haloalkane dehalogenase DhaA mutant C176Y Authors Dohnalek, J., Stsiapanava, A., Gavira, J.A., Kuta Smatanova, I., Kuty, M. 3FWH Structure of haloalkane dehalogenase mutant Dha15 (I135F/C176Y) from Rhodococcus rhodochrous
21 Authors Gavira, J.A., Stsiapanava, A, Kuty, M., Dohnalek, J., Lapkouski, M., Kuta Smatanova, I
22 Zpráva 2009 – MU Brno Postup plnění úkolů 2009: Ve shodě s grantovým návrhem byly v roce 2010 izolovány a charakterizovány nové dehalogenásy. Zaměřili jsme se na členy podrodiny HLD-III. Enzymy DrbA a DmbC byly identifikovány fylogenetickou analýzou jako členové této podrodiny. Geny drbA a dmbC byly a klonovány do E. coli a purifikovány afinitní chromatografií. Enzymy vykazovaly novou specifitu a molekulární velikost. Dále byly rozvíjeny a zdokonalovány softwarové nástroje pro racionální design proteinů - počítačové programy umoţňující studium struktury a dynamiky komplikovaných proteinových struktur: (i) program CAVER pro počítání velikosti a průchodnosti tunelů v proteinových strukturách, (ii) program HOTSPOT WIZARD pro racionální design mutantů se změněnou substrátovou specifitou. Do programu CAVER byla implementována analýza dynamiky tunelů. V HOTSPOT WIZARDu bylo vylepšeno grafické rozhraní. U proteinu DhaA a jeho mutantů byla prostudována dynamika tunelů krystalografickou analýzou a počítačovým modelováním. Kromě dvou cest pozorovatelných v krystalových strukturách byly nalezeny další 3 alternativní cesty, spojující aktivní místo enzymu s okolním solventem. Molekulárně-dynamickými studiemi byl vysvětlen vliv mutací na vlastnosti a funkci těchto cest. V navazujícím projektu bude provedena analogická studie s proteinem LinB - projekt je ve fázi konstrukce a validace mutantů. Vliv mutací na strukturu a dynamiku tunelů bude studován transitními kinetikami a pokročilými modelovacími metodami. Krystalografická analýza mutantů bude provedena ve spolupráci se skupinou Dr. Ivy Kuté-Smatanové na SBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady v rámci spolupráce CBB. Akce pořádané v roce 2009: Členové týmu z MU se podíleli na organizaci Kongresu FEBS 2009. Stav financí: pro rok 2009 nebyly investice plánovány mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem neinvestiční prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem Plán prací pro rok 2010: Zpracovat a vyhodnotit data a připravit publikace a disertační práce týkající se těchto témat: - vývoj dehalogenas rezistentních k organickým solventům - exprese, purifikace a charakterizace halogenalkandehalogenasy DbeA z Bradyrhizobium japonicum - obhajoby PhD prací (Klvaňa, Mozga, Koudeláková, Chovancová) a prezentace na mezinárodních konferencích. V roce 2010 se budeme nadále podílet na akcích ESF-EUROCORES a odborných a výukových aktivitách; budeme organizovat setkání pracovních skupin. Dále se navrhuje nad rámec schváleného Cíle 7 (s ukončením k 31. 12. 2010) provést tyto experimentální a modelovací práce, které povedou ke konsolidaci dříve získaných výsledků a jejich zhodnocení.
23 1. Vliv organických rozpouštědel na strukturu a funkci dehalogenujících enzymů. Budou dokončeny konstrukce mutantů se zvýšenou odolností se solventy a tyto studovány pomocí počítačových simulací. 2. Bude dokončen virtuální screening halogenalkandehalogenas pomocí automatického dokovacího programu a nalezené ligandy budou testovány experimentálně. 3. Budou dokončeny charakterizace halogenalkandehalogenas nesoucích mutace v povrchových smyčkách.
Publikace: 1.
Klvaňa, M., Pavlová, M., Koudeláková, T., Chaloupková, R., Dvořák, P., Prokop, Z., Stsiapanava, A., Kutý, M., Kutá-Smatanová, I., Dohnálek, J., Kulhánek, P., Wade, R.C., Damborský, J., 2009: Pathways and Mechanisms for Product Release in the Engineered Haloalkane Dehalogenases Explored using Classical and Random Acceleration Molecular Dynamics Simulations. Journal of Molecular Biology 392: 13391356. IF = 4.146
2.
Pavlová, M., Klvaňa, M., Chaloupková, R., Banáš, P., Otyepka, M., Wade, R., Nagata, Y., Damborský, J., 2009: Redesigning Dehalogenase Access Tunnels as a Strategy for Degrading an Anthropogenic Substrate. Nature Chemical Biology 5: 727 - 733. IF= 14,612
3.
Jesenská, A., Monincová, M., Chrobáková, T., Hasan, K., Chaloupková, R., Prokop, Z., Geerlof, A., Damborský, J., 2009 Isolation and Biochemical Characterization of Haloalkane Dehalogenases DrbA and DmbC: Representatives of Novel Subfamily. Applied and Environmental Microbiology 75: 5157-5160. IF = 3,801
4.
Pavelka, A., Chovancová, E., Damborský, J., 2009: HotSpot Wizard: A Web Server for Identification of Hot Spots in Protein Engineering. Nucleic Acids Research 37: W376– W383. IF = 6,878
5.
Damborský, J., 2009: Editorial: Protein Design and Engineering for Biocatalysis Biotechnology Journal 4: 439.
6.
Damborský, J., Brezovský, J., 2009: Computational Tools for Designing and Engineering Biocatalysts. Current Opinion in Chemical Biology 13: 26-34. IF = 7,854
7.
Prudniková, T., Mozga, T., Řezáčová, P., Chaloupková, R., Sato, Y., Nagata, Y., Brynda, J., Kutý, M., Damborský, J., Kutá Smatanová, I., 2009: Crystallization and Preliminary X-ray Analysis of a Novel Haloalkane Dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Acta Crystallographica 65: 353-356. IF = 0,606
8.
Jesenská, A., Sýkora, J., Olżyńska, A., Brezovský, J., Zdráhal, Z., Damborský, J., Hof, M., 2009: Nanosecond Time-Dependent Stokes Shift at the Tunnel Mouth of Haloalkane Dehalogenases. Journal of the American Chemical Society 131: 494-501. IF = 8,091
Přednášky:
24 Koudeláková,T., Chaloupková R., Pavlová, M., Zimmer, R., Bornscheuer, U.T., and Damborský J.: Directed evolution of haloalkane dehalogenase towards higher activity in buffer containing dimethyl sulfoxide, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic (presented by TK). Fořtová, A., Sýkora, J., Olzyńska, A., Brezovský, J., Zdráhal, Z., Hof, M. and Damborský, J.: Study of water molecule dynamics at the tunnel openings of haloalkane dehalogenase, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic (presented by AF). Chaloupková R.: Thermodynamic analysis of the enantioselectivity of haloalkane dehalogenase DbjA and its variants DbjA(delta) DbjA(delta)+H139A towards brominated esters and beta-substituted bromoalkanes, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic (presented by RCH). Damborský J.: Engineering of tunnels in proteins with buried active sites, March 29 - April 03, 2009, Sant Feliu, Spain, (presented by JD). Brezovský, J., Prokop, Z., Sato, Y., Florián, J., Mozga, T., Chaloupková, R., Koudelaková, T. , Jeřábek, P., Natsume, R., Nagata, Y., Senda, T. and Damborský J.: Two Bases of Enantioselectivity in Haloalkan Dehalogenase DBJA, April 14-15, 2009, Brno, Czech Republic, (presented by JB). Koudeláková, T., Chovancová, E., Brezovský, J., Pavlová, M., Monincová, M.,Mozga, T., Fořtová, A., Hasan, K., Dvořák, P. , Jarkovský J. and Damborský J.: Quantitative Analyses of Substrate Specifity of Haloalkane Dehalogenase, April 14-15, 2009, Brno, Czech Republic, (presented by TK). Hasan, K., Fořtová, A., Chaloupková, R., Koudeláková, T., Prokop, Z., Nagata, Y. And Damborský J.: Haloalkane Dehalogenase from Agrobacterium Tumefaciens C58: Cloning, Expresion, Purification and Biochemical Characterization, April 14-15, 2009, Brno, Czech Republic, (presented by KH). Bidmanová, Š., Prokop, Z., Chaloupková, R. and Damborský J.: Fluorescence Fiber-optic Enzymatic Biosensor for Detection of Halogenated Compounds, April 14-15, 2009, Brno, Czech Republic, (presented by ŠB). Damborský J. and Sochor J.:Computer-Assisted Engineering of Biomolecules, April 20-22, 2009, Budmerice, Slovakia, (presented by JD). Fořtová, A., Sýkora, J., Olţinska, A., Brezovský, J., Zdráhal, Z., Hof M., a Damborský J.: Studium dynamiky molekul vody v ústí tunelu haloalkándehalogenáz, May 26-27, 2009, Devět Skal, Czech Republic, (presented by AF). Pavlová, M., Klvaňa, M., Prokop, Z., Chaloupková, R., Banáš, P., Otyepka, M., Wade, R.C., Nagata, Y. and Damborský J.: Construction of improved biocatalyst by engineering of the access tunnels: A new concept in enzyme engineering, July 5-9, 2009, Bern, Switzerland, (presented by MP). Damborský J.: Keyhole-Lock-Key Model: Engineering of Tunnels in Proteins with Buried Active Sites, August 24-27, 2009, Wien, Austria, (presented by JD). Damborský, J., Prokop, Z., Fořtová A.,, Chaloupková, R., Pavlová, M., Chovancová E, Brezovský, J., Klvaňa, M., Koudeláková, T., Mozga, T., Pavelka, A., Dvořák P.and Straková, M.: Engineering of biocatalysts with modified activity, specificity and stability by
25 modification of access tunnels, September 20-24, 2009, Groningen, The Netherlands, (presented by JD).
Postery:
Pavelka, A., Chovancová, E., Damborský, J.: HotSpot Wizard: a Web Server for the Identification of Mutagenesis Hot Spots in Enzyme Structures, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic, (presented by TP). Brezovský, J., Prokop, Z., Sato, Y., Florián, J., Mozga, T. , Chaloupková, R., Koudeláková, T., Jeřábek, P. , Natsume, R., Nagata, Y., Senda, T., and Damborský, J.: Modulation of Enantioselectivity in Haloalkane Dehalogenase DbjA by Engineering of a Surface Loop, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic, (presented by JB). Stsiapanava, A., J. Dohnálek, J., Kutý, M., Gavira, J.A., Koudelaková, T., Damborský, J., and Kutá Smatanová, I.: Crystallization and preliminary structure analysis of several DhaA mutants from Rhodococcus rhodochrous, March 12-14, 2009, Nové Hrady, Czech Republic, (presented by AS). Chaloupková R., Štěpánková V., Prokop Z. and Damborský J.: Effects of water-miscible solvents on structure, activity and stability of haloalkane dehalogenases, April 14-17, 2009, Gratz, Austria, (presented by RCH). Koudeláková, T., Chaloupková, R., Pavlová, M., Zimmer, C., Bornscheuer U.T.and Damborský J.: Directed evolution of the haloalkane dehalogenase towards higher activity in organic co-solvent, April 14-17, 2009, Gratz, Austria, (presented by TK). Dvořák, P., Pavlová, M., Klvaňa, M., Brezovský, J., Chaloupková, R., Prokop, Z. and Damborský, J.: Increasing the activity of haloalkane dehalogenase DhaA with non-natural anthropogenic substrate 1,2-dichloroethane using methods of focused directed evolution, September 20-24, 2009, Groningen, The Netherlands, (presented by PD).
