MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
ÚSTAV CHEMIE
Mastné kyseliny a možnosti jejich stanovení v rostlinném materiálu pomocí plynové chromatografie
Bakalářská práce Lukáš Romanský
Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Miroslava Bittová, Ph.D.
Brno 2011
Poděkování Chtěl bych poděkovat vedoucí své bakalářské práce Mgr. Miroslavě Bittové, Ph.D. za cenné rady a připomínky, odborné vedení, trpělivost a čas, který mi věnovala při zpracovávání této práce. Dále panu RNDr. Zbyňku Boháčkovi za opravu plynového chromatografu a rady s chromatografií spojené. Také bych chtěl poděkovat své rodině za psychickou a materiální podporu během mého studia.
Prohlašuji, že jsem práci vypracoval samostatně a vycházel výhradně z uvedené literatury.
V Brně dne . . . . . . . . . . . .
.......................
Romanský Lukáš
Abstrakt
Cílem této bakalářské práce bylo stanovení mastných kyselin v rostlinném extraktu pomocí plynové chromatografie s plamenově ionizačním detektorem. Teoretická část shrnuje instrumentaci plynové chromatografie a její využití při stanovení metylesterů mastných kyselin v reálných vzorcích. Praktická část popisuje přípravu metylesterů ze sušených semínek vinné révy a výběr vhodných podmínek pro jejich analýzu.
Abstract
The aim of this work was to determine the fatty acids in plant extracts by gas chromatography with flame ionization detector. The theoretical part summarizes the instrumentation of gas chromatography and its use in determination of fatty acid methyl esters in real samples. The practical part describes the preparation of methyl esters from the dried seeds of grapes and selection of appropriate conditions for their analysis.
Obsah: I. Teoretická část ……………………………….…………………………………………… 7 1. Plynová chromatografie …………….…….………………………………………….…… 7 1.2. Historie ………………………….............…………………………………….…….. 7 1.3. Instrumentace ……………………………………………………………………….. 8 1.3.1. Nosný plyn …………………………..……………………………………….. 9 1.3.2. Dávkovač …………………………..………………………………………… 9 1.3.3. Kolony……………………………….……………………..……………….. 10 1.3.4. Detektory ………………………………………………….……………..…. 12 1.3.5. Termostat …………………………………………………………………... 13 1.4. Popis chromatogramu a základní pojmy ...………………………………...………. 13 1.4.1. Vyhodnocení chromatogramu ……………………………………………… 14 2. Lipidy a mastné kyseliny ……….……….………………………………………………. 15 2.1. Dělení mastných kyselin ………………………………………………………….. 16 2.2. Získávání olejů z rostlin …………………………………………………………... 17 2.3.Možnosti využití mastných kyselin ……………………………………………….. 17 2.4. Analýza mastných kyselin pomocí plynové chromatografie……………………... 18 2.5. Derivatizace mastných kyselin a příprava na analýzu …………………………… 19 2.5.1. Typy extrakcí mastných kyselin ze vzorku ve formě metylesterů ..….……. 20 2.5.2. Srovnání metod přípravy metylesterů ..……………………………………. 22 II. Experimentální část …………..………….……………………………………………… 23 3. Chemikálie …………..…….…………………………………………………………….. 23 4. Instrumentace ………….………………………………………………………………… 24 5
5. Analýza metylesterů mastných kyselin ………………………………………………… 25 5.1. Kondicionace kolony …………………………………………………………... 25 5.2. Příprava roztoku standardu a vzorku pro analýzu …………………………….... 26 5.3. Úschova standardu a vzorku metylesterů..……………………………………… 27 5.4. Výběr podmínek pro analýzu metylesterů ……………………………………... 27 5.5. Analýza standardu a vybraného vzorku ………………………………………... 31 5.6. Úprava postupu esterifikace ……………………………………………………. 36 6. Závěr ……………………………………………………………………………………. 37 7. Použité zkratky …………………………………………………………………………. 38 8. Literatura ……………………………………………………………………………….. 39
6
I. Teoretická část
1.
Plynová chromatografie Chromatografie je v dnešní době třetí nejpoužívanější technikou v analytické chemii a to
pouze za vážením a měřením pH. Obecná definice chromatografie zní: „Fyzikální separační metoda, při níž jsou separované složky distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární (stacionární fáze, SF) zatímco druhá se pohybuje v daném směru (mobilní fáze, MF nebo eluent).“ IUPAC (1993) [1] Plynová chromatografie je významná separační metoda v analytické chemii těkavých látek. Výhodou této metody je její rychlost při separaci složitých směsí látek, ať už plynů či kapalin. To znamená, že stanovované látky mají dostatečný tlak syté páry, jsou tepelně stálé, mají relativní molekulovou hmotnost menší než 1000 a bod varu je menší než 400°C. Další výhodou je možnost použití malého množství vzorku potřebné pro analýzu. Metoda je nepoužitelná v případě separace makromolekul, organických a anorganických solí.[1-3]
1.1.
Historie Již v roce 1906 přišel ruský botanic Michail Semjonovič Cvět s novou separační
technikou a pojmenoval jí jako chromatografii (název zřejmě pochází ze dvou řeckých slov chroma = barva a graphein = psaní). „..metoda, při níž jsou různé komponenty směsi rozděleny na adsorpční koloně v průtočném systému, je chromatografická metoda.“[1] Moderní plynová analýza byla ovšem v podobě jak ji známe dnes představena angličany Archerem Johnem Porterem Martinem a Richardem Laurencem Millingtonem Syngem (Martin a Synge) v roce 1952, když pro separaci těkavých mastných kyselin použili plynovou chromatografii. Jako mobilní fáze byl použit dusík a stacionární fází byl silikonový olej. V polovině 20.stolení byla problémem analytické chemie analýza ropy, zejména tedy získání přesných informací o jejím složení, proto petrochemický průmysl přijal plynovou chromatografii. Plynová chromatografie se rovněž využila v dalších oblastech, zejména pro analýzu aminokyselin nebo steroidů v biochemii. Problém byl ovšem v omezené délce náplňové kolony a rozlišení separace mělo tudíž své hranice. Toto omezení bylo odstraněno s nástupem kapilární kolony, kterou původně navrhl a prezentoval A.J.P. Martin v roce 1956. Dalším 7
pokrokem bylo použití skleněné kapiláry, která byla ovšem křehká a další nevýhodou byla aktivita směrem k vysoce polárním analytům. Tyto problémy však byly do značné míry odstraněny používáním křemenné kolony, která již byly vysoce flexibilní, odolná a chemicky inertní, navenek potažená ochrannou vrstvou polyimidu. Ve vývoji detektorů pro plynovou chromatografii bylo jedním z největších úspěchů propojení plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) na přelomu 60. a 70. let 20.století. Díky strukturním informacím a selektivitě jež poskytovala tato kombinace analytických technik se stala metoda GC-MS nejúčinnější metodou pro analýzu složitých směsí. [1,4,5] 1.2.
Instrumentace Zařízení plynové chromatografie se skládá ze 3 základních částí, dávkovače (injektoru),
kolony a detektoru (Obr.č.1). Nástřik vzorku se provádí přes pryžové septum speciálními injekčními stříkačkami dle analyzované látky, to znamená buď plynotěsnými nebo klasickými. V dávkovači je umístěna skleněná vložka (liner), kde dochází vlivem vysoké teploty k odpaření vzorku a smísení s nosným plynem. Plynná forma analytu s nosným plynem prochází přes kolonu do detektoru. Detektorem protéká MF s obsahem analytu a reaguje na změnu složení prostřednictvím signálu, který je zaznamenáván a posléze vyhodnocen v závislosti na čase v chromatogramu. Výsledkem chromatografické separace je eluční křivka (pík). Velikost signálu závisí na druhu a koncentraci složek obsažených v mobilní fázi.[2,3,6]
Obr.č.:1 Schéma aparatury plynové chromatografie
8
1.2.1. Nosný plyn Funkcí nosného plynu je transport vzorku kolonou až do detektoru, proto se také nazývá mobilní fází. Nosný plyn musí být vůči vzorku a stacionární fázi inertní. Jako nosný plyn se používá vodík, helium, dusík, argon a oxid uhličitý, kde zdrojem těchto plynů jsou především tlakové lahve, ovšem používají se také generátory pracující na bázi molekulových sít. Plyn by měl před vstupem do injektoru procházet čistícím zařízením zachycujícím vlhkost a nečistoty, které by mohly vést k poškození stacionární fáze kolony. Každý z těchto plynů má jiné vlastnosti a tudíž má jiný vliv na účinnost separace. Při výběru nosného plynu záleží na detekčním systému a koloně, která má být pro separaci použita, dále také na toxicitě, bezpečnosti práce a ceně. Žádný nosný plyn nesmí obsahovat vodu a kyslík, mohlo by totiž dojít k poškození SF v koloně. Mezi nejčastěji používané plyny patří vodík, dusík a helium. Vodík má hlavní nevýhodu neboť je hořlavý a se vzduchem explozivní, ovšem v porovnání s dusíkem je jeho účinnost nesrovnatelně lepší díky jeho velké tepelné vodivosti a malé viskozitě. Díky těmto fyzikálním vlastnostem plynu se časy analýz mohou lišit až o desítky minut. Srovnatelnou dobu analýzy s vodíkem má pouze helium, které spojuje výhody vodíku a dusíku, ovšem je příliš drahé. Průtok nosného plynu chromatografem je ovlivňován regulátorem tlaku a teploty. Průtok musí být nastaven tak, aby došlo k co nejlepší separaci látek na koloně a došlo k co nejmenšímu rozšíření zón píku.[2,3,6,7]
1.2.2. Dávkovač Funkcí dávkovače (injektoru) je převedení vzorku do plynného stavu vlivem vysoké teploty, které probíhá ve skleněné vložce (lineru) (Obr.č.2) , vnesení zplyněného vzorku do nosného plynu a jeho promísení a následnému nanesení na začátek kolony v co nejužší zóně. Zařízení, které slouží pro nadávkování vzorku do dávkovače, závisí na skupenství vzorku. Pro plyny slouží plynotěsné stříkačky nebo dávkovací ventily s objemem do 1 ml. Pro kapaliny slouží stříkačky a automatické dávkovače s objemem 0,5 až 5 μ l . Dávkování může probíhat jak ručně, tak automatickými dávkovači. Existují 2 možnosti dávkování vzorku: -
Nad ústí kolony
-
Na kolonu (on-column) - dávkování s děličem toku (split injection) - dávkování bez děliče toku (splitless injection)
9
Metoda s dávkováním vzorku nad ústí kolony se používá především pro náplňové kolony a metoda dávkování na kolonu pro kapilární kolony. Metoda s děličem toku je vhodná pro analýzu velkého množství složek ve vzorku a na kolonu se dostane pouze určitá část (zhruba 0,1 - 10%) a zbylá část je odvedena ventilem (split valve) do odpadu. Dělič toku umožňuje tedy vést jen část vzorku na kolonu a poměr vzorku, který odejde do odpadu ku vzorku jdoucímu na kolonu, se nazývá rozdělovací poměr (splitovací poměr, split ratio). Metoda s děličem toku se hojně využívá v kvalitativní analýze za podmínek vysokého chromatografického rozlišení zón složek. Metoda bez děliče toku se používá pro zředěné vzorky při stopové analýze a na kolonu se dostane zhruba 80% z celého objemu vzorku, aby se zabránilo rozšiřování zóny (chvostování píků). Používá se spíše pro kvantitativní stanovení složek ve směsi látek, které se výrazně liší v bodech varu. Pro metodu bez děliče toku, se používá totéž zařízení jako s dělením toku, avšak odvod děliče je uzavřen.[2,3]
Obr.č.2.: Skleněná vložka (liner)
1.2.3. Kolony V kolonách dochází k samotné separaci vzorku. Účinnost kolony je závislá na několika faktorech, a to zejména na rychlosti toku nosného plynu, teplotě kolony a tloušťce stacionární fáze. Při používání kolony je nutná její údržba, zejména kondicionace, kdy před samotnou separací je umožněna interakce SF s MF a rozpouštědlem. Během kondicionace dochází k ustálení hladiny nulové linie a vymývání nečistot.
10
Dle konstrukce kolony se dělí na 2 základní typy: 1) Náplňové: Skleněné nebo kovové trubice (Al, Ni, nerezová ocel a dříve i Cu) naplněné sorbenty nebo nosiči pokrytými kapalnou fází. Délka náplňových kolon dosahuje až 5 metrů s vnitřním průměrem 2-6 mm. Mají vyšší kapacitu než kapilární kolony, proto se používají k separaci nízkovroucích a málo zadržovaných plynů, popřípadě je-li požadován větší objem stacionární fáze pro analýzu. Jako adsorbent (GSC – plyn-pevná látka) se používá silikagel, alumina, molekulová síta či porapaky (kopolymer styren-divinylbenzen), jako zakotvené fáze (GLC – plyn-kapalina) se používají polysiloxany, polyethylenglykoly, silikony nebo uhlovodíky (př. skvalan). Jako nosiče kapalné stacionární fáze se používají silikagely, křemelina nebo aktivovaná alumina. 2) Kapilární:
(Obr.č.3.)
Skleněné, plastové (z polyamidu nebo polyesteru), křemenné nebo
kovové trubice, které jako nosiče stacionární fáze využívají své vnitřní stěny. Dosahuje délek od 15 do 100 metrů o vnitřním průměru 100 – 700 μ m s vrstvou stacionární fáze 0,01 – 10 μ m . Jako stacionární fáze se nejčastěji používá dimetylpolysiloxan, fenyldimetylpolysiloxan, difenyldimetylpolysiloxan nebo fenylmetylpolysiloxan.
Obr.č.3.: Kapilární kolona
Kapilární kolony se dále dělí podle tloušťky vrstvy nosiče na vnitřní stěně kapiláry. - SCOT (Support-coated open tubular): vrstvička nosiče se zakotvenou kapalinou (1-5 μ m ) - WCOT (Wall-coated open tubular): tenký film kapalné fáze (0,01-1 μ m ) - PLOT (Porous-layer open tubular): vrstvička pevného sorbentu na vnitřní stěně (10 μ m ) [2,3,6,7]
11
1.2.4. Detektory Detektor je zařízení, které reaguje na změnu signálu při průtoku nosného plynu. Zaznamenává se signál vysílaný detektorem, který je výsledkem přítomnosti analytu v MF, v závislosti na čase. Výsledkem je potom registrovatelná forma signálu ve formě chromatogramu. Podle povahy signálu rozlišujeme detektory koncentrační (TCD, ECD, PID) a hmotnostní (FID, TID, FPD). Mezi důležité požadavky na detektory patří vysoká citlivost, velký lineární dynamický rozsah, stabilita a reprodukovatelnost signálu, nízký šum a rychlá odezva nezávislá na rychlosti toku mobilní fáze.
Plamenový ionizační detektor - FID (flame ionization detector) Je to univerzální detektor pro detekci organických sloučenin. Molekuly plynu jsou spalovány v kyslíko-vodíkovém plameni a vedou elektrický proud, který je detekován mezi dvěma elektrodami, anodou je kovová část hořáku a katodou je kovová síťka. Spálení organických sloučenin má za následek vznik iontů, které zvyšují vodivost plamene. Mez detekce FIDu je až 10-11 molů a lineární dynamický rozsah je až 107. Detektor je málo citlivý pro vzácné plyny, vodík, dusík, kyslík, chlor, amoniak, sulfan, vodu, oxid uhličitý a sirouhlík. Mezi další široce rozšířené detektory patří: Plamenový termoionizační detektor - TID (thermal ionization detector), Plamenový fotometrický detektor - FPD (flame photometric detector), Tepelně vodivostní detektor - TCD (termal conductivity detector), Detektor elektronového záchytu - ECD (electron capture detector), Fotoionizační detektor - PID (photoionization detector), Atomový emisní detektor AED (atomic emission detector), Chemiluminiscenční detektor - CLD (chemiluminiscence detector) Jak již bylo zmíněno, velký význam má spojení hmotnostní spektrometrie s plynovou chromatografií (GC-MS). Při této kombinaci metod jsou ionty analyzovány kvadrupólovým analyzátorem nebo iontovou pastí. [2,3,6,7]
12
1.2.5. Termostat Na termostatu je závislá rychlost separace složek na koloně, neboť vlivem teploty ji dokážeme upravovat. Zajišťuje ohřívání dávkovače, kolony i detektoru na požadovanou teplotu, aby se vzorek udržel v plynné fázi a na koloně probíhala separace v přiměřených časech, ale také jeho chlazení. Teplotní maxima i minima jsou rozdílná podle typu kolon, stanovení lze tedy provádět přibližně v rozmezí teplot od -70°C do 400°C. Termostat umožňuje vytvořit teplotní program pro gradientovou eluci (programovaná plynulá změna teploty), která je vhodná pro separaci směsi složek s velkým rozsahem bodů varu, nebo udržet konstantní teplotu během celé separace. [2,3,6,7] 1.3.
Popis chromatogramu a základní pojmy
tR - retenční čas složky zadržované v systému - [s, min] - kdy se složka pohybuje pomaleji než MF tM - retenční čas složky nezadržované v systému - [s, min] - kdy se složka pohybuje stejnou rychlostí jako MF, lze zjistit použitím vhodné inertní složky, která neinteraguje se SF. Je též nazýván jako mrtvý retenční čas (hold-up time)
Fm - objemová rychlost mobilní fáze - [cm3.s-1, ml.min-1, μl.min-1] – udává objem MF, který projde kolonou za jednotku času (průtoková rychlost) N - počet teoretických pater - odpovídají násobnému počtu ustavování rovnováhy ⎛ t ⎞ N = 5,545 ⋅ ⎜ R ⎟ ⎝ w1/2 ⎠
2
(1)
kde w1/ 2 je šířka píku na úrovni nulové linie, tR - retenční čas čím je tedy šířka eluční zóny užší, tím má separační systém větší počet teoretických pater (zvyšuje se počet opakovaně ustavovaných rovnováh) a účinnost separace je vyšší. Počet teoretických pater tedy může být jiný i pro stejnou kolonu například vlivem úpravy teplotního programu popřípadě úpravou průtokové rychlostí MF.
13
R – rozlišení (je mírou separace dvou sousedních píků)
R12 =
t R1 − t R 2 0,5 ( w1 + w2 )
(2)
tR - retenční čas w - šířka píku na úrovni nulové linie Vyšší hodnota R12 = lepší separace složek př.: (R12 = 1,0 - míra překrytí 2%) (R12 = 1,5 - míra překrytí 0,1%) [2,3,7]
1.3.1. Vyhodnocení chromatogramu Kvalitativní vyhodnocení jednotlivých píků vychází z elučních parametrů (jejich retenčních časů – tR) a to jejich vzájemným porovnáním se standardy za stejných podmínek separace. Kvantitativní vyhodnocování vychází z celkové plochy píku nad nulovou linií (základní), která je přímo úměrná celkové koncentraci. [2,3,7]
Obr.č.4.: Retenční charakteristiky
Pro převod šířky píku v polovině velikosti a na úrovni nulové linie se používá následující vztah:
w1/2 = 2,354σ w = 4σ
14
(3)
2.
Lipidy a mastné kyseliny Lipidy jsou přírodní látky, které se vyskytují jak v rostlinných, tak živočišných buňkách.
Představují různorodou skupinu látek, jejichž jednotícím elementem je přítomnost vyšších mastných kyselin a alkoholů. Příkladem lipidů jsou tuky, oleje, vosky, fosfolipidy, glykolipidy, sfingolipidy, lipoproteiny a v neposlední řadě mnohé vitamíny a hormony. Nejrozšířenější lipidy jsou živočišné tuky (například v másle nebo sádle) a rostlinné oleje (např.: slunečnicový, olivový). V obou těchto případech jde o triacyl deriváty glycerolu (triacylglyceroly), tedy také estery glycerolu se třemi karboxylovými kyselinami s dlouhým uhlíkatým řetězcem (glycerol je alkohol se třemi uhlíky nesoucími hydroxylové skupiny) (Obr.č.5). Zjednodušeně se jedná o estery vyšších karboxylových kyselin. Charakteristickou vlastností lipidů je jejich nerozpustnost ve vodě, ale rozpustnost v organických rozpouštědlech. Lipidy slouží jako zdroj živin a energie, mají také stavební a ochranou funkci.
Obr.č.5.: Obecná struktura lipidu
Mastné kyseliny (MK) jsou alifatické monokarboxylové kyseliny s obecným vzorcem R-COOH. V živočišných tucích převládají nasycené MK, kdežto v rostlinných olejích nenasycené MK. Téměř všechny nenasycené MK obsahují dvojné vazby s konfigurací cis. MK rostlinného i živočišného původu obecně obsahují sudý počet uhlíkových atomů ve svých nerozvětvených řetězcích, s karboxylovou kyselinou na jednou konci. Organismus má schopnost syntetizovat MK z acetylkoenzymu-A (Acetyl-CoA) postupným prodlužováním o dvou-uhlíkaté zbytky. Obecně se vyskytují hlavně jako estery v přírodních tucích a olejích nikoli volné.
15
MK se liší v délce řetězce, nejčastěji se vyskytují od 14 do 22 atomů uhlíku, ovšem příležitostně se mohou vyskytovat v rozmezí od 2 do 36 nebo dokonce výše. MK v živočišných tkáních mohou mít 1 až 6 dvojných vazeb. V přírodních tucích bylo identifikováno přes 100 různých MK a z toho jich je asi 40 velmi rozšířených. Bod tání MK se zvyšuje úměrně s délkou řetězce a snižuje stupněm nenasycenosti.[8-12]
2.1.
Dělení mastných kyselin 1. Nasycené MK (SFA - Saturated fatty acids)
Nejhojnějšími nasycenými MK ve tkáních živočichů a rostlin jsou rovné řetězce s 14, 16 a 18 atomy uhlíku. V esterifikované formě se vyskytuje celá řada MK s délkou řetězce s 2 až 36 atomy uhlíku. Kyselina palmitová (C16) a stearová (C18) jsou jedny z nejrozšířenějších nenasycených MK v přírodě. 2. Mononenasycené MK (MUFA - Mono-usaturated fatty acids) Obsahují MK s délkou řetězce nejčastěji s 10 až 30 atomy uhlíku a obsahují 1 dvojnou vazbu v poloze cis. Dvojná vazba může být v různých pozicích a podle pozice je uvedena ve svém názvosloví ve vztahu s karboxylovou skupinou. Nejhojněji je zastoupena kyselina olejová (C18). 3.
Polynenasycené MK (PUFA - Poly-unsaturated fatty acids)
Obsahují od 2 do maximálně 6 dvojných vazeb v poloze cis oddělených jednou metylovou skupinou. Kyselina linolová (C18) je nejvíce rozšířená MK tohoto typu.
Obr.č.6.: Základní strukturní typy MK
16
Rovněž se MK dělí na esenciální a neesenciální Jako esenciální MK jsou označovány ty, které si lidské tělo nedokáže samo vyrobit a tudíž musí být dodávány v potravě, neboť jsou potřebné pro zajištění úplné výživy. Esenciální MK pocházejí z rostlin, ty si je totiž dokáží vytvořit desaturací jiných MK. Nejznámější esenciální MK jsou linolová (je výchozím metabolitem pro řadu ω -6) a α -linolenová kyselina (je výchozím metobolitem pro ω -3 řadu)
(Obr.č.7)
. Z těchto 2 MK si již tělo dokáže pomocí
enzymů vytvořit další potřebné MK těchto řad. [8-9]
Obr.č.7.: esenciální MK
2.2.
Získávání olejů z rostlin Metodika získávání olejů z rostlin (semen, plodů a dužin rostlin) se provádí buď pomocí
vysokého tlaku tzv. lisováním nebo modernější extrakcí rozpouštědly, kdy se rozemletý rostlinný materiál smíchá s organickým rozpouštědlem a tuk z materiálu se „vymyje“. V dnešní době se nejčastěji používá kombinace těchto metod a výroba olejů se skládá ze 3 základních kroků zahrnující lisování, extrakci a následnou rafinaci. Rafinace je soubor technologických operací, při kterém se odstraňují z olejů netukové složky. [13,14] 2.3.
Možnosti využití mastných kyselin Je poměrně důležité vědět přesné zastoupení MK v rostlinách v oblasti výživy,
farmakologie a agronomie, zejména kvůli poměru ω -6 a ω -3 MK. V dnešní době se dostává do popředí zdravý životní styl včetně dobrého stravování, proto se některé studie zabývají složením MK v jednotlivých druzích rostlin a zjištění hladiny esenciálních MK v nich obsažených. V práci „Fatty acids profile of selected Artemisia plants: Health promotion“ vědci analyzovali 13 druhů pelyňku pomocí plynové chromatografie s použitím hmotnostního spektrometru jako detektoru pro možnost získání nového zdroje esenciálních MK. V této studii vychází z hypotézy, že ω -3 a
ω -6 MK musí být pro zajištění správné výživy v určitém poměru a cílem práce bylo vytvořit profil MK v několika druzích pelyňku, které by mohly být použity v lidské stravě. Pro úpravu 17
vzorku a převedení MK v těkavé estery využili jednokrokovou extrakci-metylaci, při níž vzorek listů zahřívali s 3M HCl v metanolu a vzniklé metylestery mastných kyselin (FAMEs, fatty acid methyl esters) extrahovaly do hexanu. Výsledkem práce bylo zjištění přítomnosti 8 MK v množství větším než 3,31 mg/g vzorku. Jednalo se o tyto MK: kyselina palmitová (C16:0), kyselina palmitová (C16:1), kyselina stearová (C18:0), kyselina olejová (C18:1), kyselina linolová (C18:2), kyselina linolenová (C18:3), kyselina arachidonová (C20: 0) a kyselina behenová (C22: 0). Tyto výsledky poukazují na to, že jisté druhy pelyňku obsahují příznivý poměr ω -3 a ω -6 MK a je možné je využít , pelyněk je obecně bohatý na MK ve srovnání s jinou listovou zeleninou jako je například špenát (1,7 mg.g-1), salát (0,6 mg.g-1) a nebo hořčice (1,1 mg.g-1). [15] Práce A.Bokoglu[16] se také týká stanovení MK v rostlinných extraktech, a to se zaměřením na 5 různých druhů rostlin rodu tolice, čeledi bobovitých. V těchto rostlinách byla prokázána vysoká koncentrace nenasycených MK linolové a linolenové a menší podíl nasycených MK palmitové a olejové. Nejen v rostlinných materiálech jsou MK identifikovány. V práci od B.Bicalho[17] byla provedena identifikace MK převedením na FAMEs v lidské krvi pomocí GC-MS. Další využití MK a jejich derivátu je v petrochemickém průmyslu. Vyčerpáváním zásob fosilních paliv a nejistota v jejich dostupnosti vyvolává zájem o alternativní zdroje energie, které by je mohly nahradit nebo doplnit. Jako ropné palivo se v dnešní době používá také bionafta. Jako bionafta jsou označovány nízkomolekulární estery vyšších MK, především FAMEs. Surovinou pro výrobu bionafty jsou olejnaté plodiny, tedy obnovitelné zdroje. Rovněž je netoxická a biologicky odbouratelná. Ovšem jednou její nevýhodou je, že při styku s vodou vznikají z bionafty MK, které mohou způsobit korozi palivového systému. [18,19]
2.4.
Analýza mastných kyselin pomocí plynové chromatografie Příprava metylester derivátů MK (FAMEs) patří mezi nejběžnější postupy pro stanovení
plynovou chromatografií. Než mohou být MK analyzovány pomocí GC, je nutné je převést na nízkomolekulární nepolární deriváty jako jsou například výše zmíněné metylestery.
18
Klasické stanovení složení MK se provádí ve 3 krocích : - lipidy ze vzorku se extrahují rozpouštědlem - izolované lipidy jsou esterifikovány / transesterifikovány do formy FAMEs - FAMEs jsou analyzovány pomocí GC Pro tyto 3 kroky jsou použity různé metody, ale ne všechny jsou vhodné pro rostlinné materiály (lipidové složení fotosyntetické tkáně se výrazně liší od ostatních zdrojů, kde rozpouštědlo musí nejen rozpustit polární lipidy, ale musí překonat interakci mezi lipidy a tkání matrice). Rozdíl je také v přítomnosti polárních skupin, kde lipidy s polárními skupinami jsou slabě rozpustné v rozpouštědlech jako hexan, toluen nebo cyklohexan, ale jsou extrahovatelné pouze silně polárním rozpouštědlem jakým je ethanol nebo metanol. Bylo prokázáno, že kombinací středně polárního chloroformu a polárního metanolu (2:1, v/v) lze extrahovat polární i nepolární deriváty lipidu z různých druhů tkání ve větší míře než většinou jiných rozpouštědel. Spojení hexan/isopropanol je velmi vhodnou kombinací rozpouštědel pro analýzu lipidů z mozkové tkáně nebo výrobků ze sušeného mléka, je ovšem nevhodné pro rostlinné tkáně, což vyplývá ze skutečnosti, že hexan je nevhodný pro membránově vázané polární lipidy. Ethanol či metanol se zdá být dobrým rozpouštědlem pro membránově připojené lipidy v tkáních rostlin a v důsledku toho, se při stanovení v rostlinných extraktech MK převádí právě na metylestery. [9],[20]
2.5.
Derivatizace mastných kyselin a příprava na analýzu Příprava výše zmíněných nepolárních derivátů metylesterů vyžaduje procesní kroky,
které mohou zahrnovat extrakci, hydrolýzu, metylaci, esterifikaci, apod. Při stanovení je vhodné maskovat jiné polární funkční skupiny nebo připravit konkrétní deriváty jako podporu k identifikaci. Proto je důležité vybrání vhodného rozpouštědla a dále je nutno zvážit, jaká metoda by měla být použita. Vzhledem k vysoké citlivosti chromatografických analýz je potřeba pouze malého množství vzorku, obvykle stačí méně než 1 mg. Péče by měla být věnována při odpařování zvoleného rozpouštědla pro estery s uhlíkovým řetězcem C14 a méně, neboť mohou být ztraceny. Mastné kyseliny s nejkratšími řetězci jako například kyselinu máselnou je nemožné získat kvantitativně. [9]
19
2.5.1. Typy extrakcí mastných kyselin ze vzorku ve formě metylesterů Existuje několik způsobů přípravy těchto metylesterů. Mezi nejzákladnější patří kysele a bazicky katalyzované esterifikace, ovšem existuje řada způsobů jak připravit požadované metylestery popřípadě jiné nízkomolekulární nepolární deriváty MK. 1. Kysele katalyzované esterifikace: Volné MK jsou esterifikovány zahříváním v přebytku bezvodého metanolu v přítomnosti kyselých katalyzátorů. Přítomnost vody může zabránit úplné reakci. Nejčastějším činidlem je 5% bezvodá kyselina chlorovodíková v metanolu, která je nejčastěji připravována probubláváním suchého metanolu chlorovodíkem. S 1-2% roztokem koncentrované H2SO4 v metanolu probíhá esterifikace stejným způsobem. Obvykle se vzorek lipidů s činidlem zahřívá zhruba 2 hodiny pod zpětným chladičem. Mezi další katalyzátory patří BF3 v metanolu (12-14% roztok) zvláště jako rychlý prostředek esterifikujících volných MK. Při nedbalém používání činidel, například při použití příliš starých nebo příliš koncentrovaných roztoků, může dojít k rozkladu či ke značné ztrátě polynenasycených MK. Nepolární lipidy, jako estery cholesterolu nebo triacylglycerolů, nejsou rozpustné v činidlech složených převážně z metanolu v rozumných časech, pokud není přidáno další rozpouštědlo k výslednému roztoku. Pro tyto účely byl kdysi používán benzen, ovšem kvůli jeho vysoké toxicitě je vhodnější použít jiné rozpouštědlo jako toluen nebo THF (tetrahydrofuran). Vzniklé FAMEs jsou po samotné esterifikaci vytřepávány do organického rozpouštědla jakým je hexan nebo heptan, a tato směs je vysušena bezvodým síranem sodným. Případný přebytek rozpouštědla může být odstraněn za sníženého tlaku na rotační vakuové odparce nebo odpařením rozpouštědla v proudu dusíku či helia. [9]
[21]
Obr.č.8.: Kysele katalyzovaná esterifikace
Kde R1COOH představuje MK, R2-OH alkohol (nejčastěji metanol).
20
2. Bazicky katalyzované esterifikace Lipidy jsou esterifikovány velmi rychle v bezvodém metanolu v přítomnosti bazického katalyzátoru. Nejběžnějším činidlem bazicky katalyzovaných reakcí je roztok metoxidu sodného v bezvodém metanolu (0,5 M), který se připravuje rozpuštěním čistého sodíku v suchém metanolu. Mezi další používaná činidla patří metoxid draselný nebo hydroxid draselný či hydroxid sodný v metanolu. FAMEs jsou stejně jako v případě kysele katalyzovaných reakcí extrahovány do hexanu či heptanu. Oddělená hexanová vrstva je následně sušena bezvodým síranem sodným. Podobně jako u kysele katalyzovaných esterifikací je nutné pro rozpuštění nepolárních lipidů jakými jsou estery cholesterolu přidat další rozpouštědlo, jakým je opět například THF. Ovšem pokud ve vzorku nejsou obsaženy, není to nutné. [9] Bazicky katalyzovaná reakce probíhá tak, že MK napřed odštěpí proton za vzniku vody: − H 2O RCOOH + NaOH ⎯⎯⎯ → RCOO − + Na + CH 3OH RCOO − + Na + ⎯⎯⎯→ NaOH + RCOOCH 3
Obr.č.9.: Bazicky katalyzovaná esterifikace
3. Diazometan jako činidlo Diazometan reaguje rychle s neesterifikovanými MK již v přítomnosti malého množství metanolu, který katalyzuje reakci k formě metylesterů. Roztok diazometanu je stabilní pouze po krátkou dobu. Nevýhodou je vysoká toxicita diazometanu, karcinogenita a potencionální explozivita a během přípravy vznikající meziprodukt nitrosamin, který je nejsilnějším známým karcinogenem. Při práci s diazometanem již není vhodné používat další činidla. [9] 4. Speciální případy Mezi speciální případy derivatizace patří MK s krátkými řetězci. Ty mohou být esterifikovány pomocí postupů uvedených výše, ale kvantitativní využití esterů z reakčního prostředí může být velmi obtížné vzhledem k jejich vysoké těkavosti a částečné rozpustnosti ve vodě. Nejvhodnější metoda neobsahuje extrakci s vodou, krok odstranění rozpouštědla a krok při kterém dochází k zahřívání reagentů. Pro tyto MK se používá metoda navržená Christophersonem a Glassem, která obsahuje pouze rozpuštění vzorku tuku v hexanu, přidání 0,5 M metanolátu sodného v metanolu, přidání kyseliny octové a práškového bezvodého chloridu vápenatého. [9]
21
Mezi speciální metody přípravy FAMEs se dá řadit také příprava pyrolýzou (Py-GC), která byla srovnávána s klasickou kysele katalyzovanou přípravou pomocí fluoridu boritého v práci : „Profiling fatty acids in vegetable oils by reactive pyrolysis–gas chromatography with dimetyl carbonate and titanium silicate“ [22]
2.5.2. Srovnání metod přípravy metylesterů Mezi jednu z novějších metodologií pro rychlou analýzu MK pomocí GC patří on-line pyrolýza-plynová chromatografie (Py-GC) s minimální úpravou vzorku a s použitím netoxických činidel. Metodika přípravy FAMEs s činidlem BF3 s následnou extrakcí rozpouštědlem je jedna z tradičních postupů pro profilování MK v olejích a tucích. Ovšem obecně lze říci že příprava vzorku je časově náročná a k přípravě vyžaduje toxické nebo žíravé látky, které mohou představovat problém pro životní prostředí i naše zdraví. Proto by mohla metoda Py-GC vyhovovat „zelené analytické chemii“, která se snaží o omezení používání nebezpečných chemikálii a omezit množství vznikajících odpadních látek. Při metodě Py-GC se používají jako činidla
TMAH
(tetrametylamonium
hydroxidu
sodného)
nebo
TMSH
(hydroxid
trimetylsulfonia), ovšem jako alternativu je možné použít DMC (dimetyl karbonát) jako transmetylační činidlo pro výrobu FAMEs. DMC jako činidlo poskytuje několik výhod, je levné, bez zápachu, nežíravé, nejedovaté a vykazuje dobré vlastnosti jakožto rozpouštědlo. Ovšem aby mohlo být použito jako činidlo je potřeba zavedení katalyzátoru (křemičitanu titaničitého). Při esterifikaci pomocí činidla DMC byl vzorek lipidu rozpuštěn a nanesen na nanoprášek křemičitanu titaničitého v křemenné trubici a byla provedena samotná pyrolýza při 500°C pomocí pyrolyzéru CDS 1000 pyroprobe vyhřívané platinovým vláknem a trubice byla spojena přímo s injektorem plynového chromatografu. Při postupu esterifikace pomocí fluoridu boritého v metanolu byly lipidy vařeny s NaOH v metanolu (0,5M), poté byl přidán fluorid boritý v metanolu a směs byla vařena pod zpětným chladičem a následně extrahována s hexanem. Po ochlazení byl přidán nasycený roztok NaCl a hexanová vrstva obsahující FAME byla vysušena bezvodým síranem sodným. [22]
22
II. Experimentální část
3.
Chemikálie
hydroxid sodný (NaOH) p.a., Merck chlorid sodný (NaCl) p.a., Merck metanol (CH3OH,), (1l=0,79 kg) p.a., Penta n-heptan (1l =0,68 kg) p.a., lach:ner síran sodný bezvodý p.a., Onex F.A.M.E. Mix Rapeseed Oil – (standard) 100mg, Neat (Supelco) Vinná réva – sušené semínka (vzorek) (Obr.č.10)
Obr.č.10.: Vzorek vinné révy
Plyny: Dusík 5.0, Messer, Brno Vodík 5.0, Messer, Brno Vzduch (stlačený plyn) 5.0, Messer, Brno
23
4.
Instrumentace
Plynový chromatogram Hewlett Packard 5890 Series II Autosampler Hewlett Packard 7673 GC/SFC injektor Kapilára Fused silica capillary SPB-1, 60m x 0,25 mm , 0,25 μ m film Jehla: objem 10 μ l (výrobce: SGE Analytical Science)
Obr.č.11.: Aparatura pro GC
Tento typ plynového chromatografu má pouze manuální nastavení rozdělovacího poměru (split ratio) při metodě dávkování vzorku s děličem toku
(Obr.č.12)
. Vývodem pro plyn, který je
umístěn pod ventilem, lze měřit průtok plynu a pomocí programu Hewlett Packard – column pressure/flow calculator (Obr.č.13) můžeme zjistit přesný dělící poměr.
Obr.č.12: Ventil pro regulaci dělícího poměru a vývod pro plyn
24
Obr.č.13.: Hewlett Packard – column pressure/flow calculator
V našem případě probíhaly analýzy s děličem toku v poměru 26:1. Průtok nosného plynu kolonou byl nastavován pomocí tlaku (inlet pressure).
5.
Analýza metylesterů mastných kyselin
5.1.
Kondicionace kolony Při kondicionaci
(Obr.č.14)
dochází k vymývání nečistot z kolony a usazování hladiny
nulové linie (base-line). V našem případě byla kondicionace prováděna 1μ l čistého rozpouštědla (heptanu) při průtoku nosného plynu kolonou (Fm) 1,5 ml/min s teplotním programem, který začínal na 70°C, poté nárůst 10°C/min na konečnou teplotu 280°C a udržení této teploty po dobu 8 minut. Celková doba kondicionace trvala 30 minut a prováděla se pokaždé po zapnutí přístroje minimálně 2x. Při kondicionaci byl nastaven dělící poměr zhruba 180:1. aby nedocházelo k přetěžování kolony velkým množství rozpouštědla. Nárůst base-line je typický, neboť kopíruje nárůst teploty zvoleného teplotního programu.
25
Obr.č.14.: Kondicionace kolony modrá – 1.promytí, červená – 2. promytí, zelená – 3. promytí
5.2.
Příprava roztoku standardu a vzorku pro analýzu standard Směs FAMEs musí být uchováván zmrazený, čili před vážením byl chvíli ponechán při
laboratorní teplotě a poté bylo odváženo 0,01 g tohoto standardu pro GC analýzu a zředěno 10 ml rozpouštědla (heptanu). Zbytek standardu byl zaizolován parafinem a opět zamražen. reálný vzorek Pro získání FAMEs ze sušených plodů vinné révy byl použit upravený postup, který se používá také pro získání FAMEs z rostlinných olejů[23]. Byla použita delší kolona, stejný průtok nosného plynu a poupravený teplotní program, který více vyhovoval rozlišení stanovovaných metylesterů mastných kyselin. Bylo použito 5,00 g sušených plodů, které byly pod zpětným chladičem vařeny 25 minut v 0,5 M roztoku NaOH v metanolu ve varné baňce (250 ml). Po 25 minutách bylo přidáno 30 ml heptanu a směs byla zahřívána další 2 minuty. Po ochlazení směsi bylo přidáno cca 10 ml nasyceného roztoku NaCl ve vodě (byl připraven smícháním 20,00 g NaCl s 50 ml H2O na vařiči). Abychom mohli oddělit pipetou heptanovou vrstvu s připravenými FAMEs, bylo nutné převést celý roztok do užší baňky (v mém případě do 100ml odměrného válce). Po oddělení byla 26
heptanová vrstva vysušena bezvodým síranem sodným, který byl nanesen na fritu a směs byla přefiltrována. Po vysušení byl roztok připraven na analýzu pomocí GC.
5.3.
Úschova standardu a vzorku metylesterů Vzorky jsou uchovávány v lednici přes noc, aby se co nejvíce omezilo vytěkávání
rozpouštedla popřípadě FAMEs z roztoku. Bylo ovšem prokázáno, že rozpouštědlo i přes úschovu v lednici vytěkává, neboť vialky (Obr.č.15) nejsou plynotěsné. Důkazem bylo zvětšování ploch píků metylesterů v závislosti na čase za současného poklesu plochy píku rozpouštědla.
Obr.č.15.: (vlevo) Vialky umístěné v autosampleru a připravené k analýze a (vpravo) vialky se vzorky
5.4.
Výběr podmínek pro analýzu metylesterů Nejdůležitějším faktorem pro rozlišení standardu FAMEs bylo nastavení správného
průtoku nosného plynu kolonou zejména kvůli metylesterům kyselin linolové, olejové a linolenové. Tyto FAMEs mají podobný bod varu (346-347°C při tlaku 760 torr
[24]
) a bylo
obtížné je dostatečně rozlišit. Dalším faktorem správného rozlišení bylo určení vhodného teplotního programu pro analýzu.
Teplotní program pro analýzu: Počáteční teplota byla nastavena na 150°C, poté následuje nárůst teploty o 3°C/min na teplotu 230°C a udržení této teploty po dobu 5 minut s následným nárůstem 15°C/min na konečných 280°C a udržení této teploty 19 minut. Celková doba analýzy trvala 59 minut (Obr.č.16). Injektor byl vyhříván po celou dobu separace na teplotu 250°C a detektor na 300°C.
27
Obr.č.16: Teplotní program pro analýzu
Průtok nosného plynu: Při této metodě byl nastaven konstantní průtok nosného plynu kolonou hodnotou 0,5 ml/min. Dávkované množství: Pomocí automatického dávkovacího systému (autosampler), byl dávkován 1μ l vzorku, který před samotným nástřikem vzorku do skleněné vložky (lineru) propláchl injekční stříkačku (2x) dávkovaným roztokem. Dále se zbavil bublin, jenž mohly být v jehle obsaženy, opakovaným nasátím a vypuštěním roztoku ze stříkačky (3x). Pro přesnější určení jednotlivých FAMEs a lepší vyhodnocení píků bylo důležité nastavit optimální průtokovou rychlost nosného plynu kolonou. Původní analýza byla provedena s průtokovu rychlostí 1,5 ml/min, kde píky metylesterů kyselin linolové a linolenové nebyly rozlišeny. Průtoková rychlost byla tedy v sérii pokusů postupně snižována. Pro srovnání uvádím chromatogramy s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min
28
(Obr.č.18)
a 0,5 ml/min
(Obr.č.17)
.
Průtok nosného plynu 0,5 ml/min:
Obr.č.17.: Analýza směsi FAMEs při průtoku 0.5 ml/min
pík
metylester kyseliny
t R [min]
w1/ 2 [min]
N
2 3 4 5 6 7 8
palmitové linolové linolenové olejové stearové eicosanové arachidonové
31,004 36,723 36,885 37,094 37,946 41,806 42,357
0,063 0,091 0,086 0,083 0,063 0,050 0,056
1,33 ⋅106 0.91 ⋅106 1,01 ⋅106 1,11 ⋅106 3,36 ⋅106 3,82 ⋅106 3,23 ⋅106
Tab.č.1.: Retenční charakteristiky při průtoku 0,5 ml/min
29
Průtok nosného plynu 1,0 ml/min:
Obr.č.18.: Analýza směsi FAMEs při průtoku 1.0 ml/min
pík
metylester kyseliny
t R [min]
w1/ 2 [min]
N
2 3 4 5 6 7 8
palmitové linolové linolenové olejové stearové eicosanové arachidonové
25,986 31,033 31,150 31,354 32,156 37,964 38,692
0,078 0,086 0,082 0,090 0,082 0,085 0,071
0,62 ⋅106 0,72 ⋅106 0,80 ⋅106 0,67 ⋅106 0,81 ⋅106 1,11 ⋅106 1,65 ⋅106
Tab.č.2.: Retenční charakteristiky při průtoku 1,0ml/min
pík 3 4 5
metylester kyseliny linolová linolenová olejová
tR [min] 36,723 36,886 37,089
w1/ 2 [min]
w [min]
0,0907 0,0864 0,0827
0,154 0,147 0,141
Tab.č.3.: Rozlišení při průtoku 0,5 ml/min
30
R3− 4 1,08 -
R4−5 1,41
pík 3 4 5
metylester kyseliny linolová linolenová olejová
t R [min]
w1/ 2 [min]
w [min]
31,033 31,150 31,354
0,0970 0,0936 0,0893
0,165 0,159 0,152
R3−4 0,72 -
R4−5 1,31
Tab.č.4.: Rozlišení při průtoku 1,0 ml/min Kde: t R - retenční čas, w1/ 2 - šířka píku v polovině výšky, w - šířka píku na základní linii, R – rozlišení sousedících píků, N – počet teoretických pater
Příklad výpočtu: pro metylester kyseliny palmitové (Fm=0,5 ml/min): Dosazení do rovnice (1) 2
⎛ 24, 432 ⎞ N = 5,545 ⋅ ⎜ = 1, 01⋅106 ⎟ ⎝ 0, 0573 ⎠ Dosazení do rovnice (3)
0, 0907 = 0, 0385 2,354 w = 0, 0385 ⋅ 4 = 0,154
σ=
pro rozlišení metylesterů kyseliny linolové a linolenové (Fm=0,5 ml/min): Dosazení do rovnice (2) R3− 4 =
0,163 = 1, 08 0,5 ⋅ 0,301
Dva sousedící píky lze brát za rozlišené, pokud je hodnota jejich rozlišení ≥ 1, 5 , kdy je míra překrytí 0,1%. Zrychlením průtoku nosného plynu bylo dosaženo kratších časů analýz za sníženého chromatografického rozlišení
(Tab.č.3.4)
. Rozlišení píků s průtokovou rychlostí 0,5
ml/min nebylo úplné, avšak na určení jednotlivých FAMEs pomocí jejich retenčních časů bylo dostačující (Obr.č.17). Pro srovnání byla dále vypočtena teoretická patra pro jednotlivé metylestery. Snížením průtokové rychlosti dosáhneme vyššího počtu teoretických pater, čímž se kolona stane účinnější.(Tab.č.1,2). 5.5
Analýza standardu a vybraného vzorku Analýza standardu i vzorku sušených semínek vinné révy probíhala při konstantním
průtoku 0,5 ml/min za teplotních podmínek viz. Obr.č.16. Vzorek i standard byly proměřeny každý 3x, pro zjištění opakovatelnosti stanovení.
31
Analýza standardu (Obr.č.19) Určení jednotlivých píků po 1. GC analýze proběhlo ve srovnání s prací Michaela Buchanana[25] na základě pořadí eluujících píků.
Obr.č.19.: Metylestery mastných kyselin standardu
¨
pík
metylester kyseliny
1.
myristové
2.
palmitové
3.
linolové
4.
linolenové
5.
olejové
6.
stearové
7.
eicosanové
8.
arachidonové
9.
erukové
10.
behenové
11.
lignocerové
Tab.č.5.: Seznam metylesterů v roztoku standardu
32
metylester kyseliny myristové palmitové linolové linolenové olejové stearové eicosanové arachidonové erukové behenové lignocerové
standard 1- t R [min]
2- t R [min]
3- t R [min]
24,432 31,010 36,724 36,894 37,098 37,952 41,810 42,359 46,012 46,616 51,814
24,430 31,006 36,722 36,878 37,085 37,949 41,806 42,358 46,011 46,616 51,808
24,410 30,995 36,722 36,885 37,085 37,938 41,803 42,353 46,004 46,608 51,810
tR [min] 24,424 31,004 36,723 36,886 37,089 37,946 41,806 42,357 46,009 46,613 51,811
Tab.č.6.: Opakovatelnost retenčních časů standardu pro 3 měření
analýza semínek vinné révy Porovnáním retenčních časů jednotlivých píků vzorku s retenčními časy standardu byla prokázána přítomnost 10 z 11 FAMEs obsažených ve standardu. Ve vzorku nebyl obsažen pouze metylester erukové kyseliny
(Tab.č.7)
v detekovatelném množství pomocí FID. Vzorek obsahoval
dalších zhruba 21 neidentifikovaných píků (Obr.č.17).
metylester kyseliny myristové palmitové linolové linolenové olejové stearové eicosanové arachidonové erukové behenové lignocerové
Vzorek 1- t R [min]
2- t R [min]
24,436 31,014 36,729 36,892 37,085 37,955 41,819 42,363 46,622 51,817
24,418 30,995 36,719 36,873 37,072 37,937 41,804 42,351 46,606 51,800
3- t R [min] tR [min] 24,429 24,428 31,007 31,005 36,731 36,726 36,890 36,885 37,087 37,081 37,942 37,945 41,812 41,812 42,351 42,355 46,614 46,614 51,807 52,808
Tab.č.7.: Opakovatelnost retenčních časů vzorku pro 3 měření
33
Obr.č.17.: Srovnání standardu s reálným vzorkem červená: standard, modrá: vzorek
pík
metylester kyseliny
1.
myristové
2.
palmitové
3.
linolové
4.
linolenové
5.
olejové
6.
stearové
7.
eicosanové
8.
arachidonové
9.
erukové
10.
behenové
11.
lignocerové
Tab.č.8.: Seznam metylesterů MK
Obr.18.: Přiblížení píků 3.-5. červená: standard, modrá: vzorek
34
Srovnání retenčních časů metylesterů standard tR [min] 24,424 31,004 36,723 36,886 37,089 37,946 41,806 42,357 46,009 46,613 51,811
metylester kyseliny myristové palmitové linolové linolenové olejové stearové eicosanové arachidonové erukové behenové lignocerové
vzorek tR [min] 24,428 31,005 36,726 36,885 37,081 37,945 41,812 42,355 46,614 52,808
Tab.č.9.: Srovnání retenčních časů standardu a vzorku Kde:
tR - průměrný retenční čas (viz. Tabulka č.7 a č.8)
Statisticky bylo zjištěno, že všechny retenční časy jsou v intervalu spolehlivosti (95%ní pravděpodobnost) a podle Dean-Dixonova testu naměřené retenční časy nejsou odlehlé. Statistické vyhodnocení pro metylester kyseliny myristové: tR =
tR =
1 n ∑ tR n i =1 i
24, 436 + 24, 418 + 24, 429 = 24, 428 min 3
Rozpětí: R = t R max − t R min R = 24, 436 − 24, 418 = 0, 018
Dean-Dixonův test:
Q1 =
t R 2 − t R1 24, 429 − 24, 418 = = 0, 611 R 0, 018
Q2 =
tR 3 − tR 2 24, 436 − 24, 429 = = 0,389 R 0, 018
35
Tabelovaná hodnota: Qtab = 0,941
5.6.
Srovnání: ⇒ výsledky nejsou odlehlé Qtab 〉 Q1,2
Úprava postupu esterifikace: V poslední části práce byl upraven postup esterifikace. Reakce proběhla stejným
postupem a za stejných podmínek, pouze s úpravou činidla NaOH (namísto 0,5 M roztoku byl použit 1,0 M roztok NaOH v metanolu). Výsledkem byla nižší koncentrace 9 z 10 identifikovaných metylesterů a metylester kyseliny myristové nebyl vůbec detokován. Z toho vyplývá, že není vhodné používat roztok NaOH v metanolu o vyšší koncentraci (Obr.č.19).
Srovnání chromatogramu 0,5 M a 1,0 M NaOH:
Obr.č.19.: Srovnání 2 příprav FAMEs modrá - vzorek po 0,5 M NaOH , červená - vzorek po 1,0 M NaOH
36
6.
Závěr: Pomocí bazicky katalyzované esterifikace byly získány metylestery mastných kyselin ze
sušených semínek vinné révy, které byly pomocí standardní směsi 11 FAMEs určeny na základě jejich retenčních charakteristik. Analýza standardu i vzorku proběhla za identických podmínek a statisticky byla prokázána opakovatelnost analýz pomocí retenčních časů. Koncentrace, tedy plochy píků metylesterů, nebyla totožná pro sérii měření v závislosti na čase, neboť docházelo k vytěkávání rozpouštědla z roztoku. Tato skutečnost byla zapříčiněna uchováváním vzorků ve vialkách, které nebyly plynotěsné. Při porovnání retenčních časů vzorku vinné révy se standardem FAMEs, byla prokázána přítomnost 10 metylesterů. Jednalo se o mastné kyseliny: myristovou,
palmitovou,
linolovou,
linoleovou,
olejovou,
stearovou,
eikosanovou,
arachidonovou, behenovou a lignocerovou. Dalším porovnáním byla vyloučena přítomnost kyseliny erukové. Ostatní píky nebyly určeny. V závěru práce byla provedena esterifikace s použitím hydroxidu sodného v metanolu o vyšší koncentraci bez úprav podmínek pro separaci pomocí plynové chromatografie. Příprava a samotná analýza trvala zhruba 2 hodiny. Statistické vyhodnocení dokazuje, že se jedná o analytickou metodu s dobrou reprodukovatelností výsledků.
37
7.
Použité zkratky:
AED - atomic emission detektor CLD - chemiluminiscence detektor DMC - dimetyl karbonát ECD - electron capture detektor FAMEs – fatty acid metylesters FID – flame ionization detektor FPD - flame photometric detektor GC-MS - plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie GLC – plyn-kapalina chromatografie GSC – plyn-pevná fáze chromatografie MF – mobilní fáze MK – mastná kyselina MUFA - mono-usaturated fatty acids PID - photoionization detektor PLOT - porous-layer open tubular PUFA - poly-unsaturated fatty acids Py-GC – pyrolýza-plynová chromatografie SCOT - support-coated open tubular SF-stacionární fáze SFA - saturated fatty acids TCD - termal conductivity detector THF – tetrahydrofuran TID - thermal ionization detektor TMAH - tetrametylamonium hydroxidu sodného TMSH - hydroxid trimetylsulfonia WCOT - wall-coated open tubular
38
8.
Literatura:
[1] F. Švec. Co dnes hýbe kapalinovou chromatografií?. Chemické Listy 103 (2009). 266−270 [2] L. Sommer, a kol. Základy analytické chemie II. VUTIUM (2000) [3] P. Klouda. Moderní analytické metody. Pavel Klouda 2. vyd. Ostrava (2003) [4] C. F. Poole, S. K. Poole. Chromatography today. Elsevier (1991) [5] K. D. Bartle, M. Peter. History of gas chromatography. trends in analytical chemismy. (2002). vol. 21, nos. 9+10 [6] O. Mikeš. Laboratorní chromatografické metody. SNTL – Nakladatelství technické literatury. Praha (1980) [7] M. Popl, J. Kubát. Základy chromatografie. SNTL – Nakladatelství technické literatury (1981) [8] R. K. Murray, D. K. Granner, P. A. Mayes, V. W. Rodwell. Harperova biochemie (čtvrté české vydání). Nakladatelství vydavatelství H&H (2002) [9] W. W. Christie. Gas chromatography and lipids. The Oil Press (1989) [10] M. Ledvina, A. Stoklasová, J. Cerman. Biochemie pro studující medicíny. (2003) [11] J. McMurry, Organická chemie. VUTIUM. Brno (2007) [12] http://che1.lf1.cuni.cz/html/Mastne_kyseliny_2sm.pdf (3.2011) [13] I. Poustková, L. Babička, L. Kouřímská, G. Siegrová, L. Staruch. quality of hemp seed oil depending on its obtainin. Recenzovaný odborný časopis Potravinárstvo, Vol. 4, 3, 53-57, (2010) [14] http://vladahadrava.xf.cz/tuky.html (5.2011) [15] I. S. Carvalho, M. C. Teixeira, M. Brodelius. Fatty acids profile of selected Artemisia spp. plants: Health promotion. Elsevier, LWT-Food science and Technology (2010) [16] A. Bakoglu, E. Bagci, A. Kocak, E. Yuce. Fatty acid composition of some Medicafo L. (Fabaceae) species from Turkey. Asian Journal of Chemistry Vol.22. (2010) [17] B. Bicalho, F. David, K. Rumplel, E. Kindt, P. Sandra. Creating a fatty acid methyl ester database for lipid profilig in a single drop of human blood using high resolution capillary gas chromatography and mass spektrometry. Elsevier (2008) [18] A. Mohibbe, A. Waris, N. M. Nahar. Prospects and potencial of fatty acid methyl esters of some non-traditional seed oils for use as biodesel in India. Elsevier, Biomass and Bioenergy 29 (2005) 39
[19] http://kfch.upce.cz/htmls/vedecka_cinnost_bionafta.htm (3.2011) [20] I. M. Witkowska, M. Lourenço, V. Fievez, K. Arvidsson, A. Gustavsson, A. Elgersma. Comparison of methods for determining the fatty acid composition of photosynthetic tissues. Salt Lake City : Aardvark Global Publishing Company. (2008) [21] http://share.centrax.cz/CPO-4_Reakce_mastnych_kyselin_a_lipidu,_str_79-104.pdf (5.2011) [22] D. Fabbri, V. Baravelli, G. Chiavari, S. Prati. Profiling fatty acids in vegetable oils by reactive pyrolysis–gasc hromatography with dimethyl carbonate and titanium silicite. Elsevier, Journal of Chromatography A, 1100 (2005) [23] http://web.vscht.cz/kohoutkj/mastkyslab_ofic.pdf (4.2011) [24] https://www.reaxys.com (4.2011) [25] M. D. Buchanan. GC Analyses of FAMEs by Boiling Point Elution. Supelco Reporter EU Volume 34. (20099)
40
