Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta
Syntéza derivátů kyseliny kávové a jejich toxicita Diplomová p r á c e
Brno 2008
Pavla Brancová
Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav chemie
Syntéza derivátů kyseliny kávové a jejich toxicita Diplomová p r á c e
Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Petr Klán, Ph.D.
Brno 2008
Pavla Brancová
1
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně, pod odborným vedením prof. RNDr. Petra Klána, Ph.D., na základě uvedené odborné literatury a pramenů v seznamu literatury.
V Brně 9.5.2008 ......................................... Pavla Brancová
2
Ze školy by měl vycházet mladý člověk jako harmonická osobnost, nikoli jako specialista.
Albert Einstein
3
Poděkování Chtěla bych především poděkovat prof. RNDr. Petru Klánovi, Ph.D. za odborné vedení mé práce, za výborný pedagogický přístup a za velkou dávku trpělivosti. Dále bych chtěla poděkovat hlavně Mgr. Nele Pavlíkové za obětavou pomoc, odborný dohled a všem kolegům z fotochemické skupiny za přátelské prostředí a užitečné rady. A na závěr bych ještě chtěla zmínit svou rodinu, hlavně rodiče, kteří mě motivovali a byli mi vždy velkou oporou. 4
Abstrakt Kyselina kávová a některé její deriváty vykazují řadu biologických a farmakologických účinků. Odpovědnost za tyto účinky nese jejich specifická struktura. Cílem mé diplomové práce byla syntéza modelových sloučenin, konkrétně derivátů kyseliny kávové, které pak byly zkoumány jako nové ligandy aktivující obecné retinoidní receptory. Studované deriváty kávové kyseliny (methyl-, butyl-, decyl- a (E,E)-hexa-2,4dienylester, (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenová kyselina a její methylester) byly syntetizovány z kyseliny kávové a příslušného alkoholu. K metodě umožňující studium vlivů na retinoidní signálování byla použita buněčná linie P19/A15, transfekovaná genem exprimujícím luciferázu. Tato metoda umožňuje hodnocení toxicity látek narušující retinoidní signálování, k nimž patří antropogenní
polutanty
(ftaláty,
polycyklické
aromatické
uhlovodíky,
aj.),
agrochemikálie nebo farmaceutika. Mezi výše zmíněnými studovanými deriváty kávové kyseliny nebyly nalezeny nové ligandy pro retinoidní receptory. Methylester kávové kyseliny, a to v obou geometrických izomerech, narušoval retinoidní signálování pouze v přítomnosti přirozeného ligandu (ATRA) pro retinoidní receptory. Potenciace ATRY na receptory byla pozorována i u (E)-azobenzenu, který byl zvolen jako výchozí systém pozorování chování izolovaných geometrických izomerů.
Klíčová slova: kávová kyselina, retinoidní receptory, ATRA, P19/A15, E-Z izomerace, azobenzen
5
Abstract Caffeic acid and some of its derivatives display various biological and pharmacological effects. The specific of caffeic acid is responsible for the interactions with potential bioreceptors. The aim of my diploma thesis was synthesis of the different caffeic acid derivatives, which were investigated as potential new ligand for the retinoic acid receptors. A variety of caffeic acid derivatives (methyl-, butyl-, decyl- and (E,E)-hexa-2,4dienyl ester, (E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)propenoic acid and the corresponding methyl (E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)propenoate) was synthesized from caffeic acid and an alcohol. A cell line P19/A15, transfected with luciferase gene, was used as material for testing the effect of prepared derivatives on retinoic signall pathway. This method is generally used for examination of compounds such as anthropogenic pollutant (phthalates, polycyclic aromatic hydrocarbons, etc.), agrochemicals or pharmaceutics, which affect a retinoid signalling. None of the investigated derivatives was found to be a new ligand for retinoic acid receptores. Both geometric isomers (E and Z) of methyl ester caffeic acid affects retinoic signall patway only in presence of nature ligand (ATRA) for retinoic receptor. Potentiation of ATRY for the receptors was also observed in presence (E)-azobenzene, which was then chosen as a primary system for comparing the separated geometric isomers (E and Z).
Key words: caffeic acid, retinoic receptors, ATRA, P19/A15, E-Z isomeration, azobenzene
6
Použité zkratky AMP
adenosinmonofosfát
ATP
adenosintrifosfát
ATRA
kyselina all-trans retinová (All-Trans-Retinoic Acid)
CABE
butylester kávové kyseliny
CADE
decylester kávové kyseliny
CAHE
(E, E)-hexa-2,4-dienylester kávové kyseliny
CAME
methylester (E)-kávové kyseliny (E-CAME)
CAPE
fenylethylester kávové kyseliny (Caffeic Acid Phenethyl Ester)
COMT
katechol-O-methyltransferasa (Catechol-O-Methyl Transferase)
DCC
N,N´-dicyklohexylkarbodiimid
DMEM
kultivační médium (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
DMEM/F12 kultivační médium (Dulbeccos Modified Eagle Medium plus Hams 12 nutrient mixture) DMF
N,N-dimethylformamid
DMSO
dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonukleová kyselina (Deoxyribonucleic acid)
EC
embryonální rakovinné (Embryonal Carcinoma)
HOMO
nejvyšší obsazený orbital v molekule (Highest Occupied Molecular Orbital)
HPLC
vysokoúčinná
(vysokotlaká)
kapalinová
chromatografie
(High-
Performance (Pressure) Liquid Chromatography) LUMO
nejnižší neobsazený orbital v molekule (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)
MMP
methyl (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenoát
MO
molekulový orbital (Molecular Orbital)
NADH
nikotinamidadenindinukleotid (redukovaná forma)
NADPH
nikotinamidadenindinukleotidfosfát (redukovaná forma)
PBS
fosfátový fyziologický roztok (Phosphate Buffered Saline)
PPG
fotolabilní chránící skupina (Photoremovable Protecting Group)
PSS
fotostacionární stav (Photostationary State)
PTSA
para-toluensulfonová kyselina
7
RA
retinová kyselina (Retinoic Acid)
RAR
receptor kyseliny retinové (Retinoic Acid Receptor)
RARE-luc
retinoidní responzivní element luciferázy pro RAR (Retinoic Acid Responsive Element)
RECETOX Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii (Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology) RNS
reaktivní formy dusíku (Reactive Nitrogen Species)
ROS
reaktivní formy kyslíku (Reactive Oxygen Species)
RVO
rotační vakuová odparka
RXR
retinoidní receptor X (Retinoid X Receptor)
SOCl2
thionyl chlorid
THF
tetrahydrofuran
TLC
chromatografie na tenké vrstvě (Thin Layer Chromatography)
Z-CAME
methylester (Z)-kávové kyseliny
8
Obsah 1. Úvod .......................................................................................................................... 10 2. Přírodní antioxidanty .............................................................................................. 11 2.1 Polyfenoly................................................................................................................ 12 2.1.1 Flavonoidy ......................................................................................................... 13 2.1.2 Fenolické kyseliny ............................................................................................. 14 2.1.2.1 Biosyntéza kyseliny kávové ....................................................................... 15 2.1.2.2 Deriváty kyseliny kávové........................................................................... 16 2.1.2.3 Metabolismus kyseliny kávové a jejich derivátů..................................... 17 2.1.2.4 Biologická aktivita kyseliny kávové a jejich derivátů ............................ 19 2.1.2.4.1 Antioxidační účinek ............................................................................ 19 3. Buněčná linie P19/A15............................................................................................. 21 3.1 Retinoidy................................................................................................................. 21 3.2 Receptory retinoidů ............................................................................................... 23 4. Fotochemická E-Z izomerace.................................................................................. 24 4.1 E-Z izomerace na dvojné vazbě C=C ................................................................... 27 4.2 E-Z izomerace na dvojné vazbě N=N ................................................................... 31 5. Experimentální část ................................................................................................. 37 5.1 Použité přístroje ..................................................................................................... 37 5.2 Použité chemikálie ................................................................................................. 38 5.3 Příprava a vlastnosti látek..................................................................................... 39 5.3.1 Methylester (E)-kávové kyseliny ..................................................................... 39 5.3.2 Methylester (Z)-kávové kyseliny...................................................................... 40 5.3.3 Methyl-(E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenoát ................................................ 41 5.3.4 (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenová kyselina.............................................. 42 5.3.5 Butylester kávové kyseliny ............................................................................... 43 5.3.6 Decylester kávové kyseliny............................................................................... 44 5.3.7 (E,E)-hexa-2,4-dienylester kávové kyseliny.................................................... 45 5.3.8 (Z)-azobenzen .................................................................................................... 46 5.4 Testování látek na buněčné linii P19/A15............................................................ 46 5.4.1 Kultivace ............................................................................................................ 47 5.4.2 Experiment ........................................................................................................ 47 6. Výsledky a diskuse ................................................................................................... 48 7. Závěr ......................................................................................................................... 56 8. Literatura.................................................................................................................. 57
9
1. Úvod Jelikož je embryonální vývoj považován za „slabý článek“ životního cyklu organismu (fáze organogeneze a tkáňové diferenciace embryonálního vývoje jsou většinou citlivější na cytotoxické poškození vedoucí k malformacím a dalším defektům než dospělé buňky), je v poslední době věnována velká pozornost studiu procesů embryotoxicity a teratogenity. Velmi významnou roli v těchto procesech hrají především obecné retinoidní receptory, jejichž přirozenými ligandy jsou retinoidy, deriváty vitaminu A. Na rozdíl od jiných signálních molekul, retinoidy nejsou syntetizovány organismem a musí být tedy přijímány z potravy. Metabolismus retinoidů je velmi citlivě regulován, a proto může narušení příjmu z potravy nebo vliv jiných látek (xenobiotik) na jejich receptory a ovlivnění signální dráhy vyvolat závažné změny v organismu. Cílem mé práce byla syntéza modelových sloučenin, konkrétně derivátů kyseliny kávové, které pak byly testovány na buněčné linii P19/A15 jako potenciálně možné ligandy pro retinoidní receptory, tedy látky narušující retinoidní signálování. Současně byla zjišťována i viabilita (životaschopnost) buněk. Součástí mé práce bylo i pozorování chování izolovaných E a Z izomerů modelové sloučeniny na projevu toxicity látky narušující retinoidní signálování. Pro toto pozorování byl jako výchozí systém použit azobenzen, jakožto látka, jejíž Z-izomer je snadno fotochemicky dostupný. Nalezení modelové sloučeniny narušující retinoidní signálování je pouze prvním krokem projektu, po němž bude následovat využití fotolabilních chránících skupin (Photoremovable Protecting Group, PPG), které by umožňovaly fotochemicky řízené odštěpení příslušné biologicky aktivní sloučeniny.
10
2. Přírodní antioxidanty Rostliny obsahují širokou škálu strukturně velmi různorodých sloučenin, jež jsou běžnou součástí lidské potravy.1,3 V poslední době roste zájem o studium těchto přírodních látek, neboť zvýšená konzumace ovoce, zeleniny a obilovin může snižovat riziko vzniku některých závažných nemocí jako jsou některé formy rakoviny, kardiovaskulární choroby a dalších onemocnění. Předpokládá se, že je to právě díky vysokému obsahu antioxidantů, tj. látek, které mají schopnost zhášet reaktivní formy sloučenin (viz. 2.1.2.4.1).3 Mezi nejvýznamnější přírodní antioxidanty patří tokoferoly (obrázek 1) a tokotrienoly (vitamin E), askorbová kyselina (vitamin C), polyfenoly (především flavonoidy, fenolické kyseliny, jednoduché fenoly) a karotenoidy (β-karoten) (obrázek 2).2 HO
R1
R2 CH3 R3
CH3
CH3
O CH3
CH3
Obrázek 1. Obecný vzorec tokoferolů1 H3C H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
Obrázek 2. β-karoten
Některé příklady antioxidantů obsažených v potravinách rostlinného původu jsou uvedeny v tabulce 1.
11
Tabulka 1. Příklady antioxidantů obsažených v potravinách rostlinného původu1
Antioxidant
Zdroj
Zástupce
Tokoferoly, tokotrienoly Askorbová kyselina Flavonoidy flavanoly flavony flavonoly
rostlinné oleje ovoce, zelenina
α-tokoferol
zelený a černý čaj celer, petržel pórek, brokolice, grapefruit, černý čaj cibule, jablka, olivový olej, čaj citrusové plody sója maliny, jahody, červené hrozny
katechiny apigenin kaemferol kvercetin naringenin, hesperetin daidzein, genistein kyanidin
olivy, káva, bílé víno, špenát pšenice, rýže, kukuřice, rajčata řepka, pšenice ovoce, zelenina, palmový olej
kávová kyselina ferulová kyselina syringová kyselina β-karoten
flavanony izoflavony anthokyanidiny Fenolické kyseliny hydroxyskořicové hydroxybenzoové Karotenoidy
Antioxidanty jsou předmětem zájmu potravinářských odborníků, neboť obsah antioxidantů v potravinách lze nad jejich přirozenou hladinu navýšit přídavkem dalších antioxidantů.1 Tím je docíleno prodloužení trvanlivosti nebo zabránění vzniku nežádoucí chuti či vůně. K těmto účelům slouží syntetické antioxidanty, které by měly být zdravotně nezávadné, snadno aplikovatelné, účinné v nízkých koncentracích, bez nežádoucího aroma, chuti a cenově dostupné.
2.1 Polyfenoly Za polyfenoly jsou obecně považovány organické fenolické látky obsahující jedno nebo více aromatických jader substituovaných hydroxylovými skupinami. Řadíme k nim polycyklické struktury nazývané flavonoidy, které se podílí na celkovém příjmu polyfenolů v naší stravě asi ze dvou třetin. Zbylou třetinou jsou jednoduché fenolické kyseliny a jejich deriváty. Minoritní podíl hrají ostatní polyfenoly.3 Denní příjem polyfenolů byl odhadnut na 1 g a je tedy výrazně vyšší, než je průměrný příjem antioxidačních vitamínů (tokoferoly, karotenoidy a askorbová kyselina).3
12
2.1.1 Flavonoidy Flavonoidy mají v rostlinné říši široké zastoupení. Jedná se o běžné sekundární metabolity vyšších rostlin, mimo jiné jde i o barviva zodpovědná za barvu květů, plodů a někdy i listů.4 Důležitou roli hrají také při ochraně rostlin před nadměrným UV zářením, při kterém se uvolňuje velké množství reaktivních forem sloučenin (viz. 2.1.2.4.1). Flavonoidy vznikají v rostlinách kondenzací polyacetátu a aromatických aminokyselin jako je fenylalanin a tyrosin. Tyto sloučeniny vznikají v biosyntetické cestě kyseliny šikimové, která bude blíže popsána u biosyntézy kyseliny kávové (viz. 2.1.2.1). Všechny flavonoidy mají společnou základní strukturu, 2-fenyl-benzopyran (obrázek 3). Je známo přibližně 3000 těchto přírodních sloučenin.4 Flavonoidy se objevují jak ve formě volné tak ve formě glykosidicky vázaných sloučenin. Glykosidová vazba je tvořena z polohy C3 nebo C5. Sacharidem bývá glukosa, rhamnosa, galaktosa a další sacharidy. Z pohledu biologické aktivity působí na lidský organismus mnoho rostlin obsahující flavonoidy jako sekretolytika, venofarmaka, diuretika a spasmolytika.4 Např. list břízy (Betula pendula), nať přesličky (Equisetum arvense), květ bezu černého (Sambucus nigra), atd.
3´ 2´ 8
O
5´
2
7
A
4´
B 6´
C 3
6 5
4
Obrázek 3. Základní struktura flavonoidů
Mezi hlavní skupiny flavonoidů patří flavanoly, flavanony, flavony, flavonoly, proantokyanidiny, kyanidiny a izoflavonoidy. Některé zástupce už zmíněné v tabulce 1 znázorňuje obrázek 4.
13
4´
HO
O
3´
OH
4´
HO
O
OH OH
OH
OH
O
OH
CH3
kvercetin
(+)-katechin HO
3´
OH
OH
4´
O
O HO
OH
O
3´
OH
O OH
OH
O
hesperetin
genistein
Obrázek 4. Zástupci flavonoidů3
Flavonoidy zodpovědné za barvu květů hrají důležitou roli při opylování rostlin, avšak některé typy flavonoidů sehrávají roli v regulaci růstu a vývoje rostliny.4
2.1.2 Fenolické kyseliny Stejně jako flavonoidy jsou fenolické kyseliny a jejich deriváty přítomné v řadě potravin (káva, olivy, brambory, rajčata, včelí propolis, aj.) a rostlin, např. šalvěj červenokořenná (Salvia miltiorrhiza). Zastoupeny jsou především hydroxyskořicové kyseliny (kyselina kávová, ferulová, skořicová, aj.) (obrázek 5), méně hydroxybenzoové kyseliny (kyselina syringová, vanilová, aj.), a to převážně ve formě esterů, v nichž se váží karboxylem na hydroxylové skupiny organických kyselin nebo sacharidů.2,3 H3CO
COOH HO
COOH
COOH HO
kyselina skořicová
HO
kyselina ferulová kyselina kávová
Obrázek 5. Hydroxyskořicové kyseliny2
14
2.1.2.1 Biosyntéza kyseliny kávové Výchozími substráty pro biosyntézu kyseliny kávové a dalších polyfenolů (prekurzory ligninu a alkaloidů, fytohormony auxiny) jsou aminokyseliny tryptofan, tyrosin a fenylalanin.5,6 Klíčovým metabolitem nejen pro syntézu těchto aminokyselin, ale i pro řadu dalších důležitých látek je kyselina šikimová. Poprvé byla izolována z plodů badyáníku pravého (Illicium verum), jehož japonské pojmenování dalo název této kyselině.5 Metabolická dráha vychází z látek sacharidové povahy D-erytrosa-4-fosfátu 2 a fosfoenolpyruvátu 1.6,7 Jejich kondenzací a dalšími přeměnami za přítomnosti Co2+, nikotinamidových koenzymů (NADH, NADPH) a specifických enzymů vzniká šikimát 6 (schéma 1).
-
1 COOPO
COO H2O
CH2
PO
Pi
+
NAD
O
-
HO
+
NADH, H , Pi
COO
PO
H Co2+ O
HO
HO
OH
OH
-
COO NADP+
NADPH, H+
OH
HO
OH
O
6
5
OH
PO32-
OH
-
COO
P=
4
3
2
OH
O
OH
OH
Schéma 1. Biosyntéza šikimátu6,7
Schéma
2
znázorňuje
kondenzaci
fosforylovaného
šikimátu
7
s fosfoenolpyruvátem 1 za vzniku 3-fosfo-5-enolpyruvylšikimátu 8, který odštěpením fosfátu poskytuje chorismát 9. V tomto bodě se metabolická dráha větví na cestu vedoucí k aminokyselině tryptofanu a na cestu vedoucí k meziproduktu 10, který metabolickými pochody (dekarboxylací, aminací, dehydroxylací) poskytuje tyrosin a fenylalanin 11. Deaminací fenylalaninu 11 vzniká anion kyseliny skořicové 12-, který poskytuje postupnou hydroxylací para-kumarát 13 a anion kyseliny kávové 14-.6,7
15
-
COO
-
-
COO
COO ATP
1
-
COO
PO
ADP
CH2 P i CH2
Mg2+ OH
HO
OH
PO
OH
OH
OH
-
Pi
COO
+
-
-
NH3
dekarboxylace aminace dehydroxylace
11
COO
-
OOC
COO
CH2
O O
9
10 deaminace
-
COO
OH
OH
Tyrosin
-
-
-
COO
COO
hydroxylace
12-
COO
8
7
6
-
O
PO
COO
Tryptofan
hydroxylace
OH
14-
13 OH
OH
Schéma 2. Biosyntéza kyseliny kávové6
2.1.2.2 Deriváty kyseliny kávové Kyselina kávová 14 se v přírodě vyskytuje jak ve volné formě, tak i ve formě derivátů. Mezi deriváty obsahující pouze jednu jednotku kávové kyseliny patří např. fenylethylester kyseliny kávové (Caffeic Acid Phenethyl Ester, CAPE) 15 a chlorogenová kyselina 16. Kondenzací dvou molekul kyseliny kávové vzniká např. kyselina rozmarýnová 17, tří molekul např. kyselina lithospermová 18 a čtyř molekul např. kyselina lithospermová B 19. Jednotlivé jednotky jsou k sobě vázány esterovými vazbami, častý je výskyt i glykosidů.8 Zmíněné deriváty znázorňuje obrázek 6. 16
O HO
HO
COOH
O
15 14
HO
HO OH O
COOH
HO
17
O
OH
O
16
HO HO
O HO
HO
HO COOH
HO
HO COOH
OH
OH O
18
COOH
O O
OH
HO
OH HO HOOC HO
OH
O O
OH O
19
COOH
O O
OH
HO
Obrázek 6. Deriváty kyseliny kávové8
2.1.2.3 Metabolismus kyseliny kávové a jejich derivátů Přeměny kyseliny kávové se v lidských tkáních podobají metabolismu léčiv a jiných xenobiotik, kdy látky podléhají methylaci, konjugaci např. s glycinem nebo kombinaci těchto přeměn, což vede společně s bakteriálním působením (Escherichia coli, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus gasseri, aj.) v tlustém střevě k velkému počtu metabolitů (schéma 3).3,9,10
17
Po resorpci v tenkém střevě (schéma 3 – zelená část) je kyselina kávová biotransformována enzymy přítomnými v lidských tkáních (v játrech, v ledvinách, aj.). O HO
O H3CO OH COMT
14 HO
HO
dehydroxylace
redukce
redukce O
O
H3CO
HO
HO OH
21
OH
20
OH
OH
22
O
23 HO
HO
dehydroxylace β-oxidace
β-oxidace
β-oxidace O
O
O
H3CO
HO OH
OH
OH
26
25
24
HO
Gly O HO
Gly
Gly
O
O
OH
OH H3CO
NH
NH
29
28
27
OH NH
O
O
O HO
Schéma 3. Zjednodušené schéma metabolických přeměn kyseliny kávové3,9
Methylací katechol-O-methyltransferasou (COMT) se resorbovaná kyselina kávová 14 přeměňuje na kyselinu ferulovou 20. Methylace může probíhat i na hydroxylové skupině v para poloze aromatického jádra, vzniká tak kyselina izoferulová.9 Redukcí kyseliny ferulové 20 se tvoří kyselina dihydroferulová 23, po zkrácení postranního řetězce β-oxidací kyselina vanilová 26, která s glycinem poskytuje vaniloylglycin 29. Látky neresorbované v tenkém střevě podléhají v tlustém střevě bakteriálním dehydroxylačním reakcím (schéma 3 - červená část) a poté resorpci. Redukce hydroxylu probíhá častěji v para poloze aromatického jádra, takže z kyseliny kávové 14 vzniká kyselina meta-kumarová 21. Následným zkrácením postranního řetězce se tvoří kyselina 18
3-hydroxybenzoová 24, která s glycinem poskytuje 3-hydroxybenzoylglycin 27. Také dochází k bakteriální hydrogenaci v místě dvojné vazby a kyselina kávová 14 přechází na kyselinu 3,4-dihydroxyfenylpropionovou 22, která je redukována až na kyselinu benzoovou 25, která s glycinem kondenzuje na benzoylglycin 28. Zkracování postranního řetězce β-oxidací, ve schématu 3 znázorněno modře a částečně zeleně, probíhá pravděpodobně hlavně v játrech, vznikají tak deriváty kyseliny benzoové 24, 26 i samotná kyselina benzoová 25. Metabolismus derivátů kyseliny kávové není ještě zcela objasněn, ale je zřejmé, že některé deriváty jsou aktivované štěpením esterových vazeb a uvolněním kávové kyseliny.9,10 Fakt, že deriváty vykazují odlišný účinek než samotná kyselina kávová může být způsoben vyšší biologickou dostupností zapříčiněnou vyšší lipofilitou. Naopak u druhé skupiny derivátů zůstává nedotčená struktura aktivní formou (např. jako ligand receptoru) a v případě štěpení esterových vazeb nastává tudíž deaktivace (částečná nebo úplná) sloučeniny. Typické jsou redukční nebo hydrolytické reakce, např. chlorogenová kyselina 16 je hydrolyzována bakteriálními esterasami na kyselinu kávovou 14 a kyselinu chinovou.10
2.1.2.4 Biologická aktivita kyseliny kávové a jejich derivátů Jako většina sekundárních metabolitů vykazuje i kyselina kávová a její deriváty řadu biologických účinků, ať už prospěšných nebo škodlivých. Hlavním biologickým účinkem je antioxidační schopnost, která bude podrobněji rozebrána níže. Mezi další účinky patří např. protizánětlivý, antikarcinogenní, antimikrobiální a další.
2.1.2.4.1 Antioxidační účinek Antioxidační účinek je schopnost látky přerušit radikálovou reakci terminací reaktivních forem, nejčastěji kyslíku (Reactive Oxygen Species, ROS) a dusíku (Reactive Nitrogen Species, RNS). ROS (RNS) mohou být volné radikály, reaktivní aniony obsahující atom kyslíku (dusíku) nebo molekuly s kyslíkem (dusíkem), které buď mohou vytvořit volné radikály nebo jsou volnými radikály aktivovány.11,12,13 Příklady reaktivních forem kyslíku a dusíku jsou uvedeny v tabulce 2.14
19
Tabulka 2. Reaktivní formy kyslíku a dusíku14
Volné radikály Látky neradikálové povahy Reaktivní formy kyslíku Superoxid O2•- Peroxid vodíku H2O2 Hydroxylový radikál HO• Kyselina chlorná HOCl Alkoxylový radikál RO• Ozon O3 • 1 Peroxylový radikál ROO Singletový kyslík O2 Reaktivní formy dusíku Oxid dusnatý NO• Peroxodusitan ONOOOxid dusičitý NO2• Dusitany NO2Dusičnany NO3Nitrosyl NO+ Antioxidační účinek je také schopnost látky omezit tvorbu škodlivých radikálů chelatací iontů přechodných kovů (především kationů železa a mědi) katalyzující oxidaci.2,3 ROS a RNS mohou v lidském těle vzniknout mnoha přirozenými i nepřirozenými způsoby; jejich přítomnost působí škodlivě na všechny druhy buněk, např. oxidaci lipidů, oxidační modifikaci proteinů a poškození DNA (tabulka 3).13,14 Tabulka 3. Poškození biologicky důležitých molekul14
Cíl Poškození Nenasycené mastné ztráta dvojných vazeb, kyseliny v lipidech tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy)
Proteiny
DNA
agregace a síťování, fragmentace a štěpení, modifikace thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin, reakce s hemovým železem štěpení kruhu deoxyribosy, modifikace a poškození bazí, zlomy řetězce, křížové vazby řetězců
20
Následky změněná fluidita lipidů, změna v propustnosti membrán, vliv na membránově vázané enzymy, tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy změny v transportu iontů, vstup Ca2+ do cytosolu, změny v aktivitě enzymů
mutace, translační chyby, inhibice proteosyntesy
Antioxidační schopnost vyplývá ze specifické struktury (poloha a počet hydroxylových skupin, typ dalších substituentů). Strukturní faktory podmiňují snadnost odštěpení vodíku z molekuly antioxidantu, čímž dochází k inaktivaci škodlivých radikálů. V případě polyfenolů, tedy i kyseliny kávové a jejich derivátů, je důležitým faktorem míra stabilizace vzniklého radikálu antioxidantu na málo reaktivní fenoxylový radikál 30 nebo neradikálové chinoidní struktury 31 (schéma 4).2 Mezi další faktory řadíme snadnost reakce s jiným radikálem. Účinnost antioxidantů je také ovlivňována funkčními skupinami v molekule určujícími polaritu a hydrofobně-lipofilní vlastnosti molekuly.
O
OH OH
A
R
O OH
RH
A
R
O
RH
A
30
31
Schéma 4. Zjednodušené schéma reakce polyfenolických kyselin s volným radikálem2
3. Buněčná linie P19/A15 Embryonální rakovinné (Embryonal Carcinoma, EC) buňky P19 izolované z teratokarcinomu pokusných myší si částečně zachovaly charakter embryonálních kmenových buněk.15 Jsou schopné diferenciace v buňky všech tří zárodečných listů (ektoderm, mezoderm, entoderm), z nichž vznikají v průběhu dalšího vývoje orgánové soustavy. Modifikovaná buněčná linie P19/A15 má transfekovaný gen ovlivňující exprimaci luciferázy, který je pod kontrolou receptorů kyseliny retinové (Retinoic Acid Receptor, RAR).16 EC buňky P19/A15 jsou tedy vhodný model pro hodnocení toxicity látek narušující retinoidní signalování.
3.1 Retinoidy Retinoidy jsou deriváty vitaminu A, které mají důležitou roli při vývoji různých tkání obratlovců a to díky vlivu na buněčnou proliferaci, diferenciaci a apoptózu.16,17 Vitamin A je sám o sobě neúčinný, a proto musí být metabolizován na některý z aktivních metabolitů.18 Patří mezi ně kyselina retinová (Retinoic Acid, RA), vyskytující
21
se ve třech základních strukturních typech (kyselina all-trans retinová (All-TransRetinoic Acid, ATRA), 9-cis-retinová kyselina, 13-cis-retinová kyselina) (obrázek 7).19 Dále retinol (obrázek 7), estery kyseliny retinové a také karotenoidy (β-karoten) (obrázek 2).17 CH3
H3C
CH3
CH3
7
6
9 10 8
H3C
CH3
CH3
CH3
OH
ATRA CH3
H3C
O
9-cis-retinová kyselina
CH3
O
H3C
CH3
CH3
OH
retinol CH3
Obrázek 7. Retinoidy19
Suzuki a spolupracovníci v roce 2006 objevili 3 nové ligandy (deriváty kyseliny kávové) aktivující RAR.20 Jedná se o již zmíněný CAPE 15 (obrázek 6), který je známou komponentou včelího propolisu, a dále o farnesyl- a geranylester kyseliny kávové (obrázek 8). O
CH3
CH3
CH3
HO O
CH3
farnesylester kyseliny kávové HO O
CH3
CH3
HO O
HO
CH3
geranylester kyseliny kávové
Obrázek 8. Nové ligandy pro RAR20
22
OH
3.2 Receptory retinoidů Velmi významnou roli v procesech embryotoxicity (vlastnost látek, která se projevuje nepříznivými účinky na zárodek; smrtí zárodku) a teratogenity (vlastnost látek, která způsobuje trvalé funkční nebo strukturní abnormality (malformace) během období embryonálního vývoje) hrají především obecné retinoidní receptory (Retinoid X Receptor, RXR) a již zmíněné receptory kyseliny retinové (RAR), jejichž přirozenými ligandy jsou retinoidy.21,22 RAR i RXR patří do skupiny jaderných hormonálních receptorů zahrnující okolo 48 známých receptorů, např. receptor vitaminu D, receptory steroidních hormonů (glukokortikoidy, mineralokortikoidy), aj.17 RXR je aktivován pouze 9-cis-retinovou kyselinou, kdežto aktivaci RAR způsobuje jak 9-cis-retinová kyselina, tak ATRA.21,23 Obrázek 9 znázorňuje zjednodušené schéma RAR/RXR mechanismu v EC buňkách P19/A15. RAR a RXR se vyskytují v jádře buňky.24 Po navázání specifických ligandů, tedy retinoidů, změní RAR svou konformaci a dojde k vytvoření heterodimeru s RXR.24 Heterodimer je navázán na specifické místo DNA (plazmid RARE-luc). Navázáním dojde k aktivaci transkripce a dochází ke spuštění genové exprese, tedy syntéze luciferázy. Po reakci luciferázy s dodaným substrátem, luciferinem 32, dochází k vzniku oxyluciferinu 33 (schéma 5).18,25 Reakce je doprovázena luminiscencí (světlem), která je stanovena na luminometru.
RXR RAR
RXR
retinoidy
XXXXXXXX XXXXXXX
RAR RXR RAR
světlo
RAR
RARE-luc
luciferáza
luciferin
Obrázek 9. Zjednodušené schéma mechanismu RAR/RXR v EC buňkách P19/A1517
23
H N
N
S
S
COOH
luciferáza HO
H
ATP, Mg2+
N
N
HO
S
S
N
N
COOAMP
32 PPi
luciferáza O2 O N
AMP
O
N O
HO
S
S
O
+ CO2
S
HO
hν
S
33
Schéma 5. Vznik luminiscence25
4. Fotochemická E-Z izomerace Obecně je za izomeraci považována chemická reakce, při níž se mění struktura látky, ale počet i druh atomů tvořících molekulu zůstává stejný. E-Z izomerace, nazývaná též cis-trans nebo syn-anti, je geometrickou izomerací, která probíhá ve sloučeninách obsahujících dvojnou vazbu (např. C=C, C=N, N=N).26 Omezená rotace kolem dvojné vazby umožňuje molekulám vyskytovat se v odlišných konfiguracích; Z-izomer (z něm. zusammen) mající prioritní atomy na stejné straně dvojné vazby a E-izomer (z něm. entgegen), když jsou na opačných stranách.27 Pořadí priority je určováno Cahnovými-Ingoldovými-Prelogovy pravidly. V nejjednodušším případě, systém obsahující jednu dvojnou vazbu může být zastoupen pouze dvěma geometrickými izomery. Dochází-li pouze k interkonverzi, poměr výskytu obou izomerů závisí na rozdílu Gibbsovy energie (∆G°) mezi izomery.27 Za předpokladu nízké rotační bariéry (∆G‡) může docházet k neustálým vzájemným přeměnám obou forem. Obecné schéma E-Z izomerace znázorňuje obrázek 10.
24
G
++
∆G
∆G° A
A
A
A
E-izomer
Z-izomer
Obrázek 10. Obecné schéma E-Z izomerace27
Teoreticky pro systém obsahující n izomeračně schopných vazeb je možný výskyt n
2 izomerů, přičemž obecně platí, že více konjugovaný systém má nižší energetickou bariéru izomerace.27 E-Z izomerace může být aktivována termicky nebo fotochemicky (přímou absorpcí fotonu nebo fotosenzibilací).26 Po absorpci elektromagnetického záření (světla) molekulou v základním stavu (S0) dojde k excitaci obvykle jednoho elektronu z nejvyššího obsazeného orbitalu (HOMO) do nejbližšího neobsazeného orbitalu s vyšší energií (LUMO).26 Excitovaný stav může být singletový (S1, S2), kde jsou spiny obou elektronů antiparalelní, nebo tripletový (T1, T2), kde jsou spiny elektronů paralelní. Excitovaná molekula se své zvnějšku dodané energie může zbavit různými deaktivačními způsoby, buď emisí světla (zářivý proces) – fluorescence (S1→S0), fosforescence (T1→S0) nebo zvýšením tepelné energie systému (nezářivý proces). Mezi nezářivé procesy patří – vnitřní konverze (“dovolený“ přechod mezi stavy se stejnou spinovou multiplicitou, např. S2→S1), mezisystémový přechod (“zakázaný“ přechod mezi excitovanými stavy s rozdílnou spinovou multiplicitou, např. S1→T1) a vibrační relaxace (přechod z vyšších vibračních stavů do nižších). Poslední možné způsoby deaktivace excitované molekuly je bimolekulární přenos energie (ET), přenos elektronu (eT) nebo podstoupení fotochemické reakci. Za fotochemickou reakci se považuje chemická změna, při níž dochází např. ke fragmentaci, reakci s další
25
molekulou nebo v našem případě zajímavější spontánní izomeraci.26 Jednotlivé základní elektronové stavy a zároveň nejdůležitější aktivační i deaktivační procesy jsou znázorněny v tzv. Jabłoňskiho diagramu (obrázek 11).28
vibrační relaxace vnitřní konverze
S2
mezisystémový přechod S1
ES
T1
ET
fotochemické reakce, ET, eT fluorescence
absorpce
E0
S0 nezářivá deaktivace
fosforescence v=3 v=2 v=1 v=0
nezářivé procesy zářivé procesy
Obrázek 11. Jabłoňskiho diagram26,28
Molekuly jsou zastoupeny při neměnících se vnějších podmínkách převážně termicky stabilnějším izomerem, nejčastěji se jedná o E-izomer. Během kontinuálního ozařování jednoho izomeru při jedné vlnové délce dochází k překonání rotační bariéry
∆G‡ a sloučenina je zastoupena E i Z izomerem v konstantním poměru, který odpovídá poměru molárních absorpčních koeficientů obou izomerů (εE, εZ) pro danou vlnovou délku podle uvedené rovnice:
[E] / [Z] = (εZ ΦZ-E) / (εE ΦE-Z). ΦZ-E a ΦE-Z jsou kvantové výtěžky Z→E, respektive E→Z izomeračních reakcí.26 Tento ustálený stav se nazývá fotostacionární stav (photostationary state, PSS). Z výše zmíněné závislosti molárních absorpčních koeficientů na vlnové délce je patrné, že PSS je ovlivnitelný volbou vlnové délky.
26
Následující kapitoly se blíže zaměřují na E-Z izomeraci acyklických alkenů (C=C) a azosloučenin (N=N).
4.1 E-Z izomerace na dvojné vazbě C=C E-Z izomerace na dvojné vazbě C=C je založena na disociaci π-vazby a následném otočení kolem vzniklé jednoduché vazby, přičemž rotační pohyb doprovází postupné změny v hybridizaci; sp2 → sp3 → sp2 .27 Pro C=C vazbu je typický elektronový přechod z vazebných π do antivazebných π* orbitalů. Obrázek 12 (převzat z lit. 26) znázorňuje v diagramu (i) energie vazebného molekulového orbitalu (MO) π a antivazebného MO π* ethylenu jako funkce torzního úhlu θ. Disociace π-vazby je doprovázena dramatickým růstem energie systému, zatímco energie π* orbitalu klesá. Při torzním úhlu 90° (kolmé konformaci) se π a π* orbitaly transformují na dva p orbitaly, každý na jednom uhlíkovém atomu.
E [kJ mol-1]
E [kJ mol-1]
(i)
400
π*
1200
π*
(ii)
S2
π*2
S1
C C
800
200 0
ππ∗
C C
π2
S0 0
45
90
135
180
0
ππ∗
3
T1
400
π
1
45
θ []
90
135
180
θ []
o
o
Obrázek 12. Korelační diagramy ethylenu26
V diagramu (ii) obrázku 12 jsou srovnány energie π-elektronových stavů ethylenu jako funkce torzního úhlu θ. Z něj vyplývá, že fotoindukovaná E-Z izomerace alkenů probíhá přes reaktivní meziprodukty charakteru zwitterionového (S1, S2) nebo biradikálového (S0, T1), v závislosti na typu excitovaného stavu.26 Zwitterion, též nazýván hybridní či obojetný ion, je ion s výsledným nábojem nula (nenabitá molekula), avšak obsahující víceméně izolované kationové a anionové centrum. Jako biradikál je označována molekula obsahující sudý počet elektronů a dvě radikálová centra (s 27
možností delokalizace), které reagují nebo interagují téměř nezávisle. Za povšimnutí stojí i energetická náročnost E-Z izomerace; izomerace molekuly v S0 je silně endotermní, kdežto reakce exotermního charakteru nastává v T1 nebo v obou excitovaných singletových stavech. E-Z izomerace alkenů může být iniciována již zmíněnou přímou absorpcí fotonu a následnou excitací valenčního elektronu z HOMO do LUMO. Excitované stavy jsou z kvantově-mechanického hlediska nejpravděpodobněji singletové. Ty jsou však u jednoduchých alkenů energeticky náročné (obrázek 12 (ii)); konjugovanost alkenových systému energetickou náročnost excitovaných singletových stavů snižuje.27 Dalším způsobem excitace je přenos energie z tripletového fotosenzibilátoru 3
Sens*, čímž je docílena excitace molekuly alkenu (M) do tripletových stavů
nepřístupných přímým ozářením. Molekula alkenu slouží tedy jako zhášeč (deaktivátor) tripletového stavu senzibilátoru, proto se reakce nazývá tripletové zhášení (obrázek 13).26
S1 S1 T1 3
Sens* + 1M
T1
E
S0
1
Sens + 3M*
S0 3
Sens*
M
Obrázek 13. Tripletové zhášení26
Jelikož alkeny neochotně podstupují mezisystémový přechod („zakázaný“ přechod), využití tripletových fotosenzibilátorů je značné.29 Nejlepších výsledků je dosaženo použitím aromatických senzibilátorů (např. p-xylen, fenol, aj.). Posledním způsobem iniciace E-Z izomerace alkenů je fotokatalýza (Schenckův mechanismus) (schéma 6).26
28
hν
Sens
Sens* R
R
H
+
Sens*
H
R
H
H
Sens
Sens H
R
R
H
R
- Sens
- Sens
R
H
R
R
H
R
H
H
Schéma 6. Schenckův mechanismus26
Schenckův
mechanismus
je
chemická
transformace
molekuly
způsobená
senzibilátorem, který podporuje utváření přechodné kovalentní vazby s danou molekulou.30 Nejprve dojde k adici senzibilátoru na dvojnou vazbu molekuly, následně vytvoření biradikálu, rotaci kolem vzniklé C-C vazby a nakonec k odštěpení senzibilátoru
z
transformované
molekuly.
Nejlepšími
senzibilátory
v tomto
biradikálovém mechanismu jsou ketony (např. alkylarylketony), podporující E-Z izomeraci alkenů (schéma 7).31 O R1
O
H
hν
+ Ph
CH3
R1 O
Ph
Ph H
R2
R2
H
CH3
R1 O
H
CH3
+
R1
R2
oxetan Ph R2 CH3
Schéma 7. Schenckův mechanismus31
Cykloadiční produkt (oxetan) ve schématu 7 naznačuje, že fotoindukovaná E-Z izomerace alkenů je často doprovázena vedlejšími fotoreakcemi. Dominantní cestu
29
deaktivace excitovaných acyklických alkenů tedy mohou mimo zmíněné cykloadice doprovázet adice, fragmentace, přesmyky a elektrocyklizační reakce.26,32 Zastoupení jednotlivých vedlejších reakcí je silně ovlivněno nejen intenzitou záření, selekcí rozsahu vlnových délek, ale i strukturou výchozí látky (sterické efekty, aj.) a také prostředím, v němž se excitovaná molekula nachází. V úvodu zmíněná (π,π*) excitace alkenů není zcela přesná u více substituovaných alkenů, kde přítomnost tzv. Rydbergova excitovaného stavu π,R(3s) způsobuje širokou variabilitu adičních produktů (alkoholů, etherů) v protickém prostředí.29 Rydbergův excitovaný stav je charakteristický slabě vázanými elektrony přecházejícími do polárních rozpouštědel.26 Dobře známým příkladem je přímé ozáření 2,3-dimethyl-2-butenu 34 v alkoholu (schéma 8).29
H3C
CH3
H3C
CH3
hν
H3C
CH3
_ "Rydberg"
+ 34
H3C
ROH - H+
H H3C
CH3
H3C
CH3
CH3 OR
H H3C
H3C
H H3C
H3C
CH3 CH3
H3C
CH3
+
H3C
CH3
H2C
H3C
CH3
e-
CH3
CH3 OR
H
+
CH3
H3C
+
CH3 OR
H2C
CH3
majoritní
minoritní
Schéma 8. Fotoreakce alkenu v protickém prostředí29
Příkladem cyklizace je např. vznik dihydrofenanthrenu 36 doprovázející E-Z izomeraci stilbenu 35 (schéma 9).27
30
hν
hν
H
∆ H
Z-35
E-35
36
Schéma 9. E-Z izomerace stilbenu27
Na závěr stojí za zmínku i geometrie excitovaných molekul, neboť je často odlišná od molekul v základním stavu. Velké změny jsou pozorovány např. u ethylenu (obrázek 14).26
S1
S0 H
H
H
T1 H
H
H
0,135 nm
H
H
H
_
+ H
H
H
0,144 nm
0,158 nm
Obrázek 14. Geometrie molekuly ethylenu26
Obrázek 14 naznačuje tvar molekuly ethylenu jak v základním stavu, tak v excitovaných stavech, kde má molekula charakter zwitterionu (S1) nebo biradikálu (T1). Uvedené délky vazeb v nanometrech napovídají o charakteru vazby; v případě C-C vazby v T1 je délka velmi blízká jednoduché C-C vazbě v ethanu (0,154 nm), což je způsobeno lokalizací spinově nespárovaných elektronů.
4.2 E-Z izomerace na dvojné vazbě N=N Bohaté spektrum fotochemických reakcí azosloučenin poskytuje dvojná vazba N=N. Jejich reaktivita je ovlivněna přítomností nevazebného elektronového páru na každém atomu dusíku. V azosloučeninách se mimo (π,π*) přechodu tedy vyskytuje navíc (n,π*) přechod (obrázek 15).26
31
π*
π*
π
n
n
π (π,π*)
(n,π*)
Obrázek 15. Elektronové přechody (π,π*) a (n,π*)26
Nejlépe fotochemicky prostudovanou azosloučeninou je bezesporu azobenzen, který podléhá účinkem záření E-Z izomeraci (schéma 10).33
h ν / ΦE
N N
N
N
hν´ / ΦZ
∆ / kizo
E-azobenzen
Z-azobenzen
Schéma 10. E→Z a Z→E izomerace azobenzenu33
Schéma 10 prozrazuje podmínky E→Z a Z→E izomerace azobenzenu. Jak už bylo jednou zmíněno, během kontinuálního ozařování při jedné vlnové délce je molekula zastoupena E i Z izomerem v konstantním poměru ve PSS, avšak v tomto případě je poměr izomerů více nebo méně ovlivněn rychlostní konstantou kizo termické Z→E izomerace; aktivační energie se pohybuje mezi 88 až 100 kJ/mol.33 Z-azobenzen je méně stabilnější než E-azobenzen přibližně o 50 kJ/mol, proto je pro jeho izolaci ze směsi obou izomerů nutná nízká teplota.33,34 Pro studium fotochemické izomerace azobenzenu je zapotřebí znalost absorpčních spekter (graf 1).
32
10-3ε / [dm3mol-1cm-1]
E-azobenzen Z-azobenzen
vlnová délka / [nm]
Graf 1. Absorpční spektra E- a Z-azobenzenu v ethanolu33 E-azobenzen vykazuje malou absorpci ve viditelné oblasti (λmax = 444 nm/ε ≈ 440 dm3 mol-1 cm-1), což odpovídá n→π* přechodu, a vysokou absorpci v UV oblasti (λmax = 316 nm/ε ≈ 22000 dm3 mol-1 cm-1) charakterizující π→π* přechod. Naopak Z-azobenzen vykazuje vysokou absorpci při n→π* přechodu ve viditelné oblasti (λmax = 437 nm/ε ≈ 1100 dm3 mol-1 cm-1) a malou absorpci při π→π* přechodu v UV oblasti (λmax=270 nm/ε ≈ 5000 dm3 mol-1 cm-1).33 E-Z izomerace azobenzenu probíhá hlavně přes excitované singletové stavy a jsou možné dva různé mechanismy (schéma 11).33,34
33
θ N
S0
inverze
N
S1
E-azobenzen
n-π* N
N
N
N
π-π* S0
Z-azobenzen
ϕ
S2
NH
NH
rotace
hν, ∆
Schéma 11. Mechanismy izomerace azobenzenu33,34
Rotace kolem vazby mezi dusíky je spojena s redukcí dvojné vazby podobně jako např. u stilbenu a je energeticky náročnější, než inverze. Inverze jednoho substituentu na dusíku v rovině molekuly je doprovázena rehybridizací daného dusíku s malou změnou na π-vazbě.33 U substituovaných azobenzenů může být rotace i inverze bráněna sterickou překážkou. E-Z izomerace azosloučenin jsou tedy stejně jako u acyklických alkenů doprovázeny vedlejšími reakcemi. Nejčastější je fragmentace molekuly za současného uvolnění molekuly dusíku a vznikající radikály mohou iniciovat další reakce (např. polymerace nebo cyklizace). Např. ozařováním 1,4-dihydronafto[1,8-de][1,2]diazepinu 37 vzniká biradikálový meziprodukt poskytující 1,2-dihydroacenaftylen 38 (schéma 12).35
34
N
N
Z-37
hν 2 - N2
hν 1
hν1´, ∆
N
- N2
N
38
hν 2 E-37
Schéma 12. Fragmentace azosloučeniny35
Na závěr stojí za zmínku změna geometrie molekuly azobenzenu, přesněji její délky vlivem E-Z izomerace (schéma 13). Této změny se společně se změnou absorpčních spekter využívá v praktických aplikacích (např. světlem řízený transport K+ přes membrány pomocí crown-eterů s azobenzenovým víčkem, fotopřepínače na bázi zeolitů svírající molekulu azobenzenu, nanomotor ze syntetického polymeru azobenzenu či molekulové optoelektronické rozvaděče na bázi univerzálních cyklodextrinových derivátů (obrázek 16 - převzat z lit. 33), aj.).33,34
° = 0,1 nm 1A
h ν / ΦE
° 9,0 A
N N
hν´ / ΦZ
∆ / kizo
N
° 5,5 A
N
Schéma 13. Změna geometrie molekuly azobenzenu vlivem izomerace34
35
Obrázek 16. Permethylovaný α-cyklodextrin s azobenzenem33
36
5. Experimentální část 5.1 Použité přístroje Body tání byly měřené na Koflerově bloku VEB Wagetechnik Rapido 79/2106 a jsou nekorigované. Spektra protonové nukleární magnetické rezonance (1H NMR) byla měřena na spektrometru Bruker AVANCE 300 (při 300 MHz). Chemické posuny jsou udávány v relativních jednotkách, ppm (δ), a byly vztaženy na vnitřní standard tetramethylsilan (TMS) při δ = 0,00 ppm. Spektra uhlíkové nukleární magnetické rezonance (13C NMR) byla měřena na spektrometru Bruker AVANCE 300 (při 75,5 MHz). Chemické posuny jsou udávány v relativních jednotkách, ppm (δ), a byly vztaženy na vnitřní standard tetramethylsilan (TMS) při δ = 0,00 ppm. Hmotnostní spektra byla měřena Ing. Mgr. Lubomírem Prokešem kombinovanou metodou GC-MS na GCMS-QP 2010 firmy Shimadzu (30 eV), s plynovým chromatografem SHIMADZU GC-2010 s kolonou DB-XLB (d = 58 m, i.d. = 0,25 mm, 0,25 µm film stacionární fáze) nebo za použití přímého vstupu na FISONS INSTRUMENTS TRIO 1000 v pozitivním módu s EI. Vysokoúčinná
kapalinová
chromatografie
(HPLC)
byla
prováděna
na
chromatografu SHIMADZU LC-10ADVP s dávkovačem Rheodyne 7725i, na skleněné koloně Tessek SGX C-18 (∅částic = 7 µm, i.d. = 3 mm, d = 150 mm). Jako detektor byl použit UV spektrometr SHIMADZU SPD-10AVP. Jako nejvhodnější mobilní fáze byla experimentálně určená směs acetonitril:voda v objemovém poměru 7:2. Plynová chromatografie (GC) byla prováděna na chromatografu SHIMADZU GC2010 na koloně Supelco SPB 5 (15 m × 0,1 mm, 0,1 µm film stacionární fáze) s plamenově ionizačním detektorem a heliem jako nosným plynem. Ultrafialová absorpční spektra (UV) byla měřena na SHIMADZU UV 1601 UVVIS spektrofotometru v 1,0 cm křemenných kyvetách oproti čistému rozpouštědlu. Na analytickou chromatografii na tenké vrstvě (TLC) byl použitý silikagel na hliníkové fólii – Silikagel 60 F254 (Merck) a skvrny byly detekované pod UV lampou při 254 nm. Sloupcová chromatografie byla provedena na silikagelu (Merck 63 – 100 µm). Jako zdroj UV záření byla používána středotlaká rtuťová výbojka s výkonem 400 W od firmy Teslamp, temperovaná pomocí chladicího prstu z křemenného skla.
37
Jako zdroj UV záření byla používána optická lavička, která sestávala ze zdroje UV záření – HBO 202 (VEB Narva) 200 W fokusované vysokotlaké rtuťové výbojky a monochromátoru Oriel Instruments CornerStone 130 1/8 m (model 7400) s mřížkou 200 – 1600 nm, která byla nastavena na 345 ± 5 nm (360 ± 5 nm). Součástí optické lavičky pro měření kvantových výtěžků je detektor Oriel OPM od Oriel Instruments (model 71850) a program TRACQ32 pro vyhodnocování naměřených dat. Jednotlivé roztoky byly ozařovány v 1 cm křemenných kyvetách při 20 °C (10 °C) a před ozařováním byly 10 min bublány argonem kvůli odstranění kyslíku. Kyveta byla temperována Peltierovým článkem Con Brio. K měření luminiscence byl používán luminometr TECAN Genios. K měření absorbance byl používán spektrofotometr BioTec Powerwave, všechny látky byly měřeny při 570 nm. .
5.2 Použité chemikálie Kávová kyselina (98 %) byla zakoupena od firmy Sigma a používána bez dalšího čištění. (E,E)-hexa-2,4-dien-1-ol (97 %), N,N´-dicyklohexylkarbodiimid (99 %) a N,Ndimethylformamid (99 %) byly zakoupeny od firmy Aldrich a používány bez dalšího čištění. Methyljodid (99 %) byl zakoupen od firmy Fluka a používán bez dalšího čištění. Azobenzen (čistý) od firmy Reachim (USSR) byl rekrystalizován. Monohydrát PTSA (99+ %) byl zakoupen od firmy Merck a používán bez dalšího čištění. Methanol, chloroform, isopropanol, ethanol, dekan-1-ol, n-butanol, benzen, kyselina octová a ethylester kyseliny octové (ethyl-acetát) byly použity tak, jak byly dodány firmou PENTA. Dioxan a THF byly předestilovány za normálního tlaku a vysušeny. Kultivační médium červené DMEM (1 % L-glutamin, 10 % fetální bovinní sérum, fenolová červeň) a trypsin-EDTA (0,05 %) byly dodány firmou PAA. Kultivační médium bílé DMEM/F12 (1 % L-glutamin, 10 % fetální bovinní sérum), DMSO (p.a.) a ATRA (98 %) byly dodány firmou Sigma-Aldrich. Luminiscenční kit Steady-Glo (Promega) byl dodán firmou EastPort. PBS, lyzační pufr a lyzační směs byly vyrobeny na pracovišti RECETOX.
38
5.3 Příprava a vlastnosti látek 5.3.1 Methylester (E)-kávové kyseliny O HO
CH3 O
HO
Postup upraven podle literatury.36 Do 250 ml kulaté zábrusové baňky byl navážen 1,0 g kávové kyseliny (5,6 mmol), 100 mg monohydrátu PTSA (0,6 mmol) a vše bylo rozpuštěno ve 170 ml methanolu. Vzniklá reakční směs byla refluxována za průběžné kontroly reakce pomocí TLC (chloroform:methanol 9:1) až do téměř úplného vymizení skvrny výchozí kávové kyseliny (10 hodin). Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na rotační vakuové odparce (RVO). Surový produkt byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s mobilní fází chloroform:methanol (9:1) a nakonec rekrystalizován z ethyl-acetátu.
Výtěžek: 40 % čistého produktu Molekulový vzorec: C10H10O4 Vzhled: bílá pevná látka Bod tání: 159,6-161,2 °C Molární hmotnost (g mol-1): 194,18 MS (EI, m/z): 194, 163, 134, 117, 89, 77 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,80 (s, 3H), 6,25 (d, 1H, J=15,8 Hz), 6,87 (d,
1H, J=8,1 Hz), 6,94 (dd, 1H, J1=8,1 Hz, J2=1,7 Hz), 7,11 (d, 1H, J=1,7 Hz), 7,58 (d, 1H, J=15,8 Hz), 8,41 (bs, 2H) 13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 51,2; 114,1; 114,2; 115,4; 121,5; 126,3; 145,0;
145,1; 147,5; 167,7 FTIR (KBr, cm-1): 3477, 3325, 3093, 1680, 1626, 1606, 1446, 1282, 1192
39
5.3.2 Methylester (Z)-kávové kyseliny HO CH3 HO
O
O
Postup upraven podle literatury.37,38 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky bylo naváženo 0,4 g methylesteru (E)-kávové kyseliny (2,1 mmol) a rozpuštěno ve 40 ml ethanolu. Vzniklá reakční směs byla v inertní atmosféře argonu ozařována 400 W UV lampou přes filtr 2 M roztoku KNO3 (λozař = 345 nm) 1 hodinu. Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na RVO. Surový produkt obsahující směs obou izomerů kávové kyseliny byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s mobilní fází benzen:octová kyselina (5:1) a nakonec rekrystalizován z ethyl-acetátu.
Výtěžek: 24 % čistého produktu Molekulový vzorec: C10H10O4 Vzhled: nažloutlá pevná látka Bod tání: 152,0-153,2 °C Molární hmotnost (g mol-1): 194,18 MS (EI, m/z): 194, 163, 134, 117, 89, 77 1
H NMR (300 MHz, DMSO): δ (ppm) 3,71 (s, 3H), 5,78 (d, 1H, J=15,8 Hz), 6,79 (d,
1H, J=8,2 Hz), 7,02 (dd, 1H, J1=8,2 Hz, J2=2,1 Hz), 7,06 (d, 1H, J=2,1 Hz), 7,51 (d, 1H, J=15,8 Hz), 8,41 (bs, 2H) 13
C NMR (75,5 MHz, DMSO): δ (ppm) 51,1; 113,7; 114,8; 115,7; 121,3; 125,5; 145,1;
145,6; 148,4; 166,9 FTIR (KBr, cm-1): 3477, 3325, 3093, 1680, 1626, 1606, 1446, 1282, 1192
40
5.3.3 Methyl-(E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenoát O O
CH3
H3C
O
H3C O
Postup upraven podle literatury.39 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky bylo naváženo 0,5 g kávové kyseliny (2,8 mmol) a rozpuštěno v 5 ml DMF. Ke vzniklé směsi bylo jednorázově přidáno 2,5 ml methyljodidu a 1,25 g Na2CO3. Reakční směs byla míchána 24 hodin při 60 °C. Potom byla směs zředěna přidáním 20 ml destilované vody a následně protřepána ethylacetátem (3×10 ml). Organická vrstva byla vysušena MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Surový produkt byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s chloroformem jako mobilní fází. Získaný produkt byl dostatečně čistý, proto nebyl dále čištěn.
Výtěžek: 56 % čistého produktu Molekulový vzorec: C12H14O4 Vzhled: bílá pevná látka Bod tání: 66,5-67,0 °C Molární hmotnost (g mol-1): 222,24 MS (EI, m/z): 222, 191, 164, 147, 119, 91, 77 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,74 (s, 3H), 3,84 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 6,26 (d,
1H, J=15,8 Hz), 6,80 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,00 (d, 1H, J=1,7 Hz), 7,04 (dd, 1H, J1=8,3 Hz, J2=1,7 Hz), 7,58 (d, 1H, J=15,8 Hz) 13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 51,5; 55,9; 55,9; 109,8; 111,2; 115,5; 122,6;
127,4; 144,7; 149,3; 151,2; 167,6 FTIR (KBr, cm-1): 3457, 2937, 2353, 1703, 1512, 1439, 1263, 1159
41
5.3.4 (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenová kyselina O O H3C
OH
H3C O
Postup byl upraven podle literatury.40 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky bylo naváženo 126 mg methyl-(E)-3-(3,4dimethoxyfenyl)propenoátu (0,6 mmol) a rozpuštěno v 50 ml roztoku NaOH (4 mol l-1). Reakční směs byla refluxována 2 hodiny a poté okyselena konc. HCl na pH 2. Následně byla reakční směs se vzniklou sraženinou ponechána míchání při pokojové teplotě další 2 hodiny. Sraženina byla zfiltrována, promyta destilovanou vodou (3×5 ml) a nakonec rekrystalována ve směsi ethanol/voda. Získaný produkt byl dostatečně čistý, proto nebyl dále čištěn.
Výtěžek: 99 % čistého produktu Molekulový vzorec: C11H12O4 Vzhled: bílá pevná látka Bod tání: 182,3-183,9 °C Molární hmotnost (g mol-1): 208,21 MS (EI, m/z): 208, 164, 149, 121, 103, 91, 77 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,92 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 6,32 (d, 1H, J=16,0
Hz), 6,88 (d, 1H, J=8,4 Hz), 7,08 (d, 1H, J=2,0 Hz), 7,14 (dd, 1H, J1=8,4 Hz, J2=2,0 Hz), 7,73 (d, 1H, J=16,0 Hz), 8,88 (bs, 1H) 13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 56,2; 56,2; 110,3; 111,5; 115,0; 123,2; 127,4;
147,1; 149,6; 151,9; 171,9 FTIR (KBr, cm-1): 3433, 2933, 2360, 1682, 1624, 1514, 1261, 1140, 1024
42
5.3.5 Butylester kávové kyseliny O HO O
CH3
HO
Postup upraven podle literatury.36 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky byl navážen 1,0 g kávové kyseliny (5,6 mmol) a rozpuštěn v 56 ml suchého dioxanu pod atmosférou argonu. Ke vzniklé směsi bylo jednorázově přidáno 1,2 ml SOCl2. K reakční směsi bylo po 3 hodinách míchání při 100 °C přidáno po kapkách 0,8 ml n-butanolu (8,4 mmol). Reakční směs byla míchána při 100 °C dalších 6 hodin. Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na RVO. Surový produkt byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s mobilní fází chloroform:methanol (9:1) a nakonec rekrystalizován z hexanu.
Výtěžek: 23 % čistého produktu Molekulový vzorec: C13H16O4 Vzhled: světle hnědá pevná látka Bod tání: 106-108,5 °C Molární hmotnost (g mol-1): 236,26 MS (EI, m/z): 236, 180, 163, 136, 134, 89, 77 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 0,96 (t, 3H, J=6,9 Hz), 1,37-1,50 (m, 2H), 1,65-
1,74 (m, 2H), 4,22 (t, 2H, J=6,9 Hz), 6,26 (d, 1H, J=15,8 Hz), 6,88 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,00 (dd, 1H, J1=8,3 Hz, J2=1,7 Hz), 7,11 (d, 1H, J=1,7 Hz), 7,58 (d, 1H, J=15,8 Hz), 8,33 (bs, 2H) 13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 13,9; 19,3; 30,9; 64,9; 114,6; 115,7; 115,7;
122,6; 127,6; 144,1; 145,4; 146,7; 168,5 FTIR (KBr, cm-1): 3487, 3340, 2954, 2868, 1684, 1637, 1602, 1533, 1363, 1277
43
5.3.6 Decylester kávové kyseliny O HO O
7
CH3
HO
Postup upraven podle literatury.36 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky byl navážen 1,0 g kávové kyseliny (5,6 mmol) a rozpuštěn v 56 ml suchého dioxanu pod atmosférou argonu. Ke vzniklé směsi bylo jednorázově přidáno 1,2 ml SOCl2. K reakční směsi bylo po 3 hodinách míchání při 100 °C přidáno po kapkách 1,6 ml dekan-1-olu (8,4 mmol). Reakční směs byla míchána při 100 °C dalších 6 hodin. Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na RVO. Surový produkt byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s mobilní fází chloroform:methanol (9:1) a nakonec rekrystalizován z hexanu.
Výtěžek: 45 % čistého produktu Molekulový vzorec: C19H28O4 Vzhled: nažloutlá pevná látka Bod tání: 97,5-100,0 °C Molární hmotnost (g mol-1): 320,42 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 0,88 (t, 3H, J=6,5 Hz), 1,20-1,47 (m, 14H), 1,65-
1,79 (m, 2H), 4,19 (t, 2H, J=6,5 Hz), 6,25 (d, 1H, J=16,0 Hz), 6,86 (d, 1H, J=8,2 Hz), 6,98 (dd, 1H, J1=8,2 Hz, J2=1,7 Hz), 7,09 (d, 1H, J=1,7 Hz), 7,57 (d, 1H, J=16,0 Hz), 8,30 (bs, 2H) 13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 14,2; 22,8; 26,1; 28,9; 29,4; 29,7; 29,7; 32,0;
32,8; 65,1; 114,5; 115,6; 115,7; 122,5; 127,6; 144,2; 145,2; 146,7; 168,2 FTIR (KBr, cm-1): 3487, 3332, 2922, 2850, 1685, 1603, 1533, 1441, 1383, 1277, 1182
44
5.3.7 (E,E)-hexa-2,4-dienylester kávové kyseliny O HO O
CH3
HO
Postup upraven podle literatury.41 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky bylo naváženo 0,5 g kávové kyseliny (2,8 mmol), 0,3 g (E,E)-hexa-2,4-dien-1-olu (2,8 mmol) a vše bylo rozpuštěno v 6 ml THF. K vzniklé reakční směsi, která byla chlazena v ledové lázni při 0 °C a míchána, byl přidán po kapkách roztok 1,2 g DCC (5,9 mmol) v 6 ml THF. Reakční směs byla míchána a chlazena při 0 °C dalších 20 hodin. Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na RVO, vzniklý produkt byl izolován několikanásobnou extrakcí do ethyl-acetátu a zfiltrován. Filtrát byl protřepán postupně s 20 ml zředěného roztoku kyseliny citrónové, s 20 ml nasyceného roztoku NaHCO3 a nakonec s 20 ml destilované vody. Organická vrstva byla vysušena MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Surový produkt byl přečištěn pomocí HPLC na silikagelu s mobilní fází chloroform + 2 % isopropanol. Získaný produkt byl dostatečně čistý, proto nebyl dále čištěn.
Výtěžek: 14 % čistého produktu Molekulový vzorec: C15H16O4 Vzhled: nažloutlá pevná látka Bod tání: 157,6-159,1°C Molární hmotnost (g mol-1): 260,29 MS (EI, m/z): 260, 215, 180, 163, 136, 89, 81, 79, 77, 53 1
H NMR (300 MHz, (CD3)2CO): δ (ppm) 1,75 (d, 3H, J=6,3 Hz), 4,67 (d, 2H, J=6,3
Hz), 5,66-5,84 (m, 2H), 6,11 (m, 1H), 6,30 (d, 1H, J=15,8 Hz), 6,33 (dd, 1H, J1=14,9 Hz, J2=10,6 Hz), 6,88 (d, 1H, J=8,2 Hz), 7,06 (dd, 1H, J1=8,2 Hz, J2=1,9 Hz), 7,18 (d, 1H, J= 1,9 Hz), 7,57 (d, 1H, J=15,8 Hz), 8,29 (bs, 2H) 13
C NMR (75,5 MHz, (CD3)2CO): δ (ppm) 18,2; 65,0; 115,3; 115,6; 116,4; 122,6;
125,5; 127,7; 131,3; 131,7; 135,1; 145,8; 146,3; 148,8; 167,2
45
FTIR (KBr, cm-1): 3433, 3194, 2929, 1658, 1601, 1450, 1117, 978
5.3.8 (Z)-azobenzen N
N
Postup upraven podle literatury.38,41 Do 100 ml kulaté zábrusové baňky byl navážen 1,0 g (E)-azobenzenu (5,5 mmol) a rozpuštěn v 50 ml chloroformu. Vzniklá reakční směs byla v inertní atmosféře argonu ozařována 400 W UV lampou přes filtr 2 M roztoku KNO3 (λozař = 360 nm) 3 hodiny. Poté bylo z reakční směsi odpařeno rozpouštědlo na RVO a surový produkt obsahující směs obou izomerů azobenzenu byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s chloroformem jako mobilní fází. Mobilní fáze i jednotlivé frakce byly udržovány při teplotě 10 °C, chromatografie byla prováděna při červeném světle. Získaný produkt byl dostatečně čistý, proto nebyl dále čištěn.
Výtěžek: 25 % čistého produktu Molekulový vzorec: C12H10N2 Vzhled: červeno-oranžová pevná látka Bod tání: 67,5-69,5°C Molární hmotnost (g mol-1): 182,22 MS (EI, m/z): 182, 152, 128, 115, 105, 77 1
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,73-7,77 (m, 6H), 8,03-8,19 (m, 4H)
13
C NMR (75,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) 119,8; 127,1; 128,8; 153,6
FTIR (KBr, cm-1): 3450, 3417, 3064, 2922, 2850, 1574, 1510, 1475, 1441, 698
5.4 Testování látek na buněčné linii P19/A15 V rámci biologické části mé diplomové práce byla navázána spolupráce s Výzkumným centrem pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii (Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology, RECETOX). Experimenty na
46
buněčné linii P19/A15 byly prováděny Mgr. Nelou Pavlíkovou pod odborným vedením doc. Luďka Bláhy, Ph.D. Experimenty s methylesterem kyseliny (Z)-kávové a (Z)azobenzenem byly prováděny 5x, z toho jsem provedla dva experimenty s každou látkou.
5.4.1 Kultivace Buňky P19/A15 byly kultivovány v standardním médiu DMEM, obsahujícím fenolovou červeň, za teploty 37 °C a 5 % CO2, v 25 cm2 plastové kultivační lahvi. Pasážování bylo prováděno dle potřeby ve chvíli, kdy buňky dosáhly asi 60-70 % konfluence. Doba růstu těchto buněk pro jednu pasáž byla v našich podmínkách přibližně 2 dny. Během kultivace bylo pravidelně kontrolováno, zda nejsou buňky kontaminovány (např. mykoplazmaty); v případě kontaminace nebyly dále používány.
5.4.2 Experiment Adherentní buňky byly uvolňovány od podkladu kultivační láhve enzymatickým působením trypsinu; docházelo zde k rozrušení proteinů, kterými byly buňky poutány ke dnu a k sobě navzájem. Z důvodu inhibice trypsinu dvoumocnými kationy (Ca2+, Mg2+) obsaženými v kultivačním médiu bylo nutné před aplikací trypsinu vymýt zbytky média pomocí PBS (minimálně 2×3ml PBS). Přibližně po 2 minutách po přidání 0,5 ml trypsinu do kultivační láhve byly buňky uvolněné od podkladu, následovalo řádné promíchání v co nejmenším objemu bílého média DMEM/F12 a převedení suspenze do skleněné lahvičky používané pro tento účel. Po opětovném promíchání suspenze buněk byla spočítána koncentrace buněk na Bürkerově komůrce; výsledek bývá vyjádřen v počtu buněk na 1 ml média. Po pasážování byly buňky naředěny bílým kultivačním médiem DMEM/F12 na potřebnou koncentraci (10 000 buněk na jamku, tedy na 100 µl, tj. 100 000 buněk na 1 ml), poté byla buněčná suspenze napipetována na 96 (12×8) jamkovou desku (100 µl suspenze v mediu do každé jamky); vnějších 36 jamek mikrotitrační desky vysychá rychleji než vnitřních 60 jamek, proto se vnější jamky plní PBS a pouze vnitřní jamky buněčnou suspenzí. Následně byly buňky ponechány do druhého dne přisednout, dělit se a aklimatizovat v termostatu. Druhý den bylo přidáno 100 µl expozičního roztoku ředící řady standardu (ATRA) a vzorku (syntetizovaný derivát kávové kyseliny nebo azobenzen); včetně
47
negativní kontroly DMSO (1 %); konečná koncentrace DMSO ve všech jamkách byla 0,5 %, neboť došlo přítomností 100 µl kultivačního média k polovičnímu naředění DMSO. Všechny látky byly ředěny v 1 % DMSO. Expozice probíhala u všech derivátů kávové kyseliny a azobenzenu po dobu 24 hodin. Třetí den bylo provedeno měření. Při měření luminiscence bylo odsáto z každé jamky 150 µl roztoku, poté bylo přidáno 50 µl lyzační směsi (luciferinový kit + lyzační pufr) a 15 minut ponecháno na třepačce. Následovalo převedení lyzátu do celobílých desek a změření luminiscence roztoků v jednotlivých jamkách. Vyhodnocení bylo provedeno v programu Microsoft Excel, srovnávající výsledky v kontrole a v jednotlivých vzorcích. Podílem mezi luminiscencí u vzorku a kontroly byl zjištěn nárůst hodnoty luminiscence. Při měření viability (někdy označováno jako cytotoxicity) byl z třech krajních jamek odsát PBS a místo něj bylo napipetováno bílé médium; v měření použito jako blank. Následně bylo do každé jamky přidáno 50 µl neutrální červeně v bílém médiu (0,5 mg ml–1) a ponecháno hodinové inkubaci; neutrální červeň se dostává pouze do živých buněk. Poté bylo médium odstraněno, buňky opláchnuty PBS a do každé jamky bylo přidáno 150 µl lyzačního pufru. Po 15 minutovém třepání na třepačce byla změřena absorbance roztoků v jednotlivých jamkách.
6. Výsledky a diskuse O
O
HO
HO OH
R
ROH
HO
O
HO
R Methyl Butyl Decyl (E,E)-hexa-2,4-dien-1-yl
Reakční podmínky MeOH, reflux SOCl2, dioxan, 100 °C SOCl2, dioxan, 100 °C DCC, THF, 0 °C
Výtěžek (%) 40 23 45 14
Schéma 14. Syntéza esterů kávové kyseliny
48
Syntéza všech esterů kávové kyseliny byla jednokroková (schéma 14); reakční podmínky a dosažené výtěžky čistých produktů jsou shrnuty v tabulce schématu. Syntetizované
látky
čištěné
pomocí
sloupcové
chromatografie
byly
navíc
rekrystalizovány (pro dosažení co nejvyšší čistoty), ale i přes tuto vysoce ztrátovou formu čištění byly dosaženy shodné výsledky s publikovanými v případě methylesteru (E)-kávové kyseliny (CAME) a decylesteru kávové kyseliny (CADE).36 V případě butylesteru kávové kyseliny (CABE) byl opakovaně získán nižší výtěžek, v případě (E,E)-hexa-2,4-dienylesteru kávové kyseliny výtěžky nejsou známy. Syntetizované látky byly testovány na buněčné linii P19/A15 podle uvedeného postupu v kapitole 5.4.2. Látky byly testovány v uvedených koncentracích jak samotné, tak v roztoku s ATROU (32 nM); ATRA je přirozený ligand pro RAR receptory. Experimenty prováděné pouze s roztoky syntetizovaných látek byly prováděny za účelem nalezení nových ligandů pro RAR receptory. Experimenty prováděné s roztoky obsahující ATRU (32 nM) byly prováděny za účelem potenciace ATRY na receptory. Žádný studovaný ester kávové kyseliny nedokázal nahradit přirozený ligand, avšak potenciace ATRY na receptory byla pozorována u methylesteru (E)-kávové kyseliny (graf 2).
Graf 2. Luminiscence CAME + ATRA (32 nM)
49
ATRA i syntetizované látky byly rozpuštěny v 1 % DMSO. Luminiscence ATRY (32 nM) je nastavena na 100 %, tedy srovnávací látka. Na grafu 2 je viditelná výrazná potenciace luminiscence po přidání CAME už od koncentrace 0,2 nM až do 100 µM; 200 µM roztok je pro buňky cytotoxický, a tudíž nevykazuje vzestupnou tendenci luminiscence. Měření cytotoxicity látek je velice finančně i časově náročné, proto se u těchto testů na P19/A15 osvědčilo měření viability buněk pomocí neutrální červeně (někdy též uváděno jako základní cytotoxický test). Tato metoda je jednoduchá, časově nenáročná a hlavně levná. Viabilita buněk byla testována u syntetizovaných esterů kávové kyseliny v uvedených koncentracích s ATROU (32 nM) podle uvedené metody v kapitole 5.4.2. Graf 3 znázorňuje srovnání viability buněk po aplikaci esterů kávové kyseliny.
Graf 3. Srovnání viability buněk po aplikaci esterů kyseliny kávové Absorbance 1 % DMSO byla použita jako blank, nastavena na 100 %. Z grafu je patrné, že CAME vykazuje neklesající viabilitu, tedy nejpravděpodobněji nerostoucí cytotoxicitu i při vyšších koncentracích. Až při koncentraci 200 µM je potvrzena cytotoxicita už patrná v grafu 2. Ostatní estery vykazovaly s rostoucí koncentrací klesající viabilitu buněk.
50
Na základě získaných výsledků byla dále zvýšená pozornost methylesteru (E)kávové kyseliny, resp. jeho obměnám. První obměnou byla celková methylace kávové kyseliny methyljodidem. Methyl-(E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenoát (MMP) byl získán v poměrně vysokém výtěžku (dosaženo 56 % čistého produktu) vzhledem k publikovanému (dosaženo 16 % čistého produktu).39 Na závěr mé diplomové práce byl
ještě
MMP
podroben
bazické
hydrolýze
za
vzniku
(E)-3-(3,4-
dimethoxyfenyl)propenové kyseliny, čímž by byla zcela potvrzena nutnost volných hydroxylových skupin na benzenovém jádře k projevení aktivity látky na RAR receptorech. (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenová kyselina bude ještě dodatečně testována z důvodu opakovaných problémů při kultivaci buněk. Kompletní syntézu znázorňuje schéma 15. O HO OH
+
H3C
I O
DMF, Na2CO3 HO
56 %
O H3C
CH3 O
H3C NaOH O
O
99 %
O H3C
OH
H3C O
Schéma 15. Syntéza (E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenové kyseliny
Methyl-(E)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)propenoát byl následně stejnou metodou jako předešlé látky testován na buněčné linii P19/A15. Ovlivnění viability buněk nebylo pozorováno a téměř ani žádná potenciace luminiscence ATRY (32 nM). Srovnání potenciace luminiscence ARTY (32 nM) uvedenými deriváty kávové kyseliny (75 µM), včetně samotné kávové kyseliny znázorňuje graf 4.
51
Graf 4. Potenciace luminiscence ATRY (32 nM) deriváty kyseliny kávové
ATRA (32 nM) byla opět použita jako srovnávací roztok, tudíž její luminiscence byla nastavena na 100 %. Zde je výrazně patrná potenciace luminiscence ATRY roztokem CAME. Na základě těchto výsledků byla navržena další modifikace methylesteru (E)kávové kyseliny a to příprava methylester (Z)-kávové kyseliny (Z-CAME) fotochemickou cestou. Pozorování vlivu izolovaných geometrických izomerů na buňkách bylo nejdříve prozkoumáno na azobenzenu, jakožto jeden z nejlépe prostudovaných systémů podléhající fotochemické E-Z izomeraci. Nejprve byl tedy testován metodami popsanými výše (E)-azobenzen v uvedených koncentracích. Ovlivnění viability buněk (E)-azobenzenem nebylo pozorováno. Potenciace luminiscence ATRY (32 nM) byla ovlivněna přítomností (E)-azobenzenu už od koncentrace 0,2 nM; jako blank byla opět použita luminiscence ATRY (32 nM) (graf 5).
52
Graf 5. Luminiscence (E)-azobenzenu + ATRA (32 nM)
Následovala fotochemická E-Z izomerace (E)-azobenzenu na Z-izomer. Absorpční spektrum roztoku azobenzenu v acetonitrilu (5×10–5 mol l–1) bylo průběžně měřeno během ozařování vzorku na optické lavičce (λozař = 360 nm). Výchozí látkou byl (E)azobenzen, který postupným ozařováním poskytoval (Z)-azobenzen, po 3 hodinách ozařování
už
nedocházelo
k
změnám
absorpčního
spektra;
byl
pozorován
fotostacionární stav (graf 6).
Graf 6. Absorpční spektra (E)-azobenzenu a směsi (E)-, (Z)-azobenzenu v acetonitrilu po ozařování při (360 nm) 53
Izolovaný
(Z)-azobenzen
byl
testován
stejnými
metodami
ve
stejných
koncentracích jako (E)-azobenzen. Ovlivnění viability buněk (Z)-azobenzenem nebylo pozorováno. Potenciace luminiscence ATRY (32 nM) byla velmi slabě ovlivněna přítomností (Z)-azobenzenu. Srovnání potenciace luminiscence ATRY (32 nM) obou geometrických izomerů azobenzenu znázorňuje graf 7.
Graf 7. Potenciace luminiscence ATRY (E)-,(Z)-azobenzenem Jelikož je (Z)-azobenzen termicky nestabilní33 a expozice na buňkách probíhala 24 hodin při 37 °C, byla u roztoku (Z)-azobenzenu v 1 % DMSO za stejných kultivačních podmínek pozorována zpětná izomerace na termicky stabilní (E)-azobenzen pomocí analytické chromatografie TLC s chloroformem jako mobilní fází. Na základě těchto zjištěných informací byla slabá potenciace luminiscence vzorku (Z)-azobenzenu přisouzena malému zastoupení vznikajícího (E)-azobenzenu. Poslední testovanou látkou byl methylester (Z)-kávové kyseliny. Absorpční spektrum roztoku methylesteru kávové kyseliny v acetonitrilu (7×10–5 mol l–1) bylo průběžně měřeno během ozařování vzorku na optické lavičce (λozař = 345 nm). Výchozí látkou byl E-CAME, který postupným ozařováním poskytoval Z-CAME. Ozařování probíhalo 5 hodin, avšak již po 1 hodině nedocházelo k změnám absorpčního spektra; byl pozorován fotostacionární stav (graf 8).
54
Graf 8. Absorpční spektra methylesteru kávové kyseliny v acetonitrilu po ozařování při (345 nm)
Izolovaný Z-CAME byl podroben shodnému testování na buňkách P19/A15 v uvedených koncentracích. Na grafu 9 je znázorněna téměř shodná luminiscence obou geometrických izomerů methylesteru kávové kyseliny.
Graf 9. Srovnání luminiscence E-,Z-CAME + ATRA (32 nM)
55
7. Závěr Cílem mé práce byla syntéza derivátů kávové kyseliny, konkrétně methyl-, butyl-, decyl-
a
(E,E)-hexa-2,4-dienylesteru
kávové
kyseliny,
(E)-3-(3,4-
dimethoxyfenyl)propenové kyseliny a jejího methylesteru. Na základě testů na buněčné linii P19/A15 byly všechny studované deriváty zamítnuty jako možné ligandy pro retinoidní receptory nahrazující přirozený ligand (ATRA). Testy ovšem prokázaly, že methylester kávové kyseliny, a to v obou geometrických izomerech, narušoval retinoidní signálování pouze v přítomnosti přirozeného ligandu pro retinoidní receptory (ATRA). Rozdílná potenciace ATRY na receptory byla pozorována u izolovaných E a Z izomerů azobenzenu; pouze (E)azobenzen vykazoval pozitivní efekt, avšak ne tolik výrazný, jako u methylesteru kávové kyseliny. Mechanismus potenciace ATRY na receptory je spekulativní; může docházet k efektivnějšímu navazování ligandu na receptor nebo může např. potenciaci způsobit navázání studované látky na jiné specifické místo aktivovaného receptoru přirozeným ligandem. Z výsledků vypovídajících o orientační cytotoxicitě látek vychází methylester kávové kyseliny jako vhodná modelová sloučenina k dalším experimentům. Uskutečněné
experimenty
poukazují
na
nalezení
modelové
sloučeniny,
methylesteru kávové kyseliny, ovlivňující retinoidní signálování, což bylo cílem mé diplomové práce a prvním krokem projektu. Dále bude následovat aplikace fotolabilních chránících skupin (Photoremovable Protecting Group, PPG) na nalezenou modelovou sloučeninu, které by měly umožnit fotochemicky řízené odštěpení příslušné biologicky aktivní sloučeniny.
56
8. Literatura 1. Parkányiová J., Parkányiová L., Pokorný J.: Rostliny jako zdroje přírodních antioxidantů, www.vitamins.cz/archiv/2003/doc/p/P_30C.doc. 2. Trna
J.,
Táborská
E.:
Přírodní
polyfenolové
antioxidanty,
www.med.muni.cz/biochem/seminare/prirantiox.rtf. 3. Slanina J., Táborská E.: Chemické listy 2004, 98, 239-245. 4. http://faf.vfu.cz/html/txts/flavonoids.html, flavonoidy (autor neuveden). 5. Svršek J.: Rostlinné jedy, http://natura.baf.cz/natura/1997/4/9704-6.html. 6. Knagga A. R.: Natural Product Reports 2003, 20, 119-136. 7. www.gwu.edu/~mpb/shikimate1.htm, biosyntéza šikimátu (autor neuveden). 8. Jiang R. W., Lau K. M, Hon P. M., Mak T. C. W., Woo K. S., Fung K. P.: Current Medicinal Chemistry 2005, 12, 237-246. 9. Rechner A. R., Spencer J. P. E., Kuhnle G., Hahn U., Rice-Evans C. A.: Free Radical Biol. Med. 2001, 30, 1213-1222. 10. Rechner A. R., Smith M. A., Kuhnle G., Gibson G. R., Debnam E.S., Srai K. S., Moore K. P., Rice-Evans C. A.: Free Radical Biol. Med. 2004, 36, 212-225. 11. d´Ischia M.: Comptes Rendus Chemie 2005, 8, 797-806. 12. Chen B., Keshive M., Deen W. M.: Biophysical Journal 1998, 75, 745-754. 13. http://www.zdravcentra.cz/cps/rde/xchg/zc/xsl/6932_1476.html, poškození navozené reaktivními formami kyslíku a dusíku, (autor neuveden) 14. Číž M., Lojek A., Kubala L.: Volné radikály ve fyziologii živočichů, studijní materiály 2007. 15. van der Heyden M. A. G., Defize L. H. K.: Cardiovascular Research 2003, 58, 292302. 16. Novák J., Beníšek M., Pacherník J., Janošek J., Šídlová T., Kiviranta H., Verta M., Giesy J. P., Bláha L., Hilscherová K.: Environ. Toxicol. Chem. 2007, 26, 1591-1599. 17. Janošek J., Hilscherová K., Bláha L., Holoubek I.: Toxicology in Vitro 2006, 20, 1837. 18. Bílek K., Hampl A.: Analýza účinků solubilních faktorů a buněčné komunikace na neurální diferenciaci, http://old.af.mendelu.cz/mendelnet2004/obsahy/bioziv/bilek.pdf.
57
19. Grubbs C. J., Lubet R. A., Atigadda V. R., Christov K., Deshpande A. M., Tirmal V., Xia G., Bland K. I., Eto I., Brouillette W. J., Muccio D. D.: Carcinogenesis 2006, 27, 1232-1239. 20. Suzuki T., Nishimaki-Mogami T., Kawai H., Kobayashi T., Shinozaki Y., Sato Y., Hashimoto T., Asakawa Y., Inoue K., Ohno Y., Hayakawa T., Kawanishi T.: Phytomedicine 2006, 13, 401-411. 21. Bastien J., Rochette-Egly C.: Gene 2004, 328, 1-16. 22. Paleček J., Linhart I., Horák J.: Toxikologie a bezpečnost práce v chemii, Praha 1999. 23. Germain P., Chambon P., Eichele G., Evans R. M., Lazar M. A., Leid M., de Lera A. R., Lotan R., Mangelsdorf D. J., Gronemeyer H.: Pharmacological Reviews 2006, 58, 712-725. 24. Bourguet W., Vivat V., Wurtz J. M., Chambon P., Gronemeyer H., Moras D.: Molecular Cell 2000, 5, 289-298. 25. Preisler J.: Molekulová luminiscence, http://bart.chemi.muni.cz/courses/6.pdf. 26. Klán P.: Organická fotochemie, Brno 2001. 27. Dugave Ch., Koyama Y., Kakitani Y., Nagae H.: Cis-trans Isomerization in Biochemistry (ed. Dugave Ch.), kap. 1-3., WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2006. 28. Preisler J.: Molekulová luminiscence, http://bart.chemi.muni.cz/courses/1a2.pdf. 29. Kropp P. J.: Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology (ed. Horspool W. M., Lenci F.), 2nd ed., kap. 9., CRC Press, Boca Raton 2004. 30. http://old.iupac.org/reports/1996/6812verhoeven/S.htm, Schenckový mechanismus (autor neuveden). 31. Scaiano J. C.: Alkenes, http://photo.chem.uottawa.ca/Teaching/Cordoba/Part12.pdf. 32. Kropp P. J.: Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology (ed. Horspool W. M., Lenci F.), 2nd ed., kap. 13., CRC Press, Boca Raton 2004. 33. Knoll H.: Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology (ed. Horspool W. M., Lenci F.), 2nd ed., kap. 89., CRC Press, Boca Raton 2004. 34. Ortyl E., praca doktorska: Zjawiska fotochromowe w wybranych polimerach, Wrocław 2005. 35. Suginome H.: Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology (ed. Horspool W. M., Lenci F.), 2nd ed., kap. 94., CRC Press, Boca Raton 2004.
58
36. Nagaoka T., Banskota A. H., Tezuka Y., Saiki I., Kadota S.: Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3351-3359. 37. Satô M., Hiraoka A.: Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 1289-1292. 38. Murov S. L., Carmichael I., Hug G. L.: Handbook of Photochemistry (ed. Dekker M.), 2nd ed., Marcel Dekker, New York 1993. 39. Napolitano A., d´Ischia M.: J. Org. Chem. 2002, 67, 803-810. 40. Zhang L., Zhang J., Fang H., Wang Q., Wenfang W.: Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 8286-8294. 41. Kubo I., Xiao P., Fujita K.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 347-350. 42. Forber C. L., Kelusky E. C., Bunce N. J., Zernee M. C.: J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 5884-5890.
59
