(GENO)TOXICITA PRACHOVÝCH ČÁSTIC Jan Topinka Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR
[email protected]
Úvod Respirabilní (PM2.5) prachové částice ve vnějším
ovzduší obsahují komplexní směsi polutantů - řada toxických i genotoxických látek (PAU a jejich deriváty) Mechanismy působení komplexních směsí nejsou
dosud dobře popsány
Cíle Vyhodnocení genotoxicity org.látek z PM v ovzduší Studium změn v genové expresi v odpovědi na
působení těchto látek u dvou různých linií plicních buněk
Odběr vzorků PM2,5 (<2,5 μm) in 4 lokality: 1. Ostrava – Bartovice 2. Ostrava – Poruba 3. Karviná 4. Třeboň Odběr 24 hodin denně (ne vždy) 30 - 35 dní (Listopad
2009 – Duben 2010)
1-3 4
Velkoobjemový vzorkovač ECOTECH
Extrakce organických látek z filtrů Extrakce organické hmoty z filtrů dichlormetanem + chemická
analýza PAU – firma ALS Czech Republic s.r.o.
Dichlormetan – odpařen dusíkem, odparky rozpuštěny v DMSO
(50 mg/ml),
Velkoobjemové odběry a analýza PAU Porovnání zima 2008-2009 a 2009 -2010 Období odběru
Objem vzduchu [m3]
PM2,5 [μg/m3]
B[a]P [ng/m3]
c-PAHs [ng/m3]
Ostrava-Bartovice
03/2009
29 900
36.7
13.6
81.6
Ostrava-Poruba
03/2009
35 200
25.8
4.28
27.2
Karviná
04/2009
47 400
n.a.
1.88
12.1
Třebon
11-12/2008
44 700
11.4
1.11
7.92
Období odběru
Objem vzduchu [m3]
PM2,5 [μg/m3]
B[a]P [ng/m3]
kPAU [ng/m3]
Ostrava-Bartovice
1-2/2010
17 207
130,3
29,01
235,1
Ostrava-Poruba
3-4/2010
47 367
34,4
4.73
34,2
Karviná
11-12/2009
32 104
69,4
24,6
162,5
Třeboň
11-12/2009
56 622
13,0
1,71
11,2
Lokalita
Lokalita
Buněčné linie Buňky HEL – lidské embryonální plicní fibroblasty
Buňky A549 – buňky lidského alveolárního adenokarcinomu
In vitro inkubace (zima 2008-2009)
HEL a A549 –24h inkubace s extrakty organických látek (EOM) ze 4 lokalit ve 3 subtoxických koncentracích kontrola -
DMSO 10, 30, 60 µg extraktu/ml
In vitro inkubace (zima 2009-2010) Extrakty přidávány do kultivačního média k buňkám v koncentracích odpovídajících obsahu PM2.5 respektive obsahu extrahovatelné hmoty (EOM) v PM2.5/m3 vzduchu
Ostrava-Bartovice: 10, 30, 60 µg/ml. S ohledem na nižší obsah EOM/m3 v ostatních lokalitách byly spočteny následující faktory: Ostrava-Poruba 3,6; Karviná 2.2; Třeboň 10,5, kterými byly výše uvedené koncentrace vyděleny, abychom mohly udělat kvantitativní porovnání toxicity ovzduší, tj dýcháme stejný objem vzduchu ať jsme v Bartovicích nebo v Třeboni….
Prováděné analýzy test cytotoxicity (LDH test) – nalezení subtoxických koncentrací stanovení genotoxicity (hladiny DNA aduktů postlabeling)
32P-
analýza celogenomové exprese pomocí čipové technologie a ověření výsledků qPCR
Genotoxicita – DNA adukty zima 2008-2009 HEL
A549 70
DNA adukty (relativní jednotky)
DNA adukty (relativní jednotky)
70 60 50 40 30 20 10
60 50 40 30 20 10 0
0 10 30 60
10 30 60
Bartovice
Poruba
10 30 60
10 30 60
Karviná
Třeboň
10 30 60 Bartovice
10 30 60
10 30 60
10 30 60
Poruba
Karviná
Třeboň
Genotoxicita – DNA adukty zima 2009-2010 A549
7
DNA adukty na 108 nukleotidů
DNA adukty na 108 nukleotidů
HEL
6 5 4 3 2 1
0 Bartovice
Poruba
Karviná
Třeboň
7 6
5 4 3 2 1 0 Bartovice Poruba
Karviná
Třeboň
Korelace genotoxicity (DNA aduktů) s koncentrací benzo[a]pyrenu v extraktech zima 2008-2009 HEL
A549
8
DNA adducts / 08 nucleotides
DNA adducts / 108 nucleotides
6
R2 =
0.822
6
4
2
0 0
10
20
30
40
50
B[a]P ng/ml medium
60
70
R2 = 0.965 4
2
0 0
20
40
60
B[a]P ng/ml medium
80
Analýza celogenomové exprese Komplexní směsi – vedle genotoxických i řada jiných toxických účinků
Biologická interpretace – složitá a časově náročná Seznam deregulovaných genů – většinou nestačí – potřebná je analýza biologických drah a procesů
Změny genové exprese v buňkách po působení organických extraktů z PM2.5 Analýza pokrývá prakticky celý lidský
genom Výsledky zatím pro zimu 2008-2009 Platforma Illumina
Analýza celogenomové exprese Metody analýzy biologických drah – 2 základní přístupy 1. Analýza na úrovni individuálních genů Porovnání genové exprese jednotlivých genů mezi 2 skupinami (exponované vs. kontrolní), výsledkem je seznam diferenciálně exprimovaných genů 2 kroky:
1. stanovení změn exprese jednotl. genů mezi 2 nebo i více skupinami 2. seznam testován na obohacení konkrétních biologických procesů
Počty významně deregulovaných genů HEL
A549
2500 2000
10 ug/ml
Number of deregulated genes
Number of deregulated genes
3000
30 ug/ml 60 ug/ml
1500 1000 500 0 Ostrava - Ostrava Bartovice Poruba
Karviná
Třeboň
600
10 ug/ml
500
30 ug/ml
400
60 ug/ml
300 200 100 0 Ostrava Bartovice
Ostrava Poruba
Karviná
Třeboň
Analýza celogenomové exprese 2. Analýza na úrovni genových setů Genový set je skupina genů, které jsou součástí stejného biologického procesu
Např. databáze KEGG pathways (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)- databáze biochemických, metabolických a regulačních drah Tento přístup je z řady důvodů výhodnější – menší pravděpodobnost ztráty informace
Buňky HEL – identifikace změněných biologických dráh a genů (výběr)
Metabolismusof xenobiotik cytochromy P450 *
↑CYP1B1, ↑MGST1
Wnt signální dráha *
↑NKD2, ↓SMAD3 ↓CCND2, ↓WNT2 ↑MGST1
Metabolismus glutathionu * TGF-beta signální dráha * Metabolismus arachidonové kyseliny * Gap junction * Metabolismus léčiv cytochromy P450 * p53 signaling Nukleotidová excizní reparace * Přizpůsobené p-value < 0.05
↑BMP2, ↓ID2 ↑TBXAS1, ↑PTGS2 ↓TJP1, ↓TUBA3D ↑MGST1 ↓CHEK2 ↓POLE2
Závěry (stále jen dílčí) 1. Genotoxicita ovzduší – nejvyšší v Ostravě-Bartovicích
2. Analýza celogenomové exprese Identifikovány deregulované geny a biologické dráhy specifické pro dané lokality a buněčné linie
vybrány zajímavé stezky pro HEL (p-value < 0.05) a geny, které měly největší příspěvek pro deregulaci těchto stezek Výsledky na čipech ověřeny qPCR – vysoká hodnota korelace Detailnější analýza výsledků stále pokračuje
Poděkování Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha H. Líbalová K. Hanzalová A. Milcová J. Schmuczerová V. Stránecký J. Kléma J. Topinka R.J. Šrám Podpora: Ministerstvo školství mládeže a tělovýchovy (#2B08005) Grantová Agentura České republiky (#P503-11-0142)
Veřejně prezentované nesmysly… (vystoupení pana primátora Kajnara v Událostech ČT 14.11.2011)
Reakce p.Kajnara na dokument britské celoplošné
televize ITV: “Britové by si měli zamést před vlastním prahem neboť znečištění PM10 v Londýně je aktuálně vyšší než v Ostravě…” aneb svoje znečištění si rozvracet nedáme Jak to je ve skutečnosti???: http://www.chmi.cz; http://www.zuova.cz http://www.london.gov.uk/sites/default/files/monit oringairpollution.pdf
…a aby to bylo politicky vyvážené (24.11.2011 Právo , náměstek ostravského primátora p.Madej)
p.Madej “Nevidím důvod, dávat peníze do výzkumu,
který vyzkoumá jen to, co tady všichni víme. Že zde máme špatné ovzduší ovlivňující zdraví lidí. Raději bych peníze místo na výzkum dal například na čištění ostravských ulic” aneb buržoazní pavědi stěžují nám práci… Jestliže tedy vše potřebné víme: …pak netřeba monitorovat stav ovzduší na Ostravsku ze strany ČHMÚ a ZÚ Ostrava a můžeme zavřít příslušná oddělení na těchto institucích a příslušní pracovníci by mohli řídit čistící vozy…
Děkuji za pozornost
