ENVIRONMENTÁLNÍ TOXIKOLOGIE – GENOTOXICITA
Klára A. Mocová Laboratoř ekotoxikologie a LCA, Ústav chemie ochrany prostředí, Fakulta technologie ochrany prostředí, VŠCHT Praha
OBSAH
Úvod Mutageny, Mutageneze Typy mutací Testy genotoxicity na bakteriích, rostlinách a živočiších
ÚVOD
Genotoxicita – negativní vliv faktorů na genetický aparát (např. vznik trvalých, dědičných změn na DNA) Genotoxické látky: mutagenní, karcinogenní a teratogenní Genotoxické látky působí ve velmi nízkých koncentracích, neexistuje u nich prahová koncentrace Při vyšších dávkách působí toxicky spíše na tkáně a orgány, případně způsobují smrt. Genotoxické účinky se projevují obvykle po dlouhodobé expozici
GENOTOXICKÉ ÚČINKY Genotoxické účinky vyvolávají látky i ve velmi nízkých koncentracích. U ... účinek látky c ... koncentrace látky t ... doba působení látky
n
U = f (c×t )
exponent n ... klasické jedy: 0-1 UV záření: cca 2 genotoxické látky: >5 U genotoxických látek účinek závislý především na délce expozice, zatímco u ostatních látek záleží hlavně na koncentraci Lze těžko hovořit o neškodné koncentraci genotoxické látky
GENOTOXICITA - ROZDĚLENÍ
Mutageneze: vznik trvalých (dědičných) změn v genetické výbavě buňky (jedince), které se přenášejí do dalších generací
Karcinogeneze (= Kancerogeneze): nádorové bujení, jemuž předchází změny na DNA nebo napadení virem
Teratogeneze: Vznik vady na vyvíjejícím se plodu (malformace, vrozené vady vnitřních orgánů)
TYPY GENOTOXINŮ Fyzikální – různé typy záření (UV, paprsky X A) Chemické – látky alkylující, silně oxidující, deaminující, analogy dusíkatých bází A) Biologická agens – některé viry a další původci nemocí (např. prvok Toxoplasma)
NEJVÝZNAMĚJŠÍ GENOTOXINY o o o o o o o o o o o o o o o
některé těžké kovy alkylsulfáty N-nitrososloučeniny a halogennitrososloučeniny estery kyseliny metansulfonové yperit (sirný, dusíkatý) aldehydy epoxidy halogenderiváty alifatických uhlovodíků polycyklické aromatické uhlovodíky substituované polycyklické aromatické uhlovodíky aromatické a heterocyklické primární, sekundární a terciální aminy azobarviva akridinová barviva aflatoxiny
KDE NAJDEME GENOTOXINY? V továrnách (azobarviva, kadmium...) V laboratořích (rozpouštědla...) V lécích (léky na hypertenzi) V potravinách (aditiva, aflatoxiny u špatně skladovaných potravin a příliš dlouho skladovaných biopotravin) V přírodě (přirozené anebo kontaminující látky)
Genotoxiny jsou všude – je potřeba s nimi počítat, snažit se minimalizovat jejich příjem a pokusit se bránit jejich účinkům
PŘÍKLADY LÁTEK A MATERIÁLŮ VE ZDRAVOTNICTVÍ TESTOVANÝCH NA GENOTOXICITU
Léky Polymery (nitroděložní tělíska, implantáty) Keramické materiály, kterými se pokrývají kovy (opatření proti korozi kovů používaných při operacích) Kovy používané v zubním lékařství Biologické materiály – tkáně z jiných obratlovců (např. hovězí perikard)
TYPY MUTACÍ Různá dělení mutací Např. dle buněk, ve kterých vznikají (zárodečné vs. somatické)
Zde se zabýváme dělením na: 1. Genové mutace 2. Chromosomální aberace 3. Genomové mutace
GENOVÉ MUTACE Genové mutace jsou trvalé chyby v sekvenci nukleotidů v genech Pro jejich pochopení je nutné znát obecnou strukturu genu a jejich produktů – mRNA a proteinů Zopakujte si strukturu nukleových kyselin, párování bazí v nukleotidech, genetický kód, proteosyntézu a jaderné dělení (především replikaci)
STRUKTURA DNA, RNA, PROTEINŮ
Nukleotid - základní stavební jednotka DNA i RNA Nukleotid se skládá z dusíkaté báze (ta určuje nukleotidovou specifitu), cukerného zbytku (deoxy-)ribosy a fosfátu Dlouhodobé či krátkodobé dvouřetězce DNA a RNA nebo DNA:RNA se tvoří na základě komplementarity dusíkatých bazí Triplet (kodon, antikodon) je tvořen trojicí za sebou jdoucích nukleotidů; kodon ~ mRNA; antikodon ~ tRNA 1 aminokyselina v proteinu je kódována 1 tripletem na DNA (RNA) protein = genový produkt (meziproduktem v proteosyntéze je mRNA); konečným genovým produktem může být také RNA (např. rRNA, tRNA)
STRUKTURA DNA A RNA – PÁROVÁNÍ BÁZÍ
párování bází nastává v: antiparalelních řetězcích DNA krátkodobých spojeních úseků řetězců DNA a RNA (při syntéze mRNA podle DNA matrice ~ transkripce) krátkodobých spojeních tripletů na dvou řetězcích RNA (při proteosyntéze mezi mRNA a tRNA ~ translace) mezi 2 řetězci RNA nebo jen na vybraných krátkých úsecích (RNA viry, tzv. vlásenky na jednořetězcových RNA)
PRAVIDLA KOMPLEMENTARITY
standardní párování (Watson-Crickovské) – mezi komplementárními nukleotidy:
Adenin (A) Guanin (G) Cytosin (C) Thymin (T) Uracyl (U) – v RNA nahrazuje thymin, na DNA se nevyskytuje
páruje se vždy purinová báze (A, G) s pyrimidinovou (C, T, U) A-T (A-U) a G-C páry
kromě toho ještě zvláštní typy párování (u modifikovaných nukleotidů) – obvykle na RNA
GENOVÉ MUTACE
Změní-li se nukleotid (báze) v jednom řetězci DNA, změní se následovně celý nukleotidový pár Běžně se proto uvádí změna celého páru např. z AT na GC pár Není-li změna v sekvenci DNA včas opravena, zakonzervuje se a je přenášena do dalších generací buněk či jedinců = vznik mutace
GENETICKÝ KÓD
Genetický kód je tripletový (celkem 64 různých tripletů) 1 triplet kóduje 1 aminokyselinu pro 1 aminokyselinu často více kódonů (např. 4 kodóny pro alanin), které se nejčastěji liší pouze v nukleotidu na 3. pozici 61 kódujících tripletů (s aminokyselinovou specifitou) + 3 stop kodony (nekódují žádnou aminokyselinu, ale značí konec proteosyntézy)
www.wikipedia.org
GENOVÉ MUTACE - BODOVÉ Bodová mutace = změna v nukleotidové sekvenci genu Substituční mutace (záměna původního NT za jiný)
samesense (= stejný smysl) A beze změny AMK sekvence missense (= ztráta smyslu) A vznik kodónu pro jinou AMK nonsense (= nesmysl)A vznik stop kodónu
Posunové mutace – delece či inzerce NT (počet není násobkem 3 NT). Výsledkem je změna celého úseku genu od místa bodové mutace. Často vznik stop kodónu uvnitř posunuté sekvence (zkrácení proteinu) Vysvětlivky: AMKaminokyselina, NTnukleotid
GENOVÉ MUTACE - BODOVÉ Divoká alela (původní forma genu) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg cag act ctg gcc ggg gtg aac ctg...
Neutrální mutace (3. báze) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg caa act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Missense mutace M D D Q S M R L K T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg aag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Nonsense mutace M D D Q S M R L stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg tag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Posun čtecího rámce vedoucí k předčasné terminaci proteosyntézy M D D Q S M R L R L W P G stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg aga ctc tgg ccg ggg tga acc tg...
PŘ. BODOVÉ MUTACE – SRPKOVITÁ ANÉMIE
Bodová mutace v ß-řetězci hemoglobinu (Hb) na 6. pozici v ß-řetězci valin místo glutamové kyseliny Hemoglobin je tetramer (2× α a 2× ß podjednotka) Postižené buňky mění tvar a ztrácejí elasticitu (tvar srpku) Buňky při nahromadění v kapiláře způsobují nedostatečné zásobení krví (anémie) Tato mutace se natolik rozšířila, že dnes již nemůže být zvána mutací, ale běžnou formou genu – souvisí totiž s evoluční výhodou v malarických oblastech Heterozygoti pro srpkovitou anemii (tvoří 60% normálního Hb + 40% HbS) jsou odolní vůči malárii a zároveň téměř netrpí anemií Dominantní homozygoti (pouze normální Hb) jsou snadným cílem pro Plasmodium přenášející malárii, zatímco recesivní homozygoti trpí srpkovitou anémií (pouze HbS)
DALŠÍ PŘÍKLADY BODOVÝCH MUTACÍ Cystická fibróza (CF) - dědičné onemocnění - hustý hlen v dýchacích cestách - nutné jej rozpouštět (speciální pomůcky) - postižení citliví na infekci - velmi slaný pot = diagnostický znak - dnes již novorozenecký screening v ČR
další informace pro veřejnost např. na www.slanedeti.cz
MECHANISMY VZNIKU BODOVÝCH MUTACÍ
Mezi mutageny patří také látky deaminující
Deaminací cytosinu (GC pár) vzniká uracyl (dočasný GU nestabilní pár)
Uracyl do DNA nepatří, je proto rozpoznám opravným systémem jako chybný a místo je opraveno:
rozpoznání uracylu v sekvenci DNA
vyštěpení uracylu
doplnění správného – komplementárního nukleotidu (dle guaninu na komplementárním řetězci se doplní cytosin)
ligasa spojí nově přidaný nukleotid k sousedním nukleotidům v řetězci
Pokud nedojde k opravě, DNA se postupně dvakrát rozdělí a v místě původního GC páru vznikne AT pár (uracyl je posléze nahrazen thyminem)
DEAMINACE CYTOSINU
MECHANISMY VZNIKU BODOVÝCH MUTACÍ TAUTOMERISMUS BÁZÍ
Některé mutageny vytvářejí tautomery a mohou se díky tomu vázat s 2 různými bázemi DNA se díky tomu stává nestabilní a v daném místě se může zlomit nebo vzniknout bodová mutace (změna GC páru na AT pár či naopak)
Příklady těchto mutagenů: analogy dusíkatých bází:
5BrU = 5-bromuridin
-ketoformaA2H-vazby s Adeninem -enolformaA3H-vazby s Guaninem
2AP = 2-aminopurin -aminoformaA2H-vazby s Thyminem -iminoformaA3H-vazby s Cytosinem
GENOVÉ MUTACE – DUPLIKACE nejedná se o bodové mutace opakování krátkých nukleotidových motivů za sebou např. tzv. polyglutaminová onemocnění (opakování CAG tripletů) – hromadění polyglutaminových útvarů v neuronech – poškození funkce neuronů tyto typy mutací příčinou neurodegenerativních onemocnění:
Parkinsonova ch. Alzheimerova ch. Huntingtonova ch. Jacobova-Creutzfeldtova ch.
GENOVÉ DUPLIKACE – NEURODEGENERATIVNÍ CHOROBY
U neurodegenerativních chorob dochází ke ztrátě a poškození neuronů v určitých oblastech mozku
Parkinsonova choroba: pohybové obtíže – postižený přestává ovládat pohyb: špatná řeč, mimovolní neovladatelné pohyby či naopak ztuhlost, třes, deprese
Alzheimerova choroba: úbytek paměti, poruchy orientace, poruchy řeči, změny osobnosti (rozčilování...), postupně vede k demenci
Jacobova-Creutzfeldova choroba (Creutzfeld-Jacobova ch.): vždy smrtelná, prionová nemoc (spongiformní encefalopatie), poruchy zraku, paměti, rovnováhy a koordinace, halucinace, deprese, demence priony = infekční bílkoviny (Prusiner - Nobelova cena, 1982)
HUNTINGTONOVA CHOREA
typ polyglutaminového onemocnění zmnožení tripletů CAG na 4. chromosomu zdravý člověk 6 – 37 tripletů v příslušném genu 40 a více opakování = zhoubná mutace postupný zánik populací nervových buněk revmatické onemocnění (zhoršení řeči, motoriky); deprese projevuje se obvykle mezi 30. a 45. rokem dědičné onemocnění; rizikový faktor: věk otce (čím starší otec, tím více tripletů – přibývají v genech vlivem chyb při replikaci DNA) Nancy Wexler a spol. – objev genetické podstaty onemocnění
CHROMOSOMÁLNÍ ABERACE Chromosomální mutace (aberace) jsou dědičné strukturní změny na chromosomech Díky odlišnému uspořádání DNA se chromosomální aberace se netýkají prokaryotních organismů (bakterie, sinice) ani virů a proto je nelze ani na prokaryotech testovach Pro jejich pochopení je nutné znát obecnou strukturu a funkci eukaryotních chromosomů
STAVBA EUKARYOTNÍHO CHROMOSOMU Chromatin – materiál chromosomu (DNA + doprovodné proteiny, např. histony) Telomery (na obou koncích) – chrání DNA proti štěpení enzymy (exonukleasy) Centromera (uvnitř chromosomu) – nutná pro navázání chromosomu na dělicí vřeténko. Chromosom, který nemá centromeru (nebo jeho ulomená část bez centromery = acentrický fragment), se nemůže rozdělit do 2 dceřiných jader při dělení buňky
CHROMOSOMÁLNÍ ABERACE = STRUKTURNÍ ZMĚNY CHROMOSOMŮ
Delece – ztráta úseku chromosomu
Duplikace – zdvojení úseku chromosomu
Inverze – převrácení úseku chromosomu
Translokace – přesun úseku chromosomu na jiný chromosom
a) prostá – přesun pouze z jednoho na jiný chromosom
b) reciproká – vzájemná výměna mezi dvěma chromosomy ; zvláštní případ je Robertsonova translokace (= centrická fúze dvou akrocentrických chromosomů)
Chromosomální aberace jsou často jednou z příčin vzniku karcinogeneze
PŘÍKLADY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ
syndrom Cru-du-chat (s. kočičího křiku) – delece 5. chromosomu – poškození hlasivek delece 15. chromosomu – 2 možnosti: a) Prader-Willi s. - velká obezita - zděděno po otci anebo disomie – oba chromosomy od matky („chybí kousek otce“) b) Angelmanův s. - hyperaktivita, rychlý metabolismus - zděděno po matce anebo disomie – oba chromosomy od otce („chybí kousek matky“) Philadelphský chromosom – translokace chromosomů 9 a 22 – primární příčina chronické myeloidní leukémie
Pozn.: s. = syndrom
KLASTOGENEZE, KLASTOGENY Základem chromosomální aberace je 1 - 2 zlomy na chromosomu Klastogeny – látky způsobující zlomy na chromosomech (klastogenezi) Klastogeny chemické – analogy bazí (bromuracil) látky interkalační (akridin oranž), látky deaminující báze (HNO2) Fyzikální (UV, X-paprskyA)
GENOMOVÉ MUTACE – POČETNÍ ZMĚNY CHROMOSOMŮ Ploidie – počet chromosomových sad 1) Euploidie – změna počtu celých chromosomových sad: haploidie (1), diploidie (2), triploidie (3), tetraploidie (4) atd.
2) Aneuploidie – změna počtu jednotlivých chromosomů: nulisomie (0), monosomie (1) disomie (2, oba chromosomy však pocházejí od stejného rodiče = chyba !!!) trisomie (3), tetrasomie (4) atd.
PŘÍKLADY GENOMOVÝCH MUTACÍ
Obecně nazývány: chromosomální syndromy Pohlavní syndromy:
Turnerův s. - žena mající pouze 1 chromosom X (45, X) - malý vzrůst, sterilita (zakrnělé pohlavní orgány) Syndrom nadsamice – 3 chromosomy X u ženy (47, XXX) Klinefelterův s. – muž s nadbytečným chromosomem X (47, XXY) - snížená schopnost rozmnožování, znaky „ženskosti“ (chůze...) Syndrom nadsamce – muž se dvěma chromosomy Y (47,XYY) - agresivita, často těžcí zločinci ve věznicích
Ostatní chromosomální syndromy:
Downův s. – nejčastější a nejznámější, trisomie 21. chr. (47,21) - snížená mobilní schopnost, snížená inteligence, „mongolismus“, „opičí rýha“ na dlani, vrozené srdeční vady dožívají se nižšího věku, riziko vyššího věku matky Další trisomie méně časté, podobné potíže (trisomie 8., 13., 15. chromosomu)
SHRNUTÍ KLASIFIKACE MUTACÍ
Mutace genové (bodové) - mění kvalitu genu a potažmo proteinu
Mutace chromosomální (chromosomální aberace)
přestavby chromosomů způsobují změnu genové exprese (intenzitu syntézy proteinů), v některých případech ztrátu či změnu genů
Mutace genomové – způsobují disbalanci genových produktů (proteinů)
- u člověka jsou zpravidla letální (triploidie a tetraploidie v potratech), některé aneuploidie jsou slučitelné se životem: Down, TurnerA
MUTAGENEZE A REPARACE DNA
Neustále dochází ke změnám na DNA
K opravě vzniklých chyb slouží různé reparační systémy
Pokud rychlost mutageneze (genové mutace) přesáhne kapacitu reparačních systémů, mutace se zakonzervují
Mutace v genech odpovědných za reparaci – těžké postižení
Např. onemocnění Xeroderma pigmentosum Postižení postrádají funkční opravný systém vůči následkům UV záření, silně pigmentovaná kůže (pihy), vznik nádorů, nemocní se nesmí vystavovat slunečnímu záření, dožívají se 20 – 30 let
MUTACE – PŘÍTEL NEBO NEPŘÍTEL ?
Nepřítel: mutace způsobují méně či více závažné poškození organismu, znemožňují reprodukci, smrt organismu
Přítel: mocný nástroj evoluce – v důsledku genových duplikací vznik genových rodin, vznik nových genů (alel), které se uplatnily v nových přírodních podmínkách, vznik nových biologických druhů
Výhodné pro mikroorganismy s krátkou generační dobou – soutěž „kdo s koho“ – parazit pomocí mutací bojuje proti vývoji imunitních reakcí hostitele (tedy odolností)
Závěr: Postiženému jedinci mutace zpravidla mnoho radosti nepřinese, avšak z pohledu velkého časového měřítka pomáhá biologickým druhům v boji o přežití
BAKTERIÁLNÍ TESTY GENOTOXICITY – BAKTERIÁLNÍ DNA Nejznámější test = Amesův test bakteriální DNA se liší strukturně od DNA eukaryotní (tedy vč. člověka) bakteriální DNA – kruhová jediná molekula DNA v buňce (mimo plasmidy) DNA není uspořádaná jako eukaryotní chromosomy
na bakteriálních modelech lze testovat pouze genové mutace
BAKTERIÁLNÍ TESTY GENOTOXICITY
Výhody těchto testů v organismu:
mikroskopický organismus mnoho jedinců v malém „mikroprostoru“ (objem v tekutém médiu / plocha na agarové plotně), ale i „makroprostoru“ – stačí laboratoř vybavená termostaty, není třeba speciálních chovných místností či zvěřinců obvykle je známo hodně o genomu modelových organismů dostupné mutantní kmeny rychlá kultivace krátkodobé testy – brzké výsledky
Nevýhody:
bakterie má jako prokaryotní organismus evolučně a tedy i geneticky daleko k člověku – výsledky těchto testů musí být doplněny o testy na savcích
AMESŮV TEST o
Od 70. let 20. století (Bruce Ames, USA)
o
Původně vyvinut k testování karcinogenity o
Výsledky však byly sporné. Mnohé látk, které byly v Ames. testu pozitivní, nezpůsobovaly nádorové bujení a také naopak. Pouze některé látky, které se vyznačovaly pozitivním výsledkem v Ames. testu, měly souvislost s nádorovým bujením. Bylo zjištěno, že karcinogenita souvisí s mutacemi, ale že ne všechny mutace způsobují karcinogenitu. Od té doby se Amesův test používá pro zjišťování mutageneze látek.
o
Testovací organismus: bakterie Salmonella typhimurium
o
Používá se kmen vyžadující přítomnost určité látky v mediu (aminokyselina) = auxotrofní; zde konkrétně histidin
o
Živné medium tuto látku neobsahuje
o
Naočkování bakterií, přidání testované chemikálie
AMESŮV TEST – HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ •
Bakterie nerostou – chemikálie nezpůsobuje genové mutace – Amesův test je negativní (nemůžeme si troufnout tvrdit, že látka není mutagenní – nevíme, zda nemůže způsobovat např. chromosomální aberace, které Amesův test nedetekuje)
•
Bakterie rostou – látka je mutagenní, ač je bakterie závislá na přísunu určité látky (AMK), která není v mediu přítomna, je schopna života = PROBĚHLA MUTACE, díky níž se objevila schopnost bakterie syntetizovat potřebnou AMK
•
Ames-test hodnotí reverzní mutace
AMESŮV TEST – SCHÉMA POKUSU A MOŽNÝCH VÝSLEDKŮ
DALŠÍ BAKTERIÁLNÍ TESTY GENOTOXICITY Amesův test má v současnosti mnoho variant – např. ve způsobu uspořádání (Petriho misky, mikrodestičky...) SOS chromotest (Escherichia coli) – mutace způsobuje změnu zbarvení, spektrofotometrické hodnocení (mikrodestičky) Muta-Chromo-Plate test (Salmonella typhimurium) – změna zbarvení při mutaci, mikrodestičky Řadu testů lze dnes koupit od distributorů jako tzv. KITy
MUTA-CHROMOPLATE TEST – SCHÉMA VYHODNOCENÍ
MIKROJADERNÉ TESTY Vyvinuty v roce 1975 (W. Schmid) Prvně testy na buňkách kostní dřeně (myš) Později rozšířeno na další tkáně a organismy Použití v podmínkách in vitro i in vivo U člověka nejčastěji z buněk periferní krve nebo ústní sliznice Testy na rostlinách (environmentální problematika) Testy na živočišných tkáňových kulturách (např. CHO – linie z čínského křečka) – snaha omezit testy na zvířatech např. pro účely kosmetického průmyslu apod.
MIKROJADERNÉ TESTY – CO TO JE MIKROJÁDRO A JAK VZNIKÁ?
mikrojádro = mikronukleus (anglicky micronucleus) tělísko obsahující acentrické fragmenty chromosomů (vzniklé při chromosomálních aberacích - delecích), je obalené jaderným obalem mikrojádro může obsahovat i celé chromosomy, které „zbudou“ po chybném dělení jader (vznik genomových mutací, nondisjunkce) přítomnost mikrojader v buňce značí chromosomální nebo genomové mutace (typ mutací lze odlišit např. pomocí FISH – značené sondy pro centromeru – je-li v mikrojádře zjištěna centromera, jedná se o celý chromosom a tudíž aneuploidii) více mikrojader v buňce vzniká při apoptóze (programovaná buněčná smrt) mikrojádro se již dále nedělí – zůstává pouze v původní buňce
MIKROJADERNÉ TESTY - VYHODNOCOVÁNÍ Buňky se podle potřeby upraví (záleží na typu organismu a tkáně; v případě lidských buněk je potřeba je fixovat) Preparát se obarví barvivem, které se váže na jaderný materiál Mikroskopování – dnes často spojeno s digitální analýzou obrazu – automatizace vyhodnocování vysokého počtu buněk Je potřeba prohlédnout několik tisíc buněk z jednoho vzorku a spočítat kromě počtu mikrojader také frekvenci dělení – tzv. mitotický index (počet mitóz na 1000 buněk)
MIKROJADERNÝ TEST – UKAZATEL GENOTOXICITY Přítomnost mikrojader v buňkách poukazuje na mutagenezi (klastogenitu či aneuploidii) Mikrojádra mohou být také biomarkery rakoviny (genetické příčiny karcinogeneze tkví nejčastěji v chromosomálních aberacích) Mohou souviset také s teratogenitou Vyšší počet mikrojader u novorozenců, jejichž matky v průběhu těhotenství prodělaly nějakou chorobu
MIKROJADERNÉ TESTY
COMET ASSAY (KOMETOVÝ TEST) Jednoduchý, rychlý a citlivý test pro detekci poškození DNA Provádí se na živých buňkách Založen na elektroforéze + fluorescenčním značení DNA Buňky se pevně přichytí na gel Nepoškozené dlouhé molekuly DNA (celé chromosomy) zůstávají na místě (tzv. tělo komety) Fragmenty DNA migrují při elektroforéze ven z buněčných jader (vytvářejí tzv. ocas komety) Poškozené buňky mají tvar komety
COMET ASSAY (KOMETOVÝ TEST)
TESTY GENOTOXICITY NA OBRATLOVCÍCH Nelze testovat na lidech Pro zjištění bezpečnosti a rizik látek pro člověka je třeba volit co nejpodobnější organismus Menší savci – myš, potkan, čínský křeček, králík Primáti (např. makak) Savčí buněčné linie (šetří životy pokusných zvířat – navíc cena i následný chov pokusných zvířat nákladné na finance, prostor a další podmínky (např. uchování čistoty ve zvěřincích, ochrana před infekcemi, krmení...)
POZNATKY Z HAVÁRIÍ Některé znalosti o účincích chemikálií na člověka pochází z havárií nebo jiných nešťastných událostí, kdy je potřeba nalézt souvislost mezi určitou látkou (toxická látka, lék, choroba) a sledovaným jevem (mutace, nádor, malformace) Viz dále v přednášce o karcinogenezi a teratogenezi
POUŽITÁ LITERATURA
Kimball J.W.: Biology. WCB Publishers. Dubuque, Melbourne, Oxford 1998. Kocsis, A., Molnar, H. (eds.): Genotoxicity. Evaluation, Testing and Prediction. Nova Biomedical Books. New York 2009. Penning, T.M. (ed.): Chemical carcinogenesis. Springer. New York, Heidelberg, London, Dordrecht 2011
DĚKUJI ZA POZORNOST Tento projekt (57/2013/B4: Inovace předmětu Environmentální toxikologie) je podporován ze zdrojů Fondu Rozvoje Vysokých Škol.
