Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta
MIKROBIÁLNÍ OBRAZ KOŘENÍ Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce:
Autor:
doc. MUDr. Jan Šimůnek, CSc.
Bc. Eva Večeřová
Brno, květen 2012
Jméno a příjmení autora: Eva Večeřová Studijní obor: Nutriční specialista Název diplomové práce: Mikrobiální obraz koření Vedoucí diplomové práce: doc. MUDr. Jan Šimůnek, CSc. Rok obhajoby diplomové práce: 2012 Počet stran:119 Počet příloh:4
Anotace: Významným faktorem pro posouzení kvality koření je jeho mikrobiální kontaminace. Práce se zabývá zhodnocením mikrobiální čistoty koření na našem trhu a možným vlivem na lidské zdraví. Teoretická část je zaměřena na anaerobní sporulující bakterie, plísně a mykotoxiny potenciálně se nacházející v koření. Dále se věnuje faktorům ovlivňující růst mikroorganismů se zaměřením na jejich antimikrobální účinky, které lze použít v potravinářství pro eliminaci mikroorganismů. Poslední kapitola popisuje druhy koření zkoumané v praktické části, jeho charakteristika, použití, obsahové látky a možný vliv na lidské zdraví. Praktická část shrnuje výsledky laboratorní práce zaměřené na zjištění mikrobiální kontaminace koření běžně dostupného v obchodní síti České republiky. Klíčová slova: anaerobní sporulující bakterie, termorezistentní plísně, xerofilní plísně, mykotoxiny, koření
Annotation: Microbial contamination is important factor for evaluation of quality of spice. Thesis is focused on appraisal of microbial cleanness of spice on our market and possible impact on human health. Practical part is focused on anaerobic spore-forming bacteria, mold and mycotoxins potentially present in spice. Moreover is dedicated to factors influencing growth of microorganisms with focus on their antimicrobial effects, which can be used in food processing for elimination of microorganisms. Last chapter is describing kind of spice examined in practical part, their characteristics, usage, contained substances and influence on human life. Practical part summarizes the results from laboratory work focused on findings of microbial contamination of spice regulary available in Czech markets. Key words: anaerobic spore-forming bacteria, thermoresistant fungi, xerophilic fungi, mycotoxins, spices
Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. MUDr. Jana Šimůnka, CSc., a že jsem v seznamu uvedla všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne………………………….
……………………………………. podpis
Poděkování: Ráda bych poděkovala doc. MUDr. Janu Šimůnkovi, CSc. za odborné vedení diplomové práce, kritické posouzení textu, cenné rady a velkou pomoc v laboratoři k praktické části a její následné zpracování a vyhodnocení. Dále bych chtěla poděkovat své kamarádce Bc. Elišce Krejskové a kolegyni Bc. Michaele Suchánkové za jazykovou korekturu, psychickou podporu, optimismus a pomoc při psaní práce.
Obsah 1 ÚVOD ............................................................................................................................... 11 2 BAKTERIE ....................................................................................................................... 12 2.1 Rozdělení bakterií ....................................................................................................... 12 2.2 Význam, popis a charakteristika rodu Bacillus ............................................................ 12 2.2.1 Bacillus cereus ..................................................................................................... 13 2.2.1.1 Alimentární onemocnění ................................................................................. 13 2.2.1.2 Infekční dávka ................................................................................................ 14 2.2.1.3 Emetický toxin ................................................................................................ 14 2.2.1.4.Enterotoxiny ................................................................................................... 15 2.2.1.5 Spory.............................................................................................................. 15 2.2.2 Bacillus coagulans ............................................................................................... 15 2.2.3 Bacillus subtilis .................................................................................................... 15 2.2.4 Bacillus anthracis ................................................................................................. 16 2.3. Význam, popis a charakteristika rodu Clostridium ..................................................... 16 2.3.1. Clostridium botulinum ........................................................................................ 17 2.3.1.1. Botulismus .................................................................................................... 18 2.3.1.1.1 Alimentární botulismus .......................................................................................18 2.3.1.1.2 Traumatický botulismus ......................................................................................18 2.3.1.1.3 Kojenecký botulismus..........................................................................................19
2.3.2 Clostridium perfringens ....................................................................................... 19 2.3.2.1 Enterotoxin .................................................................................................... 19 2.3.2.2 Toxin α ........................................................................................................... 20 2.3.2.3 Další toxiny .................................................................................................... 20 2.4 Struktura a funkce endospor........................................................................................ 21 2.4.1 Význam a odolnost spor ....................................................................................... 21 2.4.2. Struktura zralé spory ........................................................................................... 22 2.4.3 Sporulace ............................................................................................................. 22 2.4.4 Germinace spor (klíčení) ...................................................................................... 23 2.4.5 Termorezistence spor ........................................................................................... 23 2.5 Bakteriální kontaminace koření................................................................................... 24 3 PLÍSNĚ ............................................................................................................................. 27 3.1 Morfologie plísní ........................................................................................................ 27 3.2 Cytologie plísní .......................................................................................................... 27
3.3 Rozmnožování plísní .................................................................................................. 28 3.4 Rozdělení mikroskopických hub ................................................................................. 28 3.5 Taxonomie mikroskopických hub dle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování ... 29 3.6 Nejvýznamnější rody mikroskopických vláknitých hub .............................................. 29 3.6.1 Rod Aspergillus ................................................................................................... 29 3.6.2 Rod Penicillium ................................................................................................... 30 3.6.3 Rod Mucor ........................................................................................................... 30 3.6.4 Rod Rhizopus ...................................................................................................... 31 3.6.5 Rod Fusarium ...................................................................................................... 31 3.7 Termorezistentní mikromycety ................................................................................... 32 3.7.1 Přehled termorezistentních mikromycet ............................................................... 33 3.7.1.1 Byssochlamys sp. ............................................................................................ 33 3.7.1.2 Eupenicillium spp. .......................................................................................... 33 3.7.1.3 Neosartorya sp. .............................................................................................. 34 3.7.1.4 Talaromyces sp. ............................................................................................. 34 3.8 Xerofilní mikromycety................................................................................................ 34 3.9 Toxigenní mikromycety .............................................................................................. 35 3.10 Plísně v koření .......................................................................................................... 35 3.11 Mykotoxiny .............................................................................................................. 37 3.11.1 Nejvýznamnější zástupci mykotoxinů ................................................................ 38 3.11.1.1 Aflatoxin....................................................................................................... 38 3.11.1.2 Ochratoxin ................................................................................................... 38 3.11.1.3 Patulin ......................................................................................................... 38 3.11.1.4 Citrinin ........................................................................................................ 39 3.11.1.5 Zearalenon ................................................................................................... 39 3.11.1.6 Fumonisin .................................................................................................... 39 3.11.1.7 Trichotheceny............................................................................................... 40 3.11.1.8 Sterigmatocystin ........................................................................................... 40 3.11.2 Riziko pozdních účinků mykotoxinů .................................................................. 40 3.11.3 Mykotoxikozy .................................................................................................... 41 3.11.4 Limity ................................................................................................................ 41 3.11.5 Mykotoxiny v koření .......................................................................................... 43 4 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ RŮST MIKROORGANISMŮ ............................................... 45 4.1 Výživa ........................................................................................................................ 45 4.2 Teplota ....................................................................................................................... 45 4.2.1 Smrtící účinky vysokých teplot a termorezistence ................................................ 46
4.3 pH prostředí ................................................................................................................ 47 4.4 Vodní aktivita ............................................................................................................. 47 4.4.1 Vliv na potraviny ................................................................................................. 47 4.4.2 Antimikrobiální působení aktivity vody ............................................................... 48 4.5 Oxidoredukční potenciál ............................................................................................. 48 4.6 Povrchové napětí ........................................................................................................ 49 4.7 Záření ......................................................................................................................... 49 4.7.1 Antimikrobiální působení záření .......................................................................... 49 4.7.2 Ozařování potravin............................................................................................... 50 4.7.3 Ozařování v ČR a jeho značení ............................................................................ 50 4.7.4 Legislativa ........................................................................................................... 50 4.8 Hydrostatický tlak....................................................................................................... 51 4.8.1 Antimikrobiální působení vysokého tlaku ............................................................ 52 4.8.2 Vliv na potraviny ................................................................................................. 52 4.9 Elektrický proud ......................................................................................................... 53 4.10 Ultrazvuk .................................................................................................................. 53 4.10.1 Antimikrobiální působení ultrazvuku ................................................................. 53 . 4.11 Látky s antimikrobiální aktivitou............................................................................. 54 4.11.1 Antimikrobiální aktivita vybraných druhů koření ............................................... 54 5 KOŘENÍ ........................................................................................................................... 56 5.1 Pepřovník černý (Piper nigrum) .................................................................................. 56 5.1.1 Použití pepřovníku černého .................................................................................. 56 5.1.2 Chemické látky v pepři ........................................................................................ 56 5.2 Paprika ....................................................................................................................... 57 5.2.1 Paprika roční (Capsicum Annuum) ....................................................................... 57 5.2.2 Paprika křovitá čili chilli (Capsicum frutescens)................................................... 57 5.2.2.1 Použití chilli ................................................................................................... 58 5.2.3 Chemické látky v paprikách ................................................................................. 58 5.3 Zázvorovník lékařský (Zingiber officinale) ................................................................. 58 5.3.2 Použití zázvorovníku............................................................................................ 59 5.3.3 Chemické látky zázvoru ....................................................................................... 59 5.4 Hřebíčkovec kořenný (Eugenia caryophyllata) ........................................................... 59 5.4.1 Použití hřebíčku ................................................................................................... 60
5.4.2 Chemické látky .................................................................................................... 60 5.5
Skořicovník
cejlonský,
Skořicovník
čínský
(Cinnamomum
zeylanicum,
Cinnamomum casia) ......................................................................................................... 60 5.5.1 Použití skořicovníku ............................................................................................ 60 5.5.2 Chemické látky skořice ........................................................................................ 61 5.6 Česnek setý (Allium sativum) ...................................................................................... 61 5.6.1 Použití česneku .................................................................................................... 61 5.6.2 Chemické látky česneku ....................................................................................... 61 5.7 Kmín luční (Carum carvi)........................................................................................... 62 5.7.1 Použití kmínu ....................................................................................................... 62 5.7.2 Chemické látky kmínu ......................................................................................... 62 5.8 Vliv koření na zdraví člověka ..................................................................................... 63 5.8.1 Vliv na metabolismus lipidů ................................................................................. 63 5.8.2 Vliv na diabetes melitus ....................................................................................... 63 5.8.3 Antilithogenní efekt ............................................................................................. 64 5.8.4 Antioxidační účinek ............................................................................................. 64 5.8.5 Protizánětlivý účinek............................................................................................ 65 5.8.6 Stimulace trávení ................................................................................................. 65 5.8.7 Vliv na agregaci krevních destiček ....................................................................... 65 5.8.8 Antihypertenzní účinek ........................................................................................ 65 6 PRAKTICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 66 6.1 Cíl práce ..................................................................................................................... 66 6.2 Hypotézy .................................................................................................................... 67 6.3. Materiál ..................................................................................................................... 68 6.2.1 Testované koření .................................................................................................. 68 6.2.2 Půdy .................................................................................................................... 69 6.2.3 Další roztoky........................................................................................................ 73 6.2.4 Laboratorní vybavení ........................................................................................... 74 6.2.5 Příprava laboratorního skla .................................................................................. 74 6.3 Metodika .................................................................................................................... 75 6.3.1 Stanovení celkového počtu mikroorganismů ........................................................ 75 6.3.2 Stanovení počtu kvasinek a plísní ......................................................................... 75 6.3.3 Průkaz termorezistentních mikroorganismů .......................................................... 76
6.3.4 Průkaz xerofilních plísní ...................................................................................... 76 6.3.5 Odečítání výsledků............................................................................................... 77 6.3.6 Mikroskopická diferenciace termorezistentních sporulujících bakterií a kvasinek . 78 6.3.7 Identifikace mikromycet ...................................................................................... 78 6.3.7.1 Příprava očkovací suspence: .......................................................................... 78 6.3.7.2 Očkování kmenů dle Pitta ............................................................................... 78 6.3.7.3 Mikroskopická identifikace mikromycet .......................................................... 79 6.3.7.4 Makroskopická identifikace mikromycet ......................................................... 79 6.3.8 Konzervace mikromycet ...................................................................................... 80 6.4 Statistické zpracování ................................................................................................. 80 6.5 Výsledky .................................................................................................................... 81 6.5.1 Hodnocení celkového počtu mikroorganismů ....................................................... 81 6.5.2 Hodnocení počtu kvasinek a plísní ....................................................................... 83 6.5.3 Hodnocení průkazu termorezistentních mikroorganismů ...................................... 85 6.5.4 Hodnocení průkazu xerofilních plísní ................................................................... 87 6.5.5 Hodnocení diferenciace termorezistentních sporulujících bakterií a kvasinek ....... 89 6.5.6 Výskyt termorezistentních plísní .......................................................................... 90 6.5.7 Výskyt xerofilních plísní ...................................................................................... 91 6.6 Ověřování hypotéz ...................................................................................................... 93 6.6.1 Hypotéza 1 ........................................................................................................... 93 6.6.2 Hypotéza 2 ........................................................................................................... 93 6.6.3 Hypotéza 3 ........................................................................................................... 94 6.6.4 Hypotéza 4 ........................................................................................................... 95 6.6.5 Hypotéza 5 ........................................................................................................... 95 6.6.6 Hypotéza 6 ........................................................................................................... 96 6.6.7 Hypotéza 7 ........................................................................................................... 97 6.6.8 Hypotéza 8 ........................................................................................................... 97 7 DISKUZE ......................................................................................................................... 98 8 ZÁVĚR ........................................................................................................................... 103 SOUHRN ........................................................................................................................... 105 POUŽITÉ ZDROJE ........................................................................................................... 107 PŘÍLOHY .......................................................................................................................... 120
1 ÚVOD Po staletí jsou používány různé části rostlin, většinou tropické, k úpravě chuti, vůně a barvy potravin. Účinnými látkami koření jsou silice různé koncentrace a různého složení. Používá se převážně mletých listů, kořenů, kůry, semen a jiných částí, a to sušených, takže obsah vody i vodní aktivita jsou nízké a neumožňují růst mikroorganismů. Do potravin se koření přidává v malých dávkách, ale přesto může být příčinou značné mikrobiologické kontaminace. Mikrobiologické nálezy u různých druhů koření se značně liší. Na rozsah kontaminace má značný vliv místo a doba sklizně, sušení a veškerá následná manipulace, včetně mletí a balení. Zpracování koření často probíhá v subtropických a tropických oblastech, kde jsou často velmi stížené hygienické podmínky. Počty mikroorganismů v koření jsou velmi rozdílné, pohybují se od 10 g-1 do 109 g-1. Jsou tvořeny zejména sporulujícími bakteriemi. V koření se nachází i koliformní bakterie. Často se vyskytují kvasinky a významnou složkou mikroflóry jsou plísně, které dosahují počtu až 10 5 g-1. Jelikož se koření do potravin přidává v průběhu vaření, často na začátku, je pak většina mikroorganismů usmrcena během kulinární úpravy. Proto byl v praktické části zkoumán především obsah termorezistentních mikroorganismů u těch druhů koření, které se obyčejně přidávají do pokrmů ke konci tepelné úpravy.
11
2 BAKTERIE 2.1 Rozdělení bakterií Dle fenotypového systému bakterií se zařazují následující rody bakterií do skupiny grampozitivních sporulujících tyčinek a koků, jejichž společným znakem je schopnost tvořit v nepříznivých podmínkách rezistentní spory. Díky nim jsou odolnější a proto velmi rozšířené. Jejich buňky jsou obvykle tyčinkovité, popř. kulovité a často tvoří bičíky. Z metabolického hlediska se jedná o různorodou skupinu. Většina rodů produkuje velké množství extracelulárních enzymů, což umožňuje rozkládat široké spektrum látek včetně polymerů, např. škrobu či celulózy. Často produkují antibiotika a toxiny.(71)
2.2 Význam, popis a charakteristika rodu Bacillus Zařazení rodu Bacillus: doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli a řád Bacillales. Bacillus spp. jsou sporulující grampozitivní aerobní, popř. fakultativně anaerobní bakterie. Jsou to delší tyčinky, které se mohou shlukovat do řetízků. S výjimkou B. anthracis jsou pohyblivé. Výskyt je různorodý: od půdy, přes vodu, rostliny až po potraviny a suroviny. Z biochemických znaků jsou charakteristické pro štěpení bílkovin za vzniku amoniaku a fermentace sacharidů s málo výraznou tvorbou kyselin. Jsou kataláza pozitivní a oxidáza variabilní redukující dusičnany. Jako jedni z mála jsou schopní tvorby spor. Při sporulaci se nemění tvar buňky, spory bývají lokalizovány v různých částech sporangia. Sporulace probíhá za přístupu kyslíku. Tvary endospor a mateřských buňek jsou charakteristickými znaky jednotlivých druhů bacilů využitelných v taxonomii. Podle těchto charakteristik je možné Bacillus spp. rozdělit do tří morfologických skupin. I. morfologická skupina zahrnuje endospory oválného tvaru, které neztlušťují buňku. Patří sem B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. lichnoformis, B. mycoides a B. thuringiensis. II. morfologická skupina je typická tvorbou endospor oválného tvaru, které ztlušťují mateřskou buňku. Řadí se sem B. circulans, B. coagulans nebo B. alcalophilus. Do III. morfologické skupiny řadíme bakterie tvořící endospory kulatého tvaru, co vždy ztlušťují mateřskou buňku.(150, 146)
12
2.2.1 Bacillus cereus Je sporulující, fakultativně anaerobní tyčinka, jejíž velikost se pohybuje od 1,0 μm do 5,0 μm. Většina kmenů tvoří na běžně užívaném agaru spory již během několika dní. Spory Bacillus cereus jsou vysoce termorezistentní. Většina kmenů je schopna produkce toxinu, je pohyblivá, má schopnost hemolýzy, fermentace cukrů a produkce lecitinázy. Bacillus cereus je saprofyt široce rozšířený v přírodě. Velmi často je izolován z půdy, rostlin a vody. Roste na rozkládajících se zbytcích rostlin v půdě, hnoji a krmivech. Z prostředí bakterie snadno kontaminují potraviny, např. kontaminace kravských vemen. Většina členů B.cereus jsou mezofilní, ale jsou i výjimky, které rostou při teplotách 5°C či 43°C. Za varianty B.cereus se někdy považují druhy jako je B.antracis, B.mycoide a B.thuringiensis, které jsou geneticky (podle chromozomální DNA) od sebe neodlišitelné. Vznikly evolucí z druhu B.cereus, skupina byla pojmenována Bacillus cereus sensu lato. (150, 146) 2.2.1.1 Alimentární onemocnění Bacillus cereus produkuje dva typy toxinů. Zvracení je způsobeno emetickým toxinem, zatímco průjmové onemocnění spouští enterotoxiny. Nákaza emetickým toxinem je charakterizována nauzeou, zvracením a abdominálními křečemi, inkubační doba toxinu je 0,56 hodin. Podobá se stafylokokové enterotoxinóze se stejnými symptomy a inkubační dobou. Nákaza enterotoxinem se projevuje břišními křečemi a průjmem s inkubační dobou 8-16 hodin. Připomíná otravu jídlem Clostridium perfringens. Projevy obou typů onemocnění ustupují obvykle do 24 hodin po nástupu. (150, 10)
13
Charakteristika
Průjmové onemocnění
Emetické onemocnění
Typ toxinu
Protein; enterotoxiny: Hbl,
Cyklický peptid; emetický
Nhe, CytK
toxin (cereulid)
Místo produkce toxinů
Tenké střevo hostitele
Potraviny
Infekční množství
105 – 107 (buněk či spór)
105 – 108 (KTJ/g)
Inkubační doba
8 – 16 h (ojediněle do 24 h )
0,5 – 6 h
Doba trvání nemoci
12 – 24 h (ojediněle pár dní)
6 – 24 h
Symptomy
Bolest břicha, řídký průjem a
Nevolnost, zvracení, křeče
ojediněle nevolnost Druh potraviny
Masné produkty, polévky,
Opékaná a vařená rýže,
zelenina, koření, pudinky,
těstoviny, nudle a cukrářské
uzeniny, mléko a mléčné
zboží
produkty Tab. 1 Charakteristika onemocnění způsobená Bacillus cereus (10,146) 2.2.1.2 Infekční dávka V potravinách, které vyvolaly otravu, se počet buněk B.cereus pohyboval v rozmezí 2.102 až 109 g-1 (ml-1). Celková infekční dávka kolísá mezi 105 a 108 životaschopných buněk nebo spor. Každý pokrm, který obsahuje více jak 103 buněk B. cereus na 1 gram nelze považovat za zcela bezpečný ke konzumaci. (146) 2.2.1.3 Emetický toxin Emetický toxin je pojmenován cereulid, jeho struktura je tvořena třemi opakováními čtyř aminokyselin a/nebo oxokyselin: (D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val). Tvorba toxinu začíná na konci logaritmické fáze během vegetativního růstu B.cereus. Syntéza tohoto toxinu se pohybuje v rozmezí teploty 12-37°C (největší produkce při 12 – 22°C). Produkci toxinu ovlivňuje i přístup kyslíku, hladina pH nebo přítomnost speficických aminokyselin. Mechanismus intoxikace způsobený cereulidem nebyl zcela objasněn. U zvířecích modelů bylo zpozorováno, že se cereulid váže na 5-HT3 receptor a stimulace vagus afferent způsobuje zvracení. Další biologický efekt byl popsán v případě dvou úmrtí způsobených jaterním selháním, kde toxin způsobil inhibici mitochondriální aktivity v inhibici β oxidace mastných kyselin. Zmíněný toxin je rezistentní vůči teplu, kyselému prostředí a proteolýze, 14
proto odolává žaludečním kyselinám a proteolytickým střevním enzymům. Může se tudíž vyskytnout ve znovu ohřáté potravě, která byla předtím skladována při pokojové teplotě. (10, 146) 2.2.1.4. Enterotoxiny Tři
toxiny
jsou
spojovány
s průjmovým
onemocněním:
Hemolysin
BL(Hbl),
Nehemolytický enterotoxin (Nhe) a Cytotoxin K (CytK). Bylo zpozorováno, že Hbl způsobuje akumulaci tekutiny v králičí střevní smyčce, má dermanekrotickou aktivitu, cévní propustnost, cytotoxickou aktivitu a hemolytickou aktivitu. U enterotoxinu Nhe nebyla zjištěna hemolytická aktivita. CytK je protein s nekrotickou, cytotoxickou a hemolytickou aktivitou.(146) 2.2.1.5 Spory Spory Bacillus cereus jsou více hydrofobní než spory jiných druhů rodu Bacillus. Tím snáze přilnou k různým povrchům. Proto je žádoucí používat dezinfekce, samotné mechanické čištění má malou účinnost. Spory mají pily, které jim pomáhají při adhezi. To umožňuje sporám odolávat sanitaci a tak zůstávat na površích, odkud se snadnou dostanou na potraviny. Hornstra et al. publikovali studii, kde adherované spory na povrchu mlékařských nádob před desinfekcí nechali vyklíčit pomocí mixu l-alaninu a inosinu. Tento proces vedl ke snížení přežitých buněk bacila o 3 logaritmické řády. (146, 54) 2.2.2 Bacillus coagulans Je aerobní až mikroaerofilní bakterie tvořící kyselinu mléčnou. Tvoří spory, které jsou odolné vůči chemickým a fyzikálním vlivům. Optimální teplota růstu je kolem 50°C. V potravinářství je poměrně častou příčinou kazivosti výrobků. Z důvodu tvorby spor jej nelze zařadit mezi bakterie mléčného kvašení. (146) 2.2.3 Bacillus subtilis Je ubikvitárně se vyskytující se bakterie, tvořící velmi tvrdé a ochranné endospory, což jí umožňuje přežití i v extrémních podmínkách životního prostředí. Není považován za lidský patogen. Může kontaminovat potraviny, ale jen zřídka způsobuje otravu. (28)
15
2.2.4 Bacillus anthracis Je patogenní pro savce, u nichž vyvolává sněť slezinnou (antrax). Antrax se u člověka vyskytuje po aspiraci spor nebo po konzumaci kontaminované potraviny. Vyskytují se tři druhy antraxu: kožní, plicní a střevní, kdy nejčastější je kožní antrax související s infekcí oděrek sporami z půdy nebo ze zvířat. Během 12 – 36 hodin spory vyklíčí, začnou se množit vegetativní buňky a vznikne charakteristický želatinový edém na místě kontaminace. Ten se vyvine v papulu, která se rapidně změní ve vezikulu, dále v pustulu a ve finále na nekrotický vřed, ze kterého infekce může diseminovat a vést k septickému stavu. Plicní antrax vzniká nejčastěji z inhalace spor spolu s prachem ze zvířecích chlupů. Bacillus anthracis je rezistentní vůči mnohým antibiotikům, citlivý je k penicilinu. Anthrax byl několikrát použit jako biologická zbraň, kdy bylo využito spor vhodných pro přenos vzdušnou cestou. (150, 146, 156)
2.3. Význam, popis a charakteristika rodu Clostridium Zařazení rodu Clostridium: doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Clostridia a řád Clostridiales. Clostridium spp. zahrnuje sporující, mezofilní, grampozitivní, tyčinkovité bakterie rostoucí za anaerobních podmínek. Díky tvorbě enzymů (superoxiddismutasa, peroxidasa, katalasa apod.), které neutralizují kyslíkové a peroxidové radikály, jsou některé druhy schopny tolerovat v prostředí malé množství kyslíku. Vegetativní formy jsou většinou širší než 0,5μm a dlouhé asi 10μm. Díky peritrichálně uloženým bičíkům jsou některé pohyblivé. Jejich charakteristickou vlastností je tvorba oválných či kulatých endospor vyklenujících buňku. Bakterie se vyskytují obvykle jako saprofyté a účastní se hnilobných procesů. Tvoří rezistentní spory, což přispívá k jejich rozšíření v přírodě. Spory jsou přítomny v půdě, vodě, v prachu a mohou kontaminovat potraviny. Ke svému růstu vyžadují klostridia nižší redoxní potenciál prostředí (-100mV), který umožňuje správné fungování enzymů účastnících se oxidačně-redukčních procesů v buňce (ferredoxinů). Energii získávají fermentačními procesy. Jejich bohatá enzymatická výbava umožňuje rozkládat proteiny či kvasit sacharidy. Na základě schopnosti metabolizovat různé substráty je můžeme dělit na druhy štěpící pouze sacharidy, druhy rozkládající bílkoviny, druhy schopné využívat sacharidy i bílkoviny a druhy schopné využívat puriny a pyrimidiny.
16
Pár druhů je schopno vyvolat onemocnění u lidí či zvířat, nejčastěji jsou to enterotoxikózy, neurotoxikózy, sepse a nekrotizující infekce měkkých tkání, které často komplikuje intoxikace bakteriálními toxiny a metabolickými produkty. (142) 2.3.1. Clostridium botulinum Zahrnuje heterogenní skupinu bakterií. Na základě sérologických vlastností toxinů, které bakterie produkují, jsou kmeny C.botulinum rozděleny na typy A-G. Toxiny mají shodný biologický účinek, ale rozdílnou antigenní strukturu. Tyto neurotoxiny jsou považovány za vůbec nejsilnější známé bakteriální toxiny. Jsou příčinou botulismu neboli otravy klobásovým jedem – botulotoxinem. C.botulinum je obligatorně anaerobní, avšak toleruje velmi malé stopy kysliku díky superoxiddismutase. Na základě rozdílných genetických a fenotypových vlastností jsou kmeny C.botulinum rozděleny do 4 skupin (k nim je možno zařadit i další fenotypově shodné druhy rodu Clostridium). Kmeny způsobující lidský botulismus patří do skupiny I a II. Skupina I je složena z proteolytických organismů produkujících neurotoxiny typu A, B a F. Tyto kmeny jsou mezofilní a rostou při optimální teplotě 35-37°C a nerostou pod 10°C. Jejich růst je limitován hladinou pH, optimální rozmezí je 4,3-4,5 a tolerují NaCl koncentraci až 10% v roztoku. Jejich spory jsou vysoce rezistentní k teplu. Toxicita neurotoxinu produkovaného skupinou I byla odhadnuta na ≈0,2 ng/kg tělesné hmotnosti, letální dávka pro člověka na 0,1-1 µg tělesné hmotnosti. Skupina II se skládá z neproteolytických kmenů produkujících toxiny typu B, E a F. Tyto kmeny jsou psychrotrofní s optimální teplotou růstu 26-30°C. Nicméně mohou růst i při teplotě 3°C. Limitující pH je 5 a inhibiční koncentrace NaCl kolem 5%. Spory této skupiny jsou tepelně labilnější, ale stále mohou přežít tepelné úpravy v potravinářském průmyslu. (149, 78, 64, 70) Vlastnosti Typy toxinu Proteoláza Sacharoláza Hostitel nemoci Toxinový gen Výskyt
I skupina II skupina III skupina IV skupina A, B, F B, E, F C, D G + slabá + Člověk Člověk Zvíře Chromozom Chromozom Bakteriofág Plazmid Půda, rostliny, Voda, vodní střevní trakt zvířata zvířat Tab.2 Srovnání vlastností čtyř skupin Clostridium botulinum (149, 78) 17
2.3.1.1. Botulismus Je akutní intoxikace způsobená toxinem. Toxin inhibuje uvolnění acetylcholinu z terminálních nervových zakončení na nervosvalové ploténce pomocí blokády proteinu SNA-25, podílejícího se na exostóze nesynaptických vezikul. Působí tak svalovou paralýzu. Toto paralytické onemocnění začíná postižením hlavových nervů a postupuje kaudálně ke končetinám. Mortalita dosahuje 15-60%. Rozlišujeme alimentární botulismus způsobený požitím toxinu přítomného v kontaminované potravě, traumatický botulismus způsobený toxinem vyprodukovaným v ráně a kojenecký botulismus vyvolaný požitím spór a produkcí endotoxinu ve střevě dítěte. (70, 140, 99, 72) 2.3.1.1.1 Alimentární botulismus Botulotoxin je v žaludku žaludeční šťávou rychle uvolněn a jeho sliznicí resorbován. Při resorpci nepoškozuje sliznici a stěnu žaludku a bezprostředně přechází do krve. Krví je distribuován přímo k nervovým synapsím. K plnému rozvoji intoxikace dochází většinou již do 48 hodin po příjmu kontaminované potravy. (140) Kmeny C.botulinum, produkující toxin typu A kontaminují hlavně ovoce a zeleninu. Výskyt otrav tohoto typu byl převážně zjištěn v Číně a v USA (62% případů). Typ B, vyskytující se převážně v masových výrobcích, převládá ve střední Evropě. Kmeny s produkcí botulotoxinu E jsou nejčastější příčinou otrav rybím masem a potravinami z vodních živočichů. Tvorba toxinu E byla také prokázána u Clostridium butyricum, typ F u Clostridium barati. Jsou obavy z možnosti dalšího přenosu genů neurotoxicity z C.botulinum na jiná klostridia. V naší zemi se botulismus vyskytuje zřídka, obvykle dva až tři případy ročně. V letech 1960 – 2000 bylo hlášeno pouze 103 onemocnění. Smrtelná dávka botulotoxinu pro člověka činí přibližně 6 x 10-8 g (0,1 ng/kg živé váhy). (158) 2.3.1.1.2 Traumatický botulismus Velmi vzácně se botulismus vyvine po zranění (otevřená fraktura po úrazu, střelná rána), je-li rána infikována proteolytickými druhy klostridia, může dojít k jejich klíčení a přeměně ve vegetativní formy, které produkují toxin. Rána má pak charakter klostriové myonektrózy s plynem a krepitací, kdy převažují příznaky toxické. Inkubační doba je kolem 10 dnů a průběh je podobný alimentárnímu botulismu bez gastrointestinálních příznaků. Tento typ 18
botulismu byl zaznamenán u poranění kontaminovaných půdou, u chronických uživatelů drog a po porodu císařským řezem. (140) 2.3.1.1.3 Kojenecký botulismus Je vzácné onemocnění s přibližně 71 případy ročně v USA, v roce 2005 bylo 96 reportovaných případů (54% toxin typ B, 46% typ A). Botulismus se vyskytuje nejčastěji u dětí mladších 6 měsíců, ačkoliv jsou hlášeny případy i u novorozenců a dětí stáří přibližně jednoho roku. V současné době jsou případy v USA způsobeny hlavně požitím prachu se sporami z prostředí. Na botulismus u dítěte by se mělo myslet, pokud má dítě problémy s příjmem potravy, zácpu, paralýzu a dýchací potíže. (40) 2.3.2 Clostridium perfringens Clostridium perfringens je grampozitivní anaerobní sporulující ubikvitární tyčinka. Nalézá se v půdě, vodě, vzduchu, ve střevním traktu lidí a zvířat. Ačkoliv má Clostridium poměrně vysoké požadavky pro růst, jako je 13 AMK pro něj esenciálních, optimální teplotu růstu 4335°C, pH prostředí 5-8 a substrát s vodní aktivitou 0,93-0,97, je schopno žít ve většině potravin. Má vysoce rezistentní spory přežívající var po dobu 60 minut. Tato bakterie je schopná produkovat až 13 druhů toxinů. Bakterie je klasifikována do 5 skupin dle produkce 5 hlavních toxinů (α, β, ε, ι, enterotoxin), které lze zjistit sérologickými nebo molekulárními metodami jako je PCR. (158, 76) 2.3.2.1 Enterotoxin Ve Velké Británii a USA je bakterie C.perfringens třetí nejčastější příčinou nemoci z potravin a způsobuje ji C.perfringens enterotoxin (CPE). V posledních dvou dekádách je v USA ročně hlášeno 10-20 ohnisek nákazy a desítky až stovky nemocných lidí, další ohniska nákazy pravděpodobně vůbec hlášena nejsou. Centrum pro kontrolu onemocnění a prevence odhaduje ročně až 10 000 případů. Intoxikace je charakterizována průjmem a abdominálními bolestmi. Příznaky se vyskytují do 6-24 hodin po konzumaci kontaminovaného jídla. Následná léčba je rychlá a příznaky ustupují obvykle do 12 hodin. Intoxikace C.perfringens může být způsobena požitím jídla obsahujícím >105 KTJ/g enterotoxigenního kmene, avšak už hodnota <102 KTJ v koření může hrát velkou roli při mikrobiální zátěži, kdy spory mohou vyklíčit a množství živých buněk tak dosáhnout významného počtu. Produkce enterotoxinu in vivo probíhá vylučováním toxinu ve střevě. 19
Toxin má vliv na vytvoření řady komplexů v plazmatických membránách savců. Tyto změny v permeabilitě membrány poškozují epitel, následovaný interakcí enterotoxinu s tinght junction a narušením permeability membrány intestinálního epitelu. To vyvolává nahromadění tekutiny ve střevních kličkách a průjem. (2, 76, 92) Enterotoxigenní kmeny lze zjistit díky přítomnosti genu CPE molekulárními nebo imunologickými metodami, jako je ELISA, či RPLA (reverzní pasivní latexová aglutinace). (9) V tomto případě může hrát důležitou roli koření, které je obvyklým vektorem pro mnoho organismů, zvláště pak pro sporotvorné mikroorganismy. Kořeněná jídla tak mohou představovat riziko pro veřejné zdraví. Vhodnými médii jsou například polévky, dušená masa a omáčky. Předchozí studie potvrdily, že Bacillus cereus a Clostridium perfringens jsou hlavními sporotvornými bakteriemi vyskytujícími se v koření. (122) Enterotoxin vzniká při zablokování sporulace v její časné fázi. Produkující kmeny bývají značně termorezistentní a obvykle málo α toxigenní. (29) 2.3.2.2 Toxin α Je hlavní toxin typu A C.perfringens, ostatní typy jej v malé míře také produkují. Chemicky se jedná o lecithinázu c, která z lecitinu odštěpuje fosforylcholin. Ke svému účinku potřebuje ionty Ca a pH prostředí 7,0-7,6. Do prostředí je uvolňován během logaritnické fáze růstu. Toxigenní bakterie vyvolávají u lidí tzv.snět plynatou, která je charakterizována produkcí plynu a toxiny poškozující tkáně – gangréna podkoží, myonekróza s těžkými celkovými příznaky s ohrožením života.(29, 92) 2.3.2.3 Další toxiny Toxin β je produkovaný typem B a C, toxin ε typem D vyvolávající nekrotizující enterotoxemii.
Enterotoxemie
jsou
hlavním
hospodářsky významných zvířat.(76, 29)
20
klostridiovým onemocněním domácích
2.4 Struktura a funkce endospor 2.4.1 Význam a odolnost spor Mikroorganismy jsou schopny se adaptovat na změny v jejich životním prostředí. Když se vyčerpají živiny, některé bakterie se mohou stát pohyblivými v lovu za novými živinami. Některé jsou schopny produkovat enzymy a využívat tak alternativní zdroje. Další strategií přežití v extrémních podmínkách může být tvorba endospor (vznikají uvnitř mateřské buňky, zatímco okolní buňka mateřská se rozpustí). Tento složitý vývojový proces je často iniciován při výrazné redukci potřebných živin. Umožňuje vytvářet spící a vysoce mobilní chráněné buňky se stejným genetickým materiálem v době extrémního stresu i po tisíce let. Tato schopnost se označuje jako kryptobióza. Makromolekuly ve spoře jsou stabilizovány přítomností dipikolinátu vápenatého, který spolu s nízkým obsahem vody je příčinou vysoké termorezistence spor. Endospory prokazují vysokou odolnost vůči fyzikálním i chemickým vlivům, jako jsou vysoká teplota, silná UV radiace, záření gama, vysoušení, dezinfekce, chemické poškození či enzymatická destrukce. Když se stanou okolní podmínky příznivými, bakterie se přemění ze spory zpět na buňku. (81, 18) Endospory se tvoří procesem sporulace. Jsou tvořeny převážně G+ bakteriemi rodů Bacillus,
Clostridium,
Thermoactinomyces
a
Desulfatomoaculum,
Sporosarcina,
Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces, ale také některými G- bakteriemi (Coxiella burnetti). Objevují se přibližně 6-8 hodin po ukončení logaritmické fáze růstu. Sporicidní látky jsou etylenoxid, beta-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová - Persteril, jodové preparáty, achloramin. Většina spor se nachází ve vodě a půdě, kde jsou schopny přežívat po extrémně dlouhou dobu. Medicínsky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium. (81, 18)
21
2.4.2. Struktura zralé spory Spora je vysoce organizovaná struktura, která má zcela stejný genom s původní vegetativní buňkou, avšak díky minimálnímu obsahu molekul vody je její metabolismus redukován na minimum. Odolnost endospory lze částečně vysvětlit její unikátní buněčnou strukturou. Skládá se z několika vrstev. Na povrchu je exosporium, poté vnější proteinový plášť obklopující sporu poskytuje většinu chemické a enzymatické rezistence. Pod ním se nachází velmi silná vrstva peptidoglykenu, který se nazývá kortex. Další vrstvou je zárodečná buněčná stěna. Tato vrstva se stává buněčnou stěnou bakterie po klíčení endospory. Poté vnitřní plášť, který je hlavní bariérou před propustností několika potenciálně škodlivých chemických látek Ve středu endospory, v jádře, je ve velmi dehydratovaném stavu DNA, ribozomy, enzymy potřebné k vyklíčení a velké množství kyseliny dipikolinové, která je ve formě kalciumdipikolátu, hlavním stabilizačním faktorem spory. Vnější a vnitřní plášť je tvořen celou řadou proteinů, které mohou vykazovat enzymovou aktivitu. (81, 18, 159) Obr. 1 struktura bakteriální endospory (35)
2.4.3 Sporulace Sporulace je proces tvorby spor. Trvá asi deset hodin, nastává na konci exponenciální fáze růstu a rozděluje se pracovně do 7 fází, které označují jednotlivá buněčná stádia. 1. Proces tvorby spory začíná replikací DNA a rozbalením bakteriálního chromozomu.
22
2. Vchlípením cytoplazmatické membrány se vytvoří septum, které rozdělí buňku na dvě nestejně velké části. Větší (mateřská) část je sporangium, menší budoucí spora. 3. Budoucí spora vcestuje dovnitř větší buňky mateřské a začíná se obalovat septem a vzniká předspora („forespore“). 4. V prostoru mezi dvěma membránami vzniká peptidoglykanový kortex. Do předspory se ukládá velké množství vápníku a syntetizuje se v ní kyselina dipikolinová 5. Vnější membrána tvoří z proteinů plášť spory. 6. Spora získává typické vlastnosti – dehydrataci, odolnost a světlolomnost 7. Lýze mateřské buňky apoptózou s uvolněním spory ze sporangia do okolí. (159, 19) Sporulace při zvýšené teplotě vede ke zvýšené termorezistenci spory, pravděpodobně kvůli nižšímu základnímu obsahu vody. Vyšší tvorba spor je zaznamenávána při teplotě 25°C oproti vyšší teplotě. (26, 100) 2.4.4 Germinace spor (klíčení) Přeměna ve vegetativní formu je složitý proces rozdělený do několika kroků. Základní podmínkou je dostatek vody, která musí obsahovat vhodné živiny (jednotlivé aminokyseliny, cukry, purinové nukleosidy nebo různé kombinace těchto látek) pro budoucí množení vegetativních forem. Živiny se při klíčení váží na receptory na vnitřní membránu spory a tyto interakce spouští následné uvolnění dipikolinové kyseliny a kationů a nahrazení těchto komponentů vodou. Poté dochází ke ztrátě ochranných prvků spory s následným uvolněním dipikolinové kyseliny. Po proteolytickém odstranění proteinu chránící genom dochází již k nastartování metabolismu a vytvoření všech struktur vegetativní formy. (159, 19, 127) Klíčení je závislé na okolních faktorech prostředí. Studie potvrdily, že jak rody Clostridium (C.botulinum), tak rod Bacillus (B.subtilis) klíčí rychleji, čím víc se okolní teplota blíží 37°C. Při 37°C začne klíčit i vyšší počet spor než při teplotě 20°C. Např. studie z roku 1997 uvedla, že procento klíčivosti při teplotě 20°C bylo 89%, při teplotě 37°C se zvýšilo na 95% (následně po dvou hodinách tento počet mírně poklesl). (26, 53) 2.4.5 Termorezistence spor Termorezistence patří mezi nejdůležitější vlastnosti spory. Spory jsou schopny snést několikahodinový var a ve vlhkém prostředí jsou po 15 až 30 minutách usmrcovány při teplotách 115 – 120°C. Okolní prostředí ovlivňuje odolnost bakteriálních spor. Kyselé prostředí odolnost při zahřívání snižuje, naopak přítomnost lipidů, bílkovin a vysoké 23
koncentrace cukrů odolnost zvyšují. Tato odolnost má význam při zpracování potravin, kdy je nutné rozlišovat kyselé a nekyselé potraviny a dle toho je sterilovat. (143, 133)
2.5 Bakteriální kontaminace koření Množství mikroorganismů kontaminujících koření je velice proměnlivé, pohybuje se podle různých literárních údajů od 101 KTJ/g do asi 109 KTJ/g. Z mikroorganismů jsou v koření významně zastoupeny sporulující bakterie, zejména bacily skupiny subtilis – mesentericus, dále sporulující anaeroby zejména termofilní, mikrokoky, pseudomonády, flavobakterie a streptokoky. Z patogenů je relativně častá přítomnost Clostridium perfringens a Bacillus cereus. (66) Níže uvedená tabulka představuje menší přehled studií, zabývajících se bakteriální kontaminací koření. Studi e 1. (4)
oblast
Druh koření
Saudsk á Arábie Nigérie
Kmín
3. (23)
Jižní Afrika
4. (25)
Indie
2. (7)
5. (38) 6. (39)
Nizoze msko Nizoze msko
Průměrné množství 7.107 KTJ/g
Specifika
Poznámky
Aerobní bakterie
Nízký výskyt S.aureus a B.cereus
Červený pepř, černý pepř, tymián, kari
1,8.104 – 1,1.108 KTJ/g
Aerobní bakterie
Velké množství koření. Nejvíce kontaminován byl černý pepř, koriandr, paprika, muškátový květ, bílý pepř. Chilli
102 – 106 KTJ/g
Aerobní bakterie
Vysoký výskyt B.cereus, B.polymyxa, B.subtilis a B.coagulans B.cereus (kardamon, majoránka, cibule, paprika, bílý pepř) Salmonella (paprika), E. coli (rozmarýn), streptokoky (bílý, černý pepř, paprika)
2.106 – 2.108 KTJ/g
Aerobní bakterie
Kmín
104 – 108 KTJ/g
Nespecifikováno
10 – 500 bakterií/g >107KTJ/g
Kari, paprika, bílý a černý pepř, zázvor, bazalka, kurkuma
Clostridium perfringens Aerobní bakterie
24
Escherichia coli + Bacillus cereus (pouze chilli), S.aureus, anaerobní sporuláty, Salmonella, Shigella, Vibrio a enterokoky (oba vzorky)
Dále nalezen B.cereus, C.perfringens a Enterobacteriaceae
Paprika, černý a bílý pepř, zázvor, kurkuma
>107 KTJ/g
Sporotvorné bakterie
7. ( 61)
USA
Černý pepř Červený pepř
8,3.106 – 7.108KTJ/g
Aerobní bakterie
8. (36)
Itálie
Černý a bílý pepř
6.102-4,7.106 KTJ/g
Aerobní bakterie
9. (47)
Bomba y
Celý černý pepř
1,2.107-8,2.108 KTJ/g 4,1.107 7,3.108 KTJ/g 104KTJ/g, 4,6.107 KTJ/g 4,6.104 KTJ/g
Aerobní bakterie
5,2.103 – 1,2105 KTJ/g 103-1,5.105 KTJ/g 2.6.105 KTJ/g 7,2.10 KTJ/g 2,9.105 KTJ/g 9 KTJ/g 2,9.107 KTJ/g 105 KTJ/g Méně než 2.103 KTJ/g 4,4.106KTJ/g 3,2.106 KTJ/g 1,0.106 KTJ/g 9,9.105 KTJ/g 1,5.105 KTJ/g
Aerobní bakterie
Černý a bílý pepř Koriandr a fenykl
104-107 KTJ/g
Aerobní
Černý pepř Červený pepř Zázvor Kurkuma Černý pepř Chilli Kurkuma
2,5.103 – 8.107KTJ/g
CPM
5,6.107 KTJ/g 1,1.106 KTJ/g 1,1.106 KTJ/g
CPM
mletá kurkuma 10. (65)
Japons ko
Černý pepř Bílý pepř
11. (67)
Tureck
Skořice
12. (69)
o Tureck
Bílý pepř o Cibule
13. (77)
?
14. (85)
Indie
15. (123)
USA
16. (125)
Indie
17. (128)
Indie
Černý pepř Paprika Skořice, zázvor, hřebíček Chilli Černý pepř Kari Kurkuma Koriandr
Koliformní bakterie Aerobní bakterie
Sporuláty Aerobní Koliformní Aerobní Koliformní CPM
CPM
103-105 KTJ/g
25
Výskyt E.coli, E.freundii, Serratia, Klebsiella, Bacillus,Staphylococcu s, Streptococcus Výskyt Enterobacteriaceae, Clostridium, Escherichia, Klebsiella Výskyt Staphylococcus, Salmonella, Shigella a Clostridium
Převládal B.cereus, následovaný B.megaterium. Lactobacillus byl detekován ve všech typech koření. Výskyt E.coli, Salmonella, Klebsiella pneumonia, Enterobacteriaceae Výskyt hlavně rodu Bacillus – B.cereus, B. subtilis,B. polymyxa a B.coagulans Bez výskytu B.cereus a E.coli
18. (117)
Velká Nespecifikované Británie koření a bylinky
19. (2)
Argen tina
Nespecifikované koření
20. (31) 21. (20)
Francie
Koření, bylinky, sušené houby Nespecifikované koření
22. (163)
Irsko
Indie
>105 KTJ/g >103 KTJ/g >102 KTJ/g >102 KTJ/g <106 KTJ/g <103 KTJ/g
Bacillus cereus C. perfringens E.coli Salmonella Aerobní bakterie Koliformní
<0,6 Prakticky žádný bakterií/kg nález C.botulinum 6 >10 KTJ/g, Aerobní mezofilní 51% z koření 85% z koření B.cereus 59% z koření Cl.perfringens 11% z koření S.aureus 85% z koření Enterobacteriaceae 33% z koření Koliformní 2,6% z koření Salmonella,Shigella Černý pepř, > 106 KTJ/g aerobní mezofilní 2 6 paprika, chilli, 10 -10 KTJ/g sporotvorné b. kmín 102-106 KTJ/g Pseudomonas 102-106 KTJ/g Enterobacteriaceae Tab.3 Mikrobiální kontaminace - bakterie
26
1% z CPM 0,4% z CPM 2,1% z CPM 1,5% z CPM
Výskyt B.cereus nebyl v pepři, česneku, chilli a kmínu
20% z koření 80% z koření 33% z koření 23% z koření
3 PLÍSNĚ 3.1 Morfologie plísní Mikroskopické houby, zkráceně mikromycety, jsou organismy zahrnující plísně a houby, jejichž hyfy, spory a fruktifikační orgány je možné pozorovat pouze pod mikroskopem. Jsou ubikvitárně rozšířené po celém světě a jejich stáří je odhadováno na 300 milionů let. Díky bohaté enzymatické výbavě se mohou adaptovat a kontaminovat většinu substrátu. Vzhledem k vysoké adaptaci jsou schopny osídlit velké množství biotopů, mohou se nacházet v ovzduší, v půdě, vodě, na površích živých a odumřelých organismů, plochách, předmětech, v potravinách a krmivech. (80, 107, 83) Plísně jsou mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, řadící se mezi houby (fungi). V botanice se mezi plísně řadí pouze houby s nepřehrádkovaným myceliem, řazené do třídy Zygomycetes a některé tzv. vodní plísně. Vláknité plísně náleží mezi Ascomycotina a Deuteromycotina. Technologové řadí k plísním příslušníky všech tří skupin, neboť jejich fyziologické vlastnosti a nárůsty na napadeném materiálu jsou velmi podobné. (42)
3.2 Cytologie plísní Základní jednotkou těla mikromycet je stélka (thallus). Je to vláknitý útvar tvořený vlákny (hyfy), která jsou buď jednobuněčná, nebo vícebuněčná. V každé je jedno či více haploidných jader. Spleť rozvětvených hyf se nazývá mycelium. Rozlišují se dva typy: substrátové mycelium prorůstající substrátem a vyživující celý organismus a vzdušné mycelium vyrůstající nad substrátem. Hyfy mohou vytvářet sklerocium, tvrdý polokulovitý útvar. Za nepříznivých podmínek se mohou buňky hyf proměnit na kulovité útvary obalené tlustou stěnou, chlamydospory. V takovém stavu přečkávají nepříznivé podmínky. Buněčná stěna má silnou a pevnou strukturu, dodává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a osmotickým šokem. Velkými póry stěn mohou procházet všechny sloučeniny krom polysacharidů a polypeptidů. Dominujícími polysacharidy v buněčné stěně jsou chitin a chitosan, mohou být přítomné i glukany a mangany, i látky podobné ligninu. (143, 155, 115, 98) Cytoplazmatická membrána se skládá z proteinů a lipidů. Je volně propustná pro malé molekuly a tvoří osmotické prostředí mezi buňkou a vnějším prostředím. Je to místo transportních mechanismů. 27
V cytoplazmě se nalézají kapičky lipidů i zrníčka polyfosfátů. Jsou zde uloženy útvary jako endoplazmatické retikulum, mitochondrie, vakuoly.
3.3 Rozmnožování plísní Rozmnožování se děje nepohlavně, pohlavně, rozrůstáním hyf. U nepohlavního rozmnožování rozeznáváme tyto varianty: Rozpad vlákna na větší počet vláken, dělení somatických buněk na dvě dceřiné, pučení buněk, spory (vznikají ve fruktifikačních orgánech endogenně - endospory nebo exogenně – exospory. Exospory různých druhů plísní se od sebe mohou odlišovat tvarem, mohou být jednobuněčné nebo vícebuněčné a mohou být umístěny jednotlivě, v řetízcích nebo kulovitých útvarech. Mohou vznikat rozpadem vláken v jednotlivé buňky (artrospory), pučením (blastospory) nebo ze základní buňky (konidie). Endospory vznikají ve sporangiu a nazývají se sporagiospory). U pohlavního rozmnožování dochází k: Gametogamie – kopulace dvou pohlavních gamet, které vznikají v pohlavních orgánech – gametangií Gametotangiogamie – kopulace celých pohlavních orgánů – gametangíí Somatogamie – somatické buňky přebírají pohlavní úlohu. Rozlišujeme tři fáze: plazmogamie, karyogamie, meioza. Při tomto rozmnožování vznikají pohlavní spory 4 typů: oospory, zygospory, askospory, bazidiospory. Rozrůstáním hyf, kdy propletené rozrostlé hyfy tvoří mycelium a za nepříznivých podmínek se mohou proměnit na chlamydospory. (83, 155, 98)
3.4 Rozdělení mikroskopických hub Mikroskopické houby dělíme na vláknité mikroskopické houby (mikromycety), kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy
28
3.5 Taxonomie mikroskopických hub dle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování 1. Oddělení Zygomycota = houby spájivé, které jsou typické nepřehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním s tvorbou tzv. zygospor. Nepohlavní rozmnožování se uskutečňuje pomocí endospor. Dříve třída, která se jako nepřirozená skupina rozpadla na základě projektu AFTOL. 2. Oddělení Ascomycota = houby vřeckovýtrusné, jsou typické přehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním za tvorby askospor tvořených v asku. Jejich nepohlavní rozmnožování probíhá exosporami. 3. Pomocné oddělení Deuteromycotina = houby nedokonalé se vyznačují přehrádkovaným myceliem a nepohlavním rozmnožováním pomocí exospor. Deuteromycota není přirozenou taxonomickou jednotkou, je vytvořena pro účely klasifikace hub v anamorfní fázi. Dříve byly Deuteromycota jedním z oddělení hub, dnes se v systematice zařazují do oddělení Ascomycota jako Fungi Imperfecti. (42, 141)
3.6 Nejvýznamnější rody mikroskopických vláknitých hub 3.6.1 Rod Aspergillus Rod Aspergillus, řád Eurotiales, oddělení Ascomycota. Stádia rodu Eurotium vytváří pohlavní spory. Existuje více než 185 známých druhů, z nichž asi 20 druhů je prokázano jako patogeny pro lidi i zvířata. Ve skutečnosti za 95% infekcí odpovídají tři druhy A.fumigatus, A.flavus a A.niger. Nejznámnějším je A. flavus, který produkuje aflatoxiny, A. carbonarius a A. ochraceus produkující ochratoxin A. A. fumigatus způsobuje aspergillózy s více než 80% podílem. Aspergily mohou způsobovat systémové mykózy (plicní aspergilóza, endokarditida) i povrchové infekce (otomykózy, onychomykózy, aj.), konidie přítomné v dýchacích cestách mohou mechanickým drážděním zhoršovat zdravotní stav alergiků a astmatiků. Většina těchto plísní může způsobit vážné onemocnění u imunokompromitovaných jedinců, kdy aspergillóza má často fatální důsledky. (12, 107) Tento rod zahrnuje převážně rychle rostoucí mikromycety, které tvoří plně vybarvené kolonie po třech až pěti dnech inkubace. Často mají septované mycelium, které může být černé, modré, žluté či bezbarvé. Vegetativní rozmnožování probíhá pomocí konidií, které vznikají v řetízcích z fialid na rozšířeném konci konidioforu. U některých druhů je známá 29
tvorba asků obsahujících 8 askospor. Aska jsou umístěna v kulovitém kleistotheciu, které má sírově žlutou barvu a je zřetelné pouhým okem. (143) Plísně tohoto rodu mají bohatý enzymový aparát a jsou častými původci kazivosti potravin a krmiv. Znehodnocují olejniny, tuky a jedlé oleje díky lipolytické aktivitě. Některé druhy jsou schopné snášet i velmi nízkou vodní aktivitu a proto mohou napadat sušené potraviny nebo potraviny s vysokým obsahem sacharidů a soli, jako je např. sušené maso, koření, marmelády, zelenina, sušené ovoce, obiloviny a pečivo. Jsou často využívány pro průmyslovou výrobu amyláz, lipáz a peptidáz, které se používají v potravinářském průmyslu nebo při výrobě pracích prášků. Některé plísně produkují antibiotika, která jsou velmi toxická a nejsou tak uplatnitelná v medicíně. (80, 107) 3.6.2 Rod Penicillium Rod Penicillium zahrnuje asi 220 druhů, částečně se jedná o imperfektní stádia rodů Eupenicillium a Talaromyces, které vytvářejí pohlavní askospory a jsou řazeny do třídy Ascomycetes. Plísně se vyskytují ve formě septovaného nepigmentovaného mycelia, konidiofory jsou na koncích větvené v podobě metuly, na které přisedají fialidy, z nich se odškrcují dlouhé řetízky konidií zelenošedé a modré barvy. (107) Penicillium patří k nejrozšířenějším vláknitým mikromycetům teplého a mírného klimatu. Jejich spory jsou všudypřítomné, a proto jsou také častými kontaminanty potravin, životního a pracovního prostředí člověka. (80) Některé druhy, jako je P.camemberti, P.candidum nebo P. roqueforti se používají jako startovací kultury při výrobě sýrů. Penicillia dovedou produkovat mykotoxiny a to i některé kmeny užívané v potravinářství. Druh P.veridicatum je schopen produkovat ochratoxin A a způsobovat tak ochratoxikózy u zvířat a lidí. Konidie se mohou dostat do dýchacích cest a zhoršit stav astmatiků nebo alergiků mechanickým drážděním. (107) 3.6.3 Rod Mucor Pod tento rod spadá asi 100 druhů schopných vytvářet neseptované mycelium, ze kterého vyrůstají sporangiofoty nesoucí sporangia, která jsou kulovitého tvaru, z počátku světlá, později hnědá až černá obsahující nepohlavní sporu. Pohlavní spory se vytváří přímo na hyfách mycelia. Jsou charakteristické rychlým růstem a upřednostňují organický substrát s využitelnými cukry. Vytváří typické větvené coenocytické mycelium bez přehrádek. Jde většinou o půdní houby s celosvětovým rozšířením a převážně saprofytním způsobem života. 30
Plísně se vyskytují na většině potravin, zejména ovoci a zelenině, ale způsobují i kažení mraženého masa, masných výrobků, fermentovaných potravin, pečiva a pekařských kvasnic. Některé druhy se využívají pro průmyslovou výrobu amyláz a proteolytických enzymů. (80, 107) Některé druhy produkují mykotoxiny, jiné mohou být patogenní a vyvolávat rhinocerebrální mykózy, otomykózy zevního zvukovodu a infekce popálenin. (107) Mukormykózy patří k nejagresivnějším houbovým infekcím s velmi vysokou mortalitou, nebezpečné mohou být pro jedince s oslabenou imunitou. (80) 3.6.4 Rod Rhizopus Je to rod saprofytních hub a parazitů. Nachází se na nejrůznějších organických substrátech, včetně zralého ovoce a zeleniny, v želé, sirupech, v chlebě, oříšcích a tabáku. Někteří zástupci mohou způsobit zygomikotidu (kvasinkovou infekci) s fatálními následky. Rhizopus produkuje jak vegetativní, tak asexuální a sexuální spory. (80) Rhizopus je velmi rozšířený rod mukurovitých plísní, které poměrně rychle rostou na různých kultivačních půdách. Tvoří výrazně rozvětvené mycelium šedé barvy. Některé druhy tvoří mykotoxiny, některé jsou patogenní. Některé druhy (R.japonicus, R.delemar) se používají v Japonsku ke zcukřování a zkvašování obilí na alkoholické nápoje. Rhizopus nigricans se používá pro průmyslovou výrobu fumarové kyseliny. (143) 3.6.5 Rod Fusarium Plísně se vyznačují bohatým septovaným hnědým, šedým, žlutým, červeným, fialovým nebo růžovým myceliem, na kterém se tvoří dva typy konidií: makrokonidie a mikrokonidie. Mikrokonidie jsou jednobuněčné konidie, menší než makrokonidie. Makrokonidie mají charakteristický rohlíčkovitý nebo banánovitý tvar, jsou tvořeny vždy několika buňkami. Některé druhy vytváří kromě nich ještě chlamydospory – zduřelé buňky se silnou stěnou uprostřed nebo na konci hyf, případně i v makrokonidiích. (143, 107) Mikroskopické houby rodu Fusarium jsou široce rozšířeny v přírodě a jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Jsou to parazité rostlin a způsobují velké škody na rostoucích obilovinách a při skladování rostlinných produktů, jako jsou kukuřice, ovoce, brambory, citrusy atd. Některé druhy mají schopnost produkovat mykotoxiny v obilí, což může ovlivňovat zdraví lidí i zvířat, v případě, že se tyto mykotoxiny dostanou do jejich potravního řetězce (80, 107) 31
Mezi
nejznámější
toxiny
produkované
plísněmi
tohoto
rodu
patří
skupina
trichothecenových mykotoxinů, jako jsou T2 toxin, deoxynivalenol, zearalenon a moniliformin. Fumonisiny produkované plísní Fusarium moniliforme jsou uváděny jako možné karcinogeny pro člověka. Některé druhy mohou produkovat toxická antibiotika. (107) Některé druhy fuzárií jsou známy jako původci hyalohyfomykózy člověka. U relativně zdravých jedinců se jedná nejčastěji o myotickou keratitidu po traumatické iokulaci, onychomykózu nebo o formu subkutánní mykózy manifestující se jako cysta nebo. U jedinců se sníženou imunitou nebo s oslabeným organismem se mohou tato onemocnění rozvíjet jako systémové oportunní infekce. (80)
3.7 Termorezistentní mikromycety Většina druhů plísní není termorezistentních a jsou obvykle zabity pasterizační teplotou (60°C, 30min). Několik druhů plísní, které produkují sexuální spory – askospory jsou výjimkou. (68). Askospora je výtrus, který vzniká ve vřecku (ascus) vřeckovýtrusných hub (Ascomycota). Vřecko většinou obsahuje osm askospor, kdy tento počet vzniká kombinací meiotického a mitotického dělení. Odolnost termorezistentních askospor vůči teplu je variabilní a pro každý druh a kmen jiná. Termorezistence je ovlivňována vnějšími podmínkami jako je kultivační a záhřevné médium (pH kultury, obsah sacharidů, lipidů, organických kyselin), růstovými podmínkami atd. (145). Dle Peickové termorezistence askospor roste s obsahem sacharidů v záhřevném a kultivačním médiu. Také vyšší věk kultury má vliv na větší termorezistenci askospor, to mimo jiné potvrdily i dvě studie z roku 2007 a 2009. Ty zároveň potvrdily, že čím je kultura starší, tím má na ni vysoký tlak menší vliv (má „tlustší“ buněčnou stěnu) a zároveň má nižší schopnost vyklíčit. A čím je askospora větší, tím je rezistentnější. (58, 103, 37) Askospory některých hub vyžadují pro germinaci tepelný šok. Klíčení ovlivňuje i koncentrace některých iontů v záhřevném médiu (Na+, Mn2+, Mg2+ a Ca2+). (103) Termorezistence u některých druhů plísní může být dána sklerocii-hrubostěnnými útvary, které mohou přežít záhřev na 85°C po dobu 5 minut. (145) Celkově jsou termorezistetní plísně hlavně problémem konzerv s ovocem nebo ovocných šťáv. Ovoce bývá kontaminováno již v sadech nebo na polích. Počet askospor na ovoci je obvykle niží než 1 na gram. Askospory plísní mohou přežívat pasterační teploty a po vyklíčení za sníženého přístupu kyslíku být příčinou kažení díky pektinolytickým enzymům. Zároveň mohou produkovat toxiny, které nejsou dosud plně prozkoumány (120) 32
3.7.1 Přehled termorezistentních mikromycet Mezi nejčastější termorezistentní plísně se často řadí plísně Byssochlamys fulva, Byssochlamys
nivea,
Nesoartorya
fischeri,
Talaromyces
flavus,
T.
macrosporus,
T.bacillisporus a Eupenicillium brefeldianum. (107) Jesenská a Peicková zkoumaly termorezistenty v půdě a mezi plísně přežívající teplotu 60°C po dobu 60 min patřily Aspergillus niger, Chaetomium spp., Peniciliium spp. a Scytalidium lignicola. Plísně přežívající 70°C teplotu po
stejnou dobu
byly
A.flaucus,
Byssochlamys nivea,
Dichotomomyces cejpii, Gelasinospora spp., Rhizoctonium sp. a Talaromyces flavus. Mezi přežívající 80°C teplotu patřily Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Euenicillium baarnense a Ulocladium spp. K poslední nejodolnější skupině přežívající teplotu 90°C víc než 10 minut náležely Acremonium sklerotigenum, Aspergillus ochraceus, Botryotrichum piluliferum, Byssochlamys fulva, Gilmaniella humicola, Neosatorya fischeri, Nodulisporum sp. a Talaromyces avellaneus. (63) 3.7.1.1 Byssochlamys sp. Druhy rodu Byssochlamys jsou charakteristické absencí kleistotecií, resp. gymnotecií – útvarů, které během vývoje a dozrávání askospor obalují asky. Asky tohoto druhu se vytváří ve shlucích obalených hyalinními hyfami, jsou kulovitého nebo polokulovitého tvaru a obsahují 8 askospor s hladkou stěnou. Askospory jsou schopné přežít záhřev na teplotu 8090°C po dobu 10 minut. (107) Konidiospory jsou při této teplotě usmrceny. B. nivea a B.fulva jsou nejrozšířenějšími zástupci této skupiny, častí původci kazivosti produktů z ovoce. Jsou schopni růst za sníženého parciálního tlaku a nízkého pH a díky svým enzymům modifikovat texturu ovoce. Při růstu B. nivea může produkovat CO2. Mohou produkovat toxiny, jako jsou kyseliny „byssochlamic“, kyselina mykofenolová, byssotoxin a patulin. Hlavním zdrojem je půda. (108, 43) 3.7.1.2 Eupenicillium spp. Druhy rodu Eupenicillium jsou teleomorfními stádii v životním cyklu některých druhů rodu Penicillium. Rod Eupenicillium produkuje kleistotecia s hladkou stěnou, která mají kulovitý tvar a jsou světlé barvy. Zralá kleistotecia mají velmi tvrdou stěnu, obsahují velké množství osmisporových asků, a mají schopnost přežívat několik týdnů až měsíců. (107)
33
3.7.1.3 Neosartorya sp. Rod Neosartorya zahrnuje 8 druhů a 3 variety. Anamorfní stádia se řadí k rodu Aspergillus. Pět druhů rodu Neosartorya patří do skupiny Aspergillus fumigatus a série Aspergillus fisheri, další dva druhy jsou zařazené do skupiny Aspergillus ornatus.(107) Zatímco Neosartorya je schopná produkovat jak askospory, tak konidiospory, Aspergillus produkuje pouze konidiospory. (30) Neosartorya fischeri je jednou z nejčastějších termorezistentních plísní způsobujících kažení ovocných výrobků. Byla nalezena v půdě, tlející organické hmotě, zkaženém ovoci, zelenině, zeleninových výrobcích a v koření. (120) N.fischeri je popsána jako podmíněný patogen, schopný vyvolat u pacientů s defektem imunity těžké až smrtelné infekce. Bylo popsáno úmrtí u pacienta po alogenní transplantaci kostní dřeně. N.hiratsukae byla příčinou infekce mozku u ženy v Brazílii. (144) Některé kmeny N. fischeri jsou schopné produkovat mykotoxiny jako fumitremorgin A, B a C, terrein a verruculogen. (120) 3.7.1.4 Talaromyces sp. Druhy rodu Talaromyces jsou charakteristické tvorbou gymnotecií žlutobílé barvy. Anamorfní stádia 16 druhů tohoto rodu se řadí k rodu Penicillium, anamorfní stádia dalších druhů náleží k rodům Geosmithia, Merimbla a Paecilomyces.(107) Talaromyces avellaneus je také
možné
najít
jako
přirozený
kontaminát
ovoce,
produkuje
termorezistentní
askospory.(157) Některé druhy jsou schopny produkovat mykotoxiny, T. flavus wortmannin, mitorubrin, T. wortmannii rugulosin, T.ohiensis vermikulin a T.stipitatus duclauxin, talaromycin, botriodiploidin, emodin. (45)
3.8 Xerofilní mikromycety Xerofilní plísně jsou běžné organismy, které jsou schopny růst při nízké vlhkosti potravin. Detekce jejich výskytu není součástí kontrol, které jsou buď pravidelné, nebo požadované právními předpisy České republiky. Nicméně je známo, že jsou častými kontaminanty výrobků s nízkou vodní aktivitou, jako jsou pekárenské výrobky, sušené ovoce, sladkosti, džemy nebo koření. Je známo, že xerofilní plísně jsou tolerantní k vnějším nepříznivým podmínkám, jako je sušení, vyšší koncentrace soli a cukru, vyšší osmotický tlak a teplo. Druhy Aspergillus, Eurotium, Chrysosporium a Wallemia jsou nečastější xerofilní houby a jejich pěstování a identifikace potřebuje speciální media, např. Dichloran 18% glycerol agar 34
může být použit pro detekci xerofilních hub v potravinách (přídavek glycerolu zajišťuje osmofilnost média, dichloran omezuje konkurující mikroflóru a velikost kolonií), s výjimkou potravin s vysokým obsahem NaCl. V současné době se pro zhodnocení mikrobiálního nebezpečí používá stanovení aktivity vody a teploty. Spolu s dalšími faktory vnějšího a vnitřního prostředí mohou být tyto dvě veličiny použity jako vhodný ukazatel možného šíření metabolitů v potravinách. Vodní aktivita však není konstantní a během výroby a skladování potravin se mění a to může mít vliv na přítomnou mikrofloru a přítomnost patogenních mikroorganismů. (8, 161) Pro vodní aktivity jsou u některých xerofilních hub stanoveny limity. Druh Eurotium je obecně schopno růst v rozmezí 0,7,-0,72 aw, A.penicilliodides má minimální aw 0,68, Wallemia sebi 0,69 aw, druh Chrisosporium 0,69 aw a extrémně xerofilní Xeromyces bisporus 0,61 aw. (48)
3.9 Toxinogenní mikromycety Existují mikroorganismy, které mají schopnost produkovat toxické metabolity mykotoxiny. Z celkového počtu 114 druhů mikromycetů, které mají význam v potravinách, je 65 druhů toxinogenních. Produkci mykotoxinů lze shrnout v pravidlech: 1) Určitý mykotoxin může být produkován zástupci několika rodů toxinogenních mikromycetů. 2) Dva i více mykotoxinů mohou být produkovány určitých druhem toxinogenních mikromycetů. 3) Záchyt toxinogenních mikromycetů v potravinách ještě neznamená přítomnost mykotoxinů. 4) Ne všechny kmeny potenciálně toxinogenních mikromycetů jsou toxinogenní. (97)
3.10 Plísně v koření Počty plísní mohou v přepočtu dosáhnout hodnot od 1 až do 106 KTJ/g. Plísně jsou na rozdíl od bakterií všeobecně přizpůsobivější na určité extrémní podmínky prostředí, lépe snáší hodnoty pH, nižší obsah využitelné vody a nižší teploty. Uvádí se, že nejčastěji se vyskytující rody plísní na koření jsou Aspergillus, Penicillium, Fusarium a Cladosporium, Alternaria, Culvularia a Rhizopus. Mnohé vláknité houby (plísně) tvoří toxické produkty – mykotoxiny, které mohou mít negativní vliv na zdraví. (66) V níže uvedené tabulce je přehled studií zabývající se kontaminací plísní v koření.
35
Studie
Oblast
Druh koření
1. (129)
Egypt
Kmín, fenykl, anýz, koriandr
2. (14) 3. (1) 4. (39)
Egypt
5. (61)
USA
Černý pepř
Nizozemsko
USA
Černý pepř Červený pepř
Průměrné množství
1,75.103 KTJ/g 1,78.103 KTJ/g <103 organismů/g 104-105 KTJ/g 103 - 104 KTJ/g 102-103 KTJ/g 1,7.103-3,1.105 KTJ/g
Specifika
Poznámky
Thermophilic Thermotolerant fungi
Hlavním kontaminantem byl Aspergillus fumigatus, dále Emericella nidulans, Rhizomucor pussillus, Malbranchea pulchella, Talaromyces dupontii Hlavním kontaminantem byl A. flavus, A.parasiticus
130 vzorků koření Plísně Plísně a kvasinky Kvasinky Plísně 27/150 Plísně 24/150 Plísně 23/150
1,6.103 KTJ/g
6. (44)
Velká Británie
Nespecifikováno
7. (46)
Španělsko
Nespecifikováno
8. (52)
Pákistán
Paprika, koriandr, fenykl
9. (82)
Španělsko
Černý a bílý pepř, zelený pepř, kajenský pepř
103 – 104 KTJ/g
10. (51)
Saudská Arábie
5.103-7.103 KTJ/g
11. (84)
USA
Z 57 druhů koření byl nejvíce kontaminován zázvor Koriandr Kmín
103-104 KTJ/g
1.105 KTJ/g 3,3.103 KTJ/g
A. niger, A.glaucus byly nejčastější 33/144 vzorků koření bylo kontaminováno Izolace rodu Fusarium Hlavními detekovanými rody byl Aspergillus a Penicillium spp. Nejčastější rody Aspergillus, Penicillium, Rhizopus
Nejčastěji rody Aspergillus, Penicillium Tab.4 Mikrobiální kontaminace koření - plísně
36
Detekován byl Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium citrínům Nalezeny byly Aspergillus glaucus, A.candidus, A.flavus, A.ochraceus, A.niger, Penicillium a Rhizopus Hřebíček jako jediný nebyl kontaminován plísní Detekován Penicillium (47 z 144 vzorků), Aspergilus (68 z 144). Nalezeny F.moniliforme, F.subglutinans, F.semitectum, F.solani, F.equiseti, F.oxysporum Nejvíce zkontaminován byl bílý pepř, nejméně zelený pepř Nejčastější výskyt A.flavus, a A.glaucus Výskyt A.flavus, A.niger a P. arenicola
Výskyt také rodu Wallemia, Syncephalastrum a Rhizopus
3.11 Mykotoxiny Mykotoxiny jsou hlavním problémem v tropech a subtropech, kde klimatické podmínky a zemědělské a skladovací praktiky přispívají k růstu hub a produkci toxinů. Mykotoxiny jsou sekundárními metabolity hub identifikováných v mnoha zemědělských produktech po napadení toxigenními plísněmi. (75) Vznikají během konce exponenciální fáze růstu a nemají žádný význam pro růst či metabolismus organismu, který je produkuje. Většina je syntetizována jednoduchými biosyntetickými reakcemi z malých molekul, jako je acetát či pyruvát, jsou neviditelné, bez zápachu a chuti, a není možné je pouhými smysly v potravě zjistit. (134) Z kvalitativního hlediska jsou v současné době, hned po bakteriální kontaminaci potravin, nejvýznamnějším rizikovým faktorem v potravinách s pestrou škálou toxických účinků, ať už akutních či chronických. (151) Některé jsou mutagenní, karcinogenní a specificky organotoxické. Jednoznačná toxicita mnoha mykotoxinů pro člověka nebyla prokázána, většina však prokazuje toxicitu u pokusných zvířat. Několik mykotoxinů bylo klasifikováno Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny jako lidské karcinogeny nebo potenciální lidské karcinogeny. Vyskytují se v myceliu vláknitých hub, ale mohou být přítomny i ve sporách těchto organismů. Přítomnost mykotoxinů v potravinách a krmivech souvisí s klimatickými a dalšími faktory související s růstem. Proto existují značné rozdíly mezi jednotlivými světovými regiony v ročních hlášených případech. (74) Z hygienického hlediska má největší význam 5 skupin látek: kumarinové aflatoxiny a ochratoxiny,
z trichotecenových mykotoxinů
nivalenol (deoxynivalenol),
zearalenon,
z alifatických sloučenin fumonisiny. Z hlediska výskytu je možno plísně rozdělit na: 1. Polní – Fusarium, Alternaria nebo Cladosporidium 2. Skladištní – Aspergillus, 3. Polní i skladištní – Penicillium (70). FAO v roce 2004 uvedlo, že 77 zemí má zvláštní předpisy pro výskyt mykotoxinů. (41) Většina mykotoxinů je vysoce termorezistentních a nepodléhá tepelnému rozkladu ani při razantních technologických či kulinárních úpravách potravinářské suroviny. (96) Riziko akutního toxického účinku mykotoxinů je v ČR obvykle považováno za minimální. Závažné jsou zejména pozdní toxické účinky mykotoxinů. Tyto účinky se mohou projevit po příjmu velmi nízkých jednorázových nebo opakovaných koncentrací mykotoxinů v potravinách. Z toho vyplývá, že koření, jako surovina používaná v potravinářství a ve farmacii, je významným vehikulem mikroorganismů, které mohou negativně ovlivnit kvalitu výrobků. (75, 66) 37
3.11.1 Nejvýznamnější zástupci mykotoxinů 3.11.1.1 Aflatoxin Produkuje jej převážně Aspergillus flavus (aflatoxin B1 a B2), ale i A.parasiticus (B1, G1, B2, G2), A. nominus, A. bombycis, A. pseudotamartii, A. ochraceoroseus a Penicillium. Aflatoxin M1 je hydroxylovaný produkt B1 a vyskytuje se v mléce a mléčných výrobcích od zvířat, která konzumovala kontaminované krmivo. Účinné množství toxinu naroste v substrátu za dobu 5-20 dní. (109, 27) Produkce toxinu je ovlivněna řadou biochemických faktorů, jako je zastoupením stopových prvků v substrátu nebo přítomnost nenasycených mastných kyselin. (144) Aflatoxiny vznikají při vyšší teplotě a vlhkosti. (74) Aflatoxiny se stávají účinnými po bioaktivaci, kterou vzniká 2,3-epoxid, který tvoří addukty s DNA. Jejich metabolismus probíhá především v játrech pomocí mikrozomálních oxidáz a cytozolických enzymů. Hlavní detoxikační cesta je glutathionová konjugace za katalýzy GSH (83). Aflatoxin B1 je klasifikován jako lidský karcinogen IARC.(130) LD50 AFB1 je závislé na typu organismu, drůbež 0,35, opice 0,81, duhový pstruh 3,0, potkan 1,3, myš 9,0 a křeček 10,2 mg/kg . AM1 je hepatotoxický a karcinogenní.(50) 3.11.1.2 Ochratoxin Je skupina sedmi strukturně velmi podobných izokumarinových derivátů spojených s fenylalaninem. (70) Nejvýznamnější a nejtoxičtější je ochratoxin A, oB je dechlorovaný o1 a spolu s oC se nevyskytují přirozeně. oA je produkován velkým množství skladištních plísní, včetně Aspergillus A. ochraceus, A. alliaceus, ostanus, A. mellus, A. niger a A. carbonarius. Mezi penicillia, která produkují oA patří P. viridivatum, P. cyclopium, P. vyriable a ostatní. oA je produková při teplotě 30°C a aw 0.95. LD50 pro krysy je 20-22 mg/kg. Je hepatotoxický, nefrotoxický, imunotoxický, karcinogenní a teratogenní. (109) Má schopnost ovlivnit důležité metabolické cesty (glukoneogeneze, mitochondriální transportní systémy, proteosyntéza) a narušit jejich fyziologickou funkci.(83) Není možné jej zlikvidovat běžným vařením. (109) 3.11.1.3 Patulin Je produkován rody Penicillium (hlavně P.claviforme, P.expansum, P.patulum, P.griseofulvum), Aspergillus (A.clavatus. A.terreus) a Byssochlamys (B. nivea, B.fulva). Mezi mykotoxiny je to častým kontaminantem ovoce, především jablek a posléze jablečného 38
moštu. Způsobuje krvácení a otoky v gastrointestinálním traktu. Na buněčné úrovni vyvolává inhibici DNA syntézy, transkripce a translace, inhibici syntézy proteinů, poškození buněčné membrány. Chronické účinky jsou neurotoxické, imunotoxické a genotoxické. Byl u něj prokázán karcinogenní efekt, v Amesově testu není mutagenní. (144, 109) 3.11.1.4 Citrinin Produkují jej některé druhy rodů Penicillium (P.citrinum, P.viridicatum) a Aspergillus. Má antiprotozoární a antibakteriální účinky. Je nefrotoxický a dle IARC je to silný karcinogen. Je mutagenní a působí na metabolismus jater. Často se nachází spolu s ochratoxinem A na zaplísněném obilí. (83, 144, 109) 3.11.1.5 Zearalenon Řadí se mezi laktony kyseliny β-resorcylové. Produkuje jej Fusarium graminearum a Fusarium sporotrichiodes. Je to kontaminant hlavně kukuřice, pšenice, ječmene, ovsa a sena (70) Má silné hyperestrogenní účinky, které jsou však závislé na velikosti dávky a věku a pohlaví „konzumenta“. Díky své strukturální podobnosti s estradiolem je schopen se vázat na estrogenní receptory cílových buněk savců, takže je některými autory klasifikován jako nesteroidní estrogen, mykoestrogen nebo fytoestrogen. Ačkoliv biologická účinnost zearalenonu je vysoká, aktuální toxicita je nízká.(27) 3.11.1.6 Fumonisin Producenty jsou toxinogenní kmeny rodu Fusarium (F. verticillioides, proliferatum, nygamai) a Alternaria. Je známo asi 15 analogů (A1 ,A2, B1, B2, B3, B4), z nichž B1 je převládajícím fumonisinem v potravinách. Způsobuje leukoencephalomalacii u koní, hydrothorax a plicní edém u prasat, je nefrotoxický, hepatotoxický a napadá imunitní systém. (83, 27) Biochemickou podstatou jejich toxických účinků je interference s metabolismem sfingolipidů a tím patrně narušení membránových struktur.
39
3.11.1.7 Trichotheceny Trichoteceny jsou skupinou asi 180 esterů seskviterpenických alkoholů obsahující trichothecenov tricyklický systém produkovány rody Fusarium, Stachybotrys, Myrothecium, Trichothecium a dalšími plísněmi rostoucími na běžných potravinách, krmivech a v přírodě. Podle charakteristických vlastností a počtu funkčních a substitučních skupin se rozlišují 4 základní skupiny trichothecenů – typ A, B, C, D. Deoxynivalenon (DON), známý též jako vomitoxin
je
nejčastěji
zjištěný trichothecen,
známý
je rovněž
nivelon (NIV),
diacetoxyscirpenol (DAS) a T-2 (83, 144, 109, 101). Trichotheceny mají mutagenní, genotoxické, cytotoxické, karcinogenní a imunosupresivní účinky. Nízké až střední dávky akutní orální expozice způsobují zvracení, nauzeu, průjem a gastroenteritidu, zatímco u vyšších dávek může dojít k vážnému poškození lymfoidních a epitelových buněk sliznic gastrointestinálního traktu, krvácení a šoku. Jsou velmi odolné vůči inaktivaci. (101) 3.11.1.8 Sterigmatocystin Je strukturálně a biologicky podobný aflatoxinu (je jeho prekurzorem) a stejně jako on má hepatokarcinogenní účinek u zvířat. Inhibuje DNA syntézu. U člověka je hepatotoxický a nefrotoxický. Je známo nejméně 8 derivátů. Produkuje jej Aspergillus versicolor, A.nidulans, A.rugulosus, Chaetomium a Emericella a další. LD50 pro potkany intraperitoneální injekcí je 60-65 mg/kg. Nenachází se v přírodních produktech, byl nalezen v sýrech, mase a kávových zrnech. (83, 144, 109) 3.11.2 Riziko pozdních účinků mykotoxinů Podle dosavadních výsledků sledování mykotoxinů v potravinách je riziko akutního toxického účinku mykotoxinů pro populaci v ČR považováno za minimální. Za významné se však
považuje
riziko
pozdních
toxických
účinků
(zejména
karcinogenní
riziko,
imunotoxicita), ale i vývojová toxicita po příjmu velmi nízkých jednorázových nebo opakovaných koncentrací mykotoxinů v potravinách. Nálezy alfatoxinu M1 v moči a ochratoxinu A v krevním séru svědčí o reálné expozici aflatoxinu B1 a ochratoxinu A u populace v ČR Vzhledem k tomu, že výskyt mykotoxinů v potravinách je nerovnoměrný, je třeba pokračovat ve stanovení biomarkerů a sledovat v čase trendy dietárního vystavení vybraným mykotoxinům u populace v ČR. Je potřeba 40
sledovat skupiny obyvatelstva, které konzumují jednostrannou dietu (např. vegetariány či samozásobitele potravinami) a mohou tak být vystaveni vybraným mykotoxinům. (96) 3.11.3 Mykotoxikozy Onemocnění, která vznikají v důsledku příjmu kontaminových potravin nebo krmiv toxickými mykotoxiny, se označují pojmem „mykotoxikosy“. K minimalizaci mykotoxinové kontaminace potravin a krmiv je potřeba začít už od prvovýroby, tedy dodržováním správné zemědělské praxe (GAP – Good Agricultural Practice). (50) Mezi tato onemocnění patří ergotismus, akutní beri-beri a alimentární toxická aleukie. Dále se mykotoxiny mohou podílet na vzniku toxické hepatitidy, primárního hepatomu, na vzniku Reyova syndromu, Kwashiorkoru, pulmonální mykotoxikózy, hyperestrogenismu a karcinomu jícnu. (144) 3.11.4 Limity Nejvyšší přípustné množství (NPM) mykotoxinů a dalších kontaminantů potravin je stanoveno pro danou potravinářskou komoditu v nařízení Komise č. 181/2006, 1126/2007, 105/2010 a 165/2010 ES. (50) Aflatoxiny: Vědecký výbor pro potraviny v roce 1994 uvedl, že alfatoxiny jsou genotoxické karcinogeny a je vhodné omezit jak celkový obsah aflatoxinů, tak samotného aflatoxinu B1. Jsou stanoveny maximální limity (μg/kg) pro jednotlivé komodity potravin v obsahu aflatoxinů. Ochratoxin A: EFSA přijala dne 4. dubna 2006 na žádost Komise aktualizované vědecké stanovisko týkající se ochratoxinu A v potravinách, v němž zohlednil nové vědecké poznatky a došel k závěru, že tolerovatelný týdenní příjem (TWI) je 120 ng/kg tělesné hmotnosti. Patulin: V roce 2000 vědecký výbor schválil prozatímní maximální tolerovatelný denní příjem (PMTDI) patulinu 0,4 µg/kg tělesné hmotnosti. V roce 2003 byly tyto limity přehodnoceny, např. u jablečných šťáv a jablečných šťáv používaných jako doplňky jiných nápojů, a sníženy. Fusariové toxiny: Z roku 1999 je stanoven tolerovatelný denní příjem (TDI) 1μg/kg tělesné hmotnosti, z roku 2000 hodnocení zearalenonu a stanoven prozatímní TDI 0,2 μg/kg tělesné hmotnosti, téhož roku s aktualizací v roce 2003 je stanoven TDI pro fumonisiny 2 μg/kg tělesné hmotnosti. Z roku 2000 je stanovení TDI nivalenolu na 0,7 μg/kg tělesné hmotnosti, 2001 se hodnotil T-2 a HT-2 toxin a byla stanoven prozatímní TDI 0,06 μg/kg tělesné hmotnosti. 41
V nařízení komise (ES) z roku 2006 byly stanoveny maximální limity aflatoxinu B1 5,0 μg/kg a sumy aflatoxinů B1,B2,G1 a G2 10 μg/kg v následujících druzích koření: Capsicum spp. (sušené plody, celé nebo mleté, včetně chilli, mletého chilli, kayenského pepře a papriky), Piper spp. (plody, včetně bílého a černého pepře), Myristica fragrans (muškátový oříšek), Zingiber officinale (zázvor), Curcuma longa (kurkuma). (89) Členské země EU, ale i další státy mají pevné limity pro aflatoxiny v ostatních komoditách, tyto hodnoty kolísají od 1 do 20 µg/kg. (75) Velmi vysoké množství OTA bylo několikrát zjištěno v koření a lékořici. Pro koření a lékořici bylo tedy vhodné stanovit maximální limity. Existují nejnovější důkazy, že v některých zemích, jež jsou hlavními producenty koření dováženého do Unie, nejsou zavedena preventivní opatření a úřední kontroly s cílem kontrolovat přítomnost ochratoxinu A v koření. Z důvodu ochrany veřejného zdraví bylo vhodné stanovit maximální limit ochratoxinu A v koření. Aby mohly země vyvážející koření zavést preventivní opatření, a aby nedošlo k narušení obchodu v nepřijatelném měřítku, byl na omezenou dobu stanoven vyšší maximální limit 30 μg/kg použitelný v krátkodobém horizontu (od 1.7.2010 do 30.6.2012), dokud nevstoupí v platnost maximální limit, který odráží limit dosažitelný používáním osvědčených postupů, tj.15 μg/kg od 1. 7. 2012 Tento maximální limit ochratoxinu A se nepoužije na výrobky uvedené na trh před 1. červencem 2012 v souladu s ustanoveními použitelnými k tomuto datu. Jedná se o toto koření: Capsicum spp. (sušené plody, celé nebo mleté, včetně chilli papriček, mletých chilli papriček, kayenského pepře a papriky), Piper spp. (plody, včetně bílého a černého pepře), Myristica fragrans (muškátový oříšek), Zingiber officinale (zázvor), Curcuma longa (kurkuma), směsi koření obsahující jeden nebo více výše uvedených druhů koření. (88)
42
3.11.5 Mykotoxiny v koření Mnohé vláknité houby tvoří toxické produkty – mykotoxiny v prostředí s optimální vlhkostí 75% a více s teplotou 20-30°C, které difundují do napadeného substrátu. V potravinách je na základě současných poznatků popsáno 114 druhů plísní, z nichž je 65 druhů toxigenních. V současné době je známo přes 300 mykotoxinů. Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány, je vysvětlován tím, že jsou prostředkem vláknitých mikromycetů v boji o potravu a v boji o přežití. Při pěstování kulturních plodin vzniká řada složitých vztahů a interakcí mezi rostlinou, mikroskopickými houbami, hmyzem a způsobem ošetřování rostlin. Tyto interakce pak ovlivňují produkci a obsah mykotoxinů. Většina mykotoxinů produkována plísněmi bývá přítomna v koření. (66) Následující tabulka ukazuje přehled výskytu mykotoxinů v několika studií zabývající se tímto tématem.
Studi e 1. (14)
Oblast
Druh koření
Egypt
2. (44)
Velká Británie
Černý pepř Bílý pepř Kurkuma Koriandr Kurkuma Koriandr nespecifikováno
3. (59)
Jižní Korea
4. (114)
Itálie
Červená paprika Kari Zázvor Černý pepř skořice Skořice Muškátový oříšek Chilli
Černý pepř
Průměrné množství 35µg/kg 22µg/kg 12µg/kg 8 µg/kg 8 µg/kg 2µg/kg Nezjištěno
0.08–4.66 µg/kg 0,13-0,46 µg/kg 0,18 µg/kg nekontaminováno nekontaminováno 0,98 µg/kg 2,27 µg/kg 0,47 µg/kg 26,9 µg/kg 1,2 µg/kg 1,4 µg/kg 1,2 µg/kg nekontaminováno
43
Druh mykotoxinu Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 Aflatoxin G1 Aflatoxin G1 7/24 kmenů A.flavus produkovala aflatoxin U všech nalezen aflatoxin B1, pouze u papriky v množství 0,21 µg/kg B2 Aflatoxin B1 Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2
Frekvence výskytu 4/130 z celku 4/130 2/130 1/130 14/20 vzorků koření kontaminováno A.flavus 7/41 vzorků 2/20 vzorků 1/7 vzorků 1/1 vzorků 1/3 vzorků 5/11 vzorků
5. (93)
Irsko
6. (131)
Brazílie
7. (121)
Španělsko
8. (62)
Malajsie
Pepř Chilli Kari Kajenský pepř Paprika Skořice Koriandr Kurkuma Kmín Paprika
0,46 µg/kg 3,23 µg/kg 0,40 µg/kg 0,06 µg/kg 0,32 µg/kg nekontaminováno 0,31 µg/kg 1,9 µg/kg nekontaminováno 7,0 µg/kg 3,4 µg/kg 1,0 µg/kg 0,4 µg/kg 0,13 - 7,3 µg/kg
Aflatoxiny celkem
Ochratoxin A Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Paprika Aflatoxiny celkem 0,1 - 281 µg/kg Ochratoxin A 10 - 131 µg/kg Zearalenon Chilli 0,13 - 2,5 µg/kg Aflatoxiny 0,6 - 44,6 µg/kg celkem 10 - 129 µg/kg Ochratoxin A Zearalenon Chilli 0,2-56,6 µg/kg Aflatoxin B1 0,1-11,45 µg/kg Aflatoxin B2 0,3-17,65 µg/kg Aflatoxin G1 0,2-3,2 µg/kg Aflatoxin G2 Aflatoxiny 0,2-79,7 µg/kg celkem 0,2-101,2 µg/kg Ochratoxin Tab.5 Kontaminace koření – mykotoxiny
44
4/30 10/30 3/20 2/8 2/10 0/7 1/9 4/10 0/6 vzorků 60/70 vzorků 58/70 9/70 15/70 59% z 64 vzorků 98% 39% 40% z 35 vzorků 100% 46% 52/80 14/80 21/80 3/80 52/80 65/80
4 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ RŮST MIKROORGANISMŮ Životní činnost mikroorganismů a jejich vývoj jsou závislé na vnějším prostředí. Pro rozmnožování a růst je nutné mít v prostředí dostatečné množství stavebního materiálů k syntéze buněčné hmoty a k zisku energie a zároveň vhodné fyzikální, chemické a biologické podmínky. Nepříznivé vlivy prostředí se uplatňují v přírodě selekcí odolnějších rodů, druhů či mutantů. V praxi se nepříznivé vlivy používají v inhibici mikroorganismů. (6, 143)
4.1 Výživa Mikroorganismy lze rozdělit do dvou skupin dle vztahu ke zdroji uhlíku. Autotrofní využívají jako zdroj uhlíku oxid uhličitý. Tuto energii získávají přímo ze slunečního záření či oxidací anorganických látek, jako zdroj dusíku využívají amonné soli, dusitany a dusičnany. Heterotrofní využívají jako zdroj uhlíku organické látky (polysacharidy, bílkoviny, organické kyseliny). Tato skupina u mikroorganismů převládá. (6, 143)
4.2 Teplota Teplota ovlivňuje rychlost rozmnožování i možnost života mikroorganismů. U každého mikroorganismu rozeznáváme tři základní body teploty: minimální (teplota, při které se druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí), optimální (teplota, při níž se rozmnožuje největší rychlostí) a maximální (nejvyšší teplota, kdy je schopen se ještě rozmnožovat). Optimální teplota je obvykle asi o 30°C vyšší než teplota minimální, maximální teplota převyšuje o 5 až 10°C optimální teplotu určitého mikroorganismu. Další zvýšení teploty vede k usmrcení buněk. Prudký pokles růstu při vyšších teplotách je způsoben denaturací určitých enzymů, jež jsou pro růst nezbytné. Krátkodobé zvýšení teploty nad maximální teplotu vyvolává teplotní šok, který vede k různým výkyvům metabolismu. Přitom se syntetizují tzv. teplotně šokové proteiny, které náležejí mezi tzv. stresové proteiny. Těmito proteiny se rozeznávají anomální proteiny tvořené při stresu a zajišťuje se jejich rychlé odbourávání. Minimální teplota růstu je určena tím enzymem, jehož aktivita je nejcitlivější k nízkým teplotám. (6, 143)
45
Skupina Psychrofilní Psychrotrofní Mezofilní Termofilní
Minimum Pod 0°C
Optimum 10-15°C
Maximum Pod 20°C
Koment Nejlepší růst při relativně nízké teplotě 0°C 15-30°C Okolo 25°C Schopné růst při nízkých teplotách, ale dávají přednost mírným teplotám 10-15°C 30-40°C Pod 45°C Většina bakterií, zejména ty, které žijí ve spojení s teplokrevnými živočichy 45°C 50-85°C Okolo 100°C Ze všech termofilů je široká variace v optimální a maximální teplotě Tab.6 Teplota růstu skupin mikroorganismů (148)
4.2.1 Smrtící účinky vysokých teplot a termorezistence Smrtící účinek vysokých teplot se kvantitativně vyjadřuje smrtící (letální) teplotou, což je nejnižší teplota, při které je organismus usmrcen během určité doby (nejčastěji 10 minut) a za přísně definovaných vnějších podmínek. Jednotlivé druhy se liší svou termorezistencí, avšak každá teplota, která je vyšší než maximální teplota růstu, je pro vegetativní buňky letální, působí-li dostatečně dlouhou dobu. Většina mezofilních mikroorganismů je usmrcena ve vlhkém prostředí (vlhké teplo je účinnější než suché teplo) při 65°C během 15 minut. Spory rodů Bacillus, Clostridium a Desulfotomaculum jsou usmrceny za tuto dobu až při teplotách 120°C. Spory kvasinek a plísní nemají tak vysokou odolnost, takže je ve vlhkém prostředí obvykle usmrtí 10 minutové zahřívání na 70°C. Všechny buňky určité populace téhož druhu nejsou za daných vnějších podmínek stejně odolné k teplotě. Stupeň jejich odolnosti závisí jednak na jejich fyziologickém stavu, jednak na jejich genovém vybavení, a proto při sledované teplotě obyčejně určité procento buněk přežívá. Je-li počáteční koncentrace buněk v prostředí větší, je k jejich bezpečnému usmrcení zapotřebí vyšší teploty, což je způsobeno ochranným působením shluku buněk a větší pravděpodobností výskytu buněk s vyšší termorezistencí. Jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňující termorezistenci mikroorganismů je obsah vody v prostředí i buňkách, neboť v suchém prostředí jsou mikroorganismy mnohem rezistentnější k vysokým teplotám než v prostředí vlhkém. K látkám působícím ochranně patří především lipidy, bílkoviny a vyšší koncentrace sacharidů. Termorezistenci vegetativních
46
buněk i spor silně ovlivňuje pH prostředí; obecně, termorezistence je nejvyšší, je-li pH optimální pro růst daného mikroorganismu. Hlavní příčinou letálních účinků vysokých teplot je pravděpodobně nezvratná denaturace bílkovin a z ní plynoucí inaktivace enzymů, avšak probíhají zde pravděpodobně i jiné procesy, jako např. poškození cytoplazmatické membrány, jež vede k lýze buněk. (6, 143, 148)
4.3 pH prostředí Růst a biochemická činnost mikroorganismů je silně ovlivněna koncentrací vodíkových iontů v prostředí. Ph pro optimální růst bakterií a kvasinek je poměrně úzké, pro plísně je podstatně širší. Většina bakterií roste v neutrálním či slabě alkalickém prostředí. Kvasinky vyžadují pro růst kyselé prostředí. Optimální pH většiny plísní je poblíž neutrálního bodu, rozmnožovat se ale mohou ve velmi širokém rozmezí pH (6, 143, 79). PH prostředí ovlivňuje odolnost buněk ke zvýšeným teplotám. U bakteriálních spor rodů Bacillus, Clostridium a Desulfotomaculum zabraňuje kyselé pH klíčení spor a přeměně ve vegetativní formu. Této skutečnosti se využívá u potravin sterilovaných teplem. Kyselým potravinám o pH nižším než 4,0 stačí sterilizace do 100°C. (143)
4.4 Vodní aktivita Růst mikroorganismů je charakterizován minimální, optimální a maximální vodní aktivitou. Aktivita vody je definována jako poměr tlaku vodních par potraviny k tlaku par destilované vody při určité teplotě. Hodnoty aktivity vody se pohybují v rozmezí 0.00 (naprosto suchá látka) do 1,0 (destilovaná voda). (143, 109, 11) 4.4.1 Vliv na potraviny Potraviny se podle aw dělí na tři velké skupiny:
Potraviny velmi vlhké (HMF – high moisture foods) s aw 1,00-0,90
Potraviny středně vlhké (IMF – intermediate moisture foods) s aw 0,90-0,60
Potraviny suché (LMF – low moisture foods) s aw <0,60
Růst většiny patogenů je inhibován při a w nižší než 0.9. Minimální hodnota pro bakterie působící kažení potravin je 0,90-0,91, pro kvasinky 0,87-0,94 a pro plísně 0,70 a 0,80. Převážná část mikroorganismů není schopna růst při a w pod 0,60. Vlhkost potřebná pro růst 47
mikromycet se mění dle etiologie původu plísně. Polní vláknité mikromycety vyžadují relativní vlhkost v rozmezí 20-25%, skladištní 10-18%. (109, 11) 4.4.2 Antimikrobiální působení aktivity vody Mikroorganismy potřebují vodu pro růst a rozmnožování. Mikrobiální buňka obsahuje 80 – 90% vody, v níž probíhají všechny chemické reakce. Aby nedošlo ke ztrátě vnitrobuněčné vody, musí být dostatečné množství vody obsaženo také ve vnějším prostředí. V potravinách se voda nachází volná (dostupná) a vázaná na hydrofilní koloidy rozpuštěných látek či ve formě krystalků ledu. Volná (dostupná) voda představuje termín vodní aktivita. Pokud se volná voda v prostředí sníží (ať už jejím odstraněním či přidáním solubilních látek), z buňky vyteče voda v úsilí vytvořit ztracenou rovnováhu. Ztráta vody způsobí buňce osmotický šok a dojde k plasmolýze. (109, 11) Druh mikroorganismu Aktivita vody 0,95 Bacillus cereus 0,93 Bacillus stearothermophilus 0,95 Clostridium botulinum Typ A 0,94 Clostridium botulinum Typ B 0,97 Clostridium botulinum Typ E 0,95 Escherichia Coli 0,95 Salmonella spp. 0,94 Vibrio parahaemolyticus 0,86 Staphylococcus aureus 0,97 Pseudomonas fluorescens 9,90 Saccharomyces cerevisiae 0,62 Saccharomyces rouxii 0,83 Debaryomyces hansenii 0,93 Rhizopus nigricans 0,79 Penicillium chrysogenum 0,81 Penicillium patulum 0,78 Aspergillus flavus 0,77 Aspergillus niger 0,84 Alternaria citri Tab.7 Minimální Aw při optimální teplotě (11)
4.5 Oxidoredukční potenciál Přítomnost oxidačních (kyslík, dusičnany, železité ionty, peroxidy) nebo redukčních (železnaté ionty, vodík, sloučeniny se sulfhydrylovou skupinou nebo s reaktivními dvojnými vazbami) činidel udává oxidačně redukční potenciál prostředí. Ten se vyjadřuje (Eh) jako 48
rozdíl potenciálu mezi platinovou elektrodou umístěnou do daného prostředí a normální vodíkovou elektrodou. Mikroorganismy se liší svým vztahem ke kyslíku, a proto vyžadují různý oxidačně redukční potenciál. Aerobní vyžadují přítomnost rozpuštěného kyslíku (pozitivní O-R potenciál), anaerobní působí kyslík škodlivě či má letální účinek (je nutné snížit O-R potenciál). (143)
4.6 Povrchové napětí Aniontové tenzidy ve vyšších koncentracích poškozují cytoplazmatickou membránu a tím usmrcují buňky. Kationtové tenzidy mají již ve velmi nízkých koncentracích, jež ještě nevedou k poškození cytoplazmatické membrány, silné mikrobicidní účinky. Neiontové tenzidy nepůsobí na mikroorganismy nijak nepříznivě. (143)
4.7 Záření Elektromagnetické záření je kombinací příčného postupného vlnění magnetického a elektrického pole. (32) 4.7.1 Antimikrobiální působení záření Elektromagnetické vlnění různých vlnových délek se značně liší svým fyziologickým účinkem na mikroorganismy. Infračervené záření a Hertzovy vlny samy o sobě pravděpodobně vlastní smrtící účinek na mikroorganismy nemají a působí jen svými tepelnými účinky. Viditelné světlo se uplatňuje především jako zdroj energie fototrofních mikroorganismů. Ultrafialové záření má silné mutagenní a letální účinky na mikroorganismy. Největší mutagenní a letální účinky má UV záření o vlnové délce, jež je nejvíce absorbována nukleovými kyselinami (265 nm). To způsobuje vyrážení elektronů z jejich orbitalů a tvorbu kladně nabitých kationtů. Ionizované části molekul se stávají vysoce reaktivními a vedou k řadě chemických reakcí, které buňku buď usmrtí, nebo změní její genetickou informaci (reakce radikálů s DNA způsobuje porušení fosfodiesterových vazeb a tím zpřetrhání jejího řetezce). Intenzita účinku UV světla je závislá na množství pohlceného záření a době ozařování. Mikroorganismy se liší svou odolností k účinkům UV světla. (143, 109) Záření o vlnové délce kratší 10 nm (Roentgenovo, y-záření a kosmické) mají silné mutagenní a letální účinky. Mají vysokou pronikavost. Vysoké dávky záření potřebné ke sterilizaci 49
potravin však výrazně mění vzhled, chuť i konzistenci většiny potravin. Proto se pro sterilizaci nepoužívají. V praxi se používají pouze nízké dávky y-záření. (143) 4.7.2 Ozařování potravin V celé Evropě je povoleno ozařování koření a bylin a některé země mají vlastní seznam kategorií potravin, které smějí být ozařovány. Pro všechny ozářené potraviny platí, že tato skutečnost musí být na obalu označena, ale často to není splněno. Celkem 17 členských států oznámilo kontroly potravin uvedených na trh. Celkem bylo v roce 2005 zkontrolováno 7 011 vzorků potravin. Přibližně u 4 % produktů na trhu bylo shledáno, že byly ošetřeny ozářením nedovoleně a/nebo u nich ozáření nebylo náležitě vyznačeno. Většina nevyhovujících vzorků byla odebrána z produktů pocházejících z Asie. V zemích jako Belgie a Německo je ozařováno mnoho produktů, které jsou exportovány do třetích zemí. Ve Velké Británii se potraviny neozařují.(165) 4.7.3 Ozařování v ČR a jeho značení Inspekce provedené příslušnými orgány v roce 2005 potvrdila soulad ozařovny Artim spol. s.r.o. s požadavky směrnice 1999/2/ES. V roce 2005 bylo ozářeno 85,3 tun bylin, koření a sezónní zeleniny v dávce 4-7 kGy. (94, 90) K 1. 5. 2004 nabyly v plné míře účinnosti české právní předpisy, které se týkají aspektu označování ionizací ošetřených potravin. Informace spotřebitele na obalu může být např.: MIKROBIÁLNĚ ČISTÉ (ošetřeno ionizací, RI 01CZ), STERILOVÁNO (ošetřeno ionizací, RI 01CZ), GARANCE MIKROBIÁLNÍ ČISTOTY (ošetřeno ionizací, RI 01CZ) Mikrobiální dekontaminace se provádí standardní dávkou 3-7 kGy, pro snížení koncentrací koliformních bakterií a snížení celkového počtu bakterií a plísní o 2-3 řády. Při podezření na kontaminaci zboží salmonellami je dávka zvýšena 6-9kGy. Dezinsekce koření, zeleniny apod. se provádí dávkou pod 2 kGy. (32) 4.7.4 Legislativa Vyhláška č.133/2004 v § 2 vymezuje dva druhy ozařování, ultrafialové záření a ionizující záření. Přičemž ultrafialové paprsky lze použít pouze k ošetření vody určené k výrobě balené kojenecké vody a balené pitné vody a vody používané jako surovina k výrobě potravin. 50
Ionizující záření se používá k ozařování potravin, Pro skupinu potravin:sušené byliny, koření a kořenící přípravky je to 10 kGy. Povolenými typy ionizujícího záření jsou záření radionuklidů 60Co nebo 137Cs, dále rentgenové záření o energii nepřevyšující 5 MeV nebo urychlené elektrony o energii nepřevyšující 10 MeV. (160)
4.8 Hydrostatický tlak Většina mikroorganismů se rozmnožuje při normálním atmosférickém tlaku, při zvýšení na 10 až 20 Mpa se rozmnožování zpomaluje a při 30 až 40 Mpa se u většiny (vyjma barotolerantních a barofilních) zcela zastaví. (143) HHP použitý za běžné teploty ničí vegetativní buňky a inaktivuje některé enzymy s minimální změnou organoleptických vlastností potravin. Odolnost mikroorganismů je velmi variabilní. HHP má obvykle vyšší ničivý účinek v organismech s vyšší mírou organizace a strukturní složitostí, proto prokaryota jsou obvykle více rezistentní než eukaryota. Spory vykazují velkou odolnost vůči inaktivaci vysokým tlakem. Endospory C.botulinum jsou extrémně odolné vůči HHP s variací mezi typy. Je málo studií na vliv vysokého tlaku na spory B.cereus, ale v jedné studii při kombinaci vysokého tlaku (600 Mpa) a mírné teploty (>45°C) došlo k výrazné ztrátě životnosti. Ve studiích s Clostridium perfringens bylo malé či žádné snížení životnosti spor za testovacích podmínek. (143, 112) Vysoký tlak (600-700Mpa) působí i na askospory, ve studii po dobu použití asi 60 min byl schopen snížit koncentraci askospor T.avellaneus v jablečném džusu asi o 2-3 řády. (157)
B. cereus B. cereus C. prefringens
P (Mpa) 400 600 500
Čas (min) 25 30
T (°C)
Inaktivace
30 60 25, 45, 6 75 50-55 75
0,5 log 6-7 log Minimální nebo bez redukce 3,7 log Cca. 5 log > 6 log
650 15 C. perfringens type A 827 5 C.botulinum type E 827 20 C.botulinum nonproteolytic type B 827 20 75 2-3 log C. botulinum type A 70 80 5 log C. botulinum proteolytic type B 600 4 80 2,3 log C. botulinum proteolytic type B 800 6 80 5 log C. botulinum proteolytic type A 600 Tab.8 Životnost spor při působení HHP v odlišném čase, teplotě a tlaku (112) 51
4.8.1 Antimikrobiální působení vysokého tlaku Vysoký hydrostatický tlak (HHP) nemá vliv na kovalentní vazby, proto primární struktura molekul jako jsou aminokyseliny či mastné kyseliny zůstávají beze změny. Iontové vazby a hydrofobní interakce zodpovědné za udržení sekundární a terciální struktury proteinů jsou narušeny a jsou spojeny s poklesem objemu potravin. Aplikace HHP v technologii potravin má vliv na funkční kapacitu a strukturu proteinů, změnu v enzymatické aktivitě, přenosu tepla, kombinovaných dehydratačních procesech a dalších. Buněčná smrt nastává v důsledku nahromadění několika škod v různých částech buňky. Akumulace škod přesahuje reparační schopnost buňky a dochází k úmrtí. Příležitostně takto postižená buňka může být opravena, pokud se nachází ve svém optimálním prostředí. Odlišnosti v buněčné membrány Gram pozitivních a Gram negativních bakterií vedou k odlišnostem v rezistenci k HHP. G+ jsou většinou odolnější ve srovnání s G-. Významnou roli hraje zastoupení nenasycených mastných kyselin v buněčné membráně. Barofilní a barotolerantní bakterie mají membrány s mastnými kyselinami s větším zastoupením MUFA. I psychrofily přizpůsobené růstu při nízkých teplotách obsahují velké množství MUFA. Inaktivace ATPázy a jiných proteinů také ovlivňuje funkci membrány a mění acidobazickou rovnováhu buňky. I další komponenty buňky jsou citlivé na vysoký tlak (ribozomy, syntéza bílkovin, enzymatická činnost, struktura DNA). Přesné mechanismy inaktivace spor nejsou známy. Spory jsou citlivé od středně vysokých tlaků (50-300 Mpa). (112) Askospory jsou relativně odolné vůči vysokému tlaku. Ve studii z roku 2004, byl zkoumán vliv tlaku na Talaromyces avellaneus a při působení 600 Mpa po dobu 60 minut za pokojové teploty se snížil počet askospor pouze o dva až tři řády. (157) 4.8.2 Vliv na potraviny Výroba trvanlivých, málo kyselých potravin vyžaduje inaktivaci spor kombinací HPP s jinými procesy, obvykle zvýšenou teplotou. Za standardních tlaků, které jsou využívány při zpracování potravin, nejsou spory inaktivovány a jsou získávány pasterizované produkty, ve kterých přežívající spory nemají konkurenci. Za těchto podmínek by rizika představovaná patogenními spory neměla být podceňovaná. Byly popsány postupy, kterými lze dosáhnout významného snížení počtu spor. Jedna strategie je vyvolat klíčení pomocí tlaku nebo mírným zahříváním a klíčící spory pak usmrtit v novém cyklu využívajících vysokých tlaků. Další 52
systém by mohl být kombinací současného použití HHP a mírného zahřívání. Nicméně tyto metody nemohou být spolehlivě komerčně přijaty pro sterilizaci potravin bez náležitého posouzení efektivity vůči tlaku rezistentních patogenních spor, díky proměnným efektům HHP na klíčení spor. Tlaková odolnost spor obvykle nekoreluje s tepelnou odolností. (112)
4.9 Elektrický proud Střídavý elektrický proud o malé intenzitě (30-100 mA) nemá nepříznivý vliv na mikroorganismy. Vyšší intenzita střídavého proudu působí nepříznivě svými tepelnými účinky.
Stejnosměrný
proud
může
mikroorganismy
nepříznivě
ovlivňovat
svými
elektrolytickými účinky, neboť při elektrolýze mohou v prostředí vznikat mikrobicidní sloučeniny. Mechanismus inaktivace bakterií zahrnuje oxidační stres buňky, produkci škodlivých
oxidantů
a
ireverzibilní
permeabilizaci
membrány.
Životaschopnost
mikroorganismů je závislá na délce působení proudu a hustotě elektrického proudu. Buňky na povrchu katody vykazují přitom vyšší úmrtnost, na rozdíl od bakterií mimo prostor mezi elektrodami. (143, 162)
4.10 Ultrazvuk Zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz ležící nad hranicí slyšitelnosti lidského ucha, působí na mikroorganismy letálně tehdy, mají-li poměrně velkou intenzitu a nízký kmitočet. Odolnost mikroorganismů k ultrazvuku se velmi liší. Kvasinky a větší buňky jsou více náchylné k účinkům kavitace díky své větší ploše. Obecně platí, že spory bakterií jsou odolnější než vegetativní buňky v růstové fázi. Plísně jsou odolnější oproti vegetativním buňkám, aeroby odolnější než anaeroby a koky zpravidla odolnější než tyčinky. Baktericidní účinek ultrazvuku na gram pozitivní vs. gram negativní bakterie je sporný. Některé studie uvádějí jako rezistentnější gram pozitivní, další neuvádějí významné rozdíly v inaktivaci mikroorganismů ultrazvukem. Jestliže má být ultrazvuk používán v praxi ve sterilizaci potravin a má-li být účinný, musí být použit ve spojení s tlakem (manosonikace), teplem (termosonikace) nebo s oběma opatřeními (manotermosonikace).(104, 57) 4.10.1 Antimikrobiální působení ultrazvuku Klíčový koncept ultrazvuku je rozptyl a odraz zvukových vln. Hlavním léčebným účinkem ultrazvuku je kavitace. Při vzniku podtlaku, který je vyvoláván akustickou vlnou, vznikají v tekutině (hydrofobním povrchu mikroorganismů) dutiny vyplněné vakuem a následně plyny 53
z okolních tekutin. Při odeznění podtlaku následuje exploze dutin s velmi vysokou teplotou a tlakem s destruktivním účinkem na okolí. (143, 104, 57)
. 4.11 Látky s antimikrobiální aktivitou Látky s nepříznivými specifickými účinky (v důsledku svého chemického složení) na mikroorganismy
se
nazývají
antimikrobiální;
buď
pouze
zastavují
rozmnožování
mikroorganismů – mikrobiostatické, nebo je usmrcují – mikrobicidní. Podle mechanismu účinku je můžeme rozdělit do tří základních skupin, a to na: 1. látky poškozují určitou strukturu buňky nebo její funkci; patří sem např. látky poškozující buněčnou stěnu nebo cytoplazmatickou membránu a ostatní membrány v buňce, ribozomy, mitochondrie, apod.; 2. látky působící na mikrobiální enzymy 3. látky reagující s DNA 4.11.1 Antimikrobiální aktivita vybraných druhů koření Koření se používá v potravinářském průmyslu jako přírodní přípravky k prodloužení trvanlivosti potravin. Řada bylin a koření se používá pro omezení či odstranění patogenních bakterií a zvyšuje tak celkovou kvalitu potravinářských výrobků. Přítomnost těchto látek je součástí systému rostlinné obrany vůči napadení mikroorganismy. (33) Účinnost antimikrobiálních látek koření je závislá na pH, teplotě skladování, množství kyslíku a množství aktivních složek. (33) Bylo prokázáno, že rostlinné látky ovlivňují mikrobiální buňky různými antimikrobiálními mechanizmy, včetně útoku na fosfolipidovou dvojvrstvu buněčné membrány, narušení enzymatického systému, ohrožení jejich genetického materiálu či tvorbou mastných kyselin hydroperoxidasou způsobující oxidaci nenasycených mastných kyselin. Obecně platí, že gram negativní bakterie jsou méně citlivé k antimikrobiálním látkám z důvodu obsahu jejich lipopolysacharidů ve vnější membráně, která omezuje šíření hydrofobních sloučenin. To však neznamená, že gram pozitivní bakterie jsou vždy náchylnější. Gram negativní bakterie jsou obvykle více rezistentní k antimikrobiálním látkám rostlinného původu (118). In vitro experimenty antimikrobiálních látek rostlin jsou dobře popsány ve spoustě studií, ale tato aktivita se může lišit v závislosti na testovaném mikroorganismu. (147)
54
Spousta studií potvrzuje či vyvrací inhibiční efekt jednotlivých druhů koření na různé druhy mikroorganismů, minimálně v jedné studii potvrzené antimikrobiální účinky (druhu koření použitého v praktické části) jsou následující: Bakterie
Koření mající antimikrobiální účinek
Česnek, hřebíček, skořice, kmín (147, 118) hřebíček, skořice, česnek, kmín (147, 118) skořice (147) skořice, hřebíček, česnek, kmín, pepř (116, 147, 118,79) česnek, skořice, hřebíček, kmín, zázvor (147, 118, Listeria monocytogenes 79) Skořice, hřebíček, kmín (118) Pseudomonas aeruginosa hřebíček (S.typhimurium), skořice, česnek, kmín Salmonella spp. (S.enteritidis), pepř, chilli, zázvor (118, 147, 79) skořice, hřebíček, česnek, kmín, pepř (147, 118, Staphylococcus aureus 79) hřebíček, česnek, pepř, chilli, zázvor (147, 164, Vibrio parahaemolyticus 79) hřebíček (147) Clostridium perfringens kmín, hřebíček, skořice (118) Clostridium botulinum česnek, hřebíček, skořice, kmín (116, 118) Candida albicans česnek, hřebíček (116) Saccharomyces cerevisce Tab.9 Přehled antimikrobiálních účinků koření na jednotlivé druhy bakterií Bacillus cereus Bacillus subtilis Campylobacter jejuni Escherichia coli
Mykotoxiny produkované plísněmi Aspergillus a Penicillium jsou inhibovány pryskyřicí ze skořice a hřebíčku. Gram pozitivní bakterie se ukázaly být citlivější na éterické oleje koření než gram negativní. (147) Hlavní sloučenina skořice je skořicový aldehyd s bakteriální inhibicí v rozmezí 75-100%, majoritní sloučenina hřebíčku je eugenol se stejným rozmezím inhibice. (118) Hlavní antibakteriální sloučenina česneku je allicin. (153) Je zřejmé, že éterické oleje z koření vykazují antimikrobální aktivitu. Do potravin je však koření přidáváno v nevýznamném množství, kdy není možné tento inhibiční účinek využít. (147)
55
5 KOŘENÍ Popis koření použitého v praktické části diplomové práce.
5.1 Pepřovník černý (Piper nigrum) Pepřovník černý je popínavý keř dorůstající do výšky 6 metrů. Je tropickou rostlinou, rostoucí ve vlhkém podnebním pásmu. Sklízejí se nezralé bobule, zelené nebo žluté, dříve než začnou červenat, které jsou v průměru 5 mm velké. Sklizeň trvá několik měsíců, protože dozrávají postupně. V současné době je největším světovým producentem Vietnam, který produkuje 34% světové sklizně od roku 2008. Sušený mletý pepř se používá od starověku, v současné době je ekonomicky nejdůležitějším a nejrozšířenějším kořením na světě. (87) 5.1.1 Použití pepřovníku černého Pepř bílý: Plody, které zcela dozrají, se po sesbírání máčí asi 2 až 3 dny ve vápenné vodě, čímž jejich oplodí nakvasí, změkne a dá se snadno mechanicky odstranit. Vyčištěná, vyloupaná a zralá semena zbavená oplodí přicházejí pak do obchodu jako pepř bílý. Ten je méně aromatický a více pálí. Pepř černý: Sklízí se nezralé zelené plody, které se následně skladují několik dní na hromadách, aby došlo k jejich fermentaci. Poté se suší na slunci, kdy postupně seschnou, ztvrdnou a zčernají. Pepř zelený: Rovněž se sklízí nezralé zelené plody, které se buď nakládají do octa či slaného nálevu. Jejich výhodou je, že při tepelné úpravě absorbují tekutinu a změknou.(87, 152) 5.1.2 Chemické látky v pepři Tržní druhy pepře, tj. pepř černý, bílý a zelený, pocházejí ze stejné rostliny a obsahují jako hlavní pálivou složku piperidinamid piperové kyseliny, který se triviálně nazývá piperin. Řadí se mezi alkaloidy, resp. Protoalkaloidy. Dále je přítomen příbuzný piperanin a v menším množství další příbuzné látky a jim odpovídající pyrrolididy, např. piperylin. Obsah protoalkaloidů v černém pepři bývá obvykle 2-7%, z tohoto množství činí asi 9095% piperin. V olejopryskyřicích bývá piperin doprovázen svými geometrickými isomery. Piperin a piperylin vykazují zhruba stejnou pálivost, pálivost piperazinu je asi poloviční.(154) 56
5.2 Paprika Paprika zahrnuje mnoho druhů a kultivarů. Zde uvádím několik domestikovaných druhů papriček. Capsicum annuum, které obsahují mnoho běžných druhů jako bell peppers, wax (banana pepper), kayenský pepř, jalapeños a chiltepin Capsicum frutescens (paprika křovitá), která zahrunuje malagueta, tabasco, thaiský pepř, piri piri, African birdseye chili, Malawian Kambuzi Capsicum chinense, zahrnuje nejpálivější papričky, jako jsou naga, habanero, Datil and Scotch bonnet Capsicum pubescens, která zahrnuje Jihoamerické rocoto papričky Capsicum baccatum, která zahrnuje Jihoamerické aji papričky. (152) 5.2.1 Paprika roční (Capsicum Annuum) Je nevysoká a větvitá rostlina. Květy jsou bílé barvy, stonek je hustě rozvětven, může dosahovat až 6 cm. Na pozadí listů se vyjímají plody o různé velikosti, které jsou charakteristické pro jednotlivé druhy papriky roční. Některé druhy mají až 50 šešulek. C. annuum je obzvlášť produktivní v horkém a suchém prostředí. Papriku objevil pro Evropu Kryštof Kolumbus, který ji v roce 1493 přivezl z ostrova Haiti do Španělska. Paprika patří mezi nezbytné koření. Přidává se do omáček, polévek, salátů, tvarohových pomazánek, uzenin i k masu a drůbeži. Vedle suchého koření je oblíbený i konzervovaný protlak z čerstvých zralých plodů. (152) 5.2.2 Paprika křovitá čili chilli (Capsicum frutescens) Paprika křovitá je obecně označována jako chilli. Tyto papriky jsou jasně červené, s podstatně menšími plody než jsou běžné u sladké papriky. Sušením se barva mění na tmavočervenou až oranžově-červenou. Suší se obvykle na slunci a získávají přitom svraštělý vzhled. Mletím sušených plodů papriky křovité se získává kajenský pepř. Rostlina pochází z tropické Ameriky, dnes je pěstována ve většině tropických států, nejvíce v Indii a Thajsku. (152, 102)
57
5.2.2.1 Použití chilli Plody obsahují až 0,55% palčivého kapsaicinu, což je 20krát více než plody papriky roční. Některé jsou tak ostré, že mohou způsobit při pouhém dotyku podráždění kůže. Celé plody přidáváme do nakládané zeleniny, mleté koření je nezbytnou ingrediencí curry-powder. Palčivá omáčka tabasco, užívaná podobně jako worcesterská, se připravuje zavařením nasekaných plodů do slané vody nebo octa. Chilli je typickým kořením jihoamerické kuchyně se širokým spektrem použití - masa, ryby, mušle, polévky, omáčky, vaječné a zeleninové pokrmy. (102) 5.2.3 Chemické látky v paprikách Pálivými látkami různých odrůd paprik jsou kapsaicinoidy, což je skupina vanillylamidů odvozených od C8-C11 monoenových mastných kyselin s rozvětveným řetězcem a od nasycených mastných kyselin s rozvětveným nebo přímým řetězcem. Řadí se mezi alkaloidy. Asi 90 % kapsaicinoidů reprezentují přibližně stejným dílem kapsaicin a dihydrokapsaicin, zbytek tvoří další příbuzné sloučeniny. Obsah kapsaicinoidů ve sladkých odrůdách paprik (C,frutescens) je často zanedbatelný (0,001% i méně), zatímco v některých odrůdách C.annuum se pohybuje v rozmezí 0,2-1% a ve velmi pálivých odrůdách může být i vyšší. Práh rozpoznání pálivé chuti kapsaicinu je asi 0,1 mg.kg-1 a při koncentraci 10 mg.kg-1 vyvolává silně pálivý vjem. Pálivost dihydrokapsaicinu je přibližně stejná. Oba kapsaicinoidy vykazují pálivost 150 až 300 krát vyšší než pálivé složky pepře a zázvoru. (154)
5.3 Zázvorovník lékařský (Zingiber officinale) Zázvorovník je vytrvalá tropická rostlina z čeledi zázvorovité. Dosahuje až 150 cm výšky. Svými vysokými listnatými lodyhami připomíná obyčejný rákos. Pod zemí jsou schované silně kořenité a palčivě aromatické oddenky, které jsou od pradávna vyhledávaným a dodnes obecně známým kořením. Zázvorovník se rozmnožuje vegetativně z oddenků nakrájených na kousky a vysazovaných do lehké a dostatečně vlhké půdy. Roste v tropických oblastech. Pochází z Jižní Asie, odtud se rozšířil do Východní Afriky a Střední Ameriky. (3,1 35)
58
5.3.2 Použití zázvorovníku Koření se připravuje ve dvou formách: o černý zázvor jsou oprané, usušené a neloupané oddenky o bílý zázvor jsou oddenky pečlivě oloupané Prodává se kusový, mletý či kandovaný a jako extrakt do zázvorového piva. Ke kořenění se používá zázvor jemně mletý a to do sladkého pečiva, sladkých pokrmům, polévek, k masu a rybám. Velmi populární je zázvorová limonáda, čaj i pivo. (152) 5.3.3 Chemické látky zázvoru Neloupané i loupané oddenky zázvorovníku lékařského (Zingiber officinale), známé jako hnědý nebo bílý zázvor, obsahují jako pálivé složky fenolové alkanony známé jako gingeroly a shogaoly, jejichž celkový obsah v čerstvém oddenku 0,7-0,9% a v sušeném oddenku 1,11,6%. Hlavní a nejdůležitější složkou je tzv. 6-gingerol, který v olejopryskyřicích získaných šetrným způsobem tvoří asi 75% pálivých látek a je zároveň nejpálivější složkou zázvoru. V malém množství je doprovázen svými homology 8-gingerolem (11%) a 10-gingerolem (15%). Z dalších pálivých složek jsou přítomny 6-shogaol, 8-shogaol a ve velmi malém množství další příbuzné sloučeniny. Složení pálivých složek oddenku zázvoru i příslušných olejopryskyřic se v jistých mezích liší, především v závislosti na odrůdě rostliny a posklizňových operacích. Ve skladovaných a termicky zpracovaných materiálech se např. vyskytuje významnější množství shogaolů vzniklých dehydratací příslušných gingerolů. Retroaldolisací gingerolů dále vzniká pálivý zingeron a odpovídající alkanaly které jsou nositely chutí. (154, 3)
5.4 Hřebíčkovec kořenný (Eugenia caryophyllata) Hřebíčkovec je stálezelený strom vysoký až 10m. Je původem ze Severních Moluk v Indonésii. Dnes se nejvíce pěstuje na ostrově Pemba v Tanzanii, v Madagaskaru a v Brazílii. Koření hřebíček je sušený kalich s poupětem. Vrcholová květenství se z nerozvinutých květů sbírají ručně ze žebříku a suší se na slunci, čímž ztmavnou. (87, 152)
59
5.4.1 Použití hřebíčku Hřebíček se používá vcelku nebo mletý ke kořenění sladkých pokrmů a pečiva, ale také masa. Přidává se do jemných rybích marinád, do likérů a svařeného vína. Hřebíčková silice podporuje chuť k jídlu a trávení a má pro svůj vysoký obsah eugenolu antiseptické účinky, je součástí ústní kosmetiky – ústních vod a zubních past. Po staletí byl hřebíček používán proti bolestem zubů a k navonění dechu. Hřebíček patří k nejstarším známým kořením. Před naším letopočtem byl používán už v Indii, Indonésii a Číně. Hippokrates byl jedním z prvních lékařů, kteří jej využívali pro jeho léčebné účinky. (152, 166) 5.4.2 Chemické látky Hřebíček obsahuje v množství 15-20% silici, která dlouhým skladováním prchá. Její hlavní součástí je z 80-90 % eugenol. Eugenol je nositelem vůně a mírně pálivé chutě hřebíčku. (154)
5.5 Skořicovník cejlonský, Skořicovník čínský (Cinnamomum zeylanicum, Cinnamomum casia) Skořicovník cejlonský pochází ze Srí Lanky a je to stálezelený strom 15m vysoký. Pruty kůry se seřezávají pár centimetrů nad zemí a loupou, bývají asi 3 m dlouhé a mají průměr asi 2,5 cm. Sklízejí se většinou dvakrát do roka, vždy za dva až tři roky. Sloupnutá kůra se nechává 12 hodin fermentovat. Poté se oškrábe borka a zůstane tenká kůra, která se skládá na sebe, svazuje do svazků a tak se suší. Po usušení má oba okraje stočené do trubičky. Skořicovník čínský pochází z Barmy, pěstuje se v jižní Číně, Thajsku a Indonésii. Rostlina může dosáhnout výšky přes 10 metrů. Kůra je hrubší, má červenější barvu a po usušení tvoří pouze žlábkovité trubky nebo pruhy. Prodává se v kouscích 1 až 3 mm tlustých, 2 až 5 cm širokých a až 40 cm dlouhých. Je podstatně levnější než skořice cejlonská, která má silnější aroma a je považována za nejkvalitnější.(152, 3) 5.5.1 Použití skořicovníku Ze skořicovníku se využívá sušená část kůry bohatá na silice. Z listů, větví a květů se získává skořicový olej. Skořice se používá lámaná nebo mletá ke kořenění sladkých pokrmů, kaší, nákypů, povidel, perníků a kompotů. Spolu s hřebíčkem ochucuje svařené víno.(3, 166) 60
5.5.2 Chemické látky skořice Největší zastoupení z komplexu obsahových látek má cinnamaldehyd z 50-80% v silici. Dalšími složkami silice jsou monoterpeny – α – pinen, kampfen, limonem, seskvilterpeny a jejich deriváty, eugenol, cinnamylacetát, cinnamylalkohol a kyselina skořicová. (154, 22)
5.6 Česnek setý (Allium sativum) Česnek je vytrvalá rostlina, na bázi se složenou stlačeně kulovitou cibulí. Cibule se dělí na několik dužnatých stroužků. Při oddělení stroužků je možno takto česnek vegetativně rozmnožovat. Stonek je na průřezu oblý, jednoduché listy přisedlé s celokranými čepelemi. Květy jsou oboupohlavní, ve vrcholovém květenství šroubele. Česnek kuchyňský se rozmnožuje výhradně vegetativně, tj. výsadbou. Česnek se sklízí nejčastěji v době, kdy se nať začíná ohýbat, její konce žloutnou a zasychají. Roční spotřeba česneku se pohybuje kolem 1 kg na 1 obyvatele. (153, 126, 73) 5.6.1 Použití česneku Česnek je v kuchyni hojně využíván jako koření do mnoha pokrmů. Velmi oblíbený je při výrobě uzenin, salámů a při přípravě jídel. Uplatňuje se v tradičním léčitelství díky obsahu mnoha prospěšných látek pro lidský organismus. Existují studie potvrzující účinky na snížení krevního tlaku, cholesterolu a cukru v krvi. Díky své antimikrobiální aktivitě se používá na kožní infekce, akné a při nachlazení. (153, 5) 5.6.2 Chemické látky česneku Česnek obsahuje látku alliin, což je výchozí látka sirných vazeb v česneku, farmaceuticky neúčinná. Nachází se v cytoplazmě neporušených buněk, vakuoly obsahují enzym allinazu. Ten se při poškození tkáně česneku uvolní a katalyzuje rozklad alliinu na nestabilní meziprodukt, z něhož vzniká vysoce prchavý allicin. Ajoen je další rozkladný produkt alliinu. Je nositelem antitrombotických a antioxidačních vlastností. Allicin je hlavním nositelem antibiotických, antimykotických a řady dalších účinných vlastostí česneku. Rozkladem allicinu vzniká celá řada diallylsulfidů, z nichž nejběžnější je diallyldisulfid. Nemají tak výrazné antibakteriální a antimykotické účinky jako allicin, přesto vykazují určité zdraví prospěšné vlastnosti. Česnek obsahuje přírodní antibiotika bez organicky vázané síry – garlicin a allistatin. (152, 153) 61
5.7 Kmín luční (Carum carvi) Kmín luční je dvouletá bylina, patřící do čeledi Miříkovitých. Na plodech jsou siličné kanálky, kde se vytváří silice. Semena obsahují 3-7% éterických olejů obsahujících karvon a limolen. Kmín luční často zplaňuje, proto je možné ho potkat růste na středně vlhkých až sušších loukách, pastvinách, u cest ve vyšších polohách. Pochází ze střední Asie, ale byl znám i v Egyptě. V dnešní době se pěstuje po celé Evropě, ale hlavními světovými vývozci jsou Německo a Holandsko. (13) 5.7.1 Použití kmínu V potravinářství se využívají plody jakou součást kořenících směsí. Využívají se ve formě celé, ale i drcené. Ceněné jsou pro to, že dokáží potlačit nepříjemné vůně některých druhů masa. Jsou vhodné také do omáček, polévek, pečiva a nakládané zeleniny. Kmínový odvar je vhodný pro kojence trpící nadýmáním. Plody kmínu patří mezi nejstarší koření. Známými alkoholickými nápoji vyrobenými s využitím kmínu jsou Akvavit ze Skandinávie, Allash z Ruska, Cloc z Dánska nebo Kummel z Holandska. V ČR se spotřebuje ročně přibližně 1400 t kmínu, domácí produkce je schopna zajistit 500t, zbytek se dováží z Německa a Nizozemí. (166, 24) 5.7.2 Chemické látky kmínu Hlavní složkou silice je karvon (50-80%), limonen (10-40%), α-pinen, β-pinen a myrcen. Plody mají vysoký obsah draslíku (1350 mg na 100 g), vápníku (650 – 1000 mg). Obsahují též sacharidy, bílkoviny a olej. (152, 24)
62
5.8 Vliv koření na zdraví člověka Koření neslouží jen jako nositel chuti a vůně pokrmů, ale po tisíciletí bylo uznáváno i díky svým léčivým vlastnostem, které byly efektivně využívány v mnoha zemích. Mezi něž patří například vliv na metabolismus lipidů, antidiabetické účinky, stimulace trávení, antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. (137) 5.8.1 Vliv na metabolismus lipidů Vliv česneku na metabolismus lipidů je značně různorodý. Řada autorů je toho názoru, že účinnou látkou v česneku, působící snížení obsahu cholesterolu a lipidů v krvi, je adenosin. Jiní autoři dokazují, že účinnou látkou je allicin, který ve své čisté formě průkazně snižoval triglyceridy i cholesterol. (124, 34, 49, 153) Tři hlavní antioxidační sloučeniny síry z česnekového oleje diallylsulfid, diallyldisulfid a dialliltrisulfid, potlačují oxidaci in vitro a v klinických studiích bylo zjištěno, že podávání česneku má za následek zvýšenou odolnost LDL-cholesterolu proti oxidaci. (113) U kurkumy (kurkumin) a papriky (kapsaicin) byl zjištěn
hypocholesterolemický efekt
u experimentálně
vyvolané
hyperlipidémie
a
hypercholesterolémie u potkanů. Kurkuma rovněž působila u hypertriglyceridémie u krys na hromadění tuku v játrech zvýšeným transportem triglyceridů z jater do periferie. Podobně působila paprika. (15, 137) Hlavním účinkem koření na snížení cholesterolu by měl být zvýšený obrat přeměny cholesterolu na žlučové kyseliny aktivací jaterního enzymu cholesterol-7a-hydroxylázy. (136, 137, 139) Černý pepř (piperin), zázvor, kmín, skořice ani hořčice neměli zásadní vliv na hladinu cholesterolu u potkanů krmených až desetinásobným množstvím než je obvyklé u lidí. (119) 5.8.2 Vliv na diabetes melitus Koření, jako je pískavice, česnek, cibule a kurkuma dlouhá, bylo zkoumáno, jako potenciální agent v boji proti této nemoci. (137) Ačkoliv kurkuma pravděpodobně nemá hypoglykemický účinek, ukázala se účinná u nefropatie (snížením proteinurie a úpravě renálních buněčných enzymů). (16) Další studie ukázala hypoglykemický účinek kmínu u diabetických krys (16), který následná studie vyvrátila. (105) Celkově „antidiabetické“ koření (pískavice, cibule a kurkuma dlouhá) by mohlo být pomocným terapeutickým řešením u diabetu, kdy podle dvou studií z roku 2004 by mohlo navodit stimulaci sekrece pankretického 63
inzulinu, snížení absorpce glukózy a stimulace tvorby inzulin-šetřících bioaktivních látek. (136, 137, 138) 5.8.3 Antilithogenní efekt Kurkumin a kapsaicin způsobily výrazné snížení v indukci žlučových kamenů u myší. (56) Podobný efekt byl prokázán i u cibule a česneku (124). Principy antilitogenního efektu ukazuje následující schéma: (137) Kurkumin/kapsaicin
Zvýšení konverze cholesterolu na žlučové kyseliny
Snížení krevního cholesterolu
Vyšší koncentrace kyselin ve žluči
Snížená sekrece cholesterolu do žluče Snížený index cholesterolu ve žluči
Snížené riziko cholesterolu
žlučových
saturace
krystalizace
Prevence žlučových kamenů 5.8.4 Antioxidační účinek Kurkumin, kapsaicin a eugenol (účinná látka v hřebíčku) prokázaly antioxidační účinky, piperin, zingeron (zázvor), linalool (koriandr) a kuminaldehdy (kmín) pouze nepatrně zpomalovali lipoperoxidaci. (110) Tyto sloučeniny inhibují peroxidaci lipidů zničením volných kyslíkových radikálů zvýšenou aktivitou endogenních antioxidačních enzymů – superoxid dismutázy, katalázy, glutathion peroxidázy a glutathion transferázy. Zároveň nedochází k žádné změně ve složení mastných kyselin na lipidové membráně a v množství endogenních antioxidantů – vit. E, kyselina askorbová a glutathion. (137, 17) U česneku byl 64
tento účinek rovněž prokázán. (60) U kurkuminu, kapsaicinu, piperinu a eugenolu byla prokázána inhibice oxidace LDL in vitro. (86) 5.8.5 Protizánětlivý účinek Protizánětlivý účinek je prokázán u kurkumy a hřebíčku (eugenol), jejichž principem je inhibice metabolitů kyseliny arachidonové a sekrece lysozomálních enzymů – elastáza, kolagenáza a hyaluronidáza makrofágy. (137, 111) 5.8.6 Stimulace trávení Koření je známé pro své povzbuzující účinky ohledně zažívací činnosti, používané v tradičním indickém systému léčitelství. Kurkumin, kapsaicin, zázvor, cibule, máta, kmín a fenykl stimulují tvorbu žlučových kyselin v játrech a jejich sekreci do žluče. U většiny těchto koření byla prokázána i stimulace pankreatických enzymů – lipáz, amyláz a proteáz. (137, 106) 5.8.7 Vliv na agregaci krevních destiček Vliv na agregaci krevních destiček by měly mít účinné látky kuminaldehyd, eugenol, a zingeron. Vodní extrakty z koriandru a kmínu prokázaly rovněž významný inhibiční účinek na agregaci trombocytů. (137) Česnek ve studii s laboratorními zvířaty ukázal, že brání jak tvorbě trombocytů, tak inhibuje agregaci, účinnou látkou v tomto případě by měl být ajoen. (95, 153) 5.8.8 Antihypertenzní účinek Mnohé studie u lidí ukazují smíšené a nejednoznačné výsledky antihypertenzního účinku česneku. U pokusů na zvířatech mají již pozitivnější charakter. Klinické studie z poslední doby tento účinek potvrzují. (113) Extrakt z česneku má účinek na produkci NO, kdy ve studii z roku 2009 byla prokázána aktivace synthasy oxidu dusnatého (NOS) v izolovaných krevních destičkách a v placentární tkáni in vitro. (132) Sloučeniny γ-glutamoylcysteiny inhibují ACE in vitro a přispívají tak pravděpodobně ke snížení krevního tlaku. Ve studii bylo potvrzeno, že vodný česnekový extrakt snížil sérovou aktivitu ACE u diabetických a nediabetických potkanů. (21, 55)
65
6 PRAKTICKÁ ČÁST 6.1 Cíl práce Cílem praktické části práce je zhodnotit výskyt termorezistentních mikroorganismů a xerofilních plísní u několika druhů koření zakoupených v obchodních řetězcích, srovnat s ostatními značkami koření a porovnat jej s dříve dosaženými výsledky. Dílčí cíle práce: 1. Posoudit riziko plynoucí z kontaminace koření celkovými počty mikroorganismů. 2. Posoudit riziko plynoucí z kontaminace koření plísněmi a kvasinkami. 3. Posoudit riziko plynoucí z kontaminace koření termorezistentními mikroorganismy. 4. Posoudit riziko plynoucí z kontaminace koření xerofilními plísněmi. 5. Vytvořit mikroskopické preparáty zachycených plísní. 6. Provést porovnání kontaminace mezi jednotlivými druhy koření. 7. Provést porovnání kontaminace mezi jednotlivými značkami koření. 8. Identifikovat jednotlivé druhy plísní kontaminující koření.
66
6.2 Hypotézy Hypotéza I
H0
Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření
Hypotéza II
H0
Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření
Hypotéza III
H0
Není rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření
Hypotéza IV
H0
Není rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření
Hypotéza V
H0
Není rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými druhy koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými druhy koření
Hypotéza VI
H0
Není rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými značkami koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými značkami koření
Hypotéza VII
H0
Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření
Hypotéza VIII
H0
Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření
HA
Je rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření
67
6.3. Materiál 6.2.1 Testované koření Vzorky sušeného koření byly zakoupeny v několika obchodních řetězcích v Brně v lednu 2012. Jednalo se o těchto 38 vzorků 7 různých značek:
Česnek Hřebíček Chilli Kmín Skořice Paprika Pepř Zázvor
Albert X X X X X X X
Avokádo Clever X
Fenix
X
X X X X
X
Kotány X X X
Tesco X
X X X X
X X X X X X X X Tab.10 Zastoupení vzorků koření jednotlivých druhů a značek
Vitana X X X X X X X X
Obr.2 Množství koření jednotlivých značek
Nejvíce druhů koření se podařilo zakoupit od značky Vitana (8 druhů), nejméně pak od značky Clever obchodního řetězce Billa. Z důvodu produkce odlišného sortimentu druhů koření od jednotlivých značek, nelze všechny druhy koření dostatečně srovnat mezi s sebou.
68
6.2.2 Půdy Rose Bengal Agar Base (RBAB) Výrobce:
HiMedia Laboratories
Složení (v 1000 ml připravené půdy): Sojový pepton
5,0 g
Dextróza
10,0 g
K3PO4
1,0 g
MgSO4
0,5 g
Bengálská červeň
0,05 g
Agar
15,0 g
Destilovaná voda pH 7,2 ± 0,2 Použití:
Rose Bengal Ager Base je určen pro kultivaci kvasinek a plísní.
Příprava:
31,55 g Rose Bengal Ager Base se rozpustí v 1000 ml destilované vody a
steriluje se v autoklávu při 121°C po dobu 15 minut. Zchladí se na 45°C a přidají se 4 ml chloramfenikolu. Plate count agar (PCA) Výrobce:
HiMedia Laboratories
Složení (v 1000 ml připravené půdy): Kaseinový pepton
5g
Kvasničný extrakt
2,5 g
Dextróza
1g
Agar
15 g
Destilovaná voda pH 7,0
0,2
Použití:
Pro stanovení celkového počtu mikroorganismů.
Příprava:
23,5g rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Sterilujeme v autoklávu při
teplotě 121°C 15 min. 69
Dichloran Glycerol Medium Base Výrobce:
HiMedia Laboratories
Složení dle obalu (v 1000 ml připravené půdy): Masový pepton
5g
Dextróza
10 g
K2HPO4
1g
MgSO4
0,5 g
Chloramfenikol
0,1 g
Dichloran
0,002 g
Agar
15 g
Destilovaná voda pH 5,6
0,2
Použití:
Dichloran Glycerol Medium Base je určen pro xerofilní plísně
Příprava:
15,8 g Dichloran Glycerol Medium Base se rozpustí v 500 ml destilované
vody, po rozmíchání se přidá 110 g glycerolu a sterilizuje v autoklávu teplotě 121°C po dobu 15 minut. Ve vychlazeném médiu se upraví pH na požadovanou hodnotu pomocí 0,1 M NaOH nebo 0,1 M HCl. 25 % Glycerol Nitrate Agar (G25N) Složení (v 1000 ml připravené půdy) dle Pitta (167) Czapek-Dox HiMedia
36,75 g
NaNO3
0,75g
Agar
0,75 g
Kvasničný extrakt
3,75 g
Glycerol
250 g
Destilovaná voda
750 g
Použití:
Pro pomocnou identifikaci plísní.
Příprava:
Odměřené množství se doplní vodou a glycerolem, rozmíchá se a sterilizuje
v autoklávu při 121° po dobu 15 minut. 70
Malt Extract Agar (MEA) Výrobce:
HiMedia Laboratories
Složení (v 1000 ml připravené půdy): Malt extract agar HiMedia
33,33g
Glukóza
20g
Agar
10g
Destilovaná voda Použití:
Pro pomocnou identifikaci plísní.
Příprava:
Odměřené množství jednotlivých složek se doplní destilovanou vodou na 1000
ml, rozmíchají se, nechají rozpustit a asterilizují v autoklávu při 121°po dobu 15 minut. Czapek Yeast Extract Agar dle Pitta (167) (CYA) Složení (v 1000 ml připravené půdy): Roztok stopových prvků: ZnSO4·7H2O
0,1 g
CuSO4·5H2O
0,05 g
Destilovaná voda
100 ml
Koncentrovaný Czapkův roztok: NaNO3
30,0 g
KCl
5,0 g
MgSO4·7H2O
5,0 g
FeSO4·7H2O
0,1 g
Destilovaná voda
100 ml
71
Samotná půda: KH2PO4
1,0 g
Koncentrovaný czapkův roztok
10 ml
Roztok stopových prvků
1 ml
Kvasničný extrakt
5,0 g
Sacharóza
30,0 g
Agar
15,0 g
pH 6,7 Použití:
Pro pomocnou identifikaci plísní.
Příprava:
Odměřené množství jednotlivých složek Czapek – Doxova agaru se
rozmíchá v 1000 ml destilované vody a steriluje v autoklávu při 121°C po dobu 15 minut. Bramboro-mrkvový agar Složení (v 1000ml připravené půdy) dle Fassatiové (42) Brambory
20 g
Mrkev
20 g
Agar
20 g
Destilovaná voda Použití:
Agar se použil pro konzervaci mikromycet
Příprava:
Nastrouhaná mrkev a nastrouhaná brambora se vaří v menším množství vody
15 minut. Přefiltrují se přes filtrační papír, přidá se agar a doplní se destilovanou vodou do 1000ml objemu. Sterilizuje se v autoklávu při teplotě 121° po dobu 15 minut. Sabouraudův agar (SAB) Výrobce:
HiMedia Laboratories
Složení: Pepton
10 g
Agar
20 g
Destilovaná voda
1000 ml
Použití:
Agar se použil pro konzervaci mikromycet
Příprava:
Jednotlivé složky se smíchají, doplní vodou a sterilizují v autoklávu pří teplotě
121°C po dobu 15 minut. 72
6.2.3 Další roztoky Methylenová modř Složení: Methylenová modř
0,3g
96% ethanol
30ml
Voda
100ml
Použití:
K mikroskopickému rozlišení sporulujících bakterií a kvasinek
Fyziologický roztok Složení (v 1000ml roztoku): NaCl
9g
Destilovaná voda Použití:
Jako ředící roztok
Doplníme destilovanou vodou na 1000 ml. Sterilizujeme v autoklávu při 121° 30 minut. Laktofenol (Ammanovo činidlo) Složení: Čistá krystalická kyselina karbolová (fenol)
20g
Kyselina mléčná
20g
Glycerol
40g
Destilovaná voda
20g
Použití:
K mikroskopické identifikaci mikromycet
Agarový gel Složení: Agar
0,15 g
Destilovaná voda
100 ml
Použití:
K přípravě očkovací suspenze. 73
6.2.4 Laboratorní vybavení Horkovzdušný sterilizátor, autokláv, přístroje na kultivaci (termostat), třepačka, plynový kahan, Petriho misky o průměru 90mm, pH indikátorové papírky (Phan), mikroskop, váha, digestoř, mikrobiologické kličky, hokejky, alobal, jehly, vatové zátky, laboratorní lžičky, stojan na zkumavky Laboratorní sklo:
mikrobiologické zkumavky opatřené zábrusovými uzávěry Erlenmayerovy baňky (1000 ml, 500ml, 250 ml) pipety (1ml, 2 ml, 10ml) kádinky (100ml) podložní sklíčka krycí sklíčka odměrný válec (500 ml, 100 ml)
6.2.5 Příprava laboratorního skla Laboratorní sklo bylo umýváno v myčce zn. Miele a následně sušené v sušárně při teplotě 100°C. Pro sterilizaci laboratorního skla byl použit horkovzdušný sterilizátor (160°C po dobu 1 hodiny). Pipety byly sterilizovány v kovových pouzdrech, kádinky a Erlenmayerovy baňky byly zakryty hliníkovou fólií.
74
6.3 Metodika Každý vzorek byl zpracován shodným postupem. Pro stanovení celkového počtu mikroorganismů, kvasinek a plísní bylo potřeba připravit řadu ředění, kde je předpokládán optimální výskyt mikroorganismů (10 -1 - 10-3). Z každého vzorku bylo asepticky odebrán 1g koření, toto množství bylo přidáno do erlenmayerovy baňky s 9 ml sterilního fyziologického roztoku. Po důkladné třepání (cca 20 min) na třepačce, bylo získáno 10 ml roztoku v koncentraci 10-1. Následně bylo vytvořeno, odběrem 1 ml z tohoto ředění do zkumavky s 9 ml sterilního fyziologického roztoku, ředění 10-2. Po důkladném protřepání byl opět odebrán 1 ml z ředění 10-2 a přenesen do další zkumavky s 9 ml sterilního fyziologického roztoku, tak aby bylo vytvořeno ředění 10 -3. 6.3.1 Stanovení celkového počtu mikroorganismů Pro toto stanovení byla použita ředění 10-1 a 10-2. Do jednotlivých misek bylo sterilní pipetou naočkováno po 1 ml příslušného ředění. Inokulum bylo přelito asi 20 ml kultivační půdy Plate Count Agar ochlazené na 45°C. Inokulum bylo v Petriho misce s půdou pečlivě promícháno a ve vodorovné poloze ponecháno zatuhnout. Poté byly plotny inkubovány dnem vzhůru v termostatu při teplotě 25°C po dobu 72 h ± 3 hod. Po určené době inkubace byly spočítány kolonie v každé misce, ve kterých nenarostlo více než 300 kolonií. Celkový počet mikroorganismů na ml nebo gram výrobku byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5. 6.3.2 Stanovení počtu kvasinek a plísní Pro toto stanovení byla použita ředění 10 -2 a 10-3. Do jednotlivých Petriho misek bylo sterilní pipetou naočkováno po 1 ml příslušného ředění. Inokulum bylo přelito 20 ml kultivační půdy (Rose Bengal Agar Base) ochlazené na 45°C. Inokulum bylo v misce s půdou pečlivě promícháno a směs nechána zatuhnout ve vodorovné poloze. Poté byly plotny obráceny dnem vzhůru a inkubovány v termostatu při teplotě 25°C po dobu 5 dnů. Po určené době inkubace byly spočítány kolonie v každé misce, kde nevyrostlo více než 150 kolonií. Celkový počet kvasinek a plísní na ml nebo gram výrobku byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5.
75
6.3.3 Průkaz termorezistentních mikroorganismů Průkaz termorezistentních plísní je založen na vysoké teplotě použitého agaru, který simuluje tepelnou úpravu potravin. Pro toto stanovení byl použit 1 g sterilně naváženého koření, který byl pečlivě promísen s čerstvě vyautoklávovaným horkým agarem Rose Bengal Agar base 100ml v Erlenmayerově baňce. Po zchladnutí na teplotu 45°C byla směs od jestlivých druhů koření přelita na tři Petriho misky a ponechána zatuhnout ve vodorovné poloze. Následně byly plotny obráceny dnem vzhůru a inkubovány v termostatu při teplotě 30°C po dobu až 30 dní. Během intubace byly postupně odečítány narostlé kolonie a odebírány vzorky plísní k dalšímu
postupu
identifikace
mikromycet.
Celkový
počet
termorezistentních
mikroorganismů na gram výrobku byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5. 6.3.4 Průkaz xerofilních plísní Pro toho stanovení bylo použito 0,3 g sterilně odváženého koření, které bylo po třetinách odsypáno na tři Petriho misky s již ztuhlým Dichloran Glycerol Medium Base agarem. Plotny byly následně intubovány v termostatu při teplotě 30°C po dobu 5 dní. Po určené době intubace byly spočítány kolonie v každé misce, ve které nevyrostlo více než 300 kolonií. Jejich celkový počet mikroorganismů na gram byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5. Po intubaci byly odebrány sterilní kličkou vzorky plísní k dalšímu postupu identifikace mikromycet.
76
6.3.5 Odečítání výsledků Kolonie byly počítány pouhým okem či pomocí lupy. Při stanovení mikroorganismů na selektivních půdách byly počítány všechny kolonie, které měly charakteristickou morfologii pro zjišťovanou skupinu mikroorganismů. Po stanovení počtu jednotlivých kolonií (KTJ) vyrostlých na Petriho miskách bylo množství mikroorganismů přepočteno na gram výrobku pomocí vzorce: a) Stanovení celkového počtu mikroorganismů b) Stanovení celkového počtu plísní a kvasinek
Kde
ΣC
je součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách
n1
je počet ploten používaných pro výpočet z prvního ředění
n2
je počet ploten používaných pro výpočet z druhého ředění
d
je faktor prvního ředění pro výpočet použitého ředění
c) Průkaz termorezistentních mikroorganismů
Kde
ΣC
je součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách
d) Průkaz xerofilních plísní
Kde
ΣC
je součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách
77
6.3.6 Mikroskopická diferenciace termorezistentních sporulujících bakterií a kvasinek K rozlišení sporulujících bakterií od kvasinek je nutno připravit barvené preparáty. Vhodná je methylenová modř. Ožehnutou a zchlazenou kličkou se odebrala část kultury z povrchu živné půdy a přenesla na podložní sklíčko s kapkou sterilního fyziologického roztoku. Sklíčko se suspenzí se opatrně fixuje pod kahanem. Poté se přidala kapka methylenové modři, nechala 3-5 min působit, pomocí střičky opatrně slila destilovanou vodou a nechala zaschnout. Pod mikroskopem se pozorováním zjišťovalo dle velikosti a tvaru buněk, zda se jedná o sporulující bakterie či kvasinky. 6.3.7 Identifikace mikromycet Identifikace se provedla v čistých kulturách termorezistentních a xerofilních plísní, které nám poskytla provedená izolace. Provádí se na několika různých půdách, protože různé půdy do značné míry mění charakteristické makroskopické i mikroskopické znaky mikromycet. K identifikaci se použilo schéma očkování dle Pitta. 6.3.7.1 Příprava očkovací suspenze: Sterilní kličkou se přenesly spory jak termorezistentních, tak xerofilních plísní do zkumavky s 0,5 ml sterilního agarového gelu. Následně byly kličkou v gelu rozmíchány. Operace byla provedena v digestoři za odtahu. 6.3.7.2 Očkování kmenů dle Pitta (167) Petriho misky byly označené písmeny A-F, kdy misky A, B a C byly misky zality Czapek Yeast Extract Agarem. Misky B a C se fixou rozdělily na dvě poloviny. Misky E byly zality Malt Extract Agarem a F misky 25% Glycerol Nitrate Agarem. Petriho misky F byly fixou také rozděleny na dvě poloviny. Preparační jehlou byly přeneseny spory plísní v následujícím schématu: Na misky A a E byly po třech vpiších přeneseny kmeny z očkovací suspenze prepační jehlou. Na zbývající misky B, C a F byly po dvou vpiších přeneseny dva kmeny (= 4 vpichy na jedné misce). Plotny se nechaly intubovat v termostatech po dobu 5 dnů. A, E a F misky při teplotách 25°C, B misky při teplotách 37°C a C misky při teplotě 5°C. Po určené době intubace byla provedena mikroskopická a makroskopická identifikace hub. 78
6.3.7.3 Mikroskopická identifikace mikromycet K určení mikroskopických morfologických znaků mikromycet je nutné připravit preparáty do kapaliny. Velmi vhodný je laktofenol. Ožehnutou a zchlazenou preparační jehlou se odebrala část mycelia s vyvinutými fruktifikačními orgány z povrchu živné půdy a byly přeneseny do kapky lakfofenolu na podložním sklíčku. Jednotlivá vlákna jsme se snažili druhou jehlou rozprostřít po povrchu sklíčka. Preparát byl překryt krycím sklíčkem a přebytečná tekutina se odsála filtračním papírem. Při mikroskopické identifikaci se zjišťovalo: Charakter mycelia (tloušťka vláken, barva a struktura mycelia, septy – jejich přítomnost a rozložení, způsob větvení Charakter a způsob tvoření a uspořádání fruktifikačních orgánů (sporangiofory, konidiofory, sporangia, kolumela, metuly, konidie, koremium, zygospory, askospory Přítomnost a charakter jiných útvarů (chlamydospory, sklerocium) Při této identifikaci se u většiny plísní zjistil rod. 6.3.7.4 Makroskopická identifikace mikromycet Makroskopické znaky se určovaly na Petriho miskách s vhodnou půdou. Byl použit Czapek – Doxův agar, Malt Extract agar a 25% Glycerol Nitrate Agar. Pomocí klíče a šesti misek od každé plísně jsme se pokusili dourčit kmen daného rodu. Při identifikaci se zjišťovalo: Rychlost růstu Charakter povrchu kolonií Barva mycelia Barva a vzhled rubu kolonií Barva difundující do půdy Přítomnost zvláštních útvarů Přítomnost a barva kapek transpirované kapaliny na vzdušném myceliu (167)
79
6.3.8 Konzervace mikromycet Konzervace mikromycet slouží k běžnému uchování kultur hub ve sbírce. Do sterilních zkumavek se šikmými agary (Sabouraudův konzervační agar, Bramboro-mrkvový agar) bylo pomocí sterilní očkovací kličky přenesen kmen plísně z očkovací suspenze. Zkumavka byla uzavřena vatovým tamponem a nechána v termostatu po dobu 5 dní při teplotě 30°C. Poté byla uchována týden v chladničce při teplotě 5°C a následně zalita parafínem nad horní hranicí agaru a opět vrácena do chladničky. V tomto stavu je možné uchovat mikromycety živé a nezměněné i několik let. (42)
6.4 Statistické zpracování Zjištěná data byla zpracována do tabulek a grafů pomocí programu Microsoft Excel 2007. Pro zjištění statistické významností byl použit program STASTISTICA, hodnocení neparametrickým testem Kruskal-Wallisova ANOVA a popisná statistika pomocí programu Microsoft Excel 2007.
80
6.5 Výsledky 6.5.1 Hodnocení celkového počtu mikroorganismů Při stanovení celkového počtu mikroorganismů bylo postupováno dle metodiky popsané v kapitole 6.3.1 a počet mikroorganismů na gram výrobku byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5. Výsledky kontaminace jednotlivých potravin jsou shrnuty v tabulce č.11. Koření
Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček
Celkový počet mikroorganismů v KTJ.g-1 koření Albert P P 5,5.101 P P 6,1.102 2,8.102
Tesco
Vitana Billa Kotány 2 2,3.10 P 1,8.101 <10 4,5.101 3,1.102 <10 <10 1,7.103 1,1.103 4,9.102 6,3.101 1,8.101 1,2.102 9.101 2,7.101 4,5.101 7,3.101 2,5.102 3,2.102 2,8.103 Tab.11 Celkové počty mikroorganismů
(Pozn. P = přerostlé kolonie, nepočitatelné) Obr.3 Celkové počty mikroorganismů
(Pozn. nejsou zaneseny hodnoty „P“ (nepočitatelné))
81
Fenix
Avokádo
2,7.103 3,4.102
1,8.101 1,4.102 4,9.102 1,3.103 2,1.103
1,9.102 2,5.102
Nejvíce kontaminové koření bylo Hřebíček od zn. Vitana, který obsahoval 2,8.103 mikroorganismů. Řádově stejně na tom byl kmín od zn. Avokádo, paprika od zn. Kotány, zázvor od zn. Avokádo a česnek od zn. Tesco. Naopak nejméně kontaminované koření bylo pepř a paprika od zn. Clever. Chilli, pepř, česnek a kmín od zn. Albert a pepř od zn. Tesco nám přerostlo, tudíž nebylo možné odečíst výsledky. Obr.4 Četnost koření kontaminovaných celkovými počty mikroorganismů rozdělených jednotlivých skupin dle počtu mikroorganismu
Nejvíce koření obsahuje 1.10-2 – 5.10-2 mikroorganismů. Řádově nejvíce koření obsahuje 10-2 mikroorganismů.
82
6.5.2 Hodnocení počtu kvasinek a plísní Při stanovení počtu kvasinek a plísní bylo postupováno dle metodiky popsané v kapitole 6.3.2 a počet mikroorganismů na gram výrobku byl přepočten dle vzorce uvedeného v kapitole 6.3.5. Výsledky kontaminace jednotlivých potravin jsou shrnuty v tabulce č.12 . Koření Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček
Celkový počet plísní a kvasinek v KTJ.g-1 koření Albert Tesco Vitana Clever Kotány 3 <10 2,3.10 3 3 3,2.10 8,6.10 <10 <10 <10 2 2 <10 4,5.10 2,7.10 <10 8,2.102 5,4.103 5,6.103 9,1.102 <10 <10 4,0.103 1,0.104 <10 1,4.103 3,6.102 1,4.103 6,4.102 1,9.103 <10 <10 <10 Tab.12 Celkové počty plísní a kvasinek Obr.5 Celkové počty plísní a kvasinek
83
Fenix
Avokádo
<10 <10
<10 9,1.101 <10 <10 7,3.102
1,6.103 1,4.103
Jako nejvíce kontaminovaná se nám jevila skořice od zn. Tesco, kmín od zn. Fenix a Kotány a skořice od zn. Fenix, nejméně pak pepř od zn. Vitana, Clever, Kotány, Fenix a Avokádo, paprika od zn. Clever a Fenix, chilli od zn. Albert, česnek od zn. Kotány a Avokádo, kmín od zn. Tesco, skořice od zn. Vitana a hřebíček od zn. Albert a Vitana. Obr.6 Četnost koření kontaminovaných plísněmi a kvasinkami rozdělených do jednotlivých skupin dle počtu mikroorganismu
Nejvíce vzorků koření bylo kontaminováno <10 KTJ/g. Osm vzorků koření pak bylo kontaminováno v rozmezí 1.103 – 5.103 plísní a kvasinek.
84
6.5.3 Hodnocení průkazu termorezistentních mikroorganismů Při hodnocení bylopostupováno dle metodiky popsané v kap. 6.3.3. Přistanovení KTJ/g byl použit vzorec uvedený v kapitole 6.3.5. Výsledky průkazu termorezistentích mikroorganismů jsou uvedeny v tabulce č.13. Koření Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček
Průkaz termorezistentních plísní v KTJ.g-1 koření Albert Tesco Vitana Clever Kotány Fenix 164 29 156 182 133 0 0 0 2 38 114 P 29 9 2 0 1 0 0 1 12 1 0 5 4 3 0 0 0 0 0 4 Tab. 13 Průkaz termorezistentních mikroorganismů v KTJ/g koření
(Pozn. P = přerostlé kolonie, nepočitatelné) Obr.7 Průkaz termorezistentních mikroorganismů v KTJ/g koření
(Pozn. nejsou zaneseny hodnoty „P“ (nepočitatelné))
85
Avokádo 0 7 2 3 11 0
Jako nejvíce kontaminoné koření termorezistentními mikroorganismi se nám jevil pepř od zn.Tesco, kde nám na třech Petriho miskách narostlo dohromady 182 kolonií plísní, kvasinek a sporulujích mikroorganismů. Podobně na to bylo i chilli a pepř od zn.Albert a pepř a paprika od zn.Vitana. Naopak na Petriho miskách se skořící od všech pěti obchodních značek nenarostlo nic. Paprika od zn.Clever nám na dvou Petriho miskách přerostla, tudíž nebylo možné spočítat KTJ/g koření. Obr.8 Četnost koření kontaminovaných termorezistentními mikroorganismy rozdělených do jednotlivých skupin dle počtu mikroorganismu
Nejvíce vzorků bylo kontaminováno do 10 KTJ/g s malým či žádným nárustem. Jeden vzorek byl přerostlý a tři vzorky byly spočítány s více než 150 KTJ/g.
86
6.5.4 Hodnocení průkazu xerofilních plísní Při hodnocení bylopostupováno dle metodiky popsané v kap. 6.3.4. Přistanovení KTJ/g byl použit vzorec uvedený v kapitole 6.3.5. Výsledky průkazu xerofilních plísní jsou uvedeny v tabulce č.14. Koření Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček
Průkaz xerofilních plísní v KTJ.g-1 koření Albert Tesco Vitana Clever Kotány 33 3 P P P 0 40 0 0 180 0 37 7 0 0 0 0 37 283 43 0 107 4 13 20 0 0 0 Tab.14 Průkaz xerofilních plísní
(Pozn. P = přerostlé kolonie, nepočitatelné) Obr.9 Průkaz xerofilních plísní
(Pozn. nejsou zaneseny hodnoty „P“ (nepočitatelné))
87
Fenix
Avokádo
0 0
0 0 0 0 83
133 0
Nejvíce xerofilních plísní narostlo u kmínu od zn. Albert 283KTJ/g. Paprika od zn.Vitana, Kmín od zn. Fenix a Clever na tom byly podobně. Pepř od zn. Albert, Tesco a Vitana nám přerostl a nebylo možné spočítat KTJ/g. Bez nárůstu byly vzorky pepře od zn. Clever, Fenix, Avokádo, paprika od zn. Albert, Tesco,Clever, Fenix, Avokádo, česnek od zn. Tesco, Vitana, Kotány, Avokádo, zázvor od zn. Vitana a Avokádo, kmín od zn. Vitana, skořice od stejné značky a hřebíček od zn. Albert a Vitana. Obr.10 Četnost koření kontaminovaných xerofilními plísněmi rozdělených do jednotlivých skupin dle počtu mikroorganismu
Nejvíce vzorků koření nebylo kontaminováno vůbec xerofilními plísněmi nebo narostlo v minimálním počtu <10 KTJ/g. Přerostlé byly tři vzorky pepře.
88
6.5.5 Hodnocení diferenciace termorezistentních sporulujících bakterií a kvasinek Při hodnocení bylo postupováno dle metodiky v kap. 6.3.6. Jednalo se o celkem 19 vzorků koření s nárůsty, které bylo potřeba rozlišit. Pod mikroskopem se ukázalo, že se nejedná o kvasinky, ale o objekty velikostí a tvarem odpovídající sporulujícím bakteriím. Ty se nacházely v následujících druzích koření: Koření Značka Albert, Fénix, Tesco, Avokádo, Kotány, Vitana Paprika Albert, Vitana Chilli Albert, Tesco Pepř Tesco, Vitana Česnek Albert, Fénix, Tesco, Kotány, Billa Kmín Avokádo Zázvor Vitana Hřebíček Tab.15 Přehled kontaminovaných vzorků koření sporulujícími bakteriemi Obr.11 Procentuální zastoupení sporulátů u jednotlivých značek koření
%
Obr.12 Procentuální zastoupení sporulátů u jednotlivých druhů koření
%
89
Procentuálně nejvíce sporulujících bakterií se vyskytlo u značky Tesco s 80% výskytem. Naopak nejmenší výskyt byl u značky Kotány a Clever, kde bylo takto kontaminováno 33% vzorků. Co se týče druhů koření, tak nejvíce kontaminována byla paprika v 85,7%, nejméně zázvor a pepř ve 33,3% a 28,6%. 6.5.6 Výskyt termorezistentních plísní Při průkazu termorezistentních mikroorganismů krom sporulujících bakterií vyrostlo na petriho miskách i několik málo plísní. Kontaminová byl kmín od zn. Clever dvěma druhy plísní. Při mikroskopické identifikaci se zjistilo, že se jedná o askosporu Sordaria fimicola (Hnojenka výkalová). Druhou plísní byl s velkou opatrností stanoven Aspergillus fumigatus. Nárůst byl i u pepře od zn. Tesco, kde byla pod mikroskopem nalezena masa plodniček, blíže se je nepodařilo určit. U vzorku kmínu od zn. Kotány byl nárůst mucorovité plísně, blíže neurčené. Obr.13 Celkový pohled na askospory plísně Sordaria fimicola
90
6.5.7 Výskyt xerofilních plísní Při průkazu xerofilních plísní byly nárůsty u těchto 16 vzorků koření. Koření Paprika Chilli Pepř Česnek Kmín Zázvor Hřebíček
Značka Kotány, Vitana Vitana, Albert Kotány, Vitana, Albert, Tesco Albert Kotány, Albert, Tesco, Clever, Fénix, Avokádo Kotány Tab.16 Výskyt xerofilní plísní
Obr.14 Procentuální zastoupení kontaminace xerofilními plísněmi u jednotlivých značek koření
Obr.15 Procentuální zastoupení kontaminace xerofilními plísněmi u jednotlivých druhů koření
91
Procentuálně nejvíce kontaminovaná xerofilními plísněmi byla značka koření Kotány ze 66,7%, nejméně avokádo z 20% u kterého byl kontaminován pouze jeden vzorek z pěti. Nejvíce kontaminovaný druh koření byl kmín z 85,7%, nejméně pak hřebíček, kdy u žádné ze dvou vzorků nebyl nárůst xerofilních plísní. Pokusili jsme se identifikovat druhy xerofilních plísní pomocí mikro a makroskopických znaků. Z 26 vzorků plísní se určovalo 17 díky sekundární kontaminaci vzorků a přirozených ztrát při selektivním očkování. Spíše pro zajímavost následující tabulka ukazuje přehled druhů a rodů nalezených xerofilních plísní. Výsledky je však potřeba brát s velkou rezervou. Koření Paprika Paprika Paprika Paprika Pepř Pepř Pepř Pepř Pepř Zázvor Kmín Kmín Kmín Kmín Skořice Skořice Chilli
Značka Xerofilní plíseň Vitana Aspergillus flavus Vitana Aspergillus parasiticus Vitana Mucorovitá plíseň Kotány Mucorovitá plíseň Tesco Aspergillus flavus Albert Aspergillus flavus Tesco Aspergillus parasiticus Albert Aspergillus niger Kotány Aspergillus penicillioides Kotány Aspergillus penicillioides Avokádo Mucorovitá plíseň Albert Mucorovitá plíseň Fénix čeleď Dematiaceae Avokádo čeleď Dematiaceae Tesco Mucorovitá plíseň Albert Mucorovitá plíseň Albert Mucorovitá plíseň Tab.17 Identifikace xerofilních plísní
92
6.6 Ověřování hypotéz Vzhledem k nepřítomnosti normality rozdělení výsledků, se pro ověřování všech hypotéz použil neparametrický test Kruskal-Wallisova ANOVA. 6.6.1 Hypotéza 1 H0 Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. HA Je rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. Pravděpodobnost Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček X Chilli 1 1 1 1 1 1 1 X Pepř 0,25 0,26 0,37 0,15 1 1 X Paprika 0,32 0,37 0,26 1 1 X Česnek 0,37 1 1 1 X Zázvor 1 1 1 X Kmín 1 1 X Skořice 1 X Hřebíček Tab.19. Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými druhy koření
Nulovou hypotézu nelze zamítnout na hladině významnosti α=5% (p>0,05). Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření.
6.6.2 Hypotéza 2 H0 Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. HA Je rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření.
93
Pravděpodobnost Albert Tesco Vitana Clever Kotány Fenix Avokádo X Albert 0,26 1 0,48 0,19 1 0,14 X Tesco 1 0,48 0,19 1 0,15 X Vitana 1 0,14 1 0,47 X Clever 1 1 1 X Kotány 1 0,15 X Fenix 1 X Avokádo Tab.20 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými značkami koření Nulovou hypotézu nelze zamítnout na hladině významnosti α=5% (p>0,05). Není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. 6.6.3 Hypotéza 3 H0 Není rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření. HA Je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření. Pravděpodobnost Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček X Chilli 1 1 1 1 1 1 1 X Pepř 0,20 1 1 0,36 1 1 X Paprika 0,15 1 0,14 0,61 1 X Česnek 0,16 0,32 0,26 1 X Zázvor 1 0,37 1 X Kmín 0,22 1 X Skořice 1 X Hřebíček Tab.21 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými druhy koření Nulovou hypotézu nelze zamítnout na hladině významnosti α=5% (p>0,05). Není rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření.
94
6.6.4 Hypotéza 4 H0 Není rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření HA Je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření Pravděpodobnost Albert Tesco Vitana Clever Kotány Fenix Avokádo X Albert 0,40 0,03 1 0,17 0,25 0,08 X Tesco 0,08 0,08 0,29 0,04 0,08 X Vitana 1 0,17 1 0,08 X Clever 0,39 0,08 1 X Kotány 0,04 0,08 X Fenix 0,51 X Avokádo Tab.22 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými značkami koření Nulová hypotéza byla zamítnuta na hladině významnosti α=5% (p<0,05) ve prostěch hypotézy alternativní. Je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření 6.6.5 Hypotéza 5 H0 Není rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. HA Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. Pravděpodobnost Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček X Chilli 1 1 1 1 1 1 1 X Pepř 0,08 0,41 1 0,40 0,04 1 X Paprika 0,41 1 0,49 0,04 1 X Česnek 0,48 0,22 0,41 1 X Zázvor 0,16 1 1 X Kmín 0,62 1 X Skořice 1 X Hřebíček Tab.23 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými druhy koření
95
Nulová hypotéza byla zamítnuta na hladině významnosti α=0,05 ve prospěch hypotézy alternativní. Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření 6.6.6 Hypotéza 6 H0 Není rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. HA Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. Pravděpodobnost Albert Tesco Vitana Clever Kotány Fenix Avokádo X Albert 0,14 1 0,16 0,62 0,08 0,04 X Tesco 1 0,16 0,54 0,04 0,07 X Vitana 1 1 0,32 0,11 X Clever 0,16 0,16 0,16 X Kotány 0,08 0,26 X Fenix 0,08 X Avokádo Tab.24 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými značkami koření Nulová hypotéza byla zamítnuta na hladině významnosti α=5% (p<0,05) ve prostěch hypotézy alternativní. Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými značkami koření.
96
6.6.7 Hypotéza 7 H0 Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření HA Je rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření Pravděpodobnost Chilli Pepř Paprika Česnek Zázvor Kmín Skořice Hřebíček X Chilli 1 1 1 1 1 1 ? X Pepř 0,25 0,11 1 0,25 0,32 1 X Paprika 1 1 0,17 1 1 X Česnek 1 1 1 1 X Zázvor 1 0,16 1 X Kmín 0,32 1 X Skořice 1 X Hřebíček Tab.25 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými druhy koření Nulovou hypotézu nelze zamítnout na hladině významnosti α=5% (p>0,05). Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření. 6.6.8 Hypotéza 8 H0 Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření. HA Je rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření. Pravděpodobnost Albert Tesco Vitana Clever Kotány Fenix Avokádo X Albert 0,14 1 0,16 0,22 0,32 0,41 X Tesco 1 0,16 0,26 0,32 0,14 X Vitana 1 1 1 1 X Clever 0,48 1 1 X Kotány 1 0,62 X Fenix 1 X Avokádo Tab.26 Hypotéza : rozdíl v kontaminaci mezi jednotlivými značkami koření Nulovou hypotézu nelze zamítnout na hladině významnosti α=5% (p>0,05). Není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření.
97
7 DISKUZE Koření a bylinky jsou oceňovány pro svoji charakteristickou chuť, barvu a vůni a patří mezi nejvíce univerzální a široce užívanou přísadu do potravin po celém světě. Podobně jako ostatní zemědělské produkty i koření a bylinky mohou být vystaveny celé řadě mikrobiální kontaminace před/po sklizni. (117) Spotřeba koření v České republice neroste již tolik jako po otevření trhu v devadesátých letech, vysoký zájem však stále přetrvává. Trendem je přechod z jednodruhových výrobků ke směsím a hotovým polotovarům. V koření je možné pozorovat velké rozdíly v jakosti a zdravotní nezávadnosti. Kvalita koření je dána několika základními parametry: čistotou (ČSN ISO 927), vlhkostí, stanovením celkového popela (ISO 928), popela nerozpustného v HCl (ISO 930), stanovení obsahu těkavých olejů (ISO 6571), mikrobiologickou čistotou, obsahem reziduí pesticidů, obsahem mykotoxinů, obsahem těžkých kovů, specifickou hmotností a velikostí částic (ISO 3588). Přitom dle odborníků největší alimentární rizika souvisejí právě s kontaminací mikrobiální. (70) Tato práce nazvaná Mikrobiální obraz koření se zabývá mikrobiální kontaminací několika druhů koření běžně dostupném na českém trhu ve většině obchodních řetězců. Koření bylo vybíráno dle dotazníku sesbíraného na podzim roku 2011. Dotazníku se zúčastnilo 124 respondentů, především studentů LF MU a měl za úkol zjistit, které druhy koření se běžně používají ke konci kulinární úpravy. Dle výsledků jsem vybrala těchto osm druhů: černý pepř, chilli, sladká paprika, granulovaný česnek, zázvor, kmín, hřebíček a mletá skořice. Koření bylo zakoupeno v brněnských supermarketech, ale původ jednotlivých druhů je v různých částech světa. Při zjišťování kontaminace jsem využila plotnové metody stanovení mikroorganismů. Zaměřila jsem se na záchyt termorezistentních mikroorganismů a xerofilních plísní. Záchyt termorezistentů byl prováděn takovým způsobem, aby detekoval možnost přežití spor koření používaného před koncem tepelné úpravy. Při hodnocení celkového počtu mikroorganismů byl největší nárůst u hřebíčku od zn. Vitana, kmínu od zn. Avokádo a papriky od zn. Kotány. Nejméně kontaminovaný kořením byl černý pepř a paprika od zn.Clever. Nejvyšší počet mikroorganismů byl stanoven na 2,8.103KTJ/g, 5 vzorků nám přerostlo. Ve srovnání se zahraničními studiemi je výskyt CPM velmi nízký, některé studie uvádí výskyt až 108 KTJ/g v nezávislosti na zemi původu.. Vzhledem k malému nárůstu je jednou z příčin i použití malé škály desítkového ředění. Patogenní bakterie jsem v práci nestanovovala, ale dle zahraničních studií je poměrně častý 98
výskyt rodu Bacillus spp., Clostridium spp, především Clostridium perfringens a bakterie z čeledi Enterobacteriaceae (objevuje se E.coli, Salmonella, Klebsiella pneumonia, Shigella). Ze zahraničních studií vychází jako nejvíce kontaminované koření černý a bílý pepř, kmín, paprika, koriandr, zázvor a kurkuma. Naopak hřebíček byl zkoumán pouze v jedné práci a tam celkové množství mikroorganismů vyšlo velmi nízké ve srovnání s ostatními. (77) U hodnocení počtu plísní a kvasinek bylo použit agar Rose Bengal Agar Base. Přítomnost bengálské červeně působí selektivně, potlačuje růst bakterií a omezuje výšku a velikost kolonií. Nejvíce nárůstu bylo na plotně se skořicí od zn. Tesco, kmínu a skořicí od zn. Fenix a kmínu od Kotány. Bez nárůstů byla většina vzorků pepře, dva vzorky česneku, zázvoru a hřebíčku a po jednom vzorku chilli a skořice. Nejvyšší počet plísní a kvasinek byl 1,9.103 KTJ/g, průměrné množství však bylo nižší, než publikují zahraniční studie (v průměru 10 3-104 KTJ/g). Což může být zapříčiněno opět malou škálou použitého desítkového ředění. Při průkazu termorezistentních mikroorganismů byl největší nárůst u pepře od zn. Albert, kde na třech miskách dohromady narostlo 188 kolonií plísní, kvasinek a sporulujících bakterií. Hodně kontaminovaný byl pepř od zn.Tesco a Vitana, chilli od zn. Albert a paprika od zn. Vitana. Plotny s paprikou od zn. Clever přerostly.
Na druhou stranu na Petriho
miskách se skořící od všech pěti obchodních značek nenarostlo nic. Nejvíce vzorků bylo kontaminováno do 10 KTJ/g s malým či vůbec žádným nárůstem. Termorezistentní mikroorganismy byly následně rozděleny na plísně a objekty dle velikosti a tvarem odpovídající sporulujícím bakteriím. Procentuálně nejvíce sporulujících bakterií bylo nalezeno u zn. Tesco a Albert, nejméně pak u zn. Kotány a Clever. Co se týče druhů koření, tak nejvíce kontaminovaná byla paprika a kmín, nejméně pak zázvor a pepř. Kromě sporulujících bakterií vyrostlo na Petriho miskách i několik málo plísní. Zejména na Petriho misce s kmínem od zn. Clever se nám podařilo zachytit askospory plísně Sordaria fimicola (Hnojenka výkalová) s jejíž identifikací nám pomohla RNDr. Kubátová, CSs. z Karlovy univerzity. Jedná se o poměrně rychle rostoucí plíseň, kdy perithecia se tvoří asi za 7-10 dní. Patří mezi běžné koprofilní houby, ale dá se izolovat i z půdy. Hnojenka není v dostupné literatuře uváděna jako klasický termorezistent, ale teplotní optimum pro růst na agaru má 30-35°C (Domsch et al.2007), což je o 10°C více než u jiných plísní. Nepřežije zahřívání na 45°C po dobu 24 hodin. Askospory jsou ale zcela jistě schopné přežít krátkodobě vyšší teploty (houba je známá např. i ze Sonorské pouště).
99
Další termorezistentní plísní, která vyrostla u stejného koření, byl Aspergillus fumigatus, jejíž identifikace ale nebyla ověřena od vědeckého pracoviště. A. fumigatus je schopen přežít 80 °C teploty po dobu 60 minut, jak dokázala Piecková a Jesenská (63), mezi termorezistenty se však neřadí. Nárůst byl i u pepře od zn. Tesco, kde byla pod mikroskopem nalezena masa plodniček, blíže se je však nepodařilo určit. U vzorku kmínu od zn. Kotány byl nárůst mukorovité plísně, což může značit kontaminaci z prostředí. U hodnocení průkazu xerofilních plísní byl použit agar Dichloran Glycerol Medium Base. Kdy vysoký přídavek glycerolu zajišťuje osmofilnost média snížením vodní aktivity, dichloran působí na selekci konkurující mikroflóry (kvasinky) a velikosti kolonií, chloramfenikol zabraňuje růstu bakterií přítomných v okolním prostředí a chlortetracyklin je širokospektrální antibiotikum bránící růstu gram negativních bakterií. Nejvíce xerofilních plísní narostlo u kmínu od zn. Albert, papriky od zn. Vitana, kmínu od zn. Fenix a Clever. Přerostlé kolonie, mucorovité plísně, byly u vzorků pepře od zn. Albert, Tesco a Vitana. Bez nárůstu bylo poměrně hodně vzorků a to 3 vzorky pepře, 5 vzorků papriky, 4 vzorky česneku, 2 vzorky zázvoru, po jednom vzorku kmínu, hřebíčku a skořice. Malý nárůst plísní u česneku, skořice a hřebíčku by mohl být způsoben i jejich antimikrobiální aktivitou (118, 147, 153). Celkově nejvíce vzorků nebylo vůbec kontaminováno xerofilními plísněmi nebo množství narostlých kolonií bylo velmi malé <10 KTJ/g. Nárůsty xerofilních plísní byly u celkem 16 vzorků. Po selektivním přeočkování a přirozené ztrátě u očkování se nám podařilo zachytit 17 čistých kmenů, které jsme se pokusili identifikovat dle jejich mikroskopického obrazu a posléze dourčit pomocí klíče. Velmi často se vyskytovaly plísně z rodu Aspergillus a to hlavně A.flavus, A.parasiticus, ale i A.niger a A.penicillioides. Častý výskyt plísní A.flavus a A.parasiticus sice dle zahraničních studií není překvapující, ale ani šťastný, vzhledem k jejich možnosti produkovat aflatoxiny, včetně velmi toxického aflatoxinu B1. (27, 109) Rod Aspergillus patří mezi skladištní plísně a ty snáší obecně lépe nižší vlhkost prostředí než plísně polní. Minimální aktivita vody plísně A.flavus je 0,78. (11, 109) Dalšími častě vyskytujícími byly mucorovité plísně, které se nám nepodařilo blíže určit. Dva nárůsty u kmínu od zn. Fénix a Avokádo byly čeledi Dematiaceae, kam se řadí například plíseň Alternaria, která snáší stejně jako rod Aspergillus velmi nízkou vodní aktivitu.(11) Pro zjištění zda koření splňuje mikrobiologické požadavky dané legislativou, byla použita vyhláška 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny. Při porovnání 100
výsledku mého šetření s normami, žádné koření nepřekračuje legislativní mikrobiologické limity. Při ověřování hypotéz jsem použila neparametrický test Kruskal-Wallisova ANOVA založeném na pořadí, vzhledem k nepřítomnosti normality rozložení výsledků. U ověřování první hypotézy nebyla u žádného porovnání nezávislých vzorků přítomna pravděpodobnost <0,05. Nulovou hypotézu tedy nelze zamítnout na hladině významnosti α=5 % a mohu tak říci, že není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. Největší rozdíl byl mezi kontaminací kmínu a pepře (p=0,15), výsledek však není statisticky významný. Podobný výsledek byl i u druhé hypotézy, která zjišťovala rozdíl v kontaminaci celkového počtu mezi jednotlivými značkami koření. Největší diference p= 0,14 vyšla mezi kontaminací u zn. Kotány a Vitana a u zn. Albert a Avokádo. Výsledek není statisticky významný, tudíž nulovou hypotézu opět nelze zamítnou na hladině významnosti α=5 % a lze říci, že není rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. Výsledky třetí hypotézy opět vyšly velmi podobně. Největší rozdíl v kontaminaci plísněmi a kvasinkami byl mezi paprikou a kmínem p=0,14, výsledek však není statisticky významný, proto mohu tvrdit, že nulovou hypotézu nelze zamítnout a nepotvrdil se nám rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými druhy koření. Při ověření čtvrté hypotézy byly výsledky rozporuplnější. Pravděpodobnost rozdílu mezi zn. Fenix a Tesco byla 0,04, stejně tak mezi zn. Fenix a Kotány. Mezi zn. Vitana a Albert byla pravděpodobnost dokonce 0,03. Tyto výsledky jsou statisticky významné, a proto byla na hladině významnosti α=5 % nulová hypotéza zamítnuta ve prospěch hypotézy alternativní. Mohu tedy říci, že je rozdíl v kontaminaci plísní a kvasinek mezi jednotlivými značkami koření. Rozdíly by mohli být dány i ošetřením koření při balení, např. ozářením. Na žádném sáčku však nebyla uvedena informace o ošetřování potraviny ionizací. Pátá hypotéza ověřuje kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření. Statisticky významný je rozdíl v kontaminaci mezi skořicí a pepřem, skořicí a paprikou, tj. p=0,04. Nulovou hypotézu proto zamítáme ve prospěch hypotézy alternativní. Je rozdíl v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření. Což může být dáno opět antimikrobiální aktivitou skořicovým aldehydem (118), ale svůj podíl má určitě sušení, skladování a distribuce. Při zjišťování rozdílů mezi jednotlivými značkami koření v kontaminaci termorezistentních mikroorganismů byla největší diference u zn. Avokádo a Albert, p=0,04, což je statisticky 101
významná hodnota a můžeme tak potvrdit alternativní hypotézu a říci, že je rozdíl v kontaminaci termorezistentních plísní mezi jednotlivými značkami koření. U xerofilních plísní byla diference v kontaminaci mezi druhy koření statisticky nevýznamná, největší rozdíl byl mezi česnekem a pepřem, kdy česnek neměl žádné nárůsty a pepř ve třech vzorcích přerostl, u jednoho vzorku vyrostlo 40 KTJ/g a další tří byli bez nárůstu. Pravděpodobnost rozdílu byla pouze 0,11, proto nulovou hypotézu nebylo možno zamítnout a není tak rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření. Podobné výsledky byly i u ověřování hypotézy v rozdílu kontaminace xerofilními plísněmi mezi jednotlivými značkami koření. Největší rozdíl byl mezi zn. Albert a Tesco a zn. Avokádo a Tesco, kdy p=0,14, což je statisticky nevýznamná hodnota a proto nulovou hypotézu nezamítáme a je možno říci, že není rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření. Výsledky hypotéz však mohou být zavádějící, neboť je problémem neexistující kombinace výrobce a koření. Nepodařilo se totiž sehnat stejné množství druhů koření od všech značek. Dalším problémem mohou být i přerostlé vzorky koření, kdy i dvě různě přerostlé vzorky se nemohou brát jako ekvivalentní a proto s nimi lze nakládat jako se ztracenou informací. Přes tyto problémy nelze vytvořit jednoznačný názor, k tomu by byla potřeba otestovat větší množství jednotlivých druhů a větší množství obchodních značek koření.
102
8 ZÁVĚR Bylo testováno 38 potravin, 8 druhů koření a 7 značek. Všech 8 vzorků bylo zastoupeno pouze u značky Vitana, u dalších obchodních značek byl menší sortiment koření. Vzorky byly hodnoceny na celkové počty mikroorganismů, kvasinka a plísně, termorezistentní mikroorganismy a xerofilní plísně. Z výsledků vyplývá:
Při ověřování všech hypotéz byl použit test Kruskal-Wallisova ANOVA. Rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými druhy koření nebyl statisticky významný. Největší rozdíl byl v kontaminaci mezi kmínem a pepřem.
Rozdíl v kontaminaci celkového počtu mikroorganismů mezi jednotlivými značkami koření nebyl statistiky významný.
Rozdíl v kontaminaci plísněmi a kvasinkami mezi jednotlivými druhy koření nebyl statisticky významný. Největší rozdíl byl mezi paprikou a kmínem, p=0,14.
Rozdíl v kontaminaci plísněmi a kvasinkami mezi jednotlivými značkami koření byl statisticky významný. Pravděpodobnost rozdílu mezi zn. Fenix a Tesco, zn. Fenix a Kotány byla p=0,04, mezi zn. Vitana a Albert p=0,03.
Rozdíl v kontaminaci termorezistentními mikroorganismy mezi jednotlivými druhy koření byl statisticky významný, vzhledem ke skutečnosti, že pravděpodobnost rozdílu mezi skořící a pepřem a skořící a paprikou byla 0,04.
Rozdíl v kontaminaci termorezistentními mikroorganismy mezi jednotlivými značkami koření byl statisticky významný. Největší diference v kontaminaci byla mezi zn. Avokádo a Albert. Pravděpodobnost rozdílu byla p=0,04.
Rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými druhy koření byl statisticky nevýznamný. Největší rozdíl byl mezi česnekem, kdy česnek neměl žádné nárůsty a pepřem. Pravděpodobnost rozdílu byla 0,11.
Rozdíl v kontaminaci xerofilních plísní mezi jednotlivými značkami koření byl statisticky rovněž nevýznamný.
Mezi nejvíce kontaminované vzorky celkovými počty mikroorganismů patřil hřebíček od zn. Vitana, kmín od zn. Avokádo a paprika od zn. Kotány. Nejméně pak černý pepř a paprika od zn. Clever. 103
Plísněmi a kvasinkami byly nejvíce kontaminovány vzorky skořice od zn. Tesco a Fenix a kmínu od zn. Fenix a Kotány.
Termorezistentní mikroorganismy narostly nejvíce u vzorků pepře od zn. Albert
Nejvíce xerofilních plísní narostlo u vzorků kmínu od zn. Albert, Fenix a Clever paprice od zn. Vitana.
Ze zachycených termorezistentních plísní jsme identifikovali plíseň Sordaria fimicola a Aspergillus fumigatus.
Mezi xerofilními plísněmi byl vysoký záchyt rodu Aspergillus, mucorovitých plísní a plísní z čeledi Dematiaceae.
104
SOUHRN Pěstování koření má velmi starou tradici, kdy první záznamy o použití koření a bylin se dochovaly z doby Sumerské říše (3000 př. n. l.). Koření je používáno jak v potravinářství, tak v kosmetice, v parfumerii a farmacii. V současné době, kdy se čím dál více lidí snaží zlepšit svůj životní styl, je vhodné snížit používání soli a tuků na nezbytné minimum. Jelikož je tuk „nositelem“ chuti a sůl rovněž zlepšuje senzorické vlastnosti pokrmů, často je pro zpříjemnění chuti pokrmů využíváno právě koření. Do potravin se koření přidává v malých dávkách, ale přesto může být příčinou značné mikrobiální kontaminace. Na rozsah kontaminace má velký vliv místo a doba sklizně, sušení a veškerá následná manipulace až po mletí, balení a skladování. Zpracování koření často probíhá v subtropických a tropických oblastech, kde je nízká hygienická úroveň. Počty všech mikroorganismů v koření se pohybují od 10 KTJ/g až do 108 KTJ/g. Průměrné množství plísní a kvasinek je v rozmezí 103-104 KTJ/g. Velmi častými kontaminanty koření z řad bakterií jsou sporulující bakterie. Zahraniční zdroje udávají častý výskyt salmonel, C.perfringens a B.cereus. Výskyt plísní je v koření také velmi častý, vzhledem k faktu, že primární zdroj plísní je půda a při pěstování koření dochází k přímému kontaktu s půdou velmi často. Zachytili jsme především mucorovité plísně, ale i toxikogenní plísně A.flavus a A.parasiticus, které by mohly potenciálně ohrozit zdraví konzumenta. Zabývali jsme se i výskytem termorezistentních mikroorganismů. Většina nárůstů byly sporulující bakterie, blíže neurčené. Z plísní jsme identifikovali hlavně Sordaria fimicola a A.fumigatus. Obě plísně se neřadí do termofilních plísní, ale jsou schopné přežít krátkodobé zahřívání. Některá koření mohou významně ovlivnit mikroflóru (zejména proteolytickou aktivitou) potraviny, do kterých bylo koření přidáno, a proto se některé druhy sterilizují. Mikrobiální kontaminaci koření lze významně snížit ionizujícím zářením, které se provádí i v České republice. Bohužel na žádném, pro účely DP zakoupeném, sáčku koření o tomto použitém zákroku nebyla jediná informace. Žádnou informaci jsem nenalezla ani o ošetření koření vysokým hydrostatickým tlakem. Další potenciální možností snížení kontaminace v koření je použití elektrického proudu či ultrazvuku. V naší zemi se těchto postupů zatím nevyužívá. Koření rozhodně není záležitost sterilní, pokud není dodatečně ošetřeno, a je proto velmi často vektorem mnoha patogenů. Ačkoliv onemocnění z potravin, vyvolaná kořením jsou ojedinělá, může se dostavit problém u pacientů s oslabenou imunitou. Potíže by mohly nastat i 105
u dětí, ačkoliv není doporučeno malým dětem kořenit pokrmy. Paradoxně doporučení více kořenit se týká seniorů, vzhledem k jejich sníženému chuťovému vnímání. A právě u nemocných seniorů by mohlo dojít k riziku. Co se týká samotné kontaminace, velmi důležitá je prevence (dodržení hygienických limitů, používání technologických procesů, správné ošetření plodin jak před sklizní, tak po sklizni) a monitoring importovaných surovin a výrobků, vzhledem k nejednotným hygienickým normám v různých zemích.
106
POUŽITÉ ZDROJE 1. ABDEL-HAFEZ, A. 1. I., MOHARRAM, A. M. M. AND ABDELMALLEK, A. Y.
Thermophilic and thermotolerant fungi associated with seeds of five members of the Umbelliferae from Egypt. CI3'ptogamie Mycologie.1987, vol. 8, s. 315-320 (1987). 2. AGUILERA, M.O., P.V. STAGNITTA, B. MICALIZZI a A.M.S. GUZMÁN.
Prevalence and characterization of Clostridium perfringens from spices in Argentina. Anaerobe. 2005, vol. 11, s. 327-334. 3. ALCRAFT, R. Koření. 2. vyd. Překlad Jana Marešová. Čestlice: Rebo, 2010, 128 s.
Woodhead Publishing in food science and technology. ISBN 978-80-255-0261-7. 4. AL-JASSIR, M. S. Chemical composition and microflora of black cumin (Nigella
sativa L.) seeds growing in Saudi Arabia. Food Chemisn'y,1993, vol. 45, s. 239-242 5. AMAGASE, H., PETESCH, B.L., MATSUURA H. Intake of Garlic and Its Bioactive
Components. Journal of Nutrition 2001, 131, 955-962. 6. AMBROŽOVÁ J.: Mikrobiologie v technologii vod. 1. vyd. Vysoká škola chemicko-
technologická v Praze, Praha 2004. Str. 241. ISBN 80-7080-534-X 7.
ANTAL, S. P. Study of the Bacillus fora of Nigerian spices. International Journal of Food Microbiology,1988, vol. 6, s. 259-261.
8. ANTONY-BABU, S., SINGLETON, I., Effects of ozone exposure on the xerophilic
fungus, Eurotium amstelodami is-sab-01, isolated from naan bread. International Journal of Food Microbiology, 2011, vol. 144, s.331-336. 9. ARCIERI R. et al. Direct detection of Clostridium perfringens enterotoxin in patients'
stools during an outbreak of food poisoning. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 1999, vol. 23, s 45-48. 10. ARNESEN, P.S.,FAGERLUND, L.A a GRANUM, P.E. From soil to gut: Bacillus
cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiology Reviews. 2008, Vol. 32, s. 579-606. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.15746976.2008.00112.x/pdf 11. ARORA, Daljit S. a Jasleen KAUR. Antimicrobial activity of spices. International
Journal of Antimicrobial Agents. 1999, vol. 12, 257 - 262. 12. Aspergillus. MikrobeWiki [online]. 2010 [cit. 2012-04-29]. Dostupné z:
http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aspergillus
107
13. Atlas rostlin [online]. 2010, 2012 [cit. 2012-04-23]. Dostupné z:
http://kvetiny.atlasrostlin.cz/kmin-lucni 14. AZLZ, N. H. AND YOUSSEF, Y. A. Occurrence of aflatoxins and aflatoxin-
producing molds in fresh and processed meat in Egypt. Food Additives and Contaminants, 1991, vol.8, s.321-331. 15. BABU, P.S., SRINIVASA, K. Hypolipidemic action of curcumin, the active principle
of turmeric (Curcuma longa) in streptozotocin induced diabetic rats. Molecular and Cellular Biochemistry. 1991, vol. 166, s. 169–175. 16. BABU, P.S., SRINIVASAN, K. Amelioration of renal lesions associated with diabetes
by dietary curcumin in experimental rats. Molecular and Cellular Biochemistry, 1992, vol. 181, s. 87–96. 17. BABU, P.S., SRINIVASAN, K. Influence of dietary capsaicin and onion on the
metabolic abnormalities associated with streptozotocin induced diabetes mellitus. Molecular and Cellular Biochemistry,1997, vol.175, s.49-57. 18. Bacterial Endospores. Cornell University: Department of Microbiology. [cit. 2011-12-
25]. Dostupné z: http://micro.cornell.edu/cals/micro/research/labs/angertlab/bacterialendo.cfm 19. Bacterial Endospores. Cornell University: Department of Microbiology. [cit. 2011-12-
25]. Dostupné z: http://micro.cornell.edu/cals/micro/research/labs/angertlab/endo2.cfm 20. BANERJEE, M., SARKAR, P.K., Microbiological quality of some retail spices in
India, Food Research International,2003, vol.36, s.469-474. 21. BANERJEE, S.K., MAULIK, S.K. Effect of garlic on cardiovascular disorders: a
review. Nutrition Journal, 2002, online [cit. 23.04.2012] http://www.nutritionj.com/content/1/1/4 22. BARCELOUX, DG. Cinnamon (Cinnamomum species). John Wiley & Sons, 2008, s.
39 – 43 23. BAXTER, R. AND HOLZAPFEL, W. H. A microbial investigation of selected spices,
herbs and additives in South Africa. Journal of Food Science, 1982, vol. 47, s. 570578. 24. BĚLOHOUBKOVÁ, E. Využití čeledi mrkvovité ve výživě. Brno, 2009. Bakalářská
práce. Masarykova univerzita.
108
25. BHAT, R., GEETA, H. AND KULKARNI, P. R. Microbial profile of cumin seeds and
chilli powder sold in retail shops in the city of Bombay. Journal of Food Protection, 1987, vol. 50, s. 418-419. 26. BILLON, C.M.P., C.J. MCKIRGAN, P.J. MCCLURE a C. ADAIR. The effect of
temperature on the germination of single spores of Clostridium botulinum 62A. Journal of Applied Microbiology. 1997, s. 48 - 56. 27. BINDER, Eva M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production.
Animal Feed Science and Technology. 2007, vol. 133, 149–166. 28. Biotechnology Program under the Toxic, Substances Control Act (TSCA): Bacillus
subtilis Final Risk Assessment [http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra009.ht]. 1997 [cit. 2011-12-26]. 29. Biotox. Clostridium perfringens [online]. 2001, 2007 [cit. 2012-04-14]. Dostupné z:
http://www.biotox.cz/toxikon/bakterie/bakterie/clostridium_perfringens.php 30. BUTTACHON, S., Sartorymensin, a nex indole alkaloid, and new analogues of
tryptoquivaline and fiscalins produced by Neosartorya siamensis, Tetrahedron, 2012, vol. 68, s.3253-3262. 31. CARLIN, F., BROUSSOLLE, V., PERELLE, S., Prevalence of Clostridium
botulinum in food raw materials used in REPFEDs manufactured in France, International Journal of Food Microbiology, 2004, vol.91, s.141-145. 32. Ceník dekontaminace. ARTIM [online]. 2002, 2012 [cit. 2012-05-02]. Dostupné z:
http://www.artim.cz/cenik-dekontaminace 33. CEYLAN, E.,Fung, D. Y. C. Antimicrobial activity of spices. Journal of Rapid,
Methods and Automation in Microbiology, 2004, vol. 12, s. 1–55. 34. CIVÍNOVÁ, J. Česnek. Brno, 2005. 61 s. Bakalářská práce. Masarykova univerzita,
Lékařská fakulta. 35. Cornell University, Department of Microbiology [online]. 2012 [cit. 2012-05-02].
Dostupné z: http://micro.cornell.edu/cals/micro/research/labs/angertlab/images/endospore_1.jpg 36. DACARRO, C., MANGIAROTTI, m. AND SPECCHIARELLO, M. Contamination
of spices: the pepper, lgiene Moderna, 1993, vol. 100, s. 438-448. 37. DANTIGNY, P., NANGUY, S.P-M., Significance of the physiological state of fungal
spores, International Journal of Food Microbiology, 2009, vol. 134, s.16-20.
109
38. DE BOER, E. AND BOOT, E. M. Comparison of methods for isolation and
confirmation of Clostridium perfringens from spices and herbs. Journal of Food Protection, 1983, vol. 46, s. 533-536. 39. DE BOER, E., SPIEGELENBERG, W. M. AND JANSSEN, F. W. Microbiology of
spices and herbs. Antonie van Leeuwenhoek, 1985, vol. 51, s. 435-438. 40. FAMULARO, Cristin A. American Infantile Botulism: Clinical Manifestations,
Treatment, and the Role of the Nurse Practitioner College of Nurse Practitioners. American College of Nurse Practitioners. 2009, vol. 9, s. 335-343. 41. FAO (Food and Agriculture Organization), 2004. Worldwide regulations for
mycotoxins in food and feed in 2003. Italy, s. 1728–3264. 42. FASSATIOVÁ, Olga. Plísně a vláknité houby v technické mikrobiologii. Praha:
Nakladatelství technické literatury, 1979. 43. FERREIRA,E.H.dR., et al., Byssochlamys nivea inactivation in pineapple juice and
nectar using high pressure cycles, Journal of Food Engineering, 2009, vol.95, s.664669. 44. FLANNIGAN, B. AND HUL S. C. The occurrence of aflatoxinproducing strains of
Aspergilus flavus in the mould floras of ground spices, Applied Bacteriology,1976, vol. 41,s. 411-418. 45. FRISVAD, J. C. et al. Chemotaxonomy of the genus Talaromyces. Antonie van
Leewenhoek, 1990, vol. 57, no. 3, s. 179-189. 46. GARRIDO, M. D., JORDANO, R., MARTINEZ, P., JODRAL, M., POZO, R. Fungal
contamination of commercial spices. Alimentaria, 1988, vol. 189, s. 83-84. 47. GEETA, H. AND KULKARNI, P. R. Survey of the microbiological quality of whole,
black pepper and turmeric powder sold in retail shops in Bombay. Journal of Food Protection, 1987, vol. 50, s. 401-403. 48. GOCK, M.A., et al. Influence of temperature, water activity and pH on growth of
some xerophilic fungi, International Journal of Food Microbiology, 2003, vol. 2481, s.11-19. 49. GRIFFITHS, G., et al. Onions - A Global Benefit to Health. Phytotherapy Research.
2002, n. 16, s. 603-615 50. HAJŠLOVÁ J., MALACHOVÁ A.,KOSTELANSKÁ M. a ZACHARIÁŠOVÁ M..:
Kontaminace vybraných surovin mykotoxiny, dostupné na http://www.phytosanitary.org/?link=cs/projekty/2009/, (2009). ss 110
51. HASHEM, M., ALAMRI, S., Contamination of common spices in Saudi Arabia
markets with potential mycotoxin-producing fungi, Saudi Journal of Biological Sciences, 2010, vol. 17, s.167-175. 52. HASHML M. H. AND THRANE, U. Mycotoxins and other secondary metabolites in
species of Fusarium isolated from seeds of capsicum, coriander and fenugreek. Pakistan Journal of Botany, 1990, vol. 22, s. 106-116. 53. HORNSTRA, at all. On the origin of heterogeneity in (preservation) resistance of
Bacillus spores: Input for a systems analysis approach of bacterial spore outgrowth. International Journal of Food Microbiology. 2009, 9-15, vol. 134. 54. HORNSTRA, L.M., et al. Germination of Bacillus cereus spores adhered to stainless
steel. International Journal of Food Microbiology. 2007, vol.116, s. 367-371. 55. HOSSEINI, M., SHAFIEE, S.M., BALUCHNEJADMOJARAD, T., Garlic extract
reduces serum angiotensin converting enzyme (ACE) activity in nondiabetic and streptozotocin-diabetic rats. Pathophysiology 2007, 14, 2, 109-112. 56. HUSSAIN, M.S., CHANDRASEKHARA, N. Influence of curcumin and capsaicin on
cholesterol gallstone induction in hamsters and mice. Nutrition Research, 1993, vol. 13, s. 349–357. 57. CHANDRAPALA, J., Ch. OLIVER, S. KENTISH a M. ASHOKKUMAR.
Ultrasonics in food processing e Food quality assurance and food safety. Trends in Food Science & Technology. 2012, xx, 1 - 11. 58. CHAPMAN, B., et al. Ascospore inactivation and germination by high pressure
processing is affected by ascospore age, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2007, vol. 8, s.531-534. ¨¨ 59. CHO, S-H., et al., Aflatoxin contamination in spices and processed spice products
commercialized in Korea, Food Chemistry, 2008, vol. 107, s.128-1288. 60. CHOI, Eun-Young; CHO, Youn-Ok. Allium Vegetable Diet Can Reduce the Exercise-
Induced Oxidative Stress but Does Not Alter Plasma Cholesterol Profile in Rats. Annals of Nutriton & Metabolism. 2006, n 50, s. 132-138. 61. CHRISTENSEN, C. M., FANSE, H. A., NELSON, G. H., BATES, F. AND
MIROCHA, C. J. Microflora of black and red pepper. Applied Microbiology, 1967, vol. 15, s. 622-626. 62. JALILI, M., JINAP, S., Natural occurence of aflatoxins and ochratoxin A in
commercial dried chilli, Food Control, 2012, vol.24, s.160-164. 111
63. JESENSKÁ, Z., PIECKOVÁ, E., BERNÁT, D., Heat Resistance of fungi from soil,
International Journal of Food Microbiology, 1993, vol.19, s.187-192. 64. JOHNSON, E. A. M. BRADSHAW. Clostridium botulinu and its neurotoxins: a
metabolic and cellular perspective. Toxicon. 2001, vol. 39, s. 1703 - 1722. 65. JURI, M. L., ITO, H., WATANABE, H. AND TAMURA, N. Distribution of
microorganisms in spices and their decontamination by gamma-irradiation. Journal of Agricultural and Biological Chemistry, 1986, vol. 50, s. 347-355. 66. KALHOTKA, L., Mikrobiální obraz koření, publikováno ve sborníku 2011,
Mendelova univerzita, Brno. 67. KARAPINAR, M. AND AKTUG, S. E. Microbiological quality of ground cinnamon:
incidence of Bacillus cereus. Mitteilungen aus dem Gebiete der Lebensraitteluntersuchung und Hygiene, 1988, vol. 77, s. 520-527. 68. KING, A.D., Heat resistance of Talaromyces flavus ascospores as determined by a two
phase slug flow heat exchanger,International Journal of Food Microbiology, 1997, vol. 35, s.147-151. 69. KINNER, J. A., KOTULA, A. W. AND MERCURT, A. J. Microbiological
examination of ingredients of Eastern-type turkey rolls. Poultry Science, 1968, vol. 47, s. 1442-1447. 70. KOMPRDA, T., Obecná hygiena potravin, Brno, Mendelova zemědělská a lesnická
univerzita, 2004, 145 s. ISBN 80-7157-757-X 71. KONEČNÁ, J. Struktura společenstev prokaryot v podélném profilu toku. Brno, 2010.
Diplomová práce. Masarykova univerzita. 72. KROUPA, Radek. Možnosti konzervativní léčby achalázie jícnu. Brno, 2010. 69 s.
Dizertační práce. Masarykova univerzita. 73. KUBAT K., HROUDA, L., CHRTEK, J. Klíč ke květeně České republiky. Praha,
Academia, 2002. s. 928. 74. KUIPER-GOODMAN, T. Mycotoxins: risk assessment and legislation. Toxicology
Letters. 1995, vol 82/83, s. 853-859. 75. KUMAR, V., M.S. BASU a T.P. RAJENDRAN. Mycotoxin research and mycoflora
in some commercially important agricultural commodities. Crop Protection. 2008, č. 76. Labb_e, R. G. (1989). Clostridium perfringens. In M. P. Doyle (Ed.) Foodborne
bacterial pathogens (pp. 191–234). New York: Marcel Dekker.
112
77. LERKE, P. A. AND FARBER, L. Effect of electron beam irradiation on the microbial
content of spices and teas. Food Technology, 1960, vol. 14, s. 266-267. 78. LINDSTRÖM, M., K. KIVINIEMI a H. KORKEALA. Hazard and control of group II
(non-proteolytic) Clostridium botulinum in modern food processing. International Journal of Food Microbiology. 2006, vol. 108, 92 - 104. 79. LU, Hui-ni, Ying-jie PAN, Yong ZHAO a Xiao-hong SUN. Antibacterial activity of
eighteen edible spice extracts on fice food-borne bacteria. Nat Prod Res Dev. 2010, vol. 22, s. 883-889. 80. MALÍŘ, F., OSTRÝ, V., Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví
člověka, 2003, Brno, MIKADA, 349 s. 81. MALÝ, Jan. Biologie prokaryot a virů [online]. Ústí nad Labem, 2005 [cit. 2011-11-
29]. Dostupné z WWW:
. 82. MARTINEZ-MAGANA, P., JODRAL-VILLAREJO, M., POZO-LORA. R.
Mycoflora and Aspergillus flavus in pepperon sale in Spain. Microbiologie Aliments Nutrition, 1989, vol. 7, s. 311-314. 83. MICHÁLEK, Petr. Termorezistentní mikroskopické houby v bylinách pro přípravu
"čaje". Brno, 2011. Bakalářská práce. Masarykova univerzita. 84. MOSS, M.O., BAKER, T., Moulds from spices; Eurotium species, Teaching
Techniques for Mycology:10,2000, vol.14, s.54-58. 85. MUNASIRI, M. A., PARTE, M. N., GHANEKAR, A. S., SHARMA, A., PADWAL-
DESAI, S. R. AND NADKARNI. G. B. Sterilization of ground prepacked Indian spices by gamma irradiation. Journal of Food Science, 1987, vol. 52, s. 823-826. 86. NAIDU, K.A., THIPPESWAMY, N.B.Inhibition of human lowdensity lipoprotein
oxidation by active principles from spices. Molecular and Cellular Biochemistry. 2002, vol. 229, s. 19–23. 87. NAIR, K.P.Prabhakaran. Agronomy and economy of black pepper and cardamom: The
"king" and "queen" of spices. London: Elsevier, 2011. ISBN 978-0-12-391865-9. 88. NAŘÍZENÍ KOMISE (es) č. 105/2010 89. NAŘÍZENÍ KOMISE (es) č. 1881/2006 90. Neoznačené ozařování potravin v EU. Informační centrum bezpečnosti
potravin [online]. 2007 [cit. 2012-05-02]. Dostupné z: http://www.bezpecnostpotravin.cz/neoznacene-ozarovani-potravin-v-eu.aspx 113
91. NEUGEBAUEROVÁ, J., NEČAS, T., NEUGEBAUER, P. Léčivé, aromatické a
kořeninové rostliny [online]. 2008 [cit. 2012-04-20]. Dostupné z: http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/553/lakr/ 92. NOVAK,J.S., JUNEJA,V.K. Clostridium perfringens: hazards in new generation
foods. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 2002, vol. 3, s. 127-132. 93. O´RIORDAN, M.J., WILKINSON, M.G., A survey of the incidence and level of
aflatoxin contamination in a range of imported spice preparations on the Irish retail market, Food Chemistry, 2008, vol.107, s.1429-1435. 94. Official Journal of the European Union, Report from the Commicion on food
irradiation for the year 2005, [online]. 2007 [cit. 2012-05-02]. Dostupné z: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:C:2007:122:0003:0021:EN:PDF 95. OREKHOV, A. N.; GRÜNWALD, J. Effects of Garlic on Atherosclerosis. Nutrition.
1997, n. 13, s. 656-663. 96. OSTRÝ V. Účinky mykotoxinů na lidské zdraví. Vesmír. 2000, vol. 79 97. OSTRÝ,V. Mikroskopické vláknité houby. Duben 2000. [cit. 15. dubna 2012],
Dostupné na World Wide Web: http://www.vesmir.cz/files/file/fid/2423/aid/173 98. OUŘEDNÍČKOVÁ, Veronika. Mikrobiální kontaminace fotografických materiálů.
Brno, 2010. Diplomová práce. Vysoké učení technické. 99. PASRICHA, P.J., RAVICH, W.J., HENDRIX, T.R., SOSTRE, S.B., KALLO, A.N.
Treatment of achalasia with intrasphincteric injection of botulinum toxin: a pilot trial. Ann Intern Med. 1994, vol. 121, s. 590-1. 100. PECK, M.W. et all. Effect of sporulation temperature on some properties of spores of
non-proteolytic Clostridium botulinurn. International Journal of Food Microbiology. 1995, vol. 28, 289 - 297. 101. PESTKA, James J. Deoxynivalenol: Toxicity, mechanisms and animal health risks.
Animal Feed Science and Technology. vol. 137, 283–298. 102. PETER, K. Handbook of herbs and spices. 2nd rev. ed. Cambridge: Woodhead
Publishing Limited, 2004, 360 s. Woodhead Publishing in food science and technology. ISBN 1-85573-562-8. 103. PIECKOVÁ, E. Mikroskopické vláknité huby v životnom prostredí – zdravotné
súvislosti. Habilitační práce, Bratislava: Slovenská zdravotnická univerzita v Bratislavě, 2009 114
104. PIYASENA, P., E. MOHAREB a R.C. MCKELLAR. Inactivation of microbes using
ultrasound: a review. International Journal of Food Microbiology. 2003, vol. 83, 207– 216. 105. PLATEL, K., SRINIVASAN, K. Lack of antidiabetic influence of cumin (Cuminum
cyminum) seeds and bitter gourd (Momordica charantia) juice in experimental rats. Journal of Food Science and Technology, 2004, vol. 41, s. 91–94. 106. PLATEL, K., SRINIVAWAN, K. Influence of dietary spices or their active
principles on pancreatic digestive enzymes in albino rats. Nahrung, 2000, vol. 44, s. 42–46. 107. PRAŽÁKOVÁ, Kateřina. Termorezistentní plísně v prostředí. Brno, 2008.
Bakalářská práce. Masarykova univerzita. 108. PUEL, O., et al, The inability of Byssochlamys fulva to produce patulin is related to
absence of 6-methylsalicylic acid synthase and isoepoxydon dehydrogenase genes, International Journal of Food Microbiology, 2007, vol.115, s.131-139. 109. RAY, Bibek. Fundamental Food Microbiology. New York: Taylor & Francis, 2005. 110. REDDY, A.C.P., LOKESH, B.R. Studies on spice principles as antioxidants in the
inhibition of lipid peroxidation of rat liver microsomes. Molecular and Cellular Biochemistry, 192, vol. 111, s. 117–124. 111. REDDY, A.C.P., LOKESH,B.R. Studies on the inhibitory effects of curcumin and
eugenol on the formation of reactive oxygen species and the oxidation of ferrous ion. Molecular and Cellular Biochemistry. 1994, vol. 37, s. 1–8. 112. RENDUELES, E. et all. Microbiological food safety assessment of high hydrostatic
pressure processing: A review. LWT - Food Science and Technology. 1251 – 1260, vol. 44, s.1251-1260. 113. RIED, K., FRANK, O.R., STOCKS, N.P. Effect of garlic on blood pressure: A
systematic review and meta-analysis. BMC Cardiovascular Disorder, 2008, vol. 8, s. 13. 114. ROMAGNOLI, B., MENNA, V., GRUPPIONI, N., BERGAMINI, C., Aflatoxins in
spices aromatic herbs, herb-teas and medicinal plants marketed in Italy, Food Control, 2007, vol.18, s.697-701. 115. ROSYPAL, S., et al. Nový přehled biologie. Praha: Scientia, 2003. 116. SAGDIC, Osman a Musa ÖZCAN. Antibacterial activity of Turkish spice hydrosols.
Food Control. 2003, vol.14, 141 - 143. 115
117. SAGOO, S.K., et al, Assesment of the microbiological safety of dried spices and
herbs from production and retail premises in the United Kingdom, Food Microbiology, 2009, vol.26, s. 39-43. 118. SAHADEO D., Patil a Kamble VILAS A. Antibacterial activity of some essenial oils
against food borne pahogen and food spoilage bacteria. International Journal of Pharma and Bio Sciences. 2011, vol.2, s. 143-150. 119. SAMBAIAH, K., SRINIVASAN, K., Effect of cumin, cinnamon, ginger, mustard
and tamarind in induced hypercholesterolemic rats. Die Nahrung, 1991, vol. 35, s. 47–51. 120. SAMOMAO, B.C.M., SLONGO, A.P., ARAGAO, G.M.F., Heat rezistance of
Neosartorya fischeri in various juices, LWT, 2007, vol. 40, s. 676-680. 121. SANTOS, L., MARÍN, S., SANCHIS, V., RAMOS, A.J., Co-occurrence of
aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in Capsicum powder samples available on the Spanish market, Food Chemistry, 2010, vol.122, s.826-830. 122. SARKAR, P.K. Growth and enterotoxin production by sporeforming bacterial
pathogens from spices. Food Control. 2004, vol. 15, s. 491-496. 123. SATCHELL. F. B., BRUCE, V. R.. ALLEN. G., ANDREWS, W. H. AND
GERBER, H. R. Microbiological survey of selected imported spices and associated fecal pellet specimens. Journal of the Association of Official Analytical Chemists,1989, vol. 72, s. 632-637. 124. SATYAKUMAR, V., K. SAMBAIAH a K. SRINIVASAN. Effect of dietary garlic
and onion on biliary proteins and lipid peroxidation which influence cholesterol nucleation in bile. Steroids. 2010, č. 75. 125. SEENAPPA, M. AND KEMPTON, A. G. A note on the occurrence of Bacillus
cereus and other species of Bacillus in Indian spices of export quality. Journal of Applied Bacteriology, 1981, vol. 50, s. 225-228. 126. SENDL, A. Allium sativum and Allium ursinum: Part 1 Chemistry, analysis, history,
botany. Phytomedicine 1995, 1, 4, 323-339. 127. SETLOW, P. Spore germination. Current Opinion in Microbiology. 2003, vol. 6, s.
550 - 556. 128. SHARMA, A., PADWAL-DESAI, S. R. AND NATR, P. M. Assessment of
microbiological quality of some gamma irradiated Indian spices. Journal of Food Science, 1989, vol. 54, s. 489-490. 116
129. SHARMA, A.. GHANEKAR, A. S., PADWAL-DESAI, S. R. AND NADKARNI,
G. B. Microbiological status and antifungal properties of irradiated spices. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1984, vol. 32, s.1061-1063. 130. SHEN, Han-Ming a Choon-Nam ONG. Mutations of the p53 tumor suppressor gene
and ras oncogenes in aflatoxin hepatocarcinogenesis. Mutation Research. 1996, vol.366, s. 23-44. 131. SHUNDO, L., et al., Aflatoxins and ochratoxin A in Brazilian paprika, Food
Control, 2009, vol.20, s.1099-1102. 132. SCHMITT, Ch.A., DIRSCH, V.M. Modulation of endothelial nitric oxide by plant-
derived products. Nitric Oxide 2009, vol. 21, 2, s. 77-91. 133. SKLENÁŘOVÁ, K., Termofilní mikroorganismy, Fakulta chemická, Vysoké učení
techniké, Brno, bakalářská práce, 2008, s. 35. 134. SPEIJERS, G.J.A a M.H.M. SPEIJERS. Combined toxic effects of mycotoxins.
Toxicology Letters. 2004, vol. 153, 91 - 98. 135. Spices - exotic flavors & medicines [online]. 2002 [cit. 2012-04-20]. Dostupné z:
http://unitproj.library.ucla.edu/biomed/spice/index.cfm?displayID=15 136. SRINIVASAN, K. Spices as nutraceuticals with multi-beneficial health effects.
Journal of Herbs Spices and Medicinal Plants. 2004, vol. 11 137. SRINIVASAN, K. Spices as influencers of body metabolism: an overview of three
decades of research. Food Research International. 2005, vol. 38, s. 77-86. 138. SRINIVASAN, K., Plant foods in the management of diabetes mellitus: spices as
potential antidiabetic agents. International Journal of Food Science and Nutrition, 2004, vol. 55. 139. SRINIVASAN, K., SAMBAIAH, K. The effect of spices on cholesterol 7a-
hydroxylase activity and on serum and hepatic cholesterol levels in the rats. International Journal of Vitamin and Nutrition Research. 1998, vol. 61, s. 364–369. 140. STALMACH, Petr. Botulismus. Brno, 2006. 52 s. Bakalářská práce. Masarykova
univerzita. 141. Structural and Biochemical Database. Assembling the Fungal Tree of Life [online].
2006, 2012 [cit. 2012-04-15]. Dostupné z: www.aftol.org 142. SUEN, J.C., Ch. L. HATHEWAY, A.G. STEIGERWALT a D.J. BRENNER.
Clostridium argentinense sp.nov.: a genetically homogeneous group composed of all strains of Clostridium botulinum type G and some nontoxigenic strains previously 117
identified as Clostridium subterminale or Clostridium hastiforme. International Journal of Systematic Bacteriology. 1988, Vol. 38(No. 4), 375-381. 143. ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Praha:
Academia, 2002. ISBN 80-200-1024-6 http://www.agronavigator.cz/az/vis.aspx?id=76457 144. ŠIMŮNEK, J. Plísně a mykotoxiny. Brno, říjen 2004. [cit. 21. dubna 2011] 49
Dostupné na World Wide Web: http://www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf 145. ŠIMŮNEK, J. Mykotoxiny [online]. 2003 [cit. 2012-04-29]. Dostupné z:
http://www.med.muni.cz/prelek/MYKOTW/houby/mtterm.htm 146. TÁBORSKÁ, Kateřina. Výskyt bakterií rodu Bacillus v dehydrovaných potravinách.
Zlín, 2009. Bakalářská práce. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. 147. TAJKARIMI, M.M., S.A. IBRAHIM a D.O. CLIVER. Antimicrobial herb and spice
compounds in food. Food Control. 2010, vol.21, s. 1199-1218. 148. TODAR, K. Nutrition and Growth of Bacteria. Todar's Online Textbook of
Bacteriology [online]. 2008, 2012 [cit. 2012-05-13]. Dostupné z: http://www.textbookofbacteriology.net/nutgro_5.html 149. TODAR, Kenneth. Text book of bacteriology [online]. 2011 [cit. 2011-10-29].
Pathogenic Clostridia, including Botulism and Tetanus. Dstupné z WWW: . 150. TODAR, Kenneth. Todar’s Online Textbook of Bacteriology: Bacillus cereus Food
Poisoning [http://textbookofbacteriology.net/B.cereus.html]. 2011 [cit. 2011-12-26]. 151. TURNER, Nicholas W., Sreenath SUBRAHMANYAM a Sergey A. PILETSKY.
Analytical methods for determination of mycotoxins: A review. Analytica Chimica Acta. 2009, vol. 632, s. 168-180. 152. VAUGHAN, J., C. GEISSLER a B. NICHOLSON. The new Oxford book of food
plants. New York: Oxford University Press, 2009, 249 s. ISBN 978-019-9549-467. 153. VEČEŘOVÁ, Eva. Vliv čeledi česnekovitých na výživu člověka. Brno, 2010.
Bakalářská práce. Masarykova univerzita. 154. VELÍŠEK, Jan, Chemie potravin 2, Tábor: Ossis, 2002, s. 310. 155. VESELÁ, M. Praktikum z obecné mikrobiologie. Brno: Vysoké učení technické v
Brně, Fakulta chemická, 2004. 100 s.
118
156. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno [online]. [cit. 27.12.2011]. ostupný z
WWW:http://fvl.vfu.cz/export/sites/fvl/sekce_ustavy/mikrobiologie/mikrobiologie/G x_tycinky.pdf 157. VOLDŘICH, M., DOBIÁŠ, J., TICHÁ, L., Resistance of vegetative cells and
ascospores of heat resistant mould Talaromyces avellaneus to the high pressure treatment in apple juice. Journal of Food Engineering, 2004, vol. 61, s. 541-543. 158. VOTAVA, Miroslav, et al. Lékařská mikrobiologie speciální. Praha : Neptun, 2003.
495 s. 159. VYBÍHALOVÁ, Jana. Sterilizace v dohasínajícím plazmatu. Brno, 2009. Bakalářská
práce. Masarykova univerzita. 160. VYHLÁŠKA č. 133/2004 Sb., o podmínkách ozařování potravin a surovin, o
nejvyšší přípustné dávce záření a o způsobu označení 161. VYTŘASOVÁ, J., PRIBÁŇOVÁ, P., MARVANOVÁ,L. Occurrence of xerophilic
fungi in bakery gingerbread. International Journal of Food Microbiology, 2002, vol.72, s.91-96. 162. WEI, V., M. ELEKTOROWICZ a J.A. OLESZKIEWICZ. Influence of electric
current on bacterial viability in wastewater treatment. Water Research. 2011, vol. 45, 5058 - 5062. 163. WITKOWSKA, A.M., HICKEY, D.K., ALONSO-GOMEZ,M.,WILKINSON, M.G.,
The microbiological quality of commercial herb and spice preparations use in the formulation of a chicken supreme ready meal and microbial survival following a simulated industrial heating process, Food contro, 2011, vol.22, s.616-625. 164. YANO, Yutaka, Masataka SATOMI a Hiroshi OIKAWA. Antimicrobial effect of
spices and herbs on Vibrio parahaemolyticus. International Journal of Food Microbiology. 2006, vol. 111, s. 6-11. 165. Zpráva Komise o ozařování potravin za rok 2005. Informační centrum bezpečnosti
potravin [online]. 2007 [cit. 2012-05-02]. Dostupné z: http://www.bezpecnostpotravin.cz/zprava-komise-o-ozarovani-potravin-za-rok2005.aspx 166. ŽÁČEK, Zdeněk. Vůně koření. Praha: Merkur, 1981 167. PITT, J.I., HOCKING, A.D. Fungi and food spoilage. Cambridge: University Press,
1007, 593 s. ISBN 0-41255-460-7.
119
PŘÍLOHY I
Sordaria fimicola
II
Výsledky dotazníku
120
I. příloha: Sordaria fimicola Obr.1 Celkový pohled na vřecka s 8 askosporami
Obr.2 Volné perithecium
121
Obr.3 Detail struktury
122
II. příloha: Výsledky dotazníku
Legenda Čísla udávají procentuální poměr odpovědi ANO na otázku: Toto koření a bylinky používáte v kulinární úpravě a) za studena b) do deseti minut před koncem tepelné úpravy c) nad deset minut před koncem tepelné úpravy 123
