Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta
HISTOPATOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA RENÁLNÍHO POSTIŢENÍ U SYSTÉMOVÉHO LUPUSU ERYTHEMATODES
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
MUDr. Iva Svobodová
Kateřina Dorúšková
Brno, duben 2012
Jméno a příjmení autora: Kateřina Dorúšková Název bakalářské práce: Histopatologická diagnostika renálního postiţení u systémového lupusu erythematodes Pracoviště: I. PAÚ FN u sv. Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Iva Svobodová Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Tato bakalářská práce se zabývá histopatologickou diagnostikou lupusové nefritidy u pacientů postiţených systémovým lupusem erythematodes (SLE). Vyšetření ledvin pomocí imunofluorescence, světelné a elektronové mikroskopie hraje nezastupitelnou roli v diagnostice lupusové nefritidy a při určení míry postiţení ledvin. Obecná část shrnuje základní poznatky o SLE, klasifikaci lupusové nefritidy a moţnostech její léčby. V praktické části jsou popsány základní principy a postupy histopatologických vyšetřovacích metod. V experimentální části byla provedena analýza dat získaných studiem souboru 33 pacientů s lupusovou nefritidou, která byla diagnostikována z renální punkce na I.patologickoanatomickém ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Klíčová slova: Systémový lupus erythematodes, lupusová nefritida, světelná mikroskopie, elektronová mikroskopie, imunofluorescence Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, ţe jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením paní MUDr. Ivy Svobodové. V seznamu literatury jsem uvedla všechny pouţité literární a odborné zdroje.
V Brně dne………………………
…………………………………
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucí své bakalářské práce paní MUDr. Ivě Svobodové za odborné vedení, cenné rady, vstřícný přístup, trpělivost a čas, který mi věnovala při zpracování této práce, a také paní prof. MUDr. Markétě Hermanové, Ph.D. za podnětné připomínky a cenné rady. Dále bych chtěla poděkovat vedení I. PAÚ za podporu, ale především pak kolegům z laboratoře imunohistochemie za pochopení, toleranci a podporu během celého studia.
Obsah
Úvod..................................................................................................................................... - 10 Cíl bakalářské práce ............................................................................................................. - 11 1. OBECNÁ ČÁST .............................................................................................................. - 12 1.1 Základy imunologie ....................................................................................................... - 12 1.1.1 Imunitní systém........................................................................................................... - 12 1.1.2 Antigen........................................................................................................................ - 12 1.1.3 Protilátka ..................................................................................................................... - 13 1.1.3.1 Typy protilátek ......................................................................................................... - 13 1.1.4 Autoimunitní onemocnění .......................................................................................... - 14 1.1.4.1 Etiologie autoimunitních chorob ............................................................................. - 14 1.1.4.2 Klasifikace autoimunitních chorob .......................................................................... - 15 1.1.4.3 Mechanismy tolerance ............................................................................................. - 16 2. SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTHEMATODES ............................................................... - 18 2.1 Epidemiologie ................................................................................................................ - 18 2.2 Etiopatogeneze ............................................................................................................... - 18 2.3 Imunologie ..................................................................................................................... - 19 2.4 Genetické faktory ........................................................................................................... - 21 2.5 Klinické příznaky systémového lupusu erythematodes ................................................. - 22 2.6 Klasifikace lupusové nefritidy ....................................................................................... - 23 2.6.1 Klasifikace u lupusové nefritidy International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) (2003) ................................................................................................... - 23 2.6.2 Dřívější klasifikace lupusové nefritidy ...................................................................... .- 25 2.6.3 World Health Organization (WHO) morfologická klasifikace lupusové nefritidy (upravená r 1982) ................................................................................................................. - 25 2.7 Prognóza u systémového lupusu eythematodes ............................................................. - 32 2.8 Léčba lupusové nefritidy ............................................................................................... - 32 -
3. SPECIÁLNÍ ČÁST .......................................................................................................... - 34 3.1 Příprava renální biopsie k laboratornímu vyšetření ....................................................... - 34 3.2 Imunofluorescenční vyšetření ledvinné punkce ............................................................ - 35 3.2.1 Funkce fluorochromu .................................................................................................. - 35 3.2.2 Fluorescenční mikroskop ............................................................................................ - 35 3.3 Elektronová mikroskopie ............................................................................................... - 37 3.3.1 Transmisní elektronová mikroskopie.......................................................................... - 37 3.3.2 Transmisní elektronový mikroskop ............................................................................ - 37 3.3.3 Odběr materiálu pro elektronovou mikroskopii.......................................................... - 38 3.4 Světelná mikroskopie ..................................................................................................... - 40 3.4.1 Barvení ........................................................................................................................ - 40 3.4.1.1 Typy barviv .............................................................................................................. - 40 3.4.2 Přehledné barvící metody ........................................................................................... - 41 3.4.2.1 Hematoxylin-eosin ................................................................................................... - 41 3.4.3 Jiné přehledné barvící metody .................................................................................... - 42 3.4.4 Speciální barvící metody ............................................................................................ - 42 3.5 Montovací média ........................................................................................................... - 44 3.6 Praktické provedení zpracování punkce ........................................................................ - 44 3.6.1 Imunofluorescenční vyšetření ledvinné punkce ......................................................... - 45 3.6.2 Zpracování ledvinné punkce pro účely světelné mikroskopie .................................... - 46 3.6.2.1 Fixace ....................................................................................................................... - 47 3.6.2.2 Zpracování tkáně v tkáňovém procesoru ................................................................. - 48 3.6.2.3 Zalévaní ledvinné punkce ........................................................................................ - 48 3.6.2.4 Krájení parafínového bloku ..................................................................................... - 49 3.6.2.5 Zhotovení parafinových řezů ................................................................................... - 49 3.6.2.6 Barvení parafinových řezů ....................................................................................... - 50 3.6.2.6. Hematoxylin - eosin ................................................................................................ - 50 3.6.2.6.2 Massonův trichróm modifikace dle Goldnera ...................................................... - 51 -
3.6.2.6.3 PAS ....................................................................................................................... - 53 3.6.2.6. Resorcin – fuchsin – Sirius Red (SRel) ................................................................. - 54 3.6.2.6.5 Resorcin – fuchsin s dobarvením hematoxylinem - eosinem - HEeL ................. - 56 3.6.2.6.6 Jones...................................................................................................................... - 57 3.6.2.6.7 Anilin – fuchsin – Orange G ( AFOG) ................................................................. - 58 3.6.2.6.8 Alciánová modř +PAS (P - A) .............................................................................. - 60 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................................................... - 61 4.1 Popis experimentu.......................................................................................................... - 61 5. VÝSLEDKY .................................................................................................................... - 61 6. ZÁVĚR ............................................................................................................................ - 68 7. SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ............................................................................. - 69 -
Seznam použitých zkratek AFOG – anilin – fuchsin - Orange G BCR – B-cell receptor Cca - circa ČR – Česká republika DNA - deoxyribonukleová kyselina dsDNA - dvouvláknová deoxyribonukleová kyselina ELMI – elektronová mikroskopie FITC – fluorescein-iso-thio-kyanát FN – fakultní nemocnice GN – glomerulonefritida GOLD – Massonův zelený trichróm, modifikace dle Goldnera HCL- kyselina chlorovodíková HE - hematoxylin - eosin HEel – resorcin – fuchsin s dobarvením hematoxylinem - eosinem HLA - Human Leucocyte Antigen ID - imunodepozita IF – imunofluorescence Ig - imunoglobulin ISN/RPS - International Society of Nephrology/Renal Pathology Society MHC - major histocompatibility complex Min. - minut Např - například NK – nukleová kyselina P-A – alcián - PAS Pb - párů bazí RNA- ribonukleová kyselina RTG – rentgen RTU – ready to use SLE - systémový lupus erythematodes SM – světelná mikroskopie SRel – resorcin - fuchsin s dobarvením Sírius Red Str. - strana TCR – T-cell receptor
TLR – toll like receptors UV – ultrafialové záření UZV- ultrazvuk WHO – World Health Organization I.PAÚ- I. patologicko anatomický ústav
- 10 Úvod Systémový lupus erythematodes (SLE) je systémové autoimunitní onemocnění, které postihuje téměř všechny orgány těla. Na jeho vzniku se podílí selhání autotolerance imunitního
systému
k vlastním
tkáním,
stejně tak různé multifaktoriální
příčiny
(hormonální, virové, dědičnost). Dochází k tvorbě imunokomplexů a jejich následnému ukládání ve tkáních, kde způsobují chronické záněty. Vzhledem k tomu, ţe v České republice onemocní SLE přibliţně 500 obyvatel ročně, stává se toto onemocnění velkým medicínským problémem. Při diagnostice lupusu bere lékař v potaz nejen klinické příznaky, ale velmi důleţitá je i pacientova osobní anamnéza. Finální diagnózu stanoví
lékař
především
na základě
laboratorního
biochemického a hematologického vyšetření
vyšetření.
Kromě
je kladen velký důraz
standardního na vyšetření
imunologické. Téměř všichni pacienti mají pozitivní protilátky anti - dsDNA (protilátky proti dvouvláknové DNA). Naprostá většina pacientů s lupusem má určité morfologické změny na ledvinách a kůţi, zde má své nezastupitelné místo v diagnostice histologie. Histologie je nauka o mikroskopické skladbě tkání a organismu. Rozvoj histologie je spjat s vynálezem
mikroskopu,
který nám
umoţňuje pozorovat
mikroskopickou stavbu
tkání organismů. Odběr bioptického materiálu pro histopatologické vyšetření lupusové nefritidy (punkce ledvin) patří mezi miniinvazivní chirurgické výkony a přistupuje se k němu, kdyţ nelze postiţení ledvin vyšetřit jiným, neinvazivním způsobem. Tento výkon se provádí pouze tehdy, pokud určení diagnózy přispěje k léčbě. Díky včasné a přesné diagnostice, kdy má lékař k dispozici řadu vyšetřovacích metod (imunofluorescenční vyšetření tkáně, elektronovou a světelnou mikroskopii), můţe být pacientovi nasazena adekvátní léčba, díky níţ má vyhlídky na lepší prognózu nebo alespoň dojde k oddálení zhoršení zdravotního stavu.
- 11 Cíl bakalářské práce Cílem mé bakalářské práce je popis komplexního zpracování punkční renální biopsie a statistické vyhodnocení výsledků renálních biopsií na souboru 33 pacientů s lupusovou nefritidou diagnostikovanou na pracovišti I. patologicko-anatomického ústavu (I. PAÚ) ve Fakulní nemocnici u sv. Anny v Brně v letech 2004 - 2011.
- 12 -
1. OBECNÁ ČÁST 1.1 Základy imunologie 1.1.1 Imunitní systém Mezi hlavní funkce imunitního systému patří rozeznávání tělu cizích částic (antigenů) a reakce proti nim. Mohou jimi být mikroorganismy a jejich toxiny, ale také určité nádory, které jsou rozpoznány organismem jako cizí. Důleţitou vlastností imunitního systému je autotolerance, kdy je imunitní systém schopen rozeznat vlastní tkáně organismu a udrţuje vůči nim toleranci. Imunitní systém vykonává také imunitní dohled, rozpozná vnitřní škodliviny a účastní se odklízení poškozených, starých, ale i mutovaných buněk. Správně fungující imunitní systém pak zajistí obranu proti infekčním nemocem, je zodpovědný za odvrţení transplantovaného orgánu a je schopen zamezit vzniku a růstu nádoru v těle. [1, 10]
1.1.2 Antigen Antigeny - jsou to většinou makromolekulární látky organické povahy (nukleové kyseliny, povrchové bílkoviny, lipoproteiny a glykoproteiny, ale téţ jednoduché chemické sloučeniny, či atomy kovů), které imunologicky zralý organismus za vhodných okolností rozpozná jako cizí a je schopen vyvinout adekvátní imunologickou reakci. Antigennost je závislá na řadě okolností a podmínek. Mezi rozhodující kritéria patří například velikost molekuly, ale i fyzikální, biologické a chemické vlastnosti (přístupnost povrchových determinant, rozpustnost, prostorové uspořádání). Velmi důleţitý je i způsob setkání antigenu s organismem.[4] Antigenní determinanta je skupina atomů, nacházející se na povrchu molekuly antigenu, která má schopnost specificky reagovat s receptory imunokompetentních lymfocytů, ale také s protilátkami a výkonnými nebo regulačními lymfocyty.
- 13 Hapten je neúplný antigen, aby byl schopen vyvolat imunitní odpověď, musí dojít k navázání na makromolekulární nosič (bílkovina, léky), jedině tak je schopen vyvolat tvorbu protilátek. [2, 5, 11]
1.1.3 Protilátka Protilátka je bílkovinné povahy, téţ nazývána imunoglobulin. V těle slouţí především k rozeznání cizích molekul. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny, které jsou produkovány B - lymfocyty (plazmatickými buňkami). Rozlišujeme pět tříd imunoglobulinů IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. U IgA a IgG rozlišujeme několik podtříd. Nejvyšší zastoupení v séru mají protilátky IgG, jejich molekula má tvar písmene Y, je tvořena dvěma lehkými a dvěma těţkými řetězci. Těţké řetězce se skládají ze čtyř nebo pěti strukturně podobných domén, z nichţ je kaţdá tvořena sekvencí 110 - 120 aminokyselin. Jednotlivé domény spojují krátké spojovací úseky polypeptidového řetězce. Lehké řetězce se skládají ze dvou imunoglobulinových domén. Na jejich spojení se účastní jak kovalentní tak nekovalentní vazby. Domény na N - konci lehkého i těţkého řetězce jsou variabilní, ostatní domény jsou konstantní.Tato struktura je charakteristická pro všechny IgG. [1, 2]
1.1.3.1 Typy protilátek Imunoglobuliny IgG tvoří asi 75 - 85% všech Ig v séru a jsou charakteristické pro plně rozvinutou, pokročilou imunitní reakci a téţ pro druhotnou imunní odpověď. Mohou přestoupit z mateřského organismu transplacentárním přenosem do plodu a tím představují velmi významnou sloţku ochrany jedince během prenatálního období. Podle schopnosti vázat komplement rozlišujeme 4 izotypy IgG. Lidské IgG 1 a IgG 3 aktivují komplement dobře, IgG 2 hůře a IgG 4 neaktivují komplement vůbec. IgM představují 5 % - 10 % všech Ig v séru. Skládají se z pěti čtyřřetězcových jednotek, které jsou zpevněny disulfidickými můstky a jsou navzájem propojeny J - řetězcem. V séru se objevuje v časných stádiích protilátkové odpovědi na antigen. Vyskytuje se ve formě pentameru sloţených z pěti jednotek o stejné struktuře jako IgG. Molekula IgM obsahuje
- 14 deset vazebných míst pro antigen. Monomerní forma tvoří na naivních lymfocytech B receptor pro antigen. IgA představují 10 % - 20 % všech Ig v séru. Nejčastěji se vyskytuje jako dimer, kdy jsou 2 molekuly IgA spojeny v oblasti Fc - komponenty J řetězcem.V sekretech a na sliznici obsahují tyto dimery navíc ještě sekreční částici, která tvoří důleţitou ochranu před natrávením enzymy. IgD nachází se na povrchu B lymfocytů kde tvoří BCR receptor. IgE se vyskytuje při alergických reakcích, kdy dochází k degranulaci histiocytů. Imunoglobuliny IgD a IgE tvoří minoritní skupinu všech imunoglobulinů.[1, 4]
1.1.4 Autoimunitní onemocnění Autoimunitní onemocnění jsou výsledkem abnormální imunitní reakce na autoantigeny (vnitřní antigeny). Autoimunitní onemocnění postihuje 5 – 7 % populace, díky tomu patří mezi závaţnou skupinu onemocnění a jeví se jako váţný medicínský problém.[12]
1.1.4.1 Etiologie autoimunitních chorob Na vzniku autoimunitních chorob se podílí kombinace více faktorů - vnitřních (hormonálních, genetických) a vnějších (infekce, chemické vlivy nebo UV záření), tyto účinkují jako spouštěcí faktory. Klinické onemocnění stejné povahy můţe být u různých jedinců způsobeno různými příčinami a naopak, stejný genetický defekt se můţe díky závislosti na různých dalších faktorech klinicky manifestovat rozličným způsobem. Autoimunitní onemocnění vzniká díky prolomení mechanismů autotolerance a přeměny fyziologické autoimunity v imunitu patologickou.[1, 12]
- 15 1.1.4.2Klasifikace autoimunitních chorob Autoimunitní choroby se dělí na systémové a orgánově specifické. Autoimunitní choroby systémové jsou charakterizované autoimunitní reakcí, kdy je autoimunitní odpověď namířena proti velkému spektru vzájemně nepodobných antigenů. Zároveň je aktivováno velké mnoţství klonů netolerantních T - lymfocytů, které rozpoznávají různé epitopy autoantigenů. Postiţeno je více orgánů. Autoimunitní postiţení je orgánově specifické, jestliţe dochází k autoreaktivitě vůči antigenům, jejichţ exprese je omezena jen na určitý druh tkáně nebo orgánu. Mezi těmito kategoriemi existuje neostrá hranice, kde stojí imunopatologické choroby. Většinou je postiţen jen jeden orgánový systém, ale mohou být provázeny spoustou systémových příznaků. [4, 7] Schopnost imunitního systému rozpoznat antigenní struktury vlastních tkání, a poté s nimi reagovat, je fyziologickým jevem, díky němuţ je udrţována homeostáza. Imunitní systém poškozené, apoptotické a staré nebo zmutované buňky vlastního organismu průběţně rozpoznává a poté eliminuje. Jestliţe vede autoimunitní reakce k postiţení tkání, hovoříme o autoimunitním onemocnění. [1] Autoimunitní reakce mohou být buď humorálního (protilátkového) nebo buněčného typu. Humorální reakce jsou charakterizovány tvorbou autoprotilátek, převáţně izotypu IgG, které se podílejí na tkáňovém postiţení buď cytotoxickými mechanismy, nebo tvorbou a ukládáním imunokomplexů (II. a III. typ imunopatologické reakce). Protilátka se téţ můţe navázat na buňku nebo na určitý protein a tím způsobit změny jejich funkce. Buňkami zprostředkovaná autoimunitní reakce je charakterizována poškozujícím zánětem způsobeným Tc a Th1 lymfocyty, jejich cytokiny a aktivací makrofágů (IV. typ imunopatologické reakce).[1] Existují kritéria Witebského, dle kterých lze onemocnění klasifikovat jako autoimunitní, a to tehdy, jestliţe je moţné charakterizovat autoantigen, jestliţe jsme schopni poškozující reakci reprodukovat in vitro nebo in vivo a to přenosem buněk nebo sérových faktorů na pomocné zvíře, u kterého by se posléze měla vyvinout analogická choroba. Tato kritéria ovšem splňuje jen několik málo onemocnění. U řady onemocnění se doposud nepodařilo identifikovat autoantigen, jindy se nedařilo navodit to samé onemocnění experimentálně.[1, 7]
- 16 1.1.4.3 Mechanismy tolerance Aby došlo k autoimunitnímu onemocnění, musí dojít k prolomení mechanismů autotolerance. Fyziologicky musí udrţet imunitní systém organismu imunitní reakci proti vlastním tkáním v určitých mezích. Tolerance se za fyziologických okolností udrţuje na centrální a periferní úrovni.
Tolerance centrální Pro T lymfocyty se centrální tolerance ustanovuje v thymu. Pomocí tzv. pozitivní selekce jsou zachovány ty T lymfocyty, jejichţ komplex TCR je schopen s nízkou afinitou rozpoznat vlastní MHC molekuly prezentující vlastní peptid. Negativní selekcí nazýváme proces, při němţ jsou eliminovány nebo inaktivovány lymfocyty rozpoznávající komplexy MHC prezentující vlastní peptidy s příliš vysokou afinitou. B lymfocyty podléhají negativní selekci v kostní dřeni, přičemţ jsou eliminovány ty B lymfocyty, které jsou schopny rozpoznat membránové nebo rozpustné molekuly nacházející se v tomto prostředí.[1]
- 17 Periferní tolerance Předpokládá se, ţe právě selhání mechanismů periferní tolerance má podstatný podíl na vzniku autoimunitních onemocnění. Udrţení periferní tolerance se děje několika způsoby:
Klonální delece o čímţ rozumíme fyzickou eliminaci autoreaktivních klonů pomoci apoptózy.
Klonální anergie o lymfocyt sice rozpozná autoantigen, ale chybí zde kostimulační signál, který je potřebný k úplné aktivaci buňky, dochází k funkčnímu útlumu.
Klonální ignorace o lymfocty nejsou schopny rozpoznat antigen, jde o autoantigeny exprimované na vlastních tkáních v podprahovém mnoţství, tím neposkytují dostatečně silný signál, který je potřebný pro aktivaci minimálního počtu receptorů.
Suprese o imunokompetentní buňky jsou schopny potlačit autoreaktivní lymfocyty. [1]
- 18 2. SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTHEMATODES Systémový lupus erythematodes (SLE) patří mezi nejčastější autoimunitní onemocnění. Je to chronické zánětlivé onemocnění neznámého původu, které postihuje téměř všechny důleţité orgány (kardiovaskulární systém, centrální nervový systém, kůţi, klouby, serózní blány, plíce a ledviny). SLE můţe postihnout jeden orgán nebo více v jakékoliv kombinaci. Mohou být ovšem přítomny i nespecifické příznaky, mezi něţ patří únavnost, hmotnostní úbytek a horečka. Toto onemocnění můţe pacienta z akutního i dlouhodobého hlediska ohroţovat na ţivotě. Pro toto onemocnění jsou charakteristické změny v imunologické odpovědi organismu. Pro klinický průběh je charakteristické střídání období remisí a chronických či akutních vzplanutí.[13]
2.1 Epidemiologie Onemocnění výrazně častěji postihuje ţeny ve fertilním věku (2. aţ 3. dekáda ţivota), přičemţ roční incidence nových případů je 1 aţ 10 nemocných na 100 000 obyvatel. Prevalence je aţ 50 nemocných na 100 000 obyvatel. V ČR je tímto onemocněním postiţeno cca 5 000 obyvatel. [8, 13]
2.2 Etiopatogeneze Příčinou rozvoje autoimunitních onemocnění je buď ztráta nebo sníţená tolerance vůči antigenním strukturám vlastního organismu a dále také nepřiměřená funkce Th4 lymfocytů. Th4 lymfocyty (helpery) ve spolupráci s B lymfocyty produkují autoprotilátky. Souběţně je narušena i regulace apoptózy, přičemţ mohou zbytky jaderného materiálu a buněčných membrán zůstávat nepřiměřeně dlouho v cirkulaci a tudíţ zde mohou fungovat jako antigeny, které stimulují imunitní systém k tvorbě protilátek. Některé z těchto protilátek mohou působit přímé cytotoxické poškození, jiné zase tvoří imunitní komplexy, které pak vedou k zánětu. V určitých případech mohou mít vliv i některé genetické faktory, hormonální faktory, rovněţ i faktory zevního prostředí.[13]
- 19 2.3 Imunologie Cirkulujíci autoprotilátky při SLE jsou ubikvitní a jejich detekce tvoří základ diagnostiky. Depozice protilátek v glomerulech je charakteristický znak lupusové glomerulonefritidy. Morfologické a klinické projevy této nemoci úzce souvisí s lokalizací imunodepozit (ID). Předpokládá se, ţe tvorba glomerulárních imunodepozit je počátkem zánětlivého procesu. Pochopení molekulárních a celulárních dějů vedoucích k produkci patogenních protilátek glomerulární lokalizace je předmětem výzkumu. Je známo, ţe titr autoprotilátek nekoreluje se závaţností renálního postiţení. U pacientů s nízkou hladinou cirkulujících autoprotilátek je pozorován vývoj těţké nefritidy a pacienti s vyšší hladinou autoprotilátek mohou mít minimální nebo ţádné příznaky renálního postiţení. Je pravděpodobné, ţe vlastnost (kvalita) autoprotilátky je důleţitější neţ mnoţství. Nefritogenní protilátky byly charakterizovány jako IgG, kladně nabité a zkříţeně reagujíci s mnoha antigeny, mezi něţ patří - DNA, fosfolipidy, a sloţky bazální membrány například laminin a heparan sulfát. Povaha příslušných protilátek a cílové antigeny zůstávají oblastí diskuze. Na patogenezi SLE se zcela jistě podílí anti double stranded DNA (anti - dsDNA) protilátka proti dvouvláknové DNA. Nasbírané poznatky ukazují, ţe nukleozomy jsou cílem a zprostředkovateli protilátkové reakce související s imunokomplexovými depozity v glomerulech (antibody - related glomerular immune - complex deposition).[19] Nukleozom je základní jednotka chromatinu uvolněná internukleozomálním štěpením pomocí endonukleáz uvolněných v průběhu apoptózy. Válcovité jádro nukleozomu je sloţeno z oktameru, 2 kopií histonů H2A, H2B, H3 a H4, kolem kterého je ovinutý úsek DNA o délce 146 pb (párů bazí). Sousedící nukleozomy bývají navzájem spojeny tzv. internukleozomální DNA o délce 60 pb. Molekula histonu H1 je umístěna v bodě, kde DNA vstupuje a vystupuje z nukleozomu. [6, 20] Protilátky reagující s antigenními strukturami nacházející se na nukleozomu byly detekovány u pacientů s lupusem ještě před začátkem syntézy protilátek anti - dsDNA a protilátek anti - histonových. Tyto protilátky jsou obvykle IgG, isotopy IgG2a a IgG2b podtřídy. Strukturální analýzy imunoglobulinového genu kódujícího protilátky reagující s nukleozomy podporují hypotézu, ţe nukleozom je pravděpodobně primární autoantigen.
- 20 Analýza sérové aktivity protilátek proti nukleozomům a dsDNA u lidského a myšího lupusu prokázala, ţe aktivita sérové anti - dsDNA byla vţdy spojena s ,,antinukleozomální“ aktivitou, opačně však tomu není. Poněvadţ DNA cirkuluje v nukleozomech, předpokládá se, ţe anti - DNA protilátky moţná reagují s nukleozomy. Přítomnost monoklonálních anti DNA protilátek vedla ke klíčovému poznání, ţe tyto protilátky by se mohly vázat na non DNA antigeny včetně komponent glomerulární bazální membrány. Hlavní krok k porozumění vývoje autoimunitní reakce v SLE vyplynul z poznatku, ţe buňky, které projdou apoptózou utvoří jedinečnou zásobárnu SLE autoantigenů. Je dokázáno, ţe apoptóza u SLE můţe být pozměněna. Podstatou autoimunitním onemocnění je selektivní ztráta sebetolerance. Normálně je aktivitě proti autoantigenu zamezováno několika mechanismy včetně Apo-1/Fas cesty apoptózy. Nesprávná funkce Fas má tedy potencionál vést k akumulaci lymfocytů, konkrétně autoreaktivních lymfocytů. Je pravděpodobné, ţe zvýšená apoptóza sama o sobě není dostačujícím spouštěčem produkce lupusové protilátky. Moţným mechanismem, který by mohl být zapojený do poskytování imunogenních nukleozomů u citlivých jedinců, můţe být post- translační proteinová modifikace během apoptózy. Poruchy odstranění apoptotických buněk, mohou hrát hlavní roli při SLE způsobující hromadění apoptotického materiálu ve tkáních nebo v cirkulaci, vedoucí k uvolnění imunoreaktivních proteinů. U pacientů s lupusem existují významné změny v mechanismech apoptózy.[19] Novou zajímavou patogenetickou koncepci SLE nefritidy přinesl Hans Joachim Anders, profesor medicíny na Ludwig Maximilian Universitě v Mnichově. Anders poskytl významné poznatky o roli Toll-like receptorů (TLR) v ledvinném zánětu. Jejich výzkum, role TLR7 a TLR9 dotváří koncept lupus nefritidy jako"Pseudo - antivirové nemoci". Toll-like receptory TLRs jsou vrozené patogenní senzory na povrchu buněk. (TLR1/2/4/5/6) nebo v intracelulárních endosomech (TLR3/7/8/9) a jsou schopné rozpoznat celé spektrum potenciálních patogenů, vázat pro patogeny charakteristické molekulární struktury, jako jsou LPS (TLR 4), lipopeptides (TLR1/2/6) a virové i bakteriální nukleové kyseliny (TLR3/7/8/9). Shromaţďování údajů z oblasti genetiky, kliniky a základní imunologie ukazují, ţe antivirová imunita má význam v patogenezi lupusové nefritidy. Tato myšlenka je zaloţena na existenci genetických variant, které podporují přetrvávání jaderných částic
- 21 v extracelulárním prostoru nebo uvnitř lysozomů. Tyto jaderné částice napodobují virové částice, jejich RNA nebo DNA sloţky aktivují receptory virových nukleových kyselin (NK) a rozpoznávání v antigen – prezentujících buňkách. Tyto autoadjuvantní účinky endogenních nukleových kyselin způsobují nevhodný imunitní výklad jaderných částic během prezentace antigenu. Tento proces podporuje rozšíření autoreaktivních T buněk a B buněk, coţ vede k produkci autoprotilátek a vzniku imunokomplexové glomerulonefritidy Ribonucleoprotein U1snRNP působí jako autoadjuvant aktivaci TLR7 a jako lupusový autoantigen spouští RNA - specifickou T a B buněčnou autoimunitu. Podobně hypomethylovaný chromatin působí jako autoadjuvant aktivaci TLR9 a synergně se svojí rolí autoantigenu navodí autoantigen DNA specifickou T a B buněčnou autoimunitu u lupusové nefritidy. Dezinterpretace endogenních nukleových kyselin jako autoantigenů a autoadjuvans má za následek "pseudoantiviral" autoimunitní reakci při SLE.[19]
2.4 Genetické faktory Při studii dvojčat byla nalezena zvýšená konkordance mezi jednovaječnými a dvojvaječnými dvojčaty, ale téţ zvýšené riziko postiţení sourozenců a rodičů. Nicméně frekvence SLE u příbuzných je relativně nízká (asi 3 – 18 %). Byla prokázána asociace s jednotlivými geny, ale i celými haplotypy. Významnou asociaci se SLE mají HLA geny II. třídy, HLA-DR a DQ alely. U kavkazské populace je onemocnění asociováno s haplotypem HLA A1-B8-DR3-DR52-DQ2. Také mezi některými HLA DR a DQ geny a schopností vytvářet různé autoprotilátky existuje silná asociace, coţ můţe mít vztah k jednotlivým podskupinám onemocnění.[14, 19]
- 22 2.5 Klinické příznaky systémového lupusu erythematodes Klinické příznaky mohou být velmi různorodé a mohou simulovat řadu jiných interních onemocnění.
Celkové nespecifické příznaky systémového lupusu erythematodes Pacient můţe pociťovat změny zdravotního stavu, např. poruchy spánku, nadměrné pocení, celková nevůle, zvýšená únavnost, nechutenství, artralgie a myalgie. Můţe se téţ vyskytovat pokles tělesné hmotnosti, bolestivé zduření mízních uzlin, ale také intolerance slunečního záření. Velmi významným symptomem je zvýšená tělesná teplota aţ horečka, kterou často provází třesavka.[23]
Renální projevy Zánětlivé onemocnění ledvin je vţdy velmi váţným projevem imunopatologického procesu. Díky moderním způsobům léčení je výrazně prodlouţeno přeţití nemocných, z původních 5 let aţ na 15 let pro 90% nemocných. Aţ v 10% můţe být glomerulonefritida prvním příznakem onemocnění SLE. Díky výsledkům vyšetření renálních biopsií bylo zjištěno, ţe kaţdý nemocný má určité glomerulární změny, ty však nemusejí progredovat. U pacientů můţeme nelézt asymptomatickou proteinurii či hematurii, nefrotický syndrom nebo rychle progredující glomerulonefritida (GN). Klinicky je diagnóza SLE odvislá na vývoji tzv. aktivního močového sedimentu, pro který je charakteristická přítomnost proteinurie a výskyt velkého mnoţství dysmorfních erytrocytů. V močovém sedimentu se mohou nacházet různé válce (především granulární, ale mohou se téţ vyskytovat erytrocytární, tubulární). Za hraniční patologickou hodnotu pokládáme proteinurii 0,5 g/24h, trvající nejméně 3 - 6 měsíců. Zatím není jasné, za jakých okolností přechází pacient ze stádia klinicky němého postiţení ledvin, do stádia aktivního, které se projevuje proteinurií. Je známo, ţe klinické známky renálního postiţení (včetně renálních funkcí) nemusí korelovat s morfologickou aktivitou. Postiţení můţe být subklinické. Diskrepance mezi negativním
- 23 močovým nálezem a závaţným morfologickým typem onemocnění (difúzní proliferativní GN) nacházíme zvláště u mladších pacientů. [8, 15]
2.6 Klasifikace lupusové nefritidy Morfologické změny renální biopsie pacientů se SLE tvoří spektrum vaskulárních, glomerulárních a tubulointersticiálních lézí. Klasifikace SLE se vyvíjela přes 40 let, během této doby bylo mnoho lézí identifikováno a definováno. Současná klasifikace, která pokročila od roku 1982 a byla přezkoumána roku 1995, odráţí porozumění patogenezi variantních forem renálního postiţení při SLE nefritidě. Klasifikace lupusové nefritidy je rozhodující pro péči o pacienta a moţnost srovnání laboratorních a terapeutických výsledků mezi různými klinikami.[16]
2.6.1 Klasifikace lupusové nefritidy International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) (2003)
Class I Je definována jako minimální mesangiální lupusová nefritida s akumulací imunokomplexů v mesangiu identifikovanými pomocí imunofluorescence (IF) či elektronové mikroskopie (ELMI). Zcela chybějící renální abnormality ve světelné mikroskopii (SM).
Class II Je definována jako mesangiální proliferativní lupusová
nefritida. Čistě mesangiální
hypercelularita (různým stupněm vyjádřena) související s mesangiálními imunitními depozity (ID). Přítomnost
subendoteliálního ID, dobře patrného v světelné mikroskopii, vede
k přeřazení GN do class III nebo IV. Stejně tak i přítomnost fokálně segmentální sklerotické léze.
Class III Je definována jako fokální (proliferativní) lupusová nefritida s přítomností fokálně segmentálních endokapilárních lézí nebo skleróz postihující méně neţ 50 % všech glomerulů. Mohou být přítomny nekrózy kapilárních kliček a srpky.
- 24 -
Class IV Je definována jako difúzní (proliferativní) lupusová nefritida s postiţením více neţ 50 % všech glomerulů. Tato třída je rozdělena na difúzní segmentální lupusovou nefritidu (class IVS), kdy více neţ 50% glomerulů mají segmentální proliferativní léze a difúzní lupusovou nefritidu (class IV-G), kdy více neţ 50 % zahrnutých glomerulů má globální lézi. Do této kategorie by měly být zahrnuty i poměrně vzácně se vyskytující léze glomerulů s obřími subendoteliálními ID s minimální nebo ţádnou proliferací endokapilární, mesangiální či extrakapilární.
Class V Je definována jako membranózní lupusová nefritida s globálními nebo segmentálními kontinuálními subendoteliálními imunodepozity
a konkomitantními ID v mesangiu. Tento
typ GN se můţe kombinovat s class III nebo IV při přítomnosti proliferativních (aktivních) nebo chronických lézí.
Class VI Je definována jako pokročilá lupusová nefritida zahrnující více neţ 90 % globální glomerulosklérozy. Neměly by zde být známky aktivní léze. V této klasifikaci jsou parametry aktivní a chronické definovány v souladu s diagnózou: aktivní léze (A), aktivní a chronické léze (A/C) nebo chronické léze (C). Při posuzování do jaké míry jsou glomeruly postiţeny musíme brát v úvahu aktivní i chronické postiţení.[16]
- 25 2.6.2 Dřívější klasifikace lupusové nefritidy
Original Word Health Organization (WHO) classification of Lupus nephritis (1974)
Class I ............Normální glomeruly (v IF, ELMI a SM)
Class II...........
Pouze mesangiální onemocnění
a) Normocelulární mesangium v SM, mesangiální depozita v IF a ELMI. b) Mesangiální hyperceluarita s mesangiálními depozity v IF a ELMI.
Class III.........
Class IV..........Difúzní proliferativní nefritida (více neţ 50%)
Class V..........
Fokální proliferativní glomerulonefritida (méně neţ 50%) Membranózní glomerulonefritida
2.6.3 World Health Organization (WHO) morfologická klasifikace lupusové nefritidy (upravená r 1982)
Class I............Normální glomeruly beze změn v SM, ale nacházejí se zde depozita v ELMI nebo IF
Class II...........
Čistě mesangiální změny
a) Mesangiální rozšíření nebo jemná hypercelularita (+) b) Střední hypercelularita (++)
Class III.........
Fokální segmentální glomerulonefritida (asociovaná s mírnými nebo středně
závaţnými změnami a) S aktivními nekrotickými lézemi b) S aktivními a sklerotickými lézemi c) Se sklerotickými lézemi.
Class IV.........
Difúzní
glomerulonefritida
(těţká
mesangiální,
nebo mesangiokapilární proliferace a nebo extensivní subendoteliální depozita) a) Bez segmentálních lézí b) S aktivními nekrotizujícími lézemi
endokapilární
- 26 c) S aktivními a sklerotizujícími lézemi d) Se sklerotickými lézemi
Class V..........
Difúzní membranózní glomerulonefritida
Pouze membranózní glomerulonefritida Asociovaná s lézí kategorie II (a nebo b) a) Asociovaná s lézemi kategorie III (a-c) b) Asociovaná s lézemi kategorie IV (a-d)
Class VI.........
Pokročilá sklerotická glomerulonefritida [16]
Obr.č. 1: Mesangiální proliferativní lupusová nefritis class II. Dobře patrná segmentální mírná mesangiální proliferace. Barvení P - A. Zvětšení objektiv 40X.
- 27 -
Obr.č. 2: Mesangiální proliferativní lupusová nefritis. Mesangiální zvýšená buněčnou s přítomnosti imunodepozit. Elektronová mikrofotografie.
Obr. č. 3: Fokální lupusová nefritis class III, endokapilární a mesangiální hypercelularita segmentálně vyjádřená. Barvení PAS. Zvětšení objektiv 40x.
- 28 -
Obr.č. 4: Difúzní lupusová nefritis class IV. Globálně mírně zvýšená endokapilární celularita a rozšířené glomerulární bazální membrány charakteru „wireloops“ subendoteliálními imunodepozity. Barvení HEel. Zvětšení objektiv 40x.
Obr.č. 5: Difúzní lupusová nefritis class IV. Objemná subendoteliální imunodepozita. Elektronová mikrofotografie.
- 29 -
Obr.č. 6: Difúzní lupusová nefritis class IV. Globální endokapilární a mesangiální proliferace, četné hyalinní tromby, formování celulárního srpku. Barvení AFOG. Zvětšení objektiv 40x.
Obr.č. 7: Difúzní lupusová nefritis class IV. Objemná mesangiální a subendoteliální imunodepozita. Elektronová mikrofotografie.
- 30 -
Obr.č. 8: Difúzní lupusová nefritis class IV + V. Globálně zesílené glomerulární bazální membrány s úseky charakteru „wireloops“ se subendoteliálními imunodepozity, loţiskově hyalinní tromby, segmentální endokapilární proliferace. Barvení P – A. Zvětšeníobjektiv 40x.
Obr.č. 9: Difúzní lupusová nefritis class IV + V. Objemná subendoteliální imunodepozita a současně rozáhlé úseky subepiteliálních imunodepozit (vpravo). Elektronová mikrofotografie.
- 31 -
Obr.č. 10: Membranózní lupusová nefritis class V. Mírná mesangiální hypercelularita a zesílené GBM. Barvení dle Jonese. Zvětšení objektiv 40x.
Obr. č. 11: Membranózní lupusová nefritis class V. Četná subepiteliální imunodepozita. Elektronová mikrofotografie.
- 32 2.7 Prognóza u systémového lupusu eythematodes Jiţ dříve bylo uvedeno, ţe močový nález je u pacientů se SLE charakterizován nefrotickým syndromem s mikrohematurií a současně je přítomna hypertenze a to asi u 40 % nemocných. Přibliţně do 10 let pak dochází asi u poloviny postiţených k vývoji terminální ledvinové nedostatečnosti, přičemţ extrarenální projevy SLE mohou být mírné. Při hodnocení aktivity ledvinového postiţení bývá velmi významnou známkou kvantitativní vzestup proteinurie, přítomnost močového sedimentu a pokles funkce. Základní a v současné době nejčastěji pouţívanou klasifikací histologického obrazu tkáně, která byla získána renální biopsií, je klasifikace ISN/RPS. Obecně lze konstatovat, ţe velmi dobrou prognózu mají nemocní s třídou II, ale také nemocní s třídou V (membranózní nefropatií). Třída III a především pak třída IV vázaná na přítomnost progredujících proliferativních změn má vţdy prognózu váţnou. Pro prohloubení přínosu hodnocení renálních biopsií byly zavedeny tzv. indexy aktivity a chronicity. Obzvláště první bod aktivity je velmi významnou známkou akutních zánětlivých změn glomerulů a můţe napomoci při výběru vhodné imunosupresivní léčby. Index chronicity je zaměřen více prognosticky. Prognosticky významné je hodnocení z hlediska délky trvání lupusové nefritidy nebo stupně změn funkce, ale také stupeň poškození a změn ve tkáni, dle toho, zda jsou reversibilní či nikoliv.[17]
2.8 Léčba lupusové nefritidy V polovině 20. století byla prognóza neléčených pacientů s proliferativní lupusovou nefritidou velmi špatná, střední doba přeţití nepřesahovala více neţ dva roky. Střední doba přeţití se v posledních 50 - ti letech značně prodlouţila a to především díky léčbě. Přesto však asi u 25 % - 30 % pacientů s difúzní proliferativní lupusovou nefritidou dojde do 20 let k terminálnímu selhání ledvin a to částečně i v důsledku relapsů onemocnění, které se vyvinou do 10 let u 46 % pacientů.Léčba lupusové nefritidy se dělí na dvě fáze:
- 33 - Indukce, coţ je období intenzivní léčby, nejčastěji trvá 3 - 6 měsíců. Cílem této léčby je dosaţení u pacienta s aktivním onemocněním významné a pokud moţno trvalé terapeutické odpovědi. - Fáze méně intenzivní léčby, která navazuje na indukci je udrţovací léčba. Tato má za úkol udrţet remisi a zabránit relapsům nebo alespoň co nejvíce sníţit jejich výskyt. Ještě v nedávné době byly jedinou obecně akceptovanou indukční léčbou lupusové nefritidy pulsy cyklofosfamidu. Teprve nedávno byly terapeutické moţnosti rozšířeny o mykofenolát mofetil, cyklosporin a v neposlední řadě o biologickou léčbu, která je zaměřena na ovlivnění funkce a počtu B lymfocytů.[18]
- 34 3. SPECIÁLNÍ ČÁST 3.1 Příprava renální biopsie k laboratornímu vyšetření K tomu, aby mohla být formulována závěrečná diagnóza, má patolog k dispozici několik druhů vyšetření (imunofluorescenční vyšetření ze zmraţené, nativní tkáně, elektronovou mikroskopii a konečně také histopatologické vyšetření pomocí světelné mikroskopie - z parafínových bloků). K histopatologickému vyšetření ledvin se odebírá bioptická punkce. Bioptická punkce je řazena mezi miniinvazivní výkony. Je to odběr tkáně, která je určena ke speciálnímu vyšetření (např. mikrobiologické, histologické). K odběru tkáně ze solidních orgánů jsou nejčastěji pouţívány TruCut jehly, které z vyšetřovaného orgánu vykrojí váleček cca o průměru 1 - 2 mm a délce 10 - 20 mm. Tyto odběry lze provádět pod kontrolou pomocí ultrazvuku (UZV) či rentgenu (RTG). Renální biopsie je ihned po odběru vloţena do vlhké komůrky (Petriho miska s gázou, která je zvlhčena fyziologickým roztokem a vloţena do chladícího boxu). Takto musí být co nejrychleji dopravena na pracoviště patologie, kde je předána odpovědnému laborantovi spolu s průvodkou o zaslání bioptického materiálu. Zde jsou kromě základních údajů o pacientovi (jméno, rodné číslo, bydliště) i další důleţité údaje jako je datum a čas odběru, kód zdravotní pojišťovny, základní diagnóza, délka trvání nemoci či případná léčba, oddělení a lékař ţádající vyšetření. Důleţitý je záznam o tom, zda je bioptický materiál nativní, či fixovaný (v tomto případě je nutno uvést druh fixační tekutiny). Laborant vyjme ledvinnou punkci na podloţní sklo (pomocí dřevěného zubního párátka, díky tomu nedochází k artefaktům a poničení tkáně), které je zvlhčené fyziologickým roztokem. Změří délku punkčního válečku a společně s lékařem pod speciálním laboratorním stereotaktickým mikroskopem zhodnotí výtěţnost vzorku a rozmístění glomerulů. Dle rozhodnutí lékaře provede laborant přikrojení punkce za účelem získání tří části (pro imunofluorescenční vyšetření, pro elektronovou a světelnou mikroskopii). Je třeba, aby kaţdá z těchto částí obsahovala glomeruly, jedině tak můţe patolog správně vyhodnotit diagnózu. Laborant provede nezbytnou administrativu, zapíše bioptický materiál do sešitu k tomu určenému a vyplní na ţádance kódy pro plátce zdravotní péče.
- 35 3.2 Imunofluorescenční vyšetření ledvinné punkce K tomuto vyšetření jsou třeba zmraţené řezy, které získáme zmraţením nativní tkáně při 25°C a nakrájením v tzv. kryostatu. Samotné imunofluorescenční vyšetření spočívá v tom, ţe na tkáňové řezy aplikujeme specifické protilátky namířené proti antigenním strukturám nacházejících se ve tkáni. Tyto protilátky jsou značené fluorochromem, jedná se tedy o přímou imunofluorescenci. Na našem pracovišti pouţíváme králičí polyklonální protilátky konjugované s fluorochromem, jejichţ výrobcem je firma Dako.
3.2.1 Funkce fluorochromu Díky světelné energii, která je předána elektronům v molekulách, dochází k jejich excitaci, a tím se přesouvají do vyšší energetické hladiny. Elektron obsahuje nadbytečnou energii, která se vyzáří při opětovném vrácení se elektronu do základního stavu. Energie, která je uvolněna v podobě fotonu, je vyzářena, coţ způsobí samotnou fluorescenci. K nejoblíbenější fluorescenčním barvivům patří FITC (fluorescein – iso – thio – kyanát) a Texas red.[5,21]
3.2.2 Fluorescenční mikroskop Typy fluorescenčních mikroskopů: Trans – fluorescenční (Transmition light fluorescent microscope) Vzorek je osvícen z druhé strany neţ je umístěn objektiv Světlo procházející excitačním filtrem dopadá na preparát ze spodu a tzv. zástinový kondenzor odráţí světlo tak, ţe dopadá na preparát z boku a díky tomu excitační světlo prochází mimo objektiv. Do objektivu se dostává pouze emitovaná fluorescence Epi - fluorescenční (Reflected light fluorescent microscope) K osvětlení vzorku dochází přes objektiv Emisní světlo se poté vrací zpět do objektivu, musíme pouţít tzv. dichroické zrcadlo, které odráţí excitační světlo do objektivu a propouští emitované světlo do okuláru. [21]
- 36 Fluorescenční mikroskop je vybaven zdrojem světla - rtuťovou nebo xenonovou výbojkou. Důleţitá je téţ vhodná kombinace excitačních a bariérových filtrů, přičemţ kombinace filtrů musí odpovídat pouţitému fluorochromu. Excitační světlo o niţší vlnové délce vede k emisi světla o vyšší vlnové délce. Excitační světlo je odfiltrováno bariérovým filtrem a emitované světlo můţeme pozorovat, případně fotografovat. [22]
Histologický nález ve imunofluorescenční mikroskopii při lupusové nefritidě Pro lupusovou nefritidu je typickým znakem tak zvaný full house, coţ je v různém rozsahu a různé intenzitě IF všech imunoglobulinů a frakcí komplementu.[8]
Obr. č. 12:Imunofluorescenční vyšetření ledvinné punkce - C1q. Zvětšení objektiv40x.
- 37 3.3 Elektronová mikroskopie Nedílnou součástí vyšetření ledvinné punkce u SLE je zkoumání ultrastruktury pomocí elektronové mikroskopie. Ke konstrukci prvního elektronového mikroskopu v roce 1931 vedlo poznání, ţe elektronový paprsek, coţ je svazek elektronů, má vlastnosti vlnění. Vlnová délka závisí na jeho energii, tento paprsek můţe být soustředěn díky magnetickému poli cívky. Při interakci elektronového paprsku s preparátem dochází k několika různým efektům, které můţeme detegovat jako signály a na kterých jsou zaloţeny různé typy elektronové mikroskopie (řádkovací, transmisní, analytická).[3]
3.3.1 Transmisní elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie je v podstatě obdobou konvenční světelné mikroskopie. Viditelné světlo (elektronový paprsek) prochází preparátem a vzniklý obraz je poté optickou soustavou zvětšen. V transmisním elektronovém mikroskopu zaostřený a vysoce urychlený paprsek prochází preparátem, který musí být velice tenký. Je třeba aby propustil alespoň 50 % elektronů. Svazek prošlých elektronů je zpracován systémem kontaktních čoček (elektromagnetické cívky) do zvětšeného obrazu preparátu, který pozorujeme. Zbytek elektronů je při interakci atomy těţkých kovů, jeţ se nacházejí v preparátu, rozptýlen nebo odraţen.[3]
3.3.2 Transmisní elektronový mikroskop V transmisním elektronovém mikroskopu se nachází obdoba osvětlovací soustavy objektivu jeţ vytváří intermediární obraz a okulár, díky němuţ dochází ke konečnému zvětšení obrazu. Zdroj elektronového paprsku tvoří katoda, coţ je wolframové vlákno. Ta se nachází v kovovém obalu s aperturou, pod kterou je apertura anodové destičky, přičemţ obě tyto apertury jsou centrované na osu elektronového paprsku. Vysoce ţhavená katoda emituje elektrony, tyto jsou díky rozdílu napětí mezi katodou a jejím obalem soustředěny při jeho apertuře. Odtud jsou díky velkému rozdílu napětí mezi obalem katody a anodou velmi urychleny a sraţeny do trubice mikroskopu. Při průchodu
- 38 elektromagnetickými cívkami s funkcí kondenzoru je paprsek soustředěn do roviny preparátu. Elektrony projdou preparátem a jsou dále zpracovány cívkami, které mají funkci objektivu a projektivu v definitivní obraz, ten je promítán na stínítko potaţené luminiscenční vrstvou.[3] Díky transmisnímu elektronovému mikroskopu můţeme rozlišit detaily aţ o velikosti 0,01 nm, coţ je hlavní výhoda oproti klasické světelné mikroskopii, kde fyzikální hranice rozlišitelných detailů je kolem 0,2µm, coţ je o několik řádů niţší zvětšení. Při pouţití transmisního elektronového mikroskopu lze zobrazit utrastrukturu buňky aţ na úrovni makromolekul. Ovšem toto je moţné jen v případě, pokud ultrastruktura buňky zůstane dobře zachována, ale na druhé straně je nutno ji vhodně vizualizovat - čímţ ji připravíme pro interakci se zobrazujícím paprskem elektronů.[3] Optická a osvětlovací soustava elektronového mikroskopu je umístěna v trubici, ve které je vysoké vakuum, které udrţují nejméně 2 pumpy. Pro elektronový mikroskop je téţ nezbytný přívod elektrické energie o vysokém napětí pro urychlení elektronů, ale také pro stabilizovaný přívod proudu, kterým se ovládají další prvky, především elektromagnetické cívky. Velmi důleţitou částí práce s elektronovým mikroskopem je pořizování dokumentace. Velkou nevýhodou je, ţe na rozdíl od preparátu, který byl zhotovený pro světelnou mikroskopii (preparát můţeme opakovaně prohlíţet bez ztráty kvality), preparát zhotovený pro účely elektronové mikroskopie díky tepelnému namáhání podléhá rychle zkáze. Proto se během prohlíţení zaznamenává obraz na citlivou vrstvu fotografického filmu, nebo je snímán kamerou a ukládán v digitalizované formě.[3]
3.3.3 Odběr materiálu pro elektronovou mikroskopii Pro účely elektronové mikroskopie odebíráme ostrou ţiletkou (tím zabráníme poškození tkáně) část ledvinné punkce o velikosti cca 1 mm, důrazně dbáme na to, aby námi vybraný a přikrojený kousek tkáně obsahoval glomerulus. Vzorek je nutno fixovat, dodrţovaní určitých zásad je přitom nutností. Materiál ihned po přikrojení vkládáme do vychlazené fixační tekutiny, čímţ je účinně sníţená enzymatická aktivita. Nejčastěji se pouţívají fixační tekutiny na bázi aldehydů (formaldehyd, glutaraldehyd). Na našem pracovišti se nám pro tyto
- 39 účely velmi osvědčil glutaraldehyd. Doba fixace je úměrná velikosti vzorku a nepřesahuje 2 hodiny. Po důkladném vyprání vzorků navazuje post fixace, coţ je vlastně druhá fixace prováděná pomocí oxidu osmičelého (OsO4). Oxid osmičelý se váţe na některé buněčné struktury (např. na lipidy) a tímto je, mimo jiné, do jisté míry vizualizuje pro pozorování v elektronovém mikroskopu. Vzorek zaléváme do umělé epoxidové pryskyřice (po polymeraci je daleko tvrdší neţ parafín), neboť jedině tak můţeme docílit toho, ţe lze vzorek nakrájet na velmi tenké (ultratenké) řezy v rozmezí 30 - 100 nm.[3]
Histologický nález v elektronové mikroskopii Při lupusové nefritidě odpovídá rozloţení a mnoţství elektrodenzních depozit příslušné třídě dle klasifikace WHO. Typické je rozloţení depozit v mesangiu, supepiteliálně, subendoteliálně, ale i intramembranózně. U jiného onemocnění neţ u SLE je velmi neobvyklé najít depozita ve všech těchto lokalizacích najednou.[8]
Obr. č. 13: Vyšetření ledvinné punkce elektronovou mikroskopií.
- 40 3.4 Světelná mikroskopie Další metodikou vyuţívanou v histopatologické diagnostice lupusové nefritidy je zpracování tkáně pro světelnou mikroskopii - z parafínových bloků. Pouţíváme jak barvení přehlednými barvícími metodami, tak metodami speciálními pro zvýraznění konkrétních struktur.
3.4.1 Barvení Tkáňový řez napnutý na podloţním skle má bělavou barvu. Prohlíţíme - li ho světelným mikroskopem, nejsme schopni rozeznat jednotlivé struktury, protoţe mají stejný index lomu. Světelná mikroskopie je zaloţena na pouţití velké palety barev, vyuţíváme toho, ţe různé části buněk a tkání váţí různá barviva a po obarvení je proto můţeme dobře rozlišit. Barviva - jsou to látky, které absorbují světlo o určité vlnové délce. Neabsorbované (odraţené) vlnové délky pak vnímáme jako barevný vjem.[3]
3.4.1.1 Typy barviv Podle afinity k určitým strukturám rozlišujeme barviva zásaditá, kyselá a metachromatická. Barviva zásaditá (bazická) – obsahují ve své molekule bazické skupiny (např. - NH2). Bazická barviva (methylenová modř, hematoxylin, krystalová violeť) se váţí na bazofilní struktury (např. buněčná jádra). Bazofilií nazýváme vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy.[9] Barviva kyselá (acidická) – často nazývaná téţ plazmatická, obsahují ve své molekule kyselé skupiny (např. –COOH, -OH). Typickými zástupci jsou eosin, Orange G, kyselý fuchsin, Ponceau. Oxyfilie je tedy vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy.[9]
- 41 Existuje ovšem i skupina barviv, jejichţ molekula obsahuje zásadité i kyselé skupiny. Tyto barviva pak nazýváme amfoterní.[3] Barviva metachromatická - pro tyto barviva je charakteristické, ţe barví některé sloţky preparátu jiným barveným tónem neţ je barevný tón barvícího roztoku, např. toluidinová modř barví granula ţírných buněk a hlen červenofialově.[9] Při barvení jsou moţné 2 postupy barvení: progresivní barvení:barvíme krátce a po kontrole mikroskopem eventuelně prodlouţíme dobu barvení. regresivní barvení: preparát přebarvíme a poté tkáň diferencujeme tzn. odstraníme přebytečné barvivo(např. kyselým alkoholem v metodě HEel).[3] Barvící metody obvykle zahrnují více pouţitých barev. Barvíme - li preparát postupně více barvivy, jedná se o barvení sukcesivní ( trichrómy, hematoxylin - eosin). Pokud preparáty barvíme v jedné barevné lázni, ve které je rozpuštěno více barviv, hovoříme o barvení simultánním (například při barvení krevního nátěru).[3]
3.4.2 Přehledné barvící metody Do této skupiny řadíme takové metody, které obarví buněčná jádra a cytoplazmu rozličným barevným tónem, ale zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně. Patří sem například Masonovy trichrómy, Azan, Weigert – van Gieson a nejpouţívanější metoda hematoxylin - eosin.[9]
3.4.2.1 Hematoxylin-eosin Metoda hematoxylin - eosin patří mezi základní, přehledné barvení, které se barví v histologických laboratořích nejčastěji. Tato metodika vyuţívá kombinaci dvou barviv, a to bazického hematoxylinu a kyselého eosinu. Hematoxylin je přírodní barvivo izolované ze dřeva Hematoxylin campechianum. Toto barvivo samo o sobě nemá barvící schopnosti, ty získá teprve oxidací (přidáním oxidačních činidel), při čemţ vzniká tzv. hematein. Ani roztok
- 42 hemateinu ještě nemůţeme pouţít k barvení, protoţe má nízkou afinitu ke tkáním. Teprve po přidání mořidla (kamence) se vytvoří komplex, který se dobře váţe na bazofilní tkáňové struktury, jako je například jaderný chromatin.[3, 9] Dle pouţitého kamence pak rozlišujeme kamencové hematoxyliny (kamenec hlinitodraselný při přípravě Mayerova hematoxylinu nebo kamenec hlinitoamonný při přípravě Harrisova hematoxylinu) nebo ţelezité hematoxyliny (např. kamenec ţelezitoamonný při přípravě Wiegertova hematoxylinu).[3] Eosin vytváří s hematoxylinem výrazný barevný kontrast (kamencové hematoxyliny barví jádra modře, ţelezité aţ modročerně), ale také barví cytoplazmu buněk a mezibuněčnou hmotu pojiv v různých odstínech růţové a červené, coţ umoţní jejich rozpoznání v mikroskopu.[3]
3.4.3 Jiné přehledné barvící metody Pomocí metody, která se nazývá Massonovy trichrómy můţeme barevně odlišit kolagenní vazivo od svalové tkáně. Tato metoda vyuţívá kombinaci tří barviv, první (bazické) obarví jádra, další (kyselé) obarví kolagenní vazivo a třetí svalovou tkáň, proto se také nazývá trichromové barvení. Rozlišujeme tři Massonovy trichromy – ţlutý, modrý a zelený. Dalšími často pouţívanými metodami přehledného barvení jsou Weigert van Gieson a metoda Azan.[9]
3.4.4 Speciální barvící metody Kromě jiţ výše zmíněných přehledných metod barvení pouţíváme v histologii řadu metod speciálních, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či tkáňový detail (průkaz např. polysacharidů, lipidů, elastických či retikulárních vláken, nukleových kyselin). Speciální metody můţeme pouţívat buď samostatně, nebo v kombinaci s přehlednými barvícími metodami. Tyto metody poskytují cenné informace o studovaných tkáních.[9]
- 43 Některé z těchto speciálních metod jsou zaloţeny na specifické afinitě (např. barvení kyselých mukopolysacharidů alciánovou modří nebo barvení elastických vláken). Jiné metody vyuţívají toho, ţe se barviva rozpouštějí v určitých látkách nacházejících se ve tkáni (např. průkaz lipidů barvivy rozpustnými v tucích). Poměrně velká skupina metod je zaloţena na schopnosti látek obsaţených ve znázorňované tkáňové struktuře (nenasycené mastné kyseliny, oligosacharidové řetězce) redukovat kovy – nejčastěji: Ag, ale také Au, či Os. Tyto metody nazýváme metody impregnační.[22] Další skupinu speciálních barvících metod tvoří metody histochemické. Jsou to chemické reakce, které neprobíhají in vitro, ale ve tkáňovém řezu. Výsledek proběhlé chemické reakce (např. oxidace – OH skupin na aldehydové) poté prokazujeme analytickou chemickou reakcí, výsledkem je barevný produkt, který můţeme pozorovat ve světelném mikroskopu. Typickým příkladem je reakce PAS, kdy prokazujeme aldehydové skupiny ve tkáni pomoci Schiffova reagens za vzniku červenofialového zbarvení.[3] Po obarvení tkáňových preparátů následuje odvodnění (alkoholem) a projasnění (xylenem). Na závěr se projasněné řezy montují pod krycí sklo pomocí montovacího media. Všechna montovací media musejí mít stejný, nebo alespoň velmi blízký index lomu jako sklo, aby na rozhraních optických prostředí v preparátu (podloţní sklo, řez, montovací medium, krycí sklo) nedocházelo k neţádoucím optickým efektům, které by případně mohly komplikovat mikroskopování.
- 44 -
Obr. č. 14 Vyšetření ledvinné punkce světelnou mikroskopií, barvení HE. Zvětšení - objektiv 40x.
3.5 Montovací média Rozpustná ve vodě (např. glycerin, glycerin ţelatina) Nerozpustná ve vodě (kanadský balzám, nebo media na bázi pryskyřic nerozpustných ve vodě.)[3, 9]
3.6 Praktické provedení zpracování ledvinné punkce Jak jiţ bylo dříve uvedeno, renální biopsie je dodána na patologii ve vlhké komůrce, která je vloţena v chladícím boxu a po jejím přikrojení získáme 3 části pro: Imunofluorescenční vyšetření Světelnou mikroskopii (z parafinových bloků) Elektronovou mikroskopii
- 45 3.6.1 Imunofluorescenční vyšetření ledvinné punkce K tomuto vyšetření jsou třeba zmraţené řezy, které získáme zmraţením nativní tkáně při – 25°C. Část punkčního válečku v délce cca 2 - 3 mm naorientujeme a zamrazíme pomocí speciálního média k tomu určenému. Krájení provádíme ve zmrazovacím kryostatu, coţ je rotační mikrotom v chlazené skříni. Alkoholem odmaštěná skla označíme jménem pacienta a zkratkou protilátky, která bude na toto sklo později aplikována. Na našem pracovišti pouţíváme k vyšetření ledvin protilátky proti:
IgA (imunoglobulin A)
IgG (imunoglobulin G)
IgM (imunoglobulin M)
C3 (sloţka komplementu C3)
Fb (fibrinogen)
Kappa (lehké řetězce)
Lambda (lehké řetězce)
C1 q
Tabulka č. 1: Seznam protilátek a jejich ředění. Protilátka
Katalogové
Doba
proti
Firma
číslo
Ředění
inkubace
IgA
Dako
F 0204
1/12,5
30 minut
IgG
Dako
F 0202
1/100
30 minut
IgM
Dako
F 0203
1/25
30 minut
C3c
Dako
F 0201
1/10
30 minut
Fb
Dako
F 0111
1/50
30 minut
Kappa
Dako
F 0198
1/40
30 minut
Lambda
Dako
F 0199
1/40
30 minut
C1q
Dako
F 0254
RTU
30 minut
- 46 Ukrojené řezy, které mají ideálně tloušťku 6 µm, zachytáváme na tyto označená skla. Vzorek krájíme tzv. postupným prořezáním, tzn. nejdříve na kaţdé sklo naneseme 1 řez a poté druhý a nakonec třetí řez. Tento postup nám zajistí, ţe na všech sklech lékař vidí postupně se prokrajující tkáňové struktury. Po nakrájení vloţíme skla s nakrájenými tkáňovými řezy do skleněné kyvety, která je oblepená náplastí, tímto je zabráněno případnému vniknutí vlhkosti do kyvety. Takto zabezpečená skla zůstávají v lednici při 4 - 8°C do druhého dne. Druhý den laborant z lednice vyjme kyvetu se skly a nechá chvíli vytemperovat na pokojovou teplotu. V mezičase naředí protilátky, tyto jsou dodávány jako koncentrát a laborant je naředí pomocí redestilované vody do poţadované koncentrace (tyto údaje udává výrobce v tzv. datasheetu) na jedno sklo se standardně aplikuje 100µl. Provádíme metodu přímé fluorescence, kdy na tkáňový řez přímo aplikujeme primární protilátku značenou fluorochromem. Před samotnou aplikací značených protilátek je nutné tkáňové řezy oţivit a to ponecháním na 5 minut ve fyziologickém roztoku. Poté laborant aplikuje protilátky na řezy, důsledně přitom dbá, aby na kaţdé předem popsané sklo byla aplikovaná příslušná protilátka. 30- ti minutová inkubace s primární značenou protilátkou probíhá ve vlhké komoře za pokojové teploty. Po 30 - ti minutové inkubaci následuje oplach fyziologickým roztokem 3x po 10minutách. Skla necháme zaschnout a montujeme do speciálního media UltraCruz Mounting medium pro fluorescenční mikroskopii. Na preparát kápneme kapku tohoto media a krycí sklíčko pomalu přikládáme na preparát. Preparáty se prohlíţejí pomocí fluorescenčního mikroskopu. Skla můţeme asi měsíc ponechat v lednici, tudíţ jsou k dispozici lékaři pro opětovné nahlédnutí např. v případě diagnostických nejasností.
3.6.2 Zpracování ledvinné punkce pro účely světelné mikroskopie Zpravidla největší část ledvinné punkce je určena pro vyšetření z parafínového bloku.
- 47 3.6.2.1 Fixace Prvním a zároveň nejdůleţitějším krokem je fixace. Fixace je šetrná a rychlá denaturace bílkovin nacházejících se v buňce pomocí chemických fixačních prostředků. Pomocí fixace zabráníme znehodnocení vzorku, které by nastalo díky autolýze tkáně (natrávení tkáně enzymy obsaţených v buňkách).[9] Na našem pracovišti se nám nejvíce osvědčil formol, rychle proniká do tkáně, dobře zachovává strukturu tkáně a také její barvitelnost. Do laboratoře je dodáván lékárnou jako 36% koncentrovaný formaldehyd, pro tento roztok se téţ pouţívá název 100% formol. Koncentrovaný formaldehyd musíme naředit pramenitou vodou a to do poţadované koncentrace coţ je 10% - 25% (coţ odpovídá 4 - 10% formaldehydu).[3] Fixační přípravky na bázi aldehydů účinkují tak, ţe se mezi bílkovinnými řetězci vytvářejí můstky, coţ vede k zesíťovatění bílkovin. Navenek se to projevuje tím, ţe bioptický materiál ve fixační tekutině ztuhne.[22] Při fixaci musíme dodrţet několik zásad.: Bioptický materiál by měl být vloţen do fixační tekutiny co nejdříve od odběru. Fixační tekutina musí být v nadbytku (ideálně 10 x větší objem, neţ je objem tkáně). Důleţitá je také doba fixace, obvykle se doporučuje fixace 24 - 48 hodin (u celých orgánů). U mikroexcizí postačí 4 - 6 hodin. Aby tkáň mohla být zalita do parafinu, musí projít procesem odvodnění, projasnění a prosycení parafínem. Toto se děje v přístroji zvaném autotechnikon. Obvykle pracuje přes noc podle předem nastaveného programu.[9]
- 48 3.6.2.2 Zpracování tkáně v tkáňovém procesoru V tkáňovém procesoru probíhá příprava tkáně pro vlastní zalití do parafínu v několika krocích 1. Fixace formolem (speciální program pro mikroexcize). 2. Odvodnění tkáně se provádí stoupající řadou alkoholů. 3. Prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafín. Po odvodnění se alkohol musí z tkáně dokonale odstranit, protoţe se v něm parafín nerozpouští. Proto se prosycuje tkáň takovou látkou, která dobře rozpouští parafín, ale zároveň se dobře mísí s bezvodým alkoholem. Z látek rozpouštějících parafín se k prosycování tkání pouţívá látek s niţším bodem varu, které se dají z tkáně dobře odstranit v parafinové lázni. U nás v laboratoři pouţíváme xylen. 4. Prosycení tkáně parafínem. Po prosycení tkáně xylenem přechází tkáňový bloček do tekutého parafínu při teplotě 60°C. Doba pobytu v parafínu se řídí velikostí bločku a prostupností tkáně. Parafín pouţíváme komerčně dodávaný.[9]
3.6.2.3 Zalévaní ledvinné punkce Přesto ţe i naše oddělení je vybaveno nejnovější přístrojovou technikou a zalévací linka patří ke standardnímu vybavení histologické laboratoře, osvědčilo se nám ruční zalití do umělohmotné komůrky, kdy laborant můţe snáze kontrolovat správnou orientaci ledvinné punkce. Takto zalitý parafínový blok se nechá ztuhnout.
- 49 3.6.2.4 Krájení parafínového bloku Před samotným krájením parafinového bloku si laborant nachystá podloţní skla, která označí jménem pacienta, bioptickým číslem a rokem a také zkratkami metod, kterými se bude punkce barvit. Paleta pouţitých metod je předem daná a mění se pouze na vyţádání lékaře. Téţ pořadí jednotlivých metod je neměnné a odpovídá celosvětově nastavenému trendu: 1. HEel, 2. GOLD, 3. P-A, 4. Jones, 5. AFOG, 6. PAS, 7. HE, 8. SRel, 9. PAS, 10. volný řez.
3.6.2.5 Zhotovení parafinových řezů Po zalití tkáně do parafinu, vzniká parafinový blok. Takto zhotovený blok krájíme na sáňkovém mikrotomu za pomoci mikrotomového, ţiletkového noţe. Blok se za pomoci neapolské svorky uchytí za pevnou část (tj. komůrka) do mikrotomu. Parafinová část bloku s tkání je blíţ noţi. Nejprve se provede tzv. zkrájení (trim) přebytečného parafinu nad tkání. Pokud je jiţ tkáň dostatečně viditelná po celé ploše, přistoupíme k samotnému krájení. Krájíme tenké řezy cca 1 µm (nebo tenčí). Pomocí tzv. kopíčka přeneseme řez na hladinu studené vody, kde můţe laborant co nejlépe tkáňový řez vyrovnat, poté je řez pomocí podloţního skla přenesen do vodní lázně s vodou o teplotě 45 - 50°C Vodní lázeň nám zajišťuje stálou (konstantní teplotu tj. 45 - 50°C). Na okraji vodní lázně je vyhřívaný teflonový pás, který má stejnou teplotu jako je nastavena na teplotu vody. Tento teflonový pás slouţí k případnému napínání řezů na skle. Z vodní hladiny řez „nalovíme“ na jiţ připravené podloţní sklo (označené rokem, shodným bioptickým číslem, jménem pacienta a zkratkou metody). Na 1 podloţní sklo dáváme standardně 4 řezy, vţdy se snaţíme, aby punkce byla na skle orientována stejným směrem. Skla poskládáme do stojánku k tomu určenému a vloţíme na 90 minut sušit do termostatu při 56°C.
- 50 3.6.2.6 Barvení parafinových řezů Po uplynutí poţadované doby provedeme tzv. odparafínovaní řezů a to působením xylenu (3 lázně po 5 min), následuje odstranění xylenu ze tkáně a to působením 3 lázněmi alkoholu. Následuje oplach destilovanou vodou a tímto máme skla přichystaná k následnému barvení. Na ledvinných punkcích barvíme tyto základní, přehledné barvící metody: hematoxylin-eosin (HE) a zelený trichróm (modifikace dle Goldnera - GOLD) Speciální barvící metody jsou: PAS, resorcin - fuchsin s dobarvením hematoxylinemeosinem (HEel), resorcin fuchsin s dobarvením Sírius Red (SRel), alcián – PAS (P - A), stříbření dle Jonese, anilin – fuchsin - Orange G (AFOG).
3.6.2.6.1 Hematoxylin - eosin Fixace: 10% formalín Odparafinování Destilovaná voda
oplach
Hematoxylin Mayerův
10 min.
Modrání - pramenitá voda
10 min.
Eosin 0,1%
1 min.
Oplach pramenitou vodou
1 min.
Odvodnění 3x alkohol
3 min.
Projasnění 3x xylen
5 min.
Montujeme pomocí montovacího media Solakryl. Výsledek barvení:
Jádra - modře
Vazivo, sval -
Erytrocyty - oranţovočerveně
červeně
- 51 Poznámky: Eosin alkoholický roztok ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0763. Hematoxylin Mayerův ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0306.
3.6.2.6.2 Massonův trichróm modifikace dle Goldnera (Průkaz kolagenních vláken)
Fixace: 10% formol
Odparafinovat Hematoxylin Weigertův
10 min.
Pramenitá voda – modrání
10 min.
Ponceau – kyselý fuchsin
5 min.
Destilovaná voda – krátký oplach 1% kyselina fosfomolybdenová
3 – 5 min.
Destilovaná voda – krátký oplach Barvící směs G5
5 min.
Osušit - neoplachovat Odvodnit – velmi krátce Projasnit 2x xylen Zamontovat Výsledek barvení:
Vazivo – zeleně aţ šedozeleně
Epitel – šedorůţově
Hlen – růţově
Erytrocyty – červeně
Nervové buňky – šedofialově
Acidofilní granula – červeně
Jádra – modročerně
Sval –oranţově červeně
5 min.
- 52 Příprava roztoků: Hematoxylin Weigertův roztoky A a B ready to use dodávány komerčně firmou MERCK, mícháme 1:1, roztok A - katalogové číslo HX957854 a roztok B - katalogové číslo HX957854.
Ponceau – kyselý fuchsin:
Ponceau
0,1g
Kyselý fuchsin
0,2g
Kyselina octová koncentrovaná
6ml
Destilovaná voda
doplnit do 300ml
Připravený barvící roztok je stálý, barví ihned, uchováváme při pokojové teplotě. Základní roztoky ke směsi G:
Světlá zeleň
5g
Destilovaná vod
95 ml
Orange G
5g
Destilovaná voda
95 ml
Příprava roztoků: Kaţdý ze základních roztoků připravujeme tak, ţe chemikálii rozpouštíme ve vodě 30 SRel. za stálého míchání a to při teplotě 70 - 80°C. Směs G5 :
Světlá zeleň ţlutavá 5% vodný roztok
5 ml
Orange G 5% vodný roztok
3,5 ml
Kyselina fosfowolframová 0,5% doplnit do
100 ml
Připravený barvící roztok je stálý, barví ihned, uchováváme při pokojové teplotě.
- 53 3.6.2.6.3 PAS (Průkaz polysacharidů) Fixace: 10% formalín Podstatou PAS reakce je oxidace polysacharidů, při které vznikají aldehydy jeţ reagují s Schiffovým reagens za vzniku fialově červeného zbarvení. Odparafinování Destilovaná voda
oplach
0,6% kyselina jodistá
5 min.
Destilovaná voda oplach Schiffovo reagens
5-10 min.
Pramenitá vodaprát
5 min.
Hematoxylin Mayerův
10 min.
Pramenitá voda oplach Pramenitá voda modrán
10 min.
Odvodnění alkohol
5 min.
Projasnění xylen
5 min.
Zamontovat Výsledek barvení: Jádra – modrá Neutrální mukopolysacharidy a glykogen - červené Příprava roztoků: Příprava 0,6% kyseliny jodisté:
Kyselina jodistá
0,6g
Destilovaná voda
99,4ml
- 54 Roztok se uchovává v lednici a není stálý. Je potřeba výměna 1x týdně. Schiffovo reagens pouţíváme ready to use dodávané firmou MERCK, katalogové číslo HX137254. Uchováváme v lednici, výměna je nutná 1x za 14 dní. Hematoxylin Mayerův ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0306.
3.6.2.6.4 Resorcin – fuchsin – Sirius Red (SRel) (Průkaz elastických vláken) Fixace: 10% formol Odparafínovaní Oplach destilovanou vodou Resorcin – fuchsin
50 min – 100 min.
Oplach pramenitou vodou Hematoxylin Weigertův
10 min.
Modrání jader v pramenité vodě
10 min.
1% Sirius Red (Saturnová červeň)
15 min.
Preparát se osuší pomocí filtračního papíru Odvodnění:
3x
alkohol
5 min
Projasnění:
3x
xylen
5 min
Zamontovat. Příprava roztoků:
Sirius Red 1% vodný roztok Sirius Red F 3 BA – 10 ml (moţno i Sirius Red F 3 B) Nasycený vodný roztok kyseliny pikrové – 90 ml Stálost cca 1 měsíc.
- 55 -
Resorcin-fuchsin Resorcin
12g
Fuchsin bazický krystalický
4g
Destilovaná voda
400ml
Chlorid ţelezitý29%
50ml
96% alkohol
400ml
HCl koncentrovaná
8ml
4g bazického fuchsinu, nejlépe krystalického, rozpustíme za tepla a stálého míchání ve 400ml 3% vodného roztoku resorcinu. Za varu a stálého míchání přidáváme po kapkách 50ml 29% chloridu ţelezitého a vaříme 5minut. Po zchladnutí přefiltrujeme, sraţeninu i s filtračním papírem usušíme v termostatu (24hodin). K suché sraţenině přidáme 400ml čistého 96% alkoholu a zahříváme ve vodní lázni, aţ se sraţenina rozpustí. Necháme zvolna zchladnout. Studený roztok přefiltrujeme a doplníme do 400ml 96% alkoholem. Přidáme 8ml HCl koncentrované. Uchovává se při pokojové teplotě, je stálý. Hematoxylin Weigertův roztoky A a B ready to use dodávány komerčně firmou MERCK, mícháme 1:1, roztok A - katalogové číslo HX957854 a roztok B - katalogové číslo HX957854.
Výsledek barvení:
Jádra – modročerně
Erytrocyty – ţlutě
Sval – ţlutě
Kolagen – červeně
Elastika - fialovočerveně
- 56 -
3.6.2.6.5 Resorcin – fuchsin s dobarvením hematoxylinem - eosinem – HeeL (Průkaz elastických vláken)
Fixace: 10% formol
Odparafínovaní Resorcin-fuchsin
50 min. - 100 min.
Destilovaná voda
2x oplach
Hematoxylin Mayerův
10 min.
Destilovaná voda
2x oplach
Pramenitá voda – modrání
5 min.
Eosin
1 min.
Oplach pramenitou vodou Odvodnění 2x alkohol
5 min.
Projasnění 2x xylen
5 min.
Zamontovat Výsledek barvení:
Elastická vlákna – fialově
Jádra – modře
Cytoplazma - červeně
Příprava roztoků:
Resorcin - fuchsin
Resorcin
12 g
Fuchsin bazický krystalický
4g
Destilovaná voda
400 ml
Chlorid ţelezitý29%
50 ml
96% alkohol
400 ml
HCl koncentrovaná
8 ml
- 57 -
4g bazického fuchsinu, nejlépe krystalického, rozpustíme za tepla a stálého míchání ve 400ml 3% vodného roztoku resorcinu. Za varu a stálého míchání přidáváme po kapkách 50ml 29% chloridu ţelezitého a vaříme 5minut. Po zchladnutí přefiltrujeme, sraţeninu i s filtračním papírem usušíme v termostatu (24hodin). K suché sraţenině přidáme 400ml čistého 96% alkoholu a zahříváme ve vodní lázni, aţ se sraţenina rozpustí. Necháme zvolna zchladnout. Studený roztok přefiltrujeme a doplníme do 400ml 96% alkoholem. Přidáme 8ml HCl koncentrované. Uchovává se při pokojové teplotě, je stálý.
Eosin alkoholický roztok ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0763. Hematoxylin Mayerův ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0306.
3.6.2.6.6 Jones (Průkaz glomerulárních membrán)
Fixace:10% formol Odparafínování Oplach destilovanou vodou 1% kyselina jodistá
10 min
Oplach destilovanou vodou
10 min
Roztok stříbra při 56°C
30 min - 120 min (řezy
musí být načernalé!) Oplach destilovanou vodou 0,2% chlorid zlatitý
30 sekund - 2 min
Oplach destilovanou vodou 3% sirnatan sodný
2 min
Oplach pramenitou vodou
10 min
Hematoxylin Mayerův
10 min
Modrání jader pramenitá voda
10 min
Eosin
1 min
- 58 Oplach destilovanou vodou Odvodnění alkohol
3 x 5 min
Projasnění xylen
3x 5 min
Příprava roztoků: Roztok stříbra: 40 ml 3% Hexamethylen - tetramin + 5ml 5% dusičnanu stříbrného (AgNO3), protřepeme (zmizí bílý zákal), + 5ml 3% boraxu, zfiltrujeme a dáme do termostatu předehřát při 56°C. pozn: pouze na jedno pouţití! 3% sirnatan sodný: 3g sirnatanu sodného rozpustíme v100 ml destilované vody. 0,2% chlorid zlatitý 0,2ml chloridu zlatitého rozmícháme ve 100 ml destilované vody. Eosin alkoholický roztok ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C0763 Hematoxylin Mayerův ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0306. Výsledky barvení:
Bazální membrány glomerulů, kanálky a retikulum - černě
Jádra - modře
3.6.2.6.7 Anilin – fuchsin – Orange G ( AFOG) (Průkaz proteinů)
Fixace: 10% formol Odparafínování Alkohol 80%
oplach
Bouinův roztok (v termostatu) 57°C
45 min.
Bouinův roztok (pokojová teplota)
30 min.
Alkohol 80%
do odbarvení řezů
- 59 Destilovaná voda
oplach
Hematoxylin Weigertův
10 min.
Pramenitá voda teplá
10 min.
Kyselina fosfomolybdenová
5 min.
Destilovaná voda
oplach
AFOG (anilin-fuchsin-orange-G)
8 min.
Destilovaná voda
oplach
Odvodnění alkohol
5 min
Projasnění xylen
3 x 5 min.
Zamontovat
Výsledek barvení:
Jádra – hnědočerně
Cytoplazma – šedoţlutě, oranţově
Mesangiom – modře
Basální membrána – bleděmodře
Kolagen – modře
Erytrocyty – ţlutooranţově
Fibrin, mikrotromby – červeně
Příprava roztoků:
AFOG: 0,5g anilinové modře na 100ml destilované vody, přidáme 1 g oranţ G + 1,5g kyselého fuchsinu S. Hotový roztok upravíme na pH - 1,09 pomocí 25% HCl a Na OH (asi 2,5 – 3 ml) BOUIN: Obnovit měsíčně Hematoxylin Weigertův roztoky A a B ready to use dodávány komerčně firmou MERCK, mícháme 1:1, roztok A - katalogové číslo HX957854 a roztok B - katalogové číslo HX957854.
- 60 3.6.2.6.8 Alciánová modř +PAS (P - A) Fixace: 10% formol Odparafínování Destilovaná voda
oplach
3% kyselina octová
oplach
1% alciánová modř
35 min
3% kyselina octová
oplach
Destilovaná voda
10 min
Schiffovo reagens
12 min
Pramenitá voda
10 min
Hematoxylin Mayerův
10 min
Pramenitá voda
10 min
Odvodnění alkohol
3 x 5 min
Projasnění xylen
3 x 5 min
Zamontovat Výsledek barvení:
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Glykogen - růţový
Příprava roztoků: 3% kyselina octová: 3 ml kyseliny octové + 97 ml destilované vody Alciánová modř:
1% alciánová modř v 3% kyselině octové
1% kyselina jodistá: 1g kyseliny jodisté +100 ml destilované vody Schiffovo reagens pouţíváme ready to use dodávané firmou MERCK, katalogové číslo HX137254. Hematoxylin Mayerův ready to use dodávaný firmou DIA PATH, katalogové číslo C 0306
- 61 4. Experimentální část
4.1 Popis experimentu Pro statistické vyhodnocení souboru pacientů postiţených lupusovou nefritidou jsem čerpala informace z výsledkových protokolů ledvinných punkcí, které byly vyšetřeny v naší laboratoři I.PAÚ ve Fakultní nemocnici u sv. Anny v Brně v období únor 2004 – červenec 2011. Tento soubor 33 pacientů byl vybrán na základě stanovení diagnózy lupusové nefritidy pomocí histopatologických vyšetřovacích metod: světelné mikroskopie, elektronové mikroskopie a imunofluorescenčního vyšetření. Soubor je rozdělen na muţe (4 pacienti), ţeny (19 pacientek) a děti (10 pacientů - 8 dětí ţenského pohlaví, 2 děti muţského pohlaví, hranice pro dětský věk je 19 let). Provedla jsem analýzu nálezů u sledovaného souboru pacientů, vyhodnotila jsem zastoupení jednotlivých tříd lupusové nefritidy a také jsem provedla analýzu souboru pacientů vzhledem k věku a pohlaví. Vzhledem k malému počtu jedinců v souboru, je provedena pouze základní analýza dat pomocí počítačového softwearu Excel, Pearsonova korelačního koeficientu, T-testu a intervalu správnosti.
- 62 5. Výsledky Soubor 33 pacientů byl vyšetřen pomocí světelné mikroskopie, elektronové mikroskopie a imunofluorescenčního vyšetření. Na základě těchto vyšetření byla stanovená diagnóza lupusové nefritidy u 4 muţů (12,12 %), 19 ţen (57,58 %), 10 dětí (30,30 % - z toho 2 chlapci - 6,06 % a 8 děvčat-24,24 %).
Tabulka 2. Přehled vyšetřovaných pacientů se SLE na I.PAÚ za období 2004- 2011.
Tabulka č. 3: Výskyt SLE v souboru vyšetřovaných pacientů, vyjádřeno v procentech.
- 63 Graf č. 1:Grafické znázornění výskytu SLE v souboru vyšetřovaných pacientů.
- 64 Tabulka č. 4: Soubor pacientů, jejich pohlaví, stupeň postiţení, věk a rok vyšetření.
- 65 Graf č. 2:Grafické znázornění tabulky č. 4.
Dále se zjistilo ţe: class II
byl zachycen u 3 pacientů (9,09 %)
class III
byl zachycen u 8 pacientů (24,24 %)
class IV
byl zachycen u 15 pacientů (45,45 %)
class V
byl zachycen u 4 pacientů (12,12 %)
class III+V
byl zachycen u 2 pacientů (6,06 %)
class IV+V
byl zachycen u 1 pacienta (3,03 %)
class I a VI
nebyl zachycen ţádný jedinec (0,00 %)
- 66 Nejvíce zastoupená skupina (IV) lupusových lézí byla dále rozdělena na podskupiny dle výskytu aktivních (a) aktivních i chronických (a/c) a čistě chronických (c) lézí. Procentuální zastoupení u class IV: class IV (a) bylo zachyceno 7 pacientů (46,67 %) class IV (a/c) bylo zachyceno 6 pacientů (40,00%) class IV (c) byli zachyceni 2 pacienti (13,33%) Tabulka č. 5: Zastoupení jednotlivých tříd lupusové nefritidy ve vyšetřovaném souboru.
Graf č. 3: Grafické znázornění tabulky č. 5.
- 67 Tabulka č . 6: Statistické vyhodnocení, T-testu a Pearsonův korelační koeficient.
- 68 6. Závěr
Soubor 33 pacientů 4 muţi, 19 ţen, 10 dětí (2 chlapci, 8 děvčat) postiţených lupusovou nefritidou byl vyšetřen v období únor 2004 – červenec 2011 na I. PAÚ ve FN u sv. Anny v Brně.
Celý soubor pacientů postiţených lupusovou nefritidou byl vyšetřen pomocí světelné mikroskopie, elektronové mikroskopie a imunofluorescence.
Bylo zjištěno, ţe v tomto 33 členném souboru bylo nejvíce zastoupeno postiţení lupusovou nefritidou class IV, kdy stupeň tohoto postiţení má 15 pacientů z celkového počtu 33, coţ je 45,45 %.
Dále bylo zjištěno, ţe nejvíce pacientů s lupusovou nefritidou v tomto souboru je ve věku 20 - 30 let.
Byla zjištěna častější predilekce u ţen a dětí ţenského pohlaví (19 ţen, 8 děvčat)
Tyto dva zásadní poznatky - výskyt lupusové nefritidy ve 2. – 3. dekádě ţivota a častější výskyt u ţen korelují s údaji udávanými v odborné literatuře. I kdyţ jde vývoj medicíny neustále kupředu, při diagnostice lupusové nefritidy bude mít
histopatologické vyšetření vţdy své nezastupitelné místo.
- 69 7. Seznam použité literatury 1. BARTUŇKOVÁ JIŘINA, HOŘEJŠÍ VÁCLAV, Základy imunologie, druhé vydání, ISBN 80-7254-215-X, Triton 2002, str. 55 - 59. 2. GOMOLČÁK PAVOL, Základy imunohistochemie v patologii, vydání první, ISBN 807013-239-6, T.D.V.Vladimír Dilhof 1997, str.10 - 12. 3. JIRKOVSKÁ MARIE, Histologická technika, pro studenty lékařství a zdravotnické techniky, první vydání, ISBN80-7262-263-3, Galén 2006, str. 16. - 18, 27 - 38, 66 - 72. 4. JOHN C., NOUZA K., Imunologie zdraví a nemoci, Avicenum 1987, str. 61 - 62, 101 105, 215. 5. LITZMAN JIŘÍ, FREIBERGER TOMÁŠ, KRÁL VLASTIMIL, Základy vyšetření v klinické imunologii, první vydání, ISBN 978-80-210-4227-8, Masarykova univerzita, Brno 2011, str. 20 6. NEČAS OLDŘICH, Obecná biologie, učebnice pro lékařské fakulty, druhé vydání Avicenum 1989, str. 97. 7. NOUZA KAREL, NOUZA MARTIN, Imunologie 98, druhé vydání, ISBN 80-7262-0126, Galén 1999, str. 78. 8. TEPLAN VLADIMÍR a kolektiv, Praktická nefrologie , druhé., zcela přepracované vydání, ISBN-80-247-1122-2, GRADA Publishing, str. 155 - 157 9. VACEK ZDENĚK, Histologie a histologická technika, první vydání, ISBN 80-7013-2027, IDPVZ Brno 1996, str. 68 - 73, 77 - 81.
10. www.trendyzdravi.cz (28. 11. 2011)
11. www.biochemie.upol.cz (3. 1. 2012)
- 70 12. http://www.medicina.cz/odborne/clanek.dss?s_id=4729 (10. 3. 2012)
13. www.zdn.cz (28. 11. 2011)
14. http://www.zdrava-rodina.cz/med/med1098/med1098_45.html (3. 1. 2012)
15. http://www.zdn.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/leceni-lupusove-nefritidy-144544 (28. 11. 2011)
16. Kidney inernational, Vol. 65 (2004), pp.521-531), The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited), dostupný na : http://jasn.asnjournals.org/content/15/2/241.full.pdf+html (28. 11. 2011)
17. HANS- JOACHIM ANDERS, Journal of the American Society of nephrology,Toll-Like Receptors and Danger Signaling in Kidney Injury, dostupný na: http://jasn.asnjournals.org/content/21/8/1270.full (10. 3. 2012) 18. Prof. MUDr. TESAŘ VLADIMÍR, Postgraduální nefrologie, Ročník VII, číslo 4,září 2010, dostupný na : http://www.transplant.cz/vzdelavani/2010/10_04_02.pdf (26. 11. 2011)
19. J Indian Rheumatol Asocc 2004 : 12 : 11 - 15, Sameet Agrawal Senior resident, Department of Imunology, LUPUS NEPHRITIS: AN UPDATE ON PATHOGENESIS Dostupný na : http://medind.nic.in/jaa/t04/i1/jaat04i1p11.pdf (20.2.2012) 20. www.lekarskyslovnik.cz (1. 3. 2012)
21. http://www.bc.cas.cz/doc/ekotech/study/Fluorescencni-a-konfokalni-mikroskopie.pdf (27. 11. 2011)
22. www.atlases.muni.cz (27. 11. 2011)
23. http://www.nadaceledviny.cz/informacni-brozurky-systemovy-lupuserythematosus.html?idAktualni=1440&jazyk=cz (10. 3. 2012)
