111. BAIUIN DAN METODA
1) Hewan coba
Hewan
coba
yang
macaaues
jenis
dipilih atau
Indonesia, diperoleh dari C.V.
adalah
kera
ekor
panjanq
pacaca fascicularis, asal dari
Primata Indonesia, Jakarta.
Seluruh kera berjumlah 26 ekor, terdiri atas 17 ekor kera jantan dan 7 ekor kera betina. Untuk percobaan aterogenesis dipilih berumur 6-7 tahun
dengan bobot badan
penyakit
termasuk
parasit.
Sedangkan
tuberkulosa, kera
4.5
-
kera
jantan
5.5 kg,
kera betina
bebas dari
diberi vaksinasi dan obat anti
betina
disediakan
sebagai kera pen-
damping, bebas dari penyakit dan diberi vaksinasi parasit,
yang
disediakan
dan obat anti
tanpa memperhatikan bobotnya
dan umur. Kera didalam penelitian ini dibagi dalam 3 kelompok. Kelompok I. terdiri atas 3 kera jantan
dan 1 kera betina
dipakai dalam penelitian pendahuluan di Tangerang selama 10 bulan
antara
bulan Juni 1987
sampai dengan bulan April 1988. Kelompok IS. terdiri atas 12 kera jantan dan 6 kera betina, dipakai
dalam penelitian utama
Februari 1989
sampai dengan
antara bulan
bulan Juni 1990
di Jurusan Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas
Kedokteran
Bogor, Bogor.
Hewan,
Institut
Pertanian
Kelompok 111. terdiri atas 2 kera jantan yang diberi pakan biasa (ubi, kentang dan pisang), tanpa cekaman, tanpa perlakuan yang dipakai sebagai kontrol. 2) Pakan Pakan kera jantan
(sebagai sasaran aterogenesis) dalam
penelitian ini adalah telur ayam rebus (60 gram/butir); 3 butir sehari.
minimal
Setelah telur dimakan, diberi tambahan makanan
dalam bentuk dog food khusus (Royal Canin) dan air ad libitum.
Tabel 3. Kandungan 100 gr telur (Dir-gizi 1981 dan Ned.V.M.
............................................................ Senis telur I k kal 1 Protein (gr) 1 lemak ............................................................ Telur ayam - Kuning telur - Putih telur Telur rebus Telur bebek Kuning telur - Putih telur
13 16 11
151-162 361 44 - 50
146 178-189 383-398 44 - 54
-
14
13 17 11
............................................................
1983) (gr)
I
11
-33 10 14 35
-
Konsumsi dog food rata-rata per ekor kera jantan adalah 20
-
30 gram/hari (kandungan kalori 3 kilokalori/gram)
Tabel 4. Susunan dog food (Royal Canin)
.................................................................
Unsur
!
Protein
I
21%
Lemak
I
6%
Serat
!
4%
'
dog food biasa
!
dog food khusus
Kera betina di dalam kandang yang sama dibiarkan
telur ayam rebus atau dog food ditambah air ad libitum.
I
Susunan Kera didalam kandang. a) Penelitian pendahuluan 3 kera jantan ditempatkan dalam 1 kandang "Yw berukuran 2 x 1.5 x 2 . 5 m3,
setelah diobservasi selama 2 minggu,
masing-masing kera jantan diberi tanda
A,
B dan C, ke-
ra A adalah kera yang paling dominan, sedangkan kera C adalah kera yang paling mengalah. Kera betina yang diberi tanda D
kemudian dimasukkan kedalam kandang Y,
sedangkan kera B
dan
C
dikeluarkan dari kandang Y,
setelah dibiarkan selama 2 minggu, kera
A
dikeluarkan
dari kandang Y, masuk ke dalam kandang X yang berukuran 1.2
x
0.6
x
0.75
m3, kera
C
dimasukkan ke dalam kan-
dang Y, (gambar 20).
Kandang X
Kandang Y Gambar
20.
Kandang pemisah kera dominan
Sekat antara kandang X dan kandang Y terdiri atas tripleks yang berlubang-lubang kecil sehingga kera
A
di
dalam kandang X (karena kecil) mudah melihat kera-kera di dalam kandang Y , sedangkan karena kandang Y berukuran besar kera C dan kera D tidak mudah melihat kera A. b) Penelitian utama Dibuat 6 kandang, masing-masing berukuran 2x1.5x2.5 (Gambar 21, betina,
22)
berisi 3 kera
susunan anggota kera
dengan bagan pada gambar 23.
jantan dan jantan diubah
1
m3
kera
sesuai
Gambar 21. Sewaktu adaptasi
Gambar 22. Sewaktu penyelidikan
............................. 1 2 3 ............................. 4 5 6 ............................. ............................ 10 7 11 8
[
12
2---------------------------1
9
3
Gambar 23. Bagan pemindahan kera jantan setiap 2 minggu
4) Cara memelihara kera dan kanddng
Kera-kera
dan kandang
dipelihara oleh 2 pengawas yang
terlatih untuk menangkap kera, masing-masing pengawas bergantian mengawasi makanan yang dimakan oleh kera-kera dan membantu menangkap kera-kera bila sudab waktunya untuk di pindah, diperiksa darahnya, diperiksa EKG
atau diberi EDTA per infus.
Pemeriksaan
dan pemeliharaan kesehatan dan vaksinasi
di bantu oleh seorang
dokter hewan, sedangkan pengambilan darah
dan EKG dibantu oleh
seorang ahli biologi beserta beberapa mahasiswa Fakultas Kedokteran Hewan dari Intitut Pertanian Bogor, Bogor. Kandang-kandang dibersihkan setiap hari, dengan semprotan air dan sabun, lantai-lantai kandang disikat bila perlu, agar tidak kotor. Pembedahan pada akhir penelitian dilakukan secara aseptik dibantu seorang perawat.
Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. dengan maksud untuk membuat
1)
kera lacaca
Penelitian pendahuluan dilakukan
mencoba menerapkan metoda Kaplan (1985)
fascicularis menjadi aterosklerosis dalam
waktu yang relatif singkat; 2) melatih menangani dan memelihara hewan coba Macaca
fascicularis; 3)
mencari cara
dan
takaran
optimal pemberian EDTA: 4) mengetahui biaya yang dibutuhkan untuk penelitian utama. Penelitian pendahuluan dilaksanakan di
Tangerang
(Yayasan
Riset Primata Indonesia), selama sepuluh bulan dari bulan Juni 1987
"
sampai dengan bulan April 1988, dengan 3 kera jantan dan 1 kera betina.
1
*
Penelitian utama
dilaksanakan
di
Jurusan Fisiologi dan
Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. awal
Penelitian dilaksanakan selama limabelas bulan, dimulai Februari 1989 sampai dengan ahir Hei 1990 dengan
12 kera
jantan dan 6 kera betina. I) Percobaan aterogenesis.
Percobaan
pemberian
pakan
aterogenik dan
cekaman
dimulai 2 minggu setelah masa adaptasi. a) Pakan
aterogenik
yang diberikan adalah pakan yang
berkolesterol tinggi, terdiri atas;
-
-
3
-
20
4 butir telur ayam rebus per hari
-
30 gram Dog food khusus merk Royal Canin
air ad libitum.
Perhitungan kadar kolesterol dan kalori dalam makanan; 1. 3 butir telur ayam rebus.= 180 gram, mengandung 16
-
18 gr lemak (9
-
10 gr lemak/100 gr telur)
dan 270 kalori (146 kalori/100 gram telur). 2. 20
-
30
gram dog food khusus mengandung 60
-
90
kalori (3 kalori/gram dog food khusus).
60 -
total; ad 1 + ad 2 = 330
360 kalori dalam satu
hari. Jadi, rata-rata
70 kalori/kg BB.
3. kandungan kolesterol untuk 3 butir telur;
450 x 1'8
= 810
mg kolesterol/hari
berarti kandungan kolesterol = > 2 mg/kalori.
4.
kandungan lemak dari telur dan dog food adalah 20 gram/hari (telur: 16 3 gram),
- 18 gram + dog food
ini berarti 50% dari total kalori
adalah terdiri atas lemak. b) Cekaman yang menerus. 1) cara membuat cekaman pada penelitian pendahuluan
adalah dengan cara mengisolasi kera dominan A ke dalam kandang X, dari mana kera A dapat melihat ke dalam kandang Y yang terisi kera C dan kera betina D, sehingga terjadi cekaman karena :
2)
iri hati kemarahan secara fisik tidak berdaya.
Dalam penelitian utama,
cekaman secara terus
menerus terjadi disebabkan adanya persaingan berulang-ulang karena susunan ketiga anggota kera jantan dalam satu kandang berubah-ubah setiap 2 minggu. Yang menang akan mempertahankan status sosial sebagai kera dominan, sedangkan yang kalah menjadi frustrasi. 11) Cara menangkap kera. Agar dapat menimbang,
mengambil darah, dan pemberian
EDTA secara infus, maka kera harus ditangkap yaitu dengan cara memegang ekornya, sambil ditarik, agar kera menjadi takut
dan
memegang sesuatu, diam ditempat. Kemudian dengan tangan yang lain bagian belakang lehernya dapat dipegang, tertangkaplah kera tersebut dengan 2 tangan (bersarung tangan karet).
Cara ini dipakai
untuk memindahkan kera dari 1 kandanq ke kandang lain. Bila kera tersebut perlu untuk diambil darahnya, ditim-
bang atau diinfuse EDTA, saat kera ditarik ekornya, dalam posisi tegang dan diam, dapat disuntik (pada daerah glutealnya) intramuskuler obat ketalar sebanyak
0.5
secara
cc (takaran 1 mg/kg berat
badan, 1 cc = 10 mg ketalar). Setelah disuntik, ekor kera dilepas, menunggu kera tertidur,
kemudian diangkat ke meja untuk diambil
darahnya, ditimbang atau diberi infus EDTA. 111). Cara mengambil darah setelah kera tertidur.
-
Daerah tungkai dicukur, agar kulit terlihat bersih, cari vena yang teraba atau terlihat didaerah dorsal kemudian
dipunksi
dengan
jarum
untuk
diambil
darahnya.
-
Cara yang lebih mudah adalah punksi vena femoralis yang ada dilipatan paha inguinal, lokasi vena biasanya terletak medial dari arterinya yang mudah teraba karena ada pulsasi. Darah yang diambil dikirim ke laboratorium untuk pemeriksaan (cara fotometrik) :
1) Total serum kolesterol, secara rutin diperiksa. 2) Serum trigliserida, tidak rutin 3) HDL, tidak rutin
4) LDL, tidak rutin 5)
Serum kalsium, pemeriksaan secara random untuk menjaga terjadinya hipokalsemi
6) Serum ureum, pemeriksaan secarg random untuk meli-
hat adanya toksisitas ginjal. (lihat lampiran 14, 15, 16, 17, dan 18).
IV). Cara memeriksa EKG. Untuk perekaman elektrokardiogram digunakan alat
Yang diperiksa adalah Lead I, 11, I11
dick EK-8".
AVF,
kera dalam keadaan tidur,
"Bur-
dan AVR, AVL,
setelah disuntik obat ketalar.
9 ekor kera yang terdiri atas 2 kelompok, 5 ekor kera jantan yang
dikelasi dibandingkan dengan 4 ekor kera jantan lasi.
yang tidak dike-
Perbandingan EKG dilakukan pada bulan ke 3 dan bulan ke 14
dihitung dari awal percobaan. Data yang diperoleh dengan membuat rataan data dari 3 siklus jantung. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap,
se-
dangkan uji untuk melihat ada atau tidak ada pengaruh dari perlakuan adalah dengan menggunakan analisis kesamaan beberapa rata-rata (Sudjana, 1984). Apabila hasil pengujian tersebut menunjukkan adanya pengaruh, maka selanjutnya dilakukan analisis perbandingan kesamaan rata-rata dengan uji t-student secara berpasangan,
dengan
taraf nyata 5% dan 1% (lihat lampiran 19). V). Infus EDTA, Karena
perlu waktu selama 4 jam,
tambahan obat atropin 0.25 mg
dengan cara
untuk mencegah terjadinya hipersalivasi
kera tersebut diberi suntik intramuskuler,
dan
hipersekresi lendir
maupun mencegah terjadinya spasme daerah glotis. Valium diberikan secara intravena melalui saluran infus 5 mg setiap jam, agar kera tetap tidur.
- Cara pemberian EDTA. EDTA yang dipakai adalah Na2-EDTA 15% dengan pH 7 (6.5
-
7.5).
Perlu diutarakan bahwa hasil dari penelitian pendahuluan mengenai toleransi EDTA adalah : Na2EDTA
50 mg/kg berat badan dilarutkan dalam 100 cc
glukosa 5% diberikan per infus 40 tetes/menit. Pemberian satu kali dengan cara diatas tidak menyebab kan kejang-kejang dan dapat diterima oleh kera B, terendah adalah 4.9 pada akhir pemberian EDTA.
serum
kalsium
Walaupun demikian
pemberian berulang dan kontinyu 2x/minggu menyebabkan terjadinya kematian pada kera nomor 4
(setelah lox EDTA)
disebabkan oleh
terjadinya perdarahan otak, kejadian ini mengakibatkan perubahan dalam cara pemberian EDTA menjadi : 50 mg/kg berat badan dalam 250 cc glukosa 5% dengan
kecepatan 20 tetes/menit. Kera nomor 1 dalam percobaan selanjutnya diganti menjadi kera nomor 4, mulai menerima EDTA pada bulan Juni 1989 dan mendapat 21 x EDTA per infus. Pada saat yang bersamaan, darah dapat diambil untuk pengamatan sebelum dan/atau sesudah pemberian EDTA. Pemeriksaan kalsium, ureum darah, kolesterol, LDL, HDL, trigliserida, haemoglobin
dan leukosit dilakukan sebagai penga-
matan terjadinya komplikasi. Elektrokardiografi dapat dilakukan sewaktu-waktu sebagai pengamatan keadaan miokard. Jadwal pemberian EDTA pada penelitian utama adalah sebagai berikut :
-
-
1 bulan setelah diberi pakan berkolesterol tinggi dan cekaman, EDTA diberi 2x/minggu sebanyak 10 x disusul 1 x/minggu selama 3 bulan sebanyak 12 x disusul 1 x/bulan selama 9 bulan sebanyak 9 x.
Jadwal kegiatan
VI). Cara mengukur derajat aterosklerosis. Akhir Setelah
bulan
Mei
1990, pemberian
istirahat selama 1 minggu,
EDTA
dihentikan.
kera-kera dari
grup kontrol
maupun grup kelasi dibedah dalam keadaan bius umum dengan ketalar. Jantung, aorta ascendens, cabang karotis dan arkus aortae serta a.orta descendens diangkat untuk diperiksa secara makroskopis maupun secara mikroskopis. Cara menilai dan data-data yang dikumpulkan; 1) Secara makroskopis mengukur luasnya permukaan ateroma
dan luas infark jantung, dilakukan oleh 3 orang bersama-sama, menurut konsensus dan empirik diberi angka derajat aterosklerosis sebagai berikut;
a. Aorta
(0)
= tidak terdapat deposit kolesterol
(+I) = deposit kolesterol pada pemukaan
< 100 mm2.
intima total
(+2) = deposit kolesterol pada permukaan
intima total (+3) =
> 100 mm2
deposit kolesterol pada permukaan intima total
> 100 mm2 disertai
adanya fibrosis (+4) = deposit kolesterol pada permukaan
intima total
> 100 mm2 disertai
adanya kalsifikasi. b. Karotis (0) = tidak terdapat deposit kolesterol (+I) = deposit kolesterol
c 5 mm2
(+2) = deposit kolesterol
> 5 mm2
( + 3 ) = deposit kolesterol
> 5 mm2 disertai
-
fibrosis
(+4) = deposit kolesterol
> 5 mm2 diser-
tai fibrosis dan kalsifikasi. 2) Secara mikroskopis dLukur tebalnya ateroma dan penga-
matan infark jantung oleh Bagian Patologi Universitas Padjadjaran, Bandung
dan Institut Pertanian Bogor,
Bogor, masing-masing memberi interpretasi tanpa mengetahui kera yang diperiksa tergolong kera yang dikelasi atau tidak.
-
Secara histo-patologis melihat adanya ateroma dalam intima pembuluh darah koroner.
66
- Memeriksa
jaringan otot jantung secara mikroskopis
ada atau tidaknya infark serta derajat kerusakan sel jantung. a. Koroner
Derajat aterosklerosis koroner dinilai dengan cara mikroskopis
oleh
ahli Patologi
secara konsensus dibuat gradasi dari 0 , 1+, 2+, 3+ dan 4+. 0
=
bersih, tidak ada kelainan
1+ = penebalan 2+ =
< 1/4 lumen
meliputi 1/4
3+ = 50
-
-
1/2 lumen
75% lumen tersumbat oleh penebalan
aterosklerosis 4+ =
75% sampai 100% tersumbat.
b. Infark jantung
.
Dinilai dengan makroskop?~ dan mikroskopis, diberi nilai sebagai berikut : 0
=
tidak terdapat infark jantung
1+ = infark subendokardium atau subepikar-
dium kecil 2+ =
infark cabang segmen kecil
-
transmural
3+ = infark bagian distal cabang segmen besar;
meliputi bagian distal salah satu dari :
4+ =
-
arteri anterior descendens kiri
-
arteri sirkumfleks
-
arteri koroner kanan
infark meliputi 2 cabang segmen besar bagiar distal atau 1 cabang besar daerah proksimal.
3). EKG diperiksa lagi sebelum dibedah (nekropsi) seba-
gai rekaman terahir.
VII). Analisis data hasil dari EDTA Data Terdiri
atas
diolah
dengan
menqqunakan uji Mann-Whitney.
2 kelompok contoh berukuran tidak sama dan diuji
secara satu arah,
kelompok kelasi terdiri atas 6 ekor kera,
sedangkan kelompok kontrol terdiri atas 5 ekor kera lampiran 21 dan 22).
( lihat
