Leyweg 299, 2545 CJ The Hague PO box 43515, 2504 AM The Hague Tel. +31 (0) Fax +31 (0)

Leyweg 299, 2545 CJ The Hague PO box 43515, 2504 AM The Hague Tel. +31 (0)70 367 45 45 Fax +31 (0)70 367 08 68 E-mail: [email protected]

TRANSIENT MYELOPROLIFERATIVE DISEASE (TMD) IN CHILDREN WITH DOWN SYNDROME

A DUTCH CHILDHOOD ONCOLOGY GROUP PROTOCOL PART A: SCREENING NEWBORNS WITH DOWN SYNDROME FOR TMD PART B: TREATMENT AND FOLLOW-UP OF CHILDREN WITH DOWN SYNDROME AND TMD

INCLUSIEF AMENDEMENT 1, DD 13-02-2009

SKION Versie 2.0 (februari 2009) Implementatiedatum :

2

STICHTING KINDERONCOLOGIE NEDERLAND Transient Myeloprofilerative Disease (TMD) in children with Down Syndrome RAAD VAN TOEZICHT

Prof. Dr. R. Pieters, voorzitter

Dr. M.B. Bierings, secretaris Prof. Dr. H.N. Caron, penningmeester Prof. Dr. R.M. Egeler Prof. Dr. P.M. Hoogerbrugge Prof. Dr. W.A. Kamps Prof. Dr. G.J.L. Kaspers RAAD VAN BESTUUR

Dr. J.G. de Ridder-Sluiter

LABORATORIUM

Dr. V. de Haas, hoofd laboratorium Dr. E. Sonneveld, plv. hoofd laboratorium A. Abdulovski A.A. Cosman-Choluj A. de Jong A. de Kant L.J. Frankena-Goudriaan J.W. Koning-Goedheer B.E.M. van der Linden-Schrever Drs. A.J. van der Sluijs-Gelling J.M. van Wijngaarde-Schmitz M. Lichtenauer

SECRETARIAAT

J.M.F. Bouwman S. Dihal J. Pauptit - Moen I. van der Veen M.C.J. Yap H. Ongalok

DATAMANAGEMENT

Dr. K.M. van der Pal – de Bruin, hoofd Trialbureau Ir. C. Damen-Korbijn A. van Sonsbeek-Spierings Dr. H.A. de Groot-Kruseman M.M. Scheffers-van Schie Drs. W. Mahabier Drs. M. van Mierlo

APPLICATIE BEHEER

M.L. Tros-Batist J. Godlieb

KWALITEITSMEDEWERKER

E.M. Bom

FINANCIËN

H. Blokdijk-van der Veen N.B. Zwinkels-Paalvast

3

4

ZIEKTE COMMISSIE MYELOIDE MALIGNITEITEN Prof. dr. G.J.L. Kaspers (voorzitter) VU medisch centrum De Boelelaan 1117 NL-1081 HV Amsterdam Tel: 020 444 2420 Fax: +31-20 444 2422 E-mail: [email protected] Dr. E.S.J.M. de Bont Universitair Medisch Centrum Groningen Hanzeplein 1 Postbus 30.001 9700 RB Groningen Tel: 050-3616161 E-mail: [email protected] Dr.CM Zwaan Afdeling kinderoncologie Erasmus MC/Sophia Children's Hospital Dr Molewaterplein 60 3015GJ Rotterdam, the Netherlands Tel: +31-10-7036691/6600 Fax: +31-10-7031134 (bureau) Fax: +31-10-7036801 (secretariaat) E-mail: [email protected] Protocol commissie Down syndroom leukemie Dr.CM Zwaan Afdeling kinderoncologie Erasmus MC/Sophia Children's Hospital Dr Molewaterplein 60 3015GJ Rotterdam, the Netherlands Tel: +31-10-7036691/6600 Fax: +31-10-7031134 (bureau) Fax: +31-10-7036801 (secretariaat) E-mail: [email protected] Dr. W.J.W. Kollen Willem Alexander KJC, LUMC Albinusdreef 2 2333 ZA Leiden Tel: 071 5261385 E-mail: [email protected]

5

Overige onderzoekers Dr. V. de Haas Stichting Kinderoncologie Nederland Postbus 43515 2504 AM Den Haag Tel: 070-3674545 Fax: 070-3670868 E-mail: [email protected] Dr. JP Van Wouwe Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek Kwaliteit van Leven Postbus 2215 2301 CE Leiden Tel: 071-5181758 E-mail: [email protected] Dr. D Reinhardt Kooperative AML-BFM Therapiestudien Medizinische Hochschule Hannover Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde Pädiatrische Hämatologie/ Onkologie Carl-Neuberg-Str. 1 D-30625 Hannover Tel: +49 (0)511/532 6720 Fax: +49 (0)511/532 9029 E-mail E-mail: [email protected] Dr. M Zimmermann Kooperative AML-BFM Therapiestudien Medizinische Hochschule Hannover Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde Pädiatrische Hämatologie/ Onkologie Carl-Neuberg-Str. 1 D-30625 Hannover Tel: +49 (0)511/532 3764 Fax: +49 (0)511/532 9029 E-mail: [email protected] Drs M. Blink, onderzoekster Afdeling kinderoncologie Erasmus MC- Sophia Kinderziekenhuis Dr Molewaterplein 50 3015 GE Rotterdam, the Netherlands Tel: +31-10-7044640 E-mail: [email protected]

6

BETROKKEN LABORATORIA BIJ DIAGNOSTIEK Stichting Kinderoncologie Nederland Dr. V. de Haas Postbus 43515 2504 AM Den Haag Tel: 070-3674545 Fax: 070-3670868 E-mail: [email protected] Laboratorium Leukemie en Lymfoom diagnostiek Dr. VHJ Van der Velden Erasmus MC, Afdeling Immunologie Dr. Molewaterplein 50 3015 GE Rotterdam The Netherlands Tel. 010-704 8253 Fax. 010-704 9456 E-mail : [email protected] website : www.immunology.nl Research Laboratorium Kinderoncologie Dr. ML den Boer Erasmus MC/Sophia Kinderziekenhuis Dr. Molewaterplein 60 3015 GJ Rotterdam The Netherlands Tel: 010-704 8340 Fax: 010-704 9433 E-mail: [email protected] Dr. H.B. Beverloo Tumorcytogenetisch Laboratorium Afdeling Klinische Genetica Erasmus MC Postbus 1738 3000 DR Rotterdam The Netherlands Tel: 010-704 7196 Fax: 010-704 9492 E-mail : [email protected]

7

8

INTRODUCTION This protocol concerns the management of children with Down syndrome and transient myeloproliferative disease (TMD), also referred to as transient leukemia (TL) or transient abnormal myelopoiesis (TAM). The protocol consists of 2 parts: * Part A: a study that will be performed in the Netherlands only, and concerns the screening of children with Down syndrome for the occurrence of transient myeloproliferative disease (TMD). * Part B: a study for the treatment and follow-up of children that have been identified with TMD. This study will be performed together with the AML-BFM SG, Hannover, Germany. Other collaborative groups may also join this study at a later stage. Part A will be performed by pediatricians in general and/or academic hospitals who diagnose children with Down syndrome, and aims at screening a large group of children with Down syndrome for the occurrence of TMD. In case TMD is diagnosed, the child needs to be referred to one of the seven pediatric oncology and/or stem cell transplant centers in the Netherlands for treatment and follow-up according to the protocol as described in part B.

9

SUMMARY Children with Down syndrome have an increased risk of developing both acute myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia. The prognosis of myeloid leukemia in children with Down syndrome is better than in children without Down syndrome, which is due to a specific type of myeloid leukemia these children develop, referred to as ‘myeloid leukemia of Down syndrome’ (ML DS). This leukemia is characterized by occurrence at a very young age, low diagnostic white blood cell count (WBC), enhanced chemosensitivity, GATA1 mutations, and the occurrence of a transient myeloproliferative syndrome (TMD) in newborns. Due to the enhanced sensitivity to chemotherapy, and to a greater susceptibility for treatment- related complications, children with ML DS are usually treated with reduced- intensity treatment protocols. TMD occurs in approximately 10% of Down syndrome newborns, although this was only studied in selected populations of hospitalized children. Approximately 15-20% of children with symptomatic TMD die from their disease, mainly due to liver fibrosis, effusions, and organomegaly with high WBCs. Furthermore, approximately 20% of children who survive from TMD subsequently develop ML DS. It is unknown why only a subgroup of children develops true leukemia at follow-up, and what drives this progression. It is also unknown if ML-DS can occur without preceding TMD. So far, no protocol was available to screen for TMD, and provide uniform treatment and follow-up guidelines. In this study, we will perform a population-based screening of DS children in the Netherlands for the occurrence of TMD, by testing a blood sample that will be drawn within 4 weeks after birth (part A of the study). As there is a nation-wide registry for children with Down syndrome, we will be informed about the number of children who will participate in the screening program. When TMD is diagnosed, children will be included in the TMD protocol, which provides treatment guidelines for treatment of symptomatic TMD, and aims at reducing the morbidity and mortality associated with this disease (part B of the protocol, in collaboration with the AML-BFM Study Group). The overall aim of part B of the protocol, however, is not only to reduce the TMD-related morbidity and mortality, but also to reduce the number of children that subsequently develop ML DS. This is supported by data from a pilot-study from the AML-BFM SG that showed a reduction in subsequent ML-DS development when comparing children with symptomatic TMD that had been treated with children with non-symptomatic TMD that did not receive treatment. To further study this concept of chemo-prophylaxis, we will also treat TMD children with persisting residual disease levels, as determined by flowcytometry or by GATA-1 quantative PCR at week 8 after birth, with low-dose chemotherapy (cytarabine). The hypothesis is that slow spontaneous clearance of blasts is a risk-factor for later leukemia development. This study will therefore also prospectively test whether chemo-prophylaxis of ML DS by treating the pre-leukemic clone is feasible, and reduces the number of subsequent leukemias.

10

TRANSIENT MYELOPROLIFERATIVE DISEASE (TMD) IN CHILDREN WITH DOWN SYNDROME

A DUTCH CHILDHOOD ONCOLOGY GROUP PROTOCOL PART A: SCREENING NEWBORNS WITH DOWN SYNDROME FOR TMD

11

12

INHOUDSOPGAVE PROTOCOL PART A, TMD SCREENINGSPROTOCOL Introduction Summary

9 10

TMD SCREENINGSPROTOCOL

13

Inleiding Doelstelling van de studie In- en exclusiecriteria Protocol versus studiepatiënten Evalueerbare patiënten Onderzoeksplan Deelnemende centra Deelname en patiënten registratie bij SKION Materiaal afname Screening op TMD in 2 stappen Opslag van materiaal Uitslagen Vervolg traject Terugtrekken uit de studie Studiepopulatie/loopduur van de studie Rol van het Signaleringscentrum kindergeneeskunde Add-on studies Initiatiefnemer van het onderzoek Ethische aspecten Referenties

15 18 19 19 19 19 20 20 20 21 21 21 21 22 22 23 23 23 23 25

APPENDICES 1. Patiëntenbrief en informed consent (part B) 2. METC verklaringen 3. Goedkeuring bevoegde instantie 4.‘Materiaal aanleveren aan SKION’ 5. Appendix Vragenlijst NSCK 6. Appendix Add-on studie M. Weijerman et al.

27 31 37 39 42 44

13

14

INLEIDING Kinderen met Down syndroom (DS) hebben een verhoogde kans op het krijgen van zowel acute myeloïde (AML) als acute lymfatische leukemie (ALL).1 Het betreft hier een unieke vorm van AML die niet voorkomt bij kinderen zonder Down syndroom. Onderscheidende factoren zijn het voorkomen op jonge leeftijd (meestal onder de leeftijd van 4 jaar), de lage witte bloedcellen bij diagnose, het minder frequent voorkomen van centraal zenuwstelsel uitbreiding, de verhoogde chemotherapie gevoeligheid, en de soms voorafgaande transiente leukemie op de zuigelingenleeftijd (zie verderop).2-9 Om die reden wordt deze leukemie beschouwd als een aparte entiteit in de WHO classificatie van AML, en wordt aangeduid als Myeloïde Leukemie bij Down Syndroom (ML DS).10-12 Ook acute lymfatische leukemie (ALL) bij kinderen met Down syndroom verschilt van sporadische ALL. Zo komen bijvoorbeeld minder hoog-risico genetische afwijkingen voor, zoals MLL-gen herschikkingen of het Philadelphia chromosoom, maar zijn ook de als ‘goed risico’ geclassificeerde genetische afwijkingen (hyperdiploidie en TEL-AML1 translocaties) in lagere frequenties aanwezig bij DS ALL.13-18 In tegenstelling tot DS ML, zijn de genezingskansen van kinderen met DS en ALL kleiner dan bij kinderen zonder DS en ALL, en er is dus ook geen sprake van verhoogde chemotherapie gevoeligheid zoals bij DS ML.2,15,19 Bij pasgeborenen met Down syndroom komt een tijdelijke accumulatie van blasten in het perifere bloed voor, die wel wordt aangeduid als leukemoïde reactie, of als transiënte leukemie (TL) of als ‘transient myeloproliferative disease’ (TMD).20 TMD werd, in een recente Amerikaanse studie, gediagnosticeerd op de mediane leeftijd van 7 dagen (range 1-65 dagen).21 Na 4 weken is bij 80% van de kinderen de TMD verdwenen uit het bloed, na 8 weken bij ongeveer 90%. In principe is TMD een ziekte die vanzelf overgaat (in ongeveer 80% van de kinderen), omdat deze leukemische cellen uit zichzelf in apoptose gaan, zoals dat bijvoorbeeld ook bij stadium 4S neuroblastoom gezien kan worden. TMD blijkt te ontstaan in de foetale lever, waar ook de hematopoiese plaatsvindt in de foetale periode.22,23 TMD is niet altijd een ‘goedaardige’ ziekte. Bij ongeveer 20% van de kinderen kan ernstige symptomatologie ontstaan, zoals pleurale of pericardiale effusies en hydrops foetalis, massale hepato-splenomegalie, pulmonale klachten door hyperleucocytose, lage bloedplaatjes aantallen met bloedingsneiging, en leverfibrose, die zich meestal uit door persisterende cholestase.24 Deze leverfibrose is waarschijnlijk het gevolg van secretie van factoren als TGFβ en TNFα uit de leukemische blasten. De patiënten met leverproblemen ontwikkelen meestal direct post-partum symptomen, en hebben een verhoogd risico op vervroegd overlijden aan complicaties (met name leverfibrose). Blasten hoeven niet altijd aantoonbaar te zijn in het bloed, maar kunnen soms aangetoond worden in pleura- of pericardvocht of in een leverbiopt. Zonodig moet dus agressieve diagnostiek plaatsvinden om TMD te diagnosticeren en zo nodig te behandelen. Tot nu toe ontbrak daarvoor een protocol, maar parallel aan deze studie wordt in Nederland een behandelingsprotocol geïnitieerd in een samenwerkingsverband tussen de SKION en de AMLBFM Studie Groep, zoals beschreven in 'part B'. Dit behandelprotocol is getiteld: “Prävention der myeloischen Leukämien bei Kinderen mit Down Syndrom und transient-myeloproliferativen Syndrom”; Eudract nr. 2006-002962-20). Door middel van dit protocol voor de behandeling en follow-up van TMD kunnen deze symptomatische kinderen geregistreerd en uniform behandeld worden. De geadviseerde behandeling bestaat uit 1 (of zo nodig meerdere) kuren met laaggedoseerde cytarabine.

15

TMD blijkt te ontstaan in de foetale lever hematopoiese, en komt alleen voor als er in cellen gekarakteriseerd door trisomie 21 ook een mutatie ontstaat in een hematopoietische transcriptiefactor, namelijk GATA1.22,25 Het GATA1 eiwit wordt dan getrunceerd en zo ontstaat een kort eiwit GATA1 short. 22 Ongeveer 20% van de kinderen met een TMD ontwikkelen later leukemie, namelijk ML DS.21 Het is niet bekend of ML DS ook voorkomt zonder voorafgaande TMD. De GATA1 mutaties komen zowel bij TMD als bij ML DS voor, zodat GATA1 mutaties niet verantwoordelijk zijn voor de progressie die bij 20% van de kinderen met TMD ontstaat naar ML DS.26,27 Mogelijk spelen mutaties in de zogenaamde JAK-kinases een rol bij deze transformatie.28 In de literatuur wordt de frequentie van TMD altijd opgegeven als 10%, gebaseerd op publicaties van Zipursky et al.23,29 Dit betreft echter studies in geselecteerde populaties. Een populatiegebaseerde studie is tot nu toe niet gerapporteerd. Als het getal van 10% juist zou zijn, zouden in Nederland ongeveer 5 kinderen met DS ML per jaar gediagnosticeerd moeten worden (er worden 200-250 kinderen met Down syndroom per jaar geboren in Nederland, waarvan 10% een TMD ontwikkelt (20-25 kinderen) en vervolgens 20% een DS-ML). In de praktijk worden echter maar 2 patiënten met DS ML gediagnosticeerd per jaar. Het lijkt daarom aan te nemen dat de frequentie van TMD lager is dan tot nu toe in de literatuur wordt gerapporteerd. Ook ontbreekt een goede beschrijving van de hematologische afwijkingen die TMD patiënten karakteriseren in de neonatale periode. Een van de belangrijke wetenschappelijke vragen is of de progressie van TMD naar DS ML te voorkomen is, bijvoorbeeld doormiddel van chemotherapie profylaxe. In het protocol voor de behandeling van symptomatische TMD (part B), is ook een arm opgenomen om kinderen die hun TMD onvoldoende klaren (gedefinieerd als persisterende minimale residuale restziekte vanaf de leeftijd van 8 weken) te gaan behandelen, naast het behandelvoorschrift voor kinderen met symptomatische TMD. Zij zullen eveneens behandeld gaan worden met laag gedoseerd cytarabine, om te bestuderen of dat de latere progressie naar DS ML kan voorkomen. De hypothese is dat de frequentie van DS ML terug te brengen is van 22% naar 7%, gebaseerd op een pilot-studie van de AML-BFM Studie Groep dat 2/18 behandelde kinderen voor symptomatische TMD later ML DS ontwikkelden, versus 20/81 onbehandelde kinderen (p=0.08). Hiervoor is het wel noodzakelijk alle kinderen met TMD te diagnosticeren, wat dus het doel is van het protocol in deel A. Kinderen met TMD ontwikkelen ML DS meestal voor de leeftijd van 3 jaar (mediane leeftijd is 1.5 jaar), vandaar dat systematische follow-up nodig is t/m de leeftijd van 3 jaar. Het is onbekend of er bij kinderen met DS die later ALL ontwikkelen ook een pre-leukemie aantoonbaar is in het perifere bloed. Om deze vraag te beantwoorden, zou er in neonatale bloedmonsters gekeken moeten worden met gevoelige testmethoden of de specifieke genetische opmaak die in een DS ALL sample kan worden gevonden [bijvoorbeeld immunoglobuline (Ig) gen herschikkingen of T-cel receptor (TCR) genherschikkingen] ook terug te vinden zijn in de neonatale bloedmonsters. Hier is tot op heden nooit onderzoek naar gedaan. In Nederland bestaat het zogenaamde Signaleringscentrum Kindergeneeskunde (NSCK), dat is opgericht door de Nederlandse Vereniging voor Kindergeneeskunde, en voor de praktische uitvoering is ondergebracht bij TNO. Dit centrum heeft tot taak om geoormerkte aandoeningen in Nederland te registreren, zoals bijvoorbeeld diabetes mellitus, maar ook het syndroom van Down (sinds 01 januari 2003, zie ook www.nvk.pedianet.nl). Hierbij wordt allereerst aan alle kinderartsen maandelijks gevraagd het aantal kinderen te melden dat met het syndroom van Down geboren wordt. 16

Daarna wordt een vragenlijst gestuurd met aanvullende vragen, in te vullen door de behandelend kinderarts (met vragen over zwangerschapsduur, geboortegewicht, geassocieerde afwijkingen, etc.). Dit is opgezet door Drs. M. Weijerman, kinderarts in het VUmc, en door dr. Van Wouwe, kinderarts bij TNO. De dekkingsgraad (met double-check van andere bronnen) is ongeveer 95%, en in de laatste jaren zijn respectievelijk 199, 219 en 222 kinderen met DS gerapporteerd (20032005). Dit systeem geeft ons de mogelijkheid achteraf te beoordelen van hoeveel kinderen met Down syndroom we materiaal ontvangen hebben op het centraal laboratorium van de SKION in het kader van deze studie. Daarnaast treft u in appendix 2 een aangepaste vragenlijst aan, zodat hij gebruikt kan worden om de relevante gegevens in het kader van dit TMD-onderzoek te inventariseren. Als deze studie van start gaat zal de kinderartsen gevraagd worden de vragenlijst terug te sturen naar de SKION, waar het volledige datamanagement van deze studie zal plaatsvinden.

17

DOELSTELLINGEN VAN DEZE STUDIE Primaire doelen: 1. Het vaststellen van de exacte frequentie (population-based) van transiente leukemie (TMD) bij pasgeborenen met Down syndroom in Nederland. 2. Het vaststellen en onderzoeken van de relatie tussen TMD enerzijds en het voorkomen van ML-DS en DS-ALL op latere leeftijd anderzijds 3. Het includeren van de kinderen, bij wie TMD is vastgesteld bij screenings onderzoek, in het TMD protocol van de SKION (part B). In dat protocol wordt onderzocht of met behandeling van geselecteerde TMD patiënten de TMD-geassocieerde mortaliteit en de ontwikkeling van een latere ML DS kan worden voorkomen. Secundaire doelen: 1. Nieuwe genetische factoren op te sporen die mogelijk gerelateerd zijn aan progressie van TMD naar ML-DS. 2. Onderzoek naar de aanwezigheid van lymfatische pre-leukemische clonen in neonatale bloedsamples van DS kinderen. 3. Het beschrijven van de hematologische afwijkingen en klinische verschijnselen bij patiënten met en zonder TMD (De klinische verschijnselen die we willen vergelijken omvatten onder andere het type trisomie 21, het geslacht, etniciteit, zwangerschapsduur, geboortegewicht en geassocieerde congenitale afwijkingen).

18

IN- EN EXCLUSIE CRITERIA INCLUSIE CRITERIA - Alle kinderen met Down syndroom (of serieuze verdenking op Down syndroom) die in Nederland geboren worden - Diagnose Down syndroom gesteld tussen 01-06-2007 en 01-01-2013. - Leeftijd bij de eerste bloedafname jonger dan 4 weken. - Patiënten bij wie blasten worden aangetoond in pleura- of pericardvocht, dan wel in een leverbiopt die geduid worden als passend bij TMD, kunnen ook geincludeerd worden in afwezigheid van blasten in het perifere bloed. - Getekend informed consent EXCLUSIE CRITERIA - Kinderen waarbij de diagnose Down syndroom niet bevestigd kan worden - Complicaties die de bloedafname bij voorbaat onmogelijk of onwenselijk maken

NB: Kinderen ouder dan 4 weken worden alleen geïncludeerd als studiepatiënt na overleg met de onderzoekers. PROTOCOL VERSUS STUDIE PATIËNTEN Elke patiënt die voldoet aan alle inclusie/exclusie criteria zal worden geregistreerd als protocolpatiënt. Indien de bloedafname daarna niet lukt, wordt de patiënt als studie patiënt geregistreerd, omdat niet met zekerheid kan worden vastgesteld of er sprake is van TMD. Kinderen ouder dan 4 weken zullen ook als studie en niet als protocol patiënt worden geregistreerd, omdat, als er geen TMD wordt aangetoond, dit mogelijk om een foutnegatieve uitslag gaat. Hierbij zal altijd gecheckt worden of er gearchiveerde bloeduitstrijken beschikbaar zijn uit de eerste 4 levensweken. EVALUEERBARE PATIËNTEN Alleen protocol patiënten die tot de leeftijd van 3 jaar gevolgd kunnen worden zijn evalueerbare patiënten. ONDERZOEKSPLAN Dit is een prospectieve, niet gerandomiseerde, multicenter studie. Alle Nederlandse ziekenhuizen met een kinderafdeling worden verzocht om te participeren in de studie. Een cohort van minimaal 811 pasgeborenen met DS zal worden gescreend op TMD. Dit getal van 811 kinderen heeft betrekking op het aantal evalueerbare patiënten. Dat betekent in de praktijk dat waarschijnlijk meer dan 811 kinderen zullen moeten worden gescreend (verwachting ~900-1000 kinderen), omdat een deel van de patiënten zal afvallen voor de benodigde follow-up van 3 jaar, door intercurrente ziekten als hartafwijkingen, maar ook door de TMD zelf. Indien TMD wordt aangetoond dient de patiënt verwezen te worden naar een kinderoncologisch of stamceltransplantatie centrum, voor inclusie in het SKION-TMD protocol. Gebaseerd op het aantal pasgeborenen met DS dat in Nederland jaarlijks geboren wordt van 200-250 kinderen per jaar, zal de studie maximaal 6 jaar duren. Alle kinderen die worden geboren met Down syndroom zullen worden geregistreerd door het NSCK, zoals dat al enkele jaren het geval is. Deze data worden doorgegeven aan de SKION, zodat wij exact geïnformeerd zijn over percentage kinderen waarvan we bloed hebben ontvangen voor TMD-screening. Tevens ontvangt de behandelende arts de NSCK vragenlijst, met het verzoek deze lijst ingevuld te retourneren naar de SKION. Hierop worden basale klinische 19

gegevens geregistreerd, om deze te relateren aan het wel en niet voorkomen eb/of het beloop van de TMD. DEELNEMENDE KINDERONCOLOGISCHE CENTRA EN KINDERAFDELINGEN VAN ZIEKENHUIZEN Aan alle ziekenhuizen met een kinderafdeling in Nederland wordt door middel van toezending van dit protocol verzocht om te participeren in deze studie. Daarnaast zal door bekendmaking op de website van de NVK (Pedianet, www.pedianet.nl), en via de ouderverenigingen en symposia eveneens bekendheid worden gegeven aan deze studie. Met behulp van het Nederlands Signaleringscentrum Kindergeneeskunde (NSCK), ondergebracht bij TNO, wordt het aantal geboren kinderen met Down syndroom bijgehouden, zodat er zicht is op de daadwerkelijke inclusie van kinderen met Down syndroom in deze studie. DEELNAME EN PATIENTENREGISTRATIE BIJ SKION Nadat het informed consent getekend is door de ouder(s)/wettelijke vertegenwoordiger(s) en de behandelende kinderarts, kan de patiënt per fax worden aangemeld bij het centraal laboratorium van de Stichting Kinderoncologie Nederland (SKION). Hiertoe zijn de volgende gegevens vereist: - Patiëntenidentificatie: initialen, geboortedatum en geslacht - Uitslag chromosomen onderzoek die de diagnose Down syndroom bevestigt, dan wel sterke verdenking op Down syndroom (indien de diagnose nog niet vast staat) - Geplande datum bloedafname (binnen 4 weken na de geboorte), indien de patiënt eligible is. MATERIAAL AFNAME

1. Bij een kind met Down syndroom, die in de studie geïncludeerd wordt, dient in de eerste 4 levensweken (met een voorkeur voor afname rond de 7e levensdag) het volgende diagnostische onderzoek te worden verricht: een volledig bloedbeeld, dat wordt bepaald in het eigen ziekenhuis, met in ieder geval een hemoglobine, bloedplaatjes aantal en leukocytengetal. Afname van 5 ml heparine bloed en 3 ongekleurde bloeduitstrijkjes, die naar de SKION worden gestuurd. Dit wordt bij voorkeur gecombineerd met een voor de reguliere patiëntenzorg benodigde bloedafname, bijvoorbeeld voor het afnemen van materiaal voor chromosomen onderzoek of voor endocriene bepalingen (schildklier), etc. Indien de verdenking op Down syndroom pas later ontstaat kan het onderzoek nog steeds plaatsvinden, alhoewel op de leeftijd van 4 weken bij ongeveer 80-85% van de DS kinderen een eventuele TMD spontaan verdwenen is. Als het kind ouder is dan 4 weken kan inclusie dan ook alleen plaatsvinden na overleg met de onderzoekers, en zal de patiënt als studie- en niet als protocolpatiënt worden geregistreerd. Zo mogelijk wordt in zulke gevallen gebruik gemaakt van gearchiveerde bloeduitstrijkjes, indien voorradig. NB: bij kinderen met symptomatische TMD kunnen er symptomen zijn zonder dat blasten aantoonbaar zijn in het perifere bloed. Inclusie kan ook plaatsvinden als er aantoonbare blasten aanwezig zijn in effusies of in een leverbiopsie.

20

SCREENING OP TMD IN 2 STAPPEN 1) Op het centraal laboratorium van de SKION (dr. ER van Wering) wordt, in samenwerking met het laboratorium immunologie van het Erasmus MC (dr. VHJ van der Velden), middels gestandaardiseerd morfologisch en immunologisch onderzoek (flowcytometrie) gekeken of er een TMD cloon in het sample aanwezig is. TMD wordt officieel gedefinieerd als >5% myeloblasten in de uitstrijk of bij flow-cytometrisch onderzoek, alhoewel kleinere clonen ook gedetecteerd kunnen worden en gerapporteerd zullen worden. Vervolgens zal het immunofenotype van de afwijkende cloon verder bestudeerd worden op mononucleaire cellen met medenemen van bij megakaryoblasten voorkomende markers zoals CD41, CD36, CD117, CD9 en CD32, alsmede markers die voorkomen in afwijkende fenotypes, zoals CD56 en CD7. 2) Indien er sprake is van TMD wordt door de SKION materiaal doorgestuurd naar het laboratorium kinderoncologie van het Erasmus MC (Dr. M.L. Den Boer), waar verder onderzoek naar GATA1 mutaties zal worden verricht. Indien er onvoldoende materiaal beschikbaar is kan het zijn dat een nieuwe bloedafname nodig is voor deze stap. Mutatie diagnostiek wordt bemoeilijkt in het geval van een laag blastenpercentage, zodat indien nodig ‘verrijking van het sample’ moet plaatsvinden middels flowcytometrische sortering van blasten. Na DNA-extractie zal er voor mutaties gescreend worden in exon 2 en 3 van het GATA1 gen middels sequencing van PCRgeamplificeerd genomisch DNA. Overigens kan met behulp van dHPLC ook mutatie screening plaatsvinden met een gevoeligheid van 5-10% blasten. OPSLAG VAN PATIËNTEN MATERIAAL Restmateriaal van de hierin beschreven diagnostische procedures wordt opgeslagen in de SKION celbank. Hierbij wordt gebruik gemaakt van SKION nummers, zodat de opslag in principe geanonimiseerd plaatsvindt. Indien het materiaal als rest materiaal wordt uitgegeven voor verder wetenschappelijk onderzoek wordt alleen van deze SKION nummers gebruik gemaakt, zodat het materiaal voor de ontvangende onderzoekers niet herleidbaar is. Voor patiëntenzorg doeleinden beschikt de SKION wel over de sleutel van deze codes. UITSLAGEN In eerste instantie zal middels morfologie en flowcytometrie worden vastgesteld of er sprake is van TMD. Deze uitslag zal mondeling (in geval van afwijkingen) en later ook schriftelijk aan de behandelaars meegedeeld worden door de SKION. Als er een TMD cloon wordt vastgesteld moet worden besloten in overleg met de ouders/verzorgers het kind te verwijzen naar een van de 7 kinderoncologische/stamceltransplantatie centra in Nederland voor deelname aan de TMD studie. Schriftelijke rapportage door de SKION van de GATA1 mutatie status wordt eveneens verzorgd. VERVOLG TRAJECT 1) Protocol patiënten met TMD die in het SKION TMD protocol (part B) geïncludeerd worden zullen verder via dat protocol behandeld en gevolgd worden. 2) Protocol patiënten waarbij geen TMD is vastgesteld zullen niet gevolgd worden met laboratorium diagnostiek, maar vervolgd worden middels jaarlijkse case report forms, die vanuit de SKION naar de behandelend perifere kinderarts, of het Down syndroom team waar de patiënt onder controle is, gestuurd zullen worden. Dit wordt gedaan tot de patiënt minimaal 3 jaar oud is. Indien er bij deze patiënten later toch leukemie ontstaat, zal dat in principe altijd via de SKION geregistreerd worden, behalve bij een eventuele verhuizing naar het buitenland. 3) Aan ouders/verzorgers van patiënten met TMD die geen toestemming geven voor participatie in de SKION TMD studie (part B), zal gevraagd worden of ze wel willen participeren in de followup. Dat betreft:

21

tot de leeftijd van 1 jaar: 3-maandelijkse controle tot de leeftijd van 3 jaar: 6-maandelijkse controle. Op deze tijdstippen dient een bloedbeeld gecontroleerd te worden (inclusief differentiatie). Ter medebeoordeling dienen 3 ongekleurde uitstrijkjes en 2-5 ml heparine bloed naar de SKION gestuurd te worden. Heparinebloed is nodig voor minimal residual disease follow-up met flowcytometrie en GATA1 PCR. De afdeling datamanagement van de SKION zal zorg dragen voor de follow-up via de lokale kinderarts. Deze follow-up vindt in ieder geval plaats tot de patiënt minimaal 3 jaar oud is. 4) Studie patiënten worden bij voorkeur wel gevolgd middels het follow-up programma, zoals genoemd onder punt 2, omdat er geen zekerheid is over het wel/niet bestaan van TMD. TERUGTREKKEN UIT DE STUDIE Op verzoek van ouders/verzorgers kan (zonder opgaaf van redenen) een patiënt altijd worden teruggetrokken uit de studie. De tot dan toe verkregen gegevens zullen wel worden meegenomen in de eindrapportage van het onderzoek. Patiënten van wie bloed wordt ingestuurd, maar waarbij uiteindelijk de diagnose Down syndroom niet gesteld wordt, zullen geëxcludeerd worden, en niet meegenomen worden in de verdere follow-up en analyses. Van deze patiënten zal het resterend celmateriaal en de reeds verzamelde data worden vernietigd. STUDIEPOPULATIE EN LOOPDUUR VAN DE STUDIE Er worden per jaar 200-250 kinderen met Down syndroom geboren in Nederland. Gezien de studievraag (mogelijke preventie van leukemie) en de zeer goede infrastructuur en de bekendheid van alle kinderartsen met de NSCK en de SKION, verwachten wij een hoge inclusie in deze studie in de orde van 90%. Dat betekent dat de studie een loopduur zou hebben van maximaal 6 jaar. Bij start in het 3-4e kwartaal van 2007 betekent dat de studie per 01-01-2014 moet zijn afgerond. Gezien het aantal kinderen met DS ML per jaar in Nederland, verwachten wij dat TMD voorkomt in ongeveer 5% in plaats van de in de literatuur gerapporteerde 10% van de DS kinderen. Om dat met voldoende betrouwbaarheid te kunnen bewijzen is het nodig minimaal 811 kinderen met DS te screenen op TMD (het 95% betrouwbaarheidsinterval ligt dan tussen de 4.5 en 6.0%; berekening door Dr M. Zimmemann, statisticus van de AML-BFM SG). Dit getal van 811 patiënten heeft betrekking op het aantal evalueerbare protocol patiënten, van wie dus ook daadwerkelijk middels bloedonderzoek de aanwezigheid van een TMD is aangetoond dan wel uitgesloten, en die gevolgd kunnen worden tot de leeftijd van 3 jaar. In totaal verwachten wij dat ongeveer 40 kinderen met TMD zullen worden gediagnosticeerd, en derhalve in het SKION TMD protocol kunnen worden geïncludeerd. Uiteindelijk zullen ongeveer 6 kinderen DS ML en 10 kinderen DS ALL krijgen van dit cohort.

22

ROL VAN HET SIGNALERINGSCENTRUM KINDERGENEESKUNDE (NSCK) Alle kinderartsen in Nederland wordt maandelijks gevraagd om kinderen die geboren zijn met Down syndroom te melden bij het signaleringscentrum kindergeneeskunde (NSCK). Na ontvangst van een melding zal deze electronisch worden doorgegeven aan de SKION, zodat er nagegaan kan worden van welk percentage patiënten er materiaal ontvangen is. Om dit met nog meer zekerheid vast te stellen zullen tevens de databases van de CBS, LVR/LNR en de Stichting Down syndroom geraadpleegd worden. Na een melding stuurt het signalerings-centrum een vragenlijst (CRF) naar de meldende kinderarts (appendix 2), die teruggestuurd wordt naar de SKION en daar als in een database onder een SKION nummer opgeslagen zal worden. Op die manier zijn de belangrijkste klinische gegevens van de in de studie opgenomen patiënten te achterhalen. Bovendien worden op deze manier de basale gegevens verzameld van patiënten van wie geen bloed is ontvangen – zodat eventuele selectie en de factoren die dat veroorzaken geanalyseerd kunnen worden. ADD-ON STUDIES Collega Weijerman van het VUmc zal zijn onderzoek naar kinderen met Down syndroom continueren, en daarom zullen de vragenlijsten door de SKION ook aan hem ter hand worden gesteld, voor zijn onderzoek zoals vermeld in appendix 3. INITIATIEFNEMER VAN HET ONDERZOEK Dit betreft een ‘investigator-initiated’ studie (hoofdonderzoekers CM Zwaan en ER van Wering). Het Erasmus MC is initiatiefnemer (sponsor) van deze studie. Geen van de onderzoekers betrokken bij deze studie heeft financiële belangen bij de uitvoer van deze studie. ETHISCHE ASPECTEN Het nadeel van deze studie is dat minimaal 811 kinderen eenmalig een bloedafname moeten ondergaan, die zo mogelijk wel met reguliere bloedafname gecombineerd zal worden. Bij ongeveer 40-80 kinderen (5-10%) zal een TMD gevonden worden, zodat het grootste deel van de ouders na bloedafname gerustgesteld kan worden. Ongeveer 6-8 van de 40 kinderen met TMD (15-20%) lopen het risico om aan complicaties te overlijden, zoals uit historische data afgeleid kan worden. Dit gebeurt met name ten gevolge van leverfibrose, effusies, organomegalie of hoge leucocytengetallen. Het vroegtijdig opsporen en behandelen van TMD kan in deze kinderen een reductie van morbiditeit en mortaliteit met zich meebrengen. De achterliggende vraag van deze studie is de mogelijkheid tot preventie van leukemie bij kinderen met Down syndroom. Van de ongeveer 32 kinderen met TMD die de acute fase overleven, zal bij ongeveer 6-7 kinderen een DS-ML ontstaan (20%). De maximaal te behalen gezondheidswinst is derhalve dat in ongeveer 1:100 kinderen met Down syndroom een ML DS kan worden voorkomen, inclusief de acute en late morbiditeit en mortaliteit waarmee de behandeling van een ML DS gepaard gaat. Bij ongeveer 25-30 kinderen met TMD ontstaat dus geen DS ML, en de ouders van deze kinderen zijn wellicht onnodig ongerust gemaakt. De infrastructuur in de academische kinderziekenhuizen, waarnaar alle kinderen met TMD verwezen worden, is echter van dien aard dat er voldoende mogelijkheid tot professionele begeleiding (kinderpsycholoog, maatschappelijk werk, gespecialiseerde artsen en verpleegkundigen) aanwezig is om ouders en kinderen in een onzekere periode bij te staan.

23

Dit protocol is opgesteld volgens de internationaal geldende ICH-GCP richtlijnen en procedures. Hierbij heeft de meest recente versie van de Verklaring van Helsinki als basis gediend voor de ethische aspecten van de studie. Na overleg met de CCMO, is besloten de screening en behandel en follow-up studie te combineren in 1 protocol, vanwege het potentieel therapeutische karakter van de studie. Deze studie kan dan ook als ėėn geheel voorgelegd worden voor beoordeling aan de medisch ethische toetsingscommissie van het Erasmus MC. Tevens zal aan de andere kinderoncologische centra en de algemene ziekenhuizen om een locale uitvoerbaarheidverklaring gevraagd worden voor deel B van het protocol. Voor deel A hoeft geen locale uitvoerbaarheidsverklaring overlegd te worden, zie hiervoor de aanvullende brief van de METC van het ErasmusMC dd 13-02-2008. Dit betekent dat het screeningsdeel van het protocol zonder verdere toetsing geïmplementeerd kan worden.

24

Referenties part A, screeningsprotocol op TMD

(1) Hasle H, Clemmensen IH, Mikkelsen M. Risks of leukaemia and solid tumours in individuals with Down's syndrome. Lancet. 2000;355:165-169. (2) Zwaan ChM, Kaspers GJL, Pieters R et al. Different drug sensitivity profiles of acute myeloid and lymphoblastic leukemia and normal peripheral blood mononuclear cells, in children with and without Down syndrome. Blood. 2002;99:245-251. (3) Lange BJ, Kobrinsky N, Barnard DR et al. Distinctive demography, biology, and outcome of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome in children with Down syndrome: Children's Cancer Group Studies 2861 and 2891. Blood. 1998;91:608-615. (4) Gamis AS, Woods WG, Alonzo TA et al. Increased age at diagnosis has a significantly negative effect on outcome in children with Down syndrome and acute myeloid leukemia: a report from the Children's Cancer Group Study 2891. J Clin Oncol. 2003;21:3415-3422. (5) Ravindranath Y. Down syndrome and acute myeloid leukemia: the paradox of increased risk for leukemia and heightened sensitivity to chemotherapy. J Clin Oncol. 2003;21:3385-3387. (6) Frost BM, Gustafsson G, Larsson R, Nygren P, Lönnerholm G. Cellular cytotoxic drug sensitivity in children with acute leukemia and Down's syndrome: an explanation to differences in clinical outcome? [letter]. Leukemia. 2000;14:943-944. (7) Yamada S, Hongo T, Okada S et al. Distinctive multidrug sensitivity and outcome of acute erythroblastic and megakaryoblastic leukemia in children with Down syndrome. Int J Hematol. 2001;74:428-436. (8) Creutzig U, Reinhardt D, Diekamp S et al. AML patients with Down syndrome have a high cure rate with AML-BFM therapy with reduced dose intensity. Leukemia. 2005;19:1355-1360. (9) Taub JW, Stout ML, Buck SA et al. Myeloblasts from Down syndrome children with acute myeloid leukemia have increased in vitro sensitivity to cytosine arabinoside and daunorubicin. Leukemia. 1997;11:1594-1595. (10) Hasle H, Niemeyer CM, Chessells JM et al. A pediatric approach to the WHO classification of myelodysplastic and myeloproliferative diseases. Leukemia. 2003;17:277-282. (11) Langebrake C, Creutzig U, Reinhardt D. Immunophenotype of down syndrome acute myeloid leukemia and transient myeloproliferative disease differs significantly from other diseases with morphologically identical or similar blasts. Klin Padiatr. 2005;217:126-134. (12) Webb DK. Optimizing therapy for myeloid disorders of Down syndrome. Br J Haematol. 2005;131:3-7. (13) Bassal M, La MK, Whitlock JA et al. Lymphoblast biology and outcome among children with Down syndrome and ALL treated on CCG-1952. Pediatr Blood Cancer. 2005;44:21-28. (14) Chessells JM, Harrison G, Richards SM et al. Down's syndrome and acute lymphoblastic leukaemia: clinical features and response to treatment. Arch Dis Child. 2001;85:321-325. (15) Whitlock JA, Sather HN, Gaynon P et al. Clinical characteristics and outcome of children with down syndrome and acute lymphoblastic leukemia: a children's cancer group study. Blood. 2005;106:4043-4049.

25

(16) Dördelmann M, Schrappe M, Reiter A et al. Down's syndrome in childhood acute lymphoblastic leukemia: clinical characteristics and treatment outcome in four consecutive BFM trials. BerlinFrankfurt-Münster Group. Leukemia. 1998;12:645-651. (17) Lanza C, Volpe G, Basso G et al. The common TEL/AML1 rearrangement does not represent a frequent event in acute lymphoblastic leukaemia occuring in children with Down syndrome. Leukemia. 1997;11:820-821. (18) Steiner M, Attarbaschi A, Konig M et al. Equal frequency of TEL/AML1 rearrangements in children with acute lymphoblastic leukemia with and without Down syndrome. Pediatr Hematol Oncol. 2005;22:229-234. (19) Zeller B, Gustafsson G, Forestier E et al. Acute leukaemia in children with Down syndrome: a population-based Nordic study. Br J Haematol. 2005;128:797-804. (20) Hitzler JK, Zipursky A. Origins of leukaemia in children with Down syndrome. Nat Rev Cancer. 2005;5:11-20. (21) Massey GV, Zipursky A, Chang MN et al. A prospective study of the natural history of transient leukemia (TL) in neonates with down syndrome (DS): a children's oncology group (COG) study POG-9481. Blood. 2006;107:4606-4613. (22) Li Z, Godinho FJ, Klusmann JH et al. Developmental stage-selective effect of somatically mutated leukemogenic transcription factor GATA1. Nat Genet. 2005;37:613-619. (23) Zipursky A, Brown EJ, Christensen H, Doyle J. Transient myeloproliferative disorder (transient leukemia) and hematologic manifestations of Down syndrome. Clin Lab Med. 1999;19:157-167. (24) Al Kasim F, Doyle JJ, Massey GV, Weinstein HJ, Zipursky A. Incidence and treatment of potentially lethal diseases in transient leukemia of Down syndrome: Pediatric Oncology Group Study. J Pediatr Hematol Oncol. 2002;24:9-13. (25) Crispino JD. GATA1 mutations in Down syndrome: implications for biology and diagnosis of children with transient myeloproliferative disorder and acute megakaryoblastic leukemia. Pediatr Blood Cancer. 2005;44:40-44. (26) Vyas P, Crispino JD. Molecular insights into Down syndrome-associated leukemia. Curr Opin Pediatr. 2007;19:9-14. (27) Ahmed M, Sternberg A, Hall G et al. Natural history of GATA1 mutations in Down syndrome. Blood. 2004;103:2480-2489. (28) Kiyoi H, Yamaji S, Kojima S, Naoe T. JAK3 mutations occur in acute megakaryoblastic leukemia both in Down syndrome children and non-Down syndrome adults. Leukemia. 2007. (29) Zipursky A. Transient leukaemia - a benign form of leukaemia in newborn infants with trisomy 21. Br J Haematol. 2003;120:930-938.

26

APPENDIX 1. PATIËNTEN INFORMATIEBRIEF EN INFORMED CONSENT (PART A) Informatie over diagnostiek en wetenschappelijk onderzoek bij pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiente myeloproliferatieve ziekte Officiële titel: ”SKION- protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiënte leukemie” Geachte ouder(s), Inleiding U bent voor een eerste gesprek bij een algemeen kinderarts geweest met uw pasgeboren baby omdat de mogelijkheid bestaat dat uw baby het syndroom van Down heeft. We begrijpen dat dit heel ingrijpend voor u is. Om het syndroom van Down met zekerheid vast te stellen zal de behandelend kinderarts uw baby onderzoeken en bloed af nemen voor verder onderzoek. Of misschien is dit bloedonderzoek al gedaan en komt u bij de algemeen kinderarts met uw baby voor controle of meer onderzoek. De behandelend kinderarts heeft u tijdens één van de gesprekken geïnformeerd over bovengenoemde medisch-wetenschappelijke screening op Transiënte Myeloproliferatieve Ziekte (TMZ), die voor kan komen bij kinderen met Down syndroom. Hij/zij heeft u al het één en ander uitgelegd. Voor toestemming of weigering voor dit onderzoek is goede voorlichting van onze kant nodig en een zorgvuldige afweging van uw kant. Vandaar dat u deze schriftelijke informatie ontvangt. U kunt die rustig (her)lezen en in eigen kring bespreken. Ook daarna kunt u nog altijd vragen stellen aan de artsen die aan het eind van deze informatie genoemd staan. Kinderen met Down syndroom In de eerste plaats moet u natuurlijk de (verdenking op) diagnose “syndroom van Down” verwerken. Daarnaast komen er een heleboel vragen en informatie over Down syndroom op u af. De behandelend kinderarts zal u op de hoogte brengen van de medische aspecten van een baby met het syndroom van Down, en voor begeleiding en zonodig verwijzing zorgen. Eén van die medische aspecten is dat kinderen met het syndroom van Down een verhoogde kans hebben op het krijgen van leukemie, een vorm van kanker van de bloedcellen. Het gaat daarbij om twee soorten leukemie: Acute Lymfatische Leukemie (ALL) en Acute Myeloide Leukemie (AML). Daarbij is de kans dat uw kind geen leukemie krijgt gelukkig vele malen groter dan de kans dat dit wel gebeurt. Bij kinderen met Down syndroom kan een unieke vorm van AML ontstaan, die niet bij andere kinderen voorkomt. Deze vorm van AML komt voor op zeer jonge leeftijd, meestal tussen de leeftijd van 6 maanden en 4 jaar, en reageert over het algemeen goed op behandeling met medicijnen. Voor algemene informatie over leukemie bij kinderen verwijzen we u naar de website van de Stichting KinderOncologie Nederland (SKION), www.skion.nl Soms komt bij pasgeboren baby’s met Down syndroom een tijdelijke ophoping van verkeerde cellen in het bloed voor. Uw kind heeft hierbij geen leukemie, maar een zogenaamde ‘leukemoïde reactie’. Deze reactie gaat vaak, maar niet altijd, spontaan over. Een andere naam die hiervoor gebruikt wordt is ‘transiente myeloproliferatieve ziekte’ (TMZ). In deze informatie gebruiken we verder de afkorting TMZ. Een onlangs uitgevoerd Amerikaans onderzoek over TMZ liet zien dat 4 weken na de geboorte bij 80% van de kinderen de TMZ cellen uit het bloed verdwenen zijn, zonder verdere behandeling. Na 8 weken is dit bij ongeveer 90% van de kinderen het geval. Hieruit blijkt dat TMZ een ziekte is die bij de meerderheid van de baby’s vanzelf overgaat. Dat is echter helaas niet altijd het geval. Bij ongeveer 20% van de kinderen met TMZ kunnen klachten ontstaan. Het betreft dan bijvoorbeeld problemen met vochtophoping in de borstkas of het hartzakje, sterke vergroting van lever en milt, geelzucht of problemen met de bloedstolling door lage aantallen bloedplaatjes. Vroegtijdige diagnose van TMZ kan de kans op deze complicaties verkleinen, omdat er dan zonodig behandeld kan worden.

27

Doel van het onderzoek Om vroegtijdige behandeling mogelijk te maken is het noodzakelijk om alle kinderen met Down syndroom kort na hun geboorte te testen op de aanwezigheid van TMZ. We noemen dit ook wel ‘screenen’. Omdat tot op heden hier nog onvoldoende over bekend was, hoort deze screening nog niet tot de standaard zorg bij baby’s met het syndroom van Down. We hopen door deze screening:  Te kunnen vaststellen hoe vaak TMZ exact voorkomt.  Meer inzicht te krijgen in de relatie tussen TMZ en het voorkomen van leukemie op latere leeftijd.  Het belangrijkste doel van de screening is echter de mogelijkheid tot vroegtijdige behandeling. In een eerdere studie zijn ook aanwijzingen gevonden dat kinderen bij wie de TMZ cellen te lang in het bloed aantoonbaar waren, meer risico liepen op het later (tussen de leeftijd van 6 maand en 4 jaar) ontwikkelen van AML (Acute Myeloïde Leukemie). We willen daarom in het vervolg ook kinderen gaan behandelen met langdurig aantoonbare TMZ cellen (meer dan 8 weken na de geboorte), om zo te proberen de kans op het later ontstaan van leukemie te verkleinen. De verwachting is dat uiteindelijk ongeveer 10 van de 900 gescreende kinderen met Down syndroom later AML ontwikkelen. Voor alle duidelijkheid vermelden wij hier nog dat acute lymfatische leukemie bij kinderen met Down syndroom niet voorafgegaan wordt door TMZ, en dat het al dan voorkomen hiervan in deze studie niet wordt bestudeerd. Screening en TMZ Aan dit screening protocol zal door alle Nederlandse ziekenhuizen met een kinderafdeling worden meegewerkt. De verwachting is dat in totaal bij zo’n 900 baby’s met het syndroom van Down bloed voor screening zal worden afgenomen en dat er bij ongeveer 30-50 kinderen een TMZ zal worden gevonden. Indien er bij uw kind sprake is van TMZ, dan zal de kinderarts uw kind verwijzen naar een kinderoncologisch centrum bij u in de buurt. Deze centra zijn gespecialiseerd in de zorg voor kinderen met TMZ en leukemie. Voor- en nadelen Door aan dit screeningsprotocol deel te nemen, kan eventueel aanwezige TMZ bij uw kind vroegtijdig worden opgespoord en zonodig behandeld worden. Vroegtijdige opsporing geeft de mogelijkheid tot het gericht behandelen van kinderen met TMZ die klachten ontwikkelen of van kinderen waarbij de TMZ cellen niet snel genoeg uit het bloed verdwijnen. We hopen dat deze screening en vroegtijdige behandeling er toe leidt dat kinderen met TMZ minder vaak AML ontwikkelen op latere leeftijd. We streven er naar geen extra bloedafnames plaats te laten vinden. Het zal bijna altijd zo zijn dat de afname van het buisje bloed voor screening gelijktijdig kan gebeuren met andere bloed afnames die medisch noodzakelijk zijn. Als er geen reden is voor een gewone bloedafname, maar u wel wilt meedoen aan het onderzoek, kan dat inhouden dat uw kind er extra voor geprikt moet worden. Met uitzondering van een eventuele blauwe plek na afname zijn er geen extra risico’s verbonden aan deelname aan dit protocol. Vrijwillige deelname en toestemming We verzoeken u vriendelijk een toestemmingsformulier te ondertekenen waarin staat dat u weet wat de screening inhoudt. Tevens vragen wij uw toestemming voor het verzamelen van enkele gegevens van uw kind, en voor het bewaren van restmateriaal (bloed). De Nederlandse ziekenhuizen met een afdeling kindergeneeskunde werken volgens landelijke afspraken die door de Nederlandse Vereniging voor Kindergeneeskunde (NVK) zijn vastgelegd ter bescherming van minderjarige onderzoeksdeelnemers. Voor meer informatie hierover verwijzen wij u naar de volgende website: www.ccmo.nl (wet- en regelgeving/gedragscode verzet: minderjarigen). Als u besluit niet aan de screening mee te doen, dan is dat niet van invloed op de verdere behandeling van uw kind. U krijgt voldoende tijd om hierover na te denken en u kunt te allen tijde om extra informatie vragen of op eenmaal genomen beslissingen terugkomen. Wanneer u besluit deel te nemen ontvangt u een kopie van dit document, nadat u en de behandelend arts van uw kind beiden voor deelname getekend hebben.

28

Verantwoording en vertrouwelijkheid Tot uw kind herleidbare onderzoeksgegevens kunnen slechts met uw toestemming door daartoe bevoegde personen worden ingezien. Deze personen zijn medewerkers van het onderzoeksteam, medewerkers van de Inspectie voor de Gezondheidszorg of bevoegde inspecteurs van een buitenlandse overheid, en leden van de Medisch Ethische Toetsings Commissie (METC). Inzage kan nodig zijn om de betrouwbaarheid en kwaliteit van het onderzoek na te gaan. Onderzoeksgegevens zullen worden gehanteerd met inachtneming van de Wet Bescherming Persoonsgegevens en het privacyreglement van het Erasmus MC. Persoonsgegevens die tijdens deze studie worden verzameld, zullen worden vervangen door een code, bestaande uit een studienummer en de initialen van uw kind. De sleutel van deze code zal alleen toegankelijk zijn voor de onderzoeker, de behandelend arts of de researchverpleegkundige/ datamanager. Alleen deze gecodeerde gegevens zullen gebruikt worden voor studiedocumentatie, in rapporten of publicaties over dit protocol. De vertrouwelijkheid van de gegevens blijft hierbij gewaarborgd. De gecodeerde gegevens worden opgeslagen in een computerbestand en verwerkt bij de Stichting Kinder Oncologie Nederland (SKION). De gegevens worden, indien u daar toestemming voor geeft, gedurende minstens 15 jaar bewaard. Lichaamsmaterialen die tijdens deze studie worden verzameld, worden gecodeerd opgeslagen. Na afloop van het protocol worden de opgeslagen lichaamsmaterialen vernietigd of, als u daarvoor toestemming geeft, langdurig bewaard. Het opgeslagen lichaamsmateriaal kan dan eventueel in een later stadium worden gebruikt voor onderzoek met als doelstelling de toekomstige behandeling van kinderen met leukemie verder te verbeteren. De resultaten van dit protocol worden gerapporteerd in medisch-wetenschappelijke literatuur en/of op medische congressen.

Voor dit onderzoek is goedkeuring verkregen van de Raad van Bestuur na een positief oordeel van de Medisch Ethische Toetsing Commissie Erasmus MC Rotterdam. De voor dit onderzoek geldende internationale richtlijnen zullen nauwkeurig in acht worden. Contactpersonen Bij vragen of opmerkingen kunt u contact opnemen met dr. C.M. Zwaan, kinderarts-oncoloog, tel. 0104636691, of met de researchverpleegkundigen van de afdeling kinderoncologie, Inekee van der Vaart of Eline Visser, tel. 010-4636402. Als u twijfelt over deelname van uw kind aan deze studie dan kunt u een onafhankelijke arts raadplegen die zelf niet bij het onderzoek is betrokken maar wel deskundig is op dit gebied: Dr. J.B. van Goudoever, kinderarts, tel. 010 4636077. Ook indien u voor of tijdens het onderzoek vragen heeft die u liever niet aan de onderzoekers stelt dan kunt u contact opnemen met de onafhankelijke arts. Nuttige informatie Op de volgende websites kunt u meer algemene informatie vinden: Stichting Down Syndroom www.downsyndroom.nl www.skion.nl Stichting KinderOncologie Nederland (SKION) wet- en regelgeving/gedragscode verzet: minderjarigen www.ccmo.nl Nederlandse Vereniging voor Kindergeneeskunde www.nvk.pedianet.nl

Met vriendelijke groet,

Dr. C.M. Zwaan, Kinderarts en hoofdonderzoeker Mede namens ………………. ……………………………. behandelend kinderarts, tel ………………………………

29

Toestemmingsformulier ouders/voogd behorende bij de patiënteninformatie over diagnostiek en wetenschappelijk onderzoek bij pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiënte leukemie Titel van het onderzoek: ”SKION- protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiënte leukemie”

Mij is gevraagd toestemming te verlenen voor deelname aan bovengenoemd protocol ten behoeve van: Naam kind:

Geboortedatum: __ / __ / __

Ik bevestig, dat ik het informatieformulier voor mijn kind heb gelezen. Ik begrijp de informatie. Ik heb de gelegenheid gehad om aanvullende vragen te stellen. Deze vragen zijn naar tevredenheid beantwoord. Ik heb voldoende tijd gehad om over deelname van mijn kind na te denken. Ik weet dat deelname geheel vrijwillig is en dat ik mijn toestemming op ieder moment kan intrekken zonder dat ik daarvoor een reden hoef te geven. Ik geef toestemming voor deelname van mijn kind aan screening volgens het SKION-DS-TMZ protocol onder de omstandigheden zoals die mij zijn uitgelegd.

Ik geef wel/geen* toestemming om de gegevens van mijn kind gedurende minstens 15 jaar na afloop van het protocol te bewaren. Ik geef wel/geen* toestemming voor het langdurig bewaren van restweefsel, waar mogelijk in de toekomst verder onderzoek naar het ontstaan van leukemie bij kinderen met Down syndroom mee gedaan wordt. Ik geef toestemming voor het gecodeerd verzamelen en verwerken van de gegevens over het verloop van de behandeling, zoals in deze informatiebrief beschreven is. De gegevens zullen worden opgeslagen in een database. De resultaten zullen voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt waarbij de vertrouwelijkheid gewaarborgd wordt. Ik geef toestemming, dat daartoe bevoegde medewerkers van het onderzoeksteam, bevoegde personen van de SKION, medewerkers van de Inspectie voor de Gezondheidszorg, bevoegde inspecteurs van een buitenlandse overheid of leden van de medisch-ethische toetsingscommissie inzage kunnen krijgen in de medische gegevens en onderzoeksgegevens van mijn kind.

Naam ouder/voogd **: Handtekening:

Datum :

__ / __ / __

Datum :

__ / __ / __

Datum :

__ / __ / __

Naam ouder/voogd **: Handtekening:

Naam onderzoeker/behandelend arts: Handtekening:

*

Doorhalen wat niet van toepassing is. 30

APPENDIX 2. METC VERKLARINGEN

31

32

33

34

Dr. C.M. Zwaan Afd. Kindergeneeskunde Kinderoncologie-hematologie

Doorkiesnummer 01046334428

Kamer Sp 2458 Erasmus MC - Sophia

E-mail [email protected]

Faxnummer 0104633634 Kamernummer Fd 211

Ons kenmerk RBC/ss/035775 Datum 13 februari 2008

Betreft Proefpersonenverzekering MEC-2007-168 Gelieve bij alle correspondentie m.b.t. dit onderzoek bovenstaand MEC nummer te vermelden. Geachte heer Zwaan, De Medisch Ethische Toetsings Commissie Erasmus MC (METC) heeft kennisgenomen van de e-mail van mevrouw K.E. van der Vaart d.d. 24 januari 2008 inzake de proefpersonenverzekering van het goedgekeurde onderzoek, getiteld: 'Transient myeloproliferative disease (TMD) in children with Down syndrome - A Dutch Childhood Oncology Group Protocol - Part A: Screening newborns with Down syndrome for TMD, and Part B: Treatment and follow-up of children with Down syndrome and TMD', MEC-2007-168. In het positief oordeel d.d. 4 september 2007 is aangegeven, dat de patiënten, die vanuit het Erasmus MC in dit onderzoek worden geïncludeerd, vallen onder de proefpersonenverzekering van het Erasmus MC en dat de overige deelnemende centra zelf zorg moeten dragen voor een adequate proefpersonenverzekering voor de patiënten die in hun instelling in het onderzoek worden geïncludeerd. Het protocol bestaat uit 2 delen. Deel A betreft de screening van pasgeboren baby’s met verdenking op het syndroom van Down. Er wordt eenmalig een extra buisje bloed afgenomen tijdens een venapunctie in het kader van de reguliere patiëntenzorg. Deel B betreft een behandelprotocol. In het positief oordeel is echter niet aangegeven, dat de proefpersonenverzekering alleen geldt voor patiënten die in deel B, het behandelprotocol, worden geïncludeerd. Voor deel A verleent de commissie namelijk ontheffing van de verzekeringsplicht, aangezien zij van oordeel is, dat deelname aan deel A voor de proefpersonen naar zijn aard zonder enig risico is. Er wordt immers slechts eenmalig een extra buisje bloed afgenomen tijdens een venapunctie in het kader van de reguliere patiëntenzorg. In het patiënteninformatie- en toestemmingsformulier ouders, deel A, versie 16 juli 2007, is ook geen verzekeringspassage opgenomen, terwijl in het patiënteninformatie- en toestemmingsformulier ouders, deel B, versie 16 juli 2007 wel een verzekeringspassage is opgenomen. In aanvulling op het positief oordeel d.d. 4 september 2007 bevestigt de commissie dat voor patiënten die in deel A geïncludeerd worden, ontheffing van de verzekeringsplicht wordt verleend en dat voor de patiënten die in deel B geïncludeerd worden geen ontheffing van de verzekeringsplicht wordt verleend. Het verstrekte certificaat proefpersonenverzekering Erasmus MC is alleen van toepassing voor patiënten die in het Erasmus MC in deel B van de studie geïncludeerd worden. De overige deelnemende centra dienen derhalve ook alleen zorg te dragen voor een adequate proefpersonenverzekering voor de patiënten die in hun instelling in deel B van het onderzoek worden geïncludeerd.

35

De commissie gaat ervan uit dat u de overige (potentiële) deelnemende centra van deze aanvullende informatie inzake de proefpersonenverzekering op de hoogte brengt. Met vriendelijke groet, namens de Medisch Ethische Toetsings Commissie Erasmus MC,

Mw.drs. R.M.M. Bosschaart-Castermans Secretaris

Cc.

Mw. K.E. van der Vaart, Researchverpleegkundige 36

APPENDIX 3. GOEDKEURING BEVOEGDE INSTANTIE -----Oorspronkelijk bericht----Van: [email protected] [mailto:[email protected]] Verzonden: maandag 3 september 2007 13:40 Aan: [email protected] CC: [email protected] Onderwerp: besluit NL17304.078.07 BI Geachte Dr. CM Zwaan, De Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) heeft zich als Bevoegde instantie voor de marginale beoordeling van geneesmiddelenonderzoek in Nederland, op grond van artikel 13i, van de Wet medischwetenschappelijk onderzoek met mensen (WMO), beraden over het onderzoeksprotocol Transiente leukemia bij kinderen met Down syndroom: Deel A: Protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiente leukemie Deel B: Protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiente leukemie , NL17304.078.07, Eudractnummer 2006-002962-20. Op 29-8-07 is het onderzoeksvoorstel ter beoordeling bij de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) ingediend. De Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) heeft als Bevoegde instantie geen bezwaar tegen uitvoering van het onderzoek in Nederland op basis van haar marginale toets. De marginale toets van de Bevoegde instantie betreft het controleren van de Clinical Trial Module van de Eudravigilance database op onverwachte ernstige bijwerkingen en het controleren van de EudraCT database op inspectiegegevens. Wellicht ten overvloede wijzen wij u er op dat, voordat het onderzoek in Nederland van start kan gaan, het onderzoek tevens positief beoordeeld moet worden door een daartoe bevoegde erkende Medisch Ethische Toetsingscommissie. Deze verklaring van geen bezwaar verliest haar geldigheid als met het uitvoeren van het onderzoek niet is begonnen binnen een jaar nadat deze verklaring is afgegeven. Tot slot wijst de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) erop dat, op grond van artikel 7:1 van de Algemene wet bestuursrecht (Awb), degene wiens belang rechtstreeks bij het besluit is betrokken daartegen binnen zes weken na de dag waarop dit besluit bekend is gemaakt, bezwaar kan maken bij de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO). Met vriendelijke groet, Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) 3-9-07 DIT IS EEN AUTOMATISCH GEGENEREERD BERICHT --------------Dear Dr. CM Zwaan, The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO), as Competent Authority for the review of clinical trials in the Netherlands, has performed a marginal assessment of the clinical trial application Transiente leukemia bij kinderen met Down syndroom: Deel A: Protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiente leukemie Deel B: Protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiente leukemie , NL17304.078.07, Eudractnumber 2006-002962-20, under section 13i of the Medical Research in Human Subjects Act (WMO). The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) received the clinical trial application at 29-8-07 for an assessment. Based on a marginal assessment, the Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO), as Competent Authority, found no objection against the execution of the clinical trial within the Netherlands. The marginal assessment of the Competent Authority involves a check of the Clinical trial Module of the Eudravigilance database for suspected unexpected serious adverse reactions (SUSARs) and a check of the EudraCT database on inspections.

37

The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) would like to point out that before the clinical trial commences approval from a competent accredited Ethics Committee is required. This approval loses it's validity if the study has not been started within a year after this declaration of no objection. Based on section 7:1 of the General Administration Law Act (Awb), the person whose interest is directly associated with the decision can lodge an appeal with the Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) within 6 weeks after the day the decision has been announced. With kind regards, Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) 3-9-07 THIS IS AN AUTOMATED EMAIL

38

APPENDIX 4. MATERIAAL (PART A)

AANLEVEREN AAN

SKION

VOOR

TMD

SCREENINGSONDERZOEK

1. Cytologische diagnostiek (uitstrijkpreparaten) Benodigd materiaal  Bij voorkeur worden 3 ongekleurde bloed uitstrijkjes gestuurd naar het laboratorium van de SKION. De uitstrijkjes moeten bij voorkeur zijn afgenomen vóór eventuele transfusie van bloed of bloedprodukten.  Tijdens follow-up graag eveneens 3 ongekleurde perifere bloed preparaten. Bij (verdenking) progressie naar ML DS dient de procedure te worden gevolgd zoals gemeld in het ML DS protocol. Richtlijnen voor het vervaardigen van bloed uitstrijken Ter realisatie van de gewenste uniformiteit van perifeer bloed uitstrijken gaarne aandacht voor de volgende richtlijnen:  het opbrengen van slechts een kleine druppel op het objectglas.  het uitstrijken met een glaasje dat smaller is dan het objectglas onder een hoek van 45°, langzaam uitstrijken.  zodanig uitstrijken dat het einde van de film ongeveer halverwege het objectglas komt te liggen. Pathologische cellen zijn vaak erg kwetsbaar en vallen spoedig uiteen bij snelle verplaatsing. De hoeveelheid plasma dient gering te zijn. Indien het plasma meer dan enkele seconden nodig heeft om op te drogen, gaan de cellen door osmotische invloed schrompelen. Men gebruike een geslepen dekglaasje van een telkamer of een geslepen objectglas. Doel Op de uitstrijkpreparaten wordt standaard een May-Grünwald-Giemsa kleuring gedaan voor het tellen van het percentage blasten. Voor het klassificeren van de blasten kan tevens een SudanBlack B, een Peroxidase en gecombineerde naftol AS-D chloroacetaat esterase en α-naftylacetaat-esterase verricht worden. Uitslag De uitslag wordt telefonisch en schriftelijk doorgegeven aan de behandelend kinderarts. 2. Immunophenotypering (Haemoblok – SKION) Benodigd materiaal  heparine bloed: initieel 5 ml perifeer bloed, voor follow-up monsters 2-5 ml. Hiervoor zijn in het zgn. haemoblok heparinebuizen aanwezig; na afname goed mengen om stolling te voorkomen. Het materiaal dient te worden bewaard en getransporteerd op kamertemperatuur.

39

Doel Immunofenotypering geschiedt op het laboratorium van de SKION in meervoudige labeling en volgens de richtlijnen van de SKML (www.skml.nl) in een gefaseerde aanpak. Uitslag De uitslag wordt schriftelijk aan de behandelend arts meegedeeld. 3. Checklist SKION bij diagnose en follow-up Patiënt telefonisch aanmelden bij de SKION (070-3674545). Afnames bij diagnose en follow-up: Tijdstip

Diagnose Overige tijdstippen

Preparaten (ongekleurd) Bloed

3 3

Hemoblok Bloed (heparine buis) 5 ml 5 ml

4. Verzenden per Fiege (BLS koerier) naar het SKION laboratorium Instructies voor verzenden materiaal naar de SKION (zie ook www.skion.nl): Hemoblok: Bloed en/of beenmerg kunnen in een, door de SKION verstrekt hemoblok worden verstuurd. Controle preparaten: Deze kunnen in de daartoe ontworpen goedgekeurde verpakking per gewone post worden verstuurd. Telefonisch wordt de verzending vóóraf gemeld aan de SKION: Op werkdagen van 09.00-17.00 uur: telefoon 070 - 367 45 45 (buiten deze uren kan een boodschap worden ingesproken op het antwoordapparaat). Op zaterdag van 08.30-17.30 uur via telefoon 06 - 5120 12 97 de dienstdoende analist(e) waarschuwen. Indien de analist(e) niet reageert via dit telefoonnummer (b.v. omdat ze bezig is), dan graag uw boodschap op de voice-mail inspreken, opdat u kan worden teruggebeld.

40

Verzending hemoblokken en diagnosepreparaten via Fiege (BLS-Koerier): Aanmelding voor vervoer dient te geschieden per fax 075 - 650 16 98 of per e-mail ([email protected]) bij voorkeur vóór 16.00 uur en met een speciaal daarvoor ontworpen opdrachtformulier. Eventueel tot 21.00 uur bellen naar nummer: 075 - 650 16 19; bgg 06 - 432 71 741, of 06 – 432 71 751. Formulieren en verpakkingsmateriaal zijn indien nodig aan te vragen bij het SKION laboratorium. U dient ervoor te zorgen, dat het pakket in SKION verpakking, lekdicht en met absorberend materiaal verpakt, klaar ligt op de met de koeriersdienst afgesproken plaats.

41

NSCK code

APPENDIX 5. VRAGENLIJST NSCK

Arts nr:

NSCK NSCK

Nederlands Signalerings Centrum Kindergeneeskunde

NSCK Postbus 2215 2301 CE Leiden. Tel: 071- 518 1699, email: [email protected]

Vragenlijst (vermoeden van het) Down syndroom (DS) Wij vragen u deze vragenlijst zo volledig mogelijk in te vullen. Bij vragen of opmerkingen kunt u contact opnemen met de SKION of met de hoofdonderzoekers van dit project (Telefoon: 070-3674545). Naam ziekenhuis: .................................................…SKION nr.

(indien bekend)

1.

Datum diagnose:

2.

Initialen

3.

Geboorte datum

4.

Geslacht

5.

Postcode (1e twee cijfers)

6.

Het kind is geboren

7.

Zwangerschapsduur

8.

APGAR score

9.

Geboortegewicht

………….. gram

10.

De moeder was

G

11.

Moeder: Vader

……-……-………dd-mm-jj (voornaam, achternaam)

,

……-……-………dd-mm-jj jongen

meisje

……………… thuis in ziekenhuis weken na1 min. na 5 min. na 10 min.

leeftijd leeftijd

,P

jaar, etniciteit: ………………… jaar, etniciteit:………………….

12. Wat was de uitslag van het chromosomen onderzoek: 1 Chromosomenonderzoek ja, uitslag a Trisomie 21 b Translocatie c Mozaïek d Normaal 2 nee, i.v.m……………………………….. 13. Was er

- hydrops foetalis ? - pleuravocht ? - pericardvocht ? - ascites ?

ja ja ja ja

nee nee nee nee 42

14. Datum waarop eerste bloed(beeld) geprikt is:: ….-….-…...(dd-mm-yy) Uitslagen: Hb …..mmol/l, Ht ……l/l Leucocyten …………….x10.9/l Thrombocyten:…………x10.9/l Differentiatie % (*) absolute getallen(*) ……..% neutrofiele granulocyten ……….. x10.9/l ……..% eosinofiele granulocyten ……….. x10.9/l ……..% basofiele granulocyten ……….. x10.9/l ……..% lymfocyten ……….. x10.9/l ……..% monocyten ……….. x10.9/l ……..% normoblasten ……….. x10.9/l ……..% blasten ……….. x10.9/l (*) afhankelijk of uw laboratorium dit in % of in absolute aantallen weergeeft 15. Was/ is er sprake van een icterus prolongatus (gedefinieerd als >14 dagen voor a terme en >21 dagen voor prematuur geboren babies)? ja nee Zo ja: wat was de maximaal gemeten bilirubine waarde? …………..μmol/l bilirubine totaal …………..μmol/l bilirubine geconjugeerd/ …………% bilirubine geconjugeerd 16. Wat was/ waren de indicatie(s) voor opname? a)……………………………………………………………………………………. b)……………………………………………………………………………………. c)……………………………………………………………………………………. 17. Welk onderzoek hebt u verder (laten) verricht(en) naar aangeboren afwijkingen: a b c d X-thorax ECG echocardiogram consult kindercardioloog 18. Is het kind overleden

ja, wanneer……-……-………dd-mm-jj waar………………………………………… wat is de doodsoorzaak…………………….. nee

19. Overige opmerkingen…………………………………………….…………………… Naam behandelend kinderarts: …………….…… Handtekening Datum: ……-……-………(dd-mm-jj)

Hartelijk dank voor uw medewerking De vragenlijst gaarne retourneren naar de Stichting Kinderoncologie Nederland (SKION), Postbus 43515, 2504 AM Den Haag. (Fax: 070-3670868). 43

APPENDIX 6. ADD-ON STUDIE WEIJERMAN ET AL. Gevolgen van het syndroom van Down voor patiënt en gezin. Projectgroep: Taak Drs. M.E. Weijerman, kinderarts hoofdonderzoeker Dr. A.M. van Furth, kinderarts medeonderzoeker Drs. P.E.M. van Schie, fysioth. medeonderzoeker Prof.dr. R.J.B.J. Gemke, kinderarts projectleider

Afdeling Kindergeneeskunde Vumc Kindergeneeskunde Vumc Kinderfysiotherapie Vumc Kindergeneeskunde Vumc

In samenwerking met: Stichting Downsyndroom (adviseur voor dit project: ir. E. de Graaf, voorzitter)(SDS) Nederlands SignaleringsCentrum Kindergeneeskunde (NSCK); dr. J.P. van Wouwe, adviseur) Achtergrond: Kinderen met het Down syndroom (DS) worden vooral gekenmerkt door een karakteristiek uiterlijk en het achterblijven van de verstandelijke ontwikkeling. Daarnaast is dit syndroom geassocieerd met diverse aangeboren afwijkingen (zoals hartafwijkingen en afsluitingen van het maagdarmkanaal) en een breed scala aan zich later manifesterende ziekten (zoals coeliakie, hypothyreoidie). Naar schatting worden er jaarlijks ca 300 kinderen met dit syndroom geboren en dit aantal neemt geleidelijk toe. Vooral door de verbeterde behandelingmogelijkheden van aangeboren hartafwijkingen neemt de sterfte op de zuigelingen- en kinderleeftijd af. Deze verbeterde overleving leidt tot het aan het licht komen van nieuwe ziekten en daarmee samenhangende gevolgen die in het verleden door de jonge(re) sterfte of de slechte(re) algehele gezondheid van kinderen met DS niet zichtbaar waren. Per 01-01-2003 is op initiatief van de ‘Down poli Vumc’ (ME.Weijerman) gestart met de registratie van kinderen, die geboren zijn met diagnose Down syndroom, deze registratie wordt uitgevoerd door de het Nederlands Signalerings Centrum Kindergeneeskunde (NSCK) van de Nederlandse Vereniging voor Kindergeneeskunde (NVK) en werkt samen met TNO Leiden. Studieopzet: Het doel van dit onderzoek is om (1) na te gaan wat de prevalentie, de sterfte en de co-morbiditeit is van kinderen met DS (2) na te gaan wat de belangrijkste mentale, fysieke en psychosociale gevolgen zijn voor patiënt en zijn ouders/verzorgers. Vraagstelling: a. Wat is bij kinderen met het Down syndroom a. de prevalentie b. de sterfte in verschillende levensfasen (neonataal, 1e jaar en 2e-18e jaar) c. de co-morbiditeit (hartafwijkingen, coeliakie, luchtweginfecties en astma, ea) b. Wat zijn bij kinderen met Down syndroom de belangrijkste mentale, fysieke en psychosociale gevolgen voor a. de patiënt b. zijn/haar ouders/verzorgers

44

Methoden en werkplan Vraagstelling 1: Prevalentie, sterfte en co-morbiditeit a. Prevalentie Voor een nauwkeurige schatting van de (periode)prevalentie zullen verschillende gegevensbronnen worden geraadpleegd en met elkaar worden vergeleken. Het gaat hierbij om gegevens van de Down syndroom NSCK registratie, CBS, LVR/LNR en SDS. b. Sterfte Voor een nauwkeurige schatting van de sterfte in verschillende levensfasen zullen dezelfde gegevensbronnen worden geraadpleegd en met elkaar worden vergeleken(zie a) c. Co-morbiditeit De co-morbiditeit zal worden onderzocht in 2 cohorten: (I) Een landelijk cohort van kinderen die bij diagnose in de neonatale periode worden aangemeld bij de NSCK vanaf de periode 01-012003(II) een cohort van patiënten geboren vóór 01-01-2003, geworven vanuit de Down poli van het Vumc of via de Down syndroom vereniging. Vraagstelling 2: Mentale, fysieke en psychosociale gevolgen voor de patiënt en ouders Hiervoor wordt een meer diepgaand onderzoek gedaan bij (de ouders van) de patiënten geboren vóór 01-01-2003 die werden geworven via de polikliniek van het Vumc.Aan hen zal worden gevraagd om, in aansluiting op een reguliere poliafspraak, deel te nemen aan een aantal gevalideerde en gestandaardiseerde tests (voor het kind met DS) en vragenlijsten (voor de ouders/verzorgers). Ten dele worden deze tests en vragenlijsten op indicatie ook uitgevoerd als onderdeel van de reguliere patiëntenzorg bij (ouders van) kinderen met DS. Met deze tests en vragenlijsten wordt beoogd om op gestructureerde wijze een inzicht te krijgen in de mentale, fysieke en psychosociale gevolgen van DS. a. Mentale, fysieke en psychosociale gevolgen voor de patiënt zelf door middel van de volgende tests: o Beperkingen in zelfredzaamheid (ADL) en motorische functies  Pediatric Disability Inventory (PEDI) i  Gross Motor Function Measure (GMFM) ii o Mate van mentale ontwikkeling(s achterstand)  Amsterdam Neuropsychological Tasks (ANT) iii iv  Baily/Vineland v b. Gevolgen voor de ouders/verzorgers door middel van de volgende vragenlijsten: o Thuissituatie  Child Health Questionnaire (CHQ) vi vii  Child Behaviour Check List (CBCL) viii ix  Aanvullende vragen betreffende impact van de geboorte van kind met DS op (huwelijks)relatie, verdere gezinsvorming/progenituur, tijd voor elkaar en voor evt. andere kinderen.

45

Referenties add-on studie Weijerman et al. 1 Freeman SB, Taft LF, Dooley KJ et al. Population based study of congenital heart defects in Down syndrome. Am J Med Genet 1998; 80: 213-17. 2 Book L, Hart A, Black J, Feolo M, Zone JJ, Neuhausen SL. Prevalence and clinical characteristics of celiac disease in Down’s syndrome. Am J Med Genet 2001; 98: 70-74. 3 Karlsson B, Gustafsson J, Hedov G, Ivarsson SA, Anneren G. Thyroid dysfunction in Down’s syndrome: relation to age and thyroid autoimmunity. Arch Dis Childh 1998; 79: 242-245. 4 Ilno Y. Efficacy of tympanostomy tube insertion for otitis media with effusion in children with Down syndrome. Int J Pediatr Otorhynolaryngol 1999; 49: 143-49. 5Roizen NJ, Patterson D. Down’s syndrome. Lancet 2003; 361: 1281-89. 6 Wortelboer MJ, de Wolf BT, Verschuuren-Bemelman CC, Reefhuis J, Mantingh A, Beekhuis JR, Cornel MC. Trends in live birth prevalence of Down syndrome in North Netherlands 1987-96: The impact of screening and prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2000; 20: 709-13. 7 Cornel MC. Down syndroom. In: Nationaal Kompas Volksgezondheid versie 2.31, RIVM, juni 2003 8 Najm HK, Van Arsdell GS, Watzka S, Hornberger L, Coles JG, Williams WG. Primary repair is superior to initial palliation in children with atrioventricular septal defect and tetralogy of Fallot. J Thorac Cardiovasc Surg. 1998; 116: 905-13 9 Santoro G, Marino B, Di Carlo D, Formigari R, Santoro G, Marcelletti C, Pasquini L. Patient selection for repair of complete atrioventricular canal guided by echocardiography. Eur J Cardiothor Surg 1996; 10: 439-442. 10 Walle HEK, Cornel MC, Sijmons RH, Tuerlings JHAM, Ten Kate LP. Tijdschr Kindergeneeskd 1995; 63: 40-44. 11 Leidraad voor de medische begeleiding van kinderen met het Down syndroom. Van Wouwe JP, van Diemen-Steenvoorde R, Siderius EJ et al. Ned Ver Kindergeneeskunde, Utrecht, 1998. 12 van Wouwe JP, Siderius EJ, Borstlap R, Nijenhuis TA, Hirasing RA. Ned Tijdschr Geneeskd. 2001; 145: 1617-21. Optimal medical care for children with Down syndrome and their parents 13 Janse A, Gemke RJBJ, Uijterwaal CSPM, van Tweel I, Kimpen JLL, Sinnema G. Differences in health perception between patients, parents and physicians in chronically ill children (in press). 14 Roach MA, Orsmond GI, Barratt MS. Mothers and fathers of children with Down syndrome: Parental stress and involvement in childcare. Am J Mental Retard 1999; 104: 422-436. 15 Weijerman ME, Colenbrander RJ, Hendriks ML, Sobotka-Plojhar MA. Improving fate of children with Down syndrome and congenital heart disease. Europediatrics, Praag, oktober 2003. 16 Weijerman ME, van Wouwe JP. Integrated preventive care for children with Down’s syndrome in the Netherlands; collection and analysis of the actual data. Europediatrics, Praag, oktober 2003 en Congres Ned. Ver Kindergeneeeskunde, Veldhoven, november 2003. 46

17 Wassenberg-Severijnen JE, Custers JWH, Hox JJ, Vermeer A, Helders PJM. Reliability of the Dutch Pediatric Eveliation of Disability Inventory (PEDI). Clin Rehabilit 2003; 17: 457-462. De Pediatric Disability Inventory (PEDI) is een uit Amerika afkomstig door de groep van Paul Helders (hgl [kinder]fysiotherapie, WKZ-UMCU) voor NL vertaald en gevalideerd meetinstrument die het meest geschikt lijkt om in de patientengroep van onder studie (beperkingen in) ADL functies te bepalen. Er ligt via Petra van Schie, kinderfysiotherapeut alhier, een aanbod om door een Utrechtse student bij een aantal Down kinderen de PEDI te doen. 18 Russell DJ, Rosenbaum PL, Cadman DT, Gowland C, Hardy S, Jarvis S. The Gross Motor Function Measure: a means to evaluate the effects of physiotherapy. Dev Med Child Neurol 1989; 31: 341-352. 19 De Sonneville LMJ (1999). Amsterdam Neuropsychological Tasks : A computer-aided assessment program. In: BPLM den Brinker, PJ Beek, AN Brand, SJ Maarse, LJM Mulder (eds). Cognitive ergonomics, clinical assessment and comuter assisted learning: Computers in psychology, Vol 6. Lisse, Swets & Zeitlinger, ISBN 9026515537, pp 187-203. 20 De Sonneville LMJ, Visser M, Licht R (1999). Attention and information processing in 4 and 5 year old children: results of a computerized assessment technique. In: BPLM den Brinker, PJ Beek, AN Brand, SJ Maarse, LJM Mulder (eds). Cognitive ergonomics, clinical assessment and comuter assisted learning: Computers in psychology, Vol 6. Lisse, Swets & Zeitlinger, ISBN 9026515537, pp 204-217. 21 Bayley N. Bayley scales of infant development manual, 2nd edition. The Psychological Corporation, 1993. 22 Landgraf JM, Abetz L, Ware JE. Child Health Questionnaire (CHQ): A user’s manual. Boston, MA: The Health Institute, New England Medical Center, 1996. De CHQ is afgeleid van de SF36; een voor volwassenen zo ongeveer als internationale geaccepteerde KvL vragenlijst. Hierin zitten overigens ook elementen van school, ADL en cognitieve ontwikkeling. Bij de vertaling en validering van dit Amerikaanse instrument voor het Nederland is Gemke rechtstreeks betrokken via ZonMw project met iMGZ van het EUMC. 23 Raat H, Bonsel GJ, Essink-Bot ML, Landgraff JM, Gemke RJBJ. Reliability and validity of comprehensive health status measures in children: The Child Health Questionnaire (CHQ) in relation to the Health Utilities Index (HUI). J Clin Epidem 2002; 55: 67-76. 24Achenbach TM, Verhulst FC, Baron GD, Akkerhuis GW. Epidemiological comparisons of American and Dutch children: I. Behavioral/emotional problems and competencies reported by parents for ages 4 to 16. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 1987; 26: 317-25. 25 Achenbach TM, Verhulst FC, Baron GD, Althuas M. A comparison of syndromes derived from the Child Behavior Checklist for American and Dutch boys aged 6-11 and 12-16. J Child Psychol Psychiatry 1987; 28: 437-53.

47

48

TRANSIENT MYELOPROLIFERATIVE DISEASE (TMD) IN CHILDREN WITH DOWN SYNDROME

A DUTCH CHILDHOOD ONCOLOGY GROUP PROTOCOL

PART B: TREATMENT AND FOLLOW-UP OF CHILDREN WITH DOWN SYNDROME AND TMD

INCLUSIEF AMENDEMENT 1, DD 13-02-2009

50

INHOUDSOPGAVE PROTOCOL PART B, TMD TREATMENT AND FOLLOW-UP DUTCH ADDENDUM TO INTERNATIONAL TMD PROTOCOL

53

1. Inclusion 2. Diagnosis and requested samples 3. Treatment indications for symptomatic disease 4. Treatment indications for minimal residual disease 5. Follow-up after week 12 6. Supportive care 7. Add-on studies 8. Sponsorship 9. Ethical aspects

53 53 54 54 55 55 56 56 56

APPENDICES 1. Cytarabine courses 2. Flow-chart TMD-B study protocol 3. Patiëntenbrief en informed consent (part B) 4. METC verklaring 5. Goedkeuring bevoegde instantie 6. Duitse goedkeuring 7.‘Materiaal aanleveren aan SKION’ 8. Add-on study

57 58 59 65 69 71 75 77

INTERNATIONALE TMD

93

PROTOCOL

51

52

DUTCH ADDENDUM TO INTERNATIONAL TMD PROTOCOL 1. INCLUSION This protocol will be performed in conjunction with a screening protocol to detect all cases of transient myeloproliferative disease (TMD, also referred to as transient leukemia) in children with Down syndrome (DS) in the Netherlands. This screening protocol is entitled: “SKION protocol voor de epidemiologie en follow-up van transiente leukemie bij kinderen met Down syndroom”, and is described in part A. Once a child with Down syndrome has been diagnosed with TMD, he/she will be registered (provided informed consent is obtained) on this study for the treatment and follow-up of TMD. At this stage the child needs to be referred to one of the pediatric oncology or stem-cell transplantation centers in the Netherlands. 2. DIAGNOSIS AND REQUESTED SAMPLES a) At initial diagnosis of TMD, a peripheral blood sample (5 ml of heparinized peripheral blood), together with 3 unstained peripheral blood smears, should be sent to the DCOG central laboratory for morphology and immunophenotyping by flowcytometry, to confirm the diagnosis of TMD. This should be done using a ‘hemoblok’, as specified in appendix one. This may already have been performed in the context of the “SKION protocol voor de epidemiologie en follow-up van transiente leukemie bij kinderen met Down syndroom” described in part A, in which case there is no reason to repeat these studies. Note 1: a bone marrow sample is not needed, as in TMD the blast percentage in peripheral blood is often higher than in the bone marrow, as TMD arises in the fetal liver. Note 2: as there are no reports of central nervous system involvement of TMD, there is no need for a spinal tap at inclusion in the TMD study. Note 3: in some children TMD may be diagnosed by demonstrating leukemic cells in pleural or pericardial fluid, or in a liver biopsy, even without demonstrating leukemic cells in the peripheral blood. These children are considered eligible for the study. b) Subsequently, the remaining sample (or a new peripheral blood sample if not enough material is available) will be sent for GATA-1 mutation analysis from the DCOG to Rotterdam (M.L. den Boer, Research Laboratory for Pediatric Oncology, Erasmus MC, Rotterdam). If necessary, this will be done after flow-cytometry sorting to enrich the sample for TMD-blasts. c) For each patient, a GATA1 mutation-specific primer for minimal residual disease follow-up studies will be designed (V.H.J. van der Velden, Leukemia and Lymphoma Diagnostics Laboratory, Department of Immunology, Erasmus MC, Rotterdam). The sensitivity of the patient-specific RQ-PCR will be evaluated by making a dilution series of the initial sample (10% blasts to 0,001% blasts in 10-fold dilution steps), and the specificity will be evaluated by analyzing peripheral blood mononuclear cell DNA obtained from a pool of 10 healthy donors. This approach will result in a sensitivity of at least 0,01% (1 leukemic cell within 10,000 normal cells) in the vast majority of patients. d) Standard cytogenetic analysis on peripheral blood is indicated in case of TMD, as it has been described by Massey et al. (Blood 2006) that especially children with additional cytogenetic abnormalities have more risk to develop subsequent DS ML.

53

3. TREATMENT INDICATIONS FOR SYMPTOMATIC DISEASE 3.1. Patients with low WBC with minor or no clinical symptoms should not be treated. 3.2 The decision to treat a child with symptomatic TMD is left to the discretion of the investigator. Clear indications may consist of: - persisting hyperbilirubinemia and/or cholestasis indicative of beginning liver fibrosis due to TMD (after exlcuding other causes) - pleural or pericardial effusions - large hepato- or splenomegaly leading to breathing or feeding difficulties - high WBC with deep thrombocytopenia/bleeding problems and/or pulmonary complications. Especially liver dysfunction, elevated transaminases and organomegaly are important riskfactors for early death due to TMD, hence an aggressive work-up including liver biopsy may be necessary, as well as rapid treatment with low-dose cytarabine (Massey et al., Blood 2006). In a recent report from Klusmann et al (Blood 2008), summarizing data from 146 patients with TMD, a correlation between high white blood cell (WBC) count, ascites, preterm delivery, bleeding diatheses, failure of spontaneous remission, and the occurrence of early death was identified. Treatment with cytarabine (0.5-1.5 mg/kg) was administered to 28 patients with high WBC count, thrombocytopenia, or liver dysfunction. The therapy had a beneficial effect on the outcome of those children with risk factors for early death (5-year EFS 52% +/- 12% vs 28% +/11% [no treatment]; p=.02) It is anticipated that approximately 15% of children will need treatment for symptomatic TMD. 3.3. In case patients are treated for symptomatic TMD, a second course should be administered if the peripheral blood is not cleared from TMD blasts. This will be assessed by the DCOG central laboratory, using standard morphological analysis of peripheral blood. Therefore, 1 week after the last dose of cytarabine, 5 ml peripheral heparinized blood and 3 unstained peripheral blood smears need to be send to the DCOG for this analysis. 3.4. In addition, the patients should be followed by minimal residual disease measurements as explained below, which may lead to subsequent cytarabine courses at week 8 or 12. 4. TREATMENT INDICATIONS FOR MINIMAL RESIDUAL DISEASE: Follow-up peripheral blood samples (5 ml. heparinized peripheral blood plus 3 unstained peripheral blood smears) for minimal residual disease levels are needed at the following timepoints (please send the samples to the DCOG central laboratory): Time points Time point 1: Time point 2: Time point 2A: Time point 3:

at week 4 (or later if the child has not been diagnosed in the first 4 weeks) at week 8 at week 10, only for patients who were treated because of high MRDlevels at week 8. at week 12.

54

Samples will be analyzed using 2 MRD-methods; i.e. flowcytometry and RQ-PCR: a) Flowcytometric MRD analysis will be performed in the laboratory of the DCOG, and in the Leukemia and Lymphoma Diagnostics Laboratory at Erasmus MC. PB samples will be evaluated using 4-color flowcytometry. The presence of residual TL populations will be evaluated using the patient-specific labeling designed at the initial sample. It has to be mentioned that the sensitivity and specificity of flowcytometry are limited. Hence, only larger residual disease levels (i.e. >5x10-3) will be considered to represent sufficient leukemic load to treat patients. b) In addition, the presence of residual leukemic populations will be evaluated by the patient-specific GATA-1 RQ-PCR (real-time quantative polymerase chain reaction) assay. This assay is both specific and sensitive, and may therefore be used to detect minimal residual levels as low as 10-4. Treatment will be indicated for those children who have a minimal residual disease level at week 8 that is greater than 1x10-3 as determined by PCR, or greater than 1x10-2 by flowcytometry. Treatment will be repeated at approximately week 11, in case the results from time point 2A (week 10) indicate that the threshold level of MRD below 1x10-3 as determined by PCR, or 1x10-2 by flowcytometry, has not been reached. The final aim is to reach “MRD-negativity”, defined as an MRD level below 1x10-4 by PCR, or 1x10-3 by flowcytometry at week 12 or later. Children with positive MRD at week 12 (i.e. MRD levels above the week 12 threshold) will not be treated. It is anticipated that approximately 15% of children will need treatment for persisting MRD levels. 5) FOLLOW-UP AFTER WEEK 12 Children who have experienced TMD have a 20% chance of being diagnosed with myeloid leukemia of Down syndrome (ML DS; the leukemia is diagnosed at a median age of 1.5 years in children who have suffered from TMD). In case children have been treated it is hypothesized that this risk will be lower (in the range of 7%). The remaining follow-up requires sending samples to the DCOG for peripheral blood examination at 6, 9 and 12 months, after which peripheral blood examination is done every 6 months to detect the occurrence of leukemia using CBC, morphology, immunophenotyping and GATA1 RQ-PCR. This monitoring will be continued until 3 years of age. Please send 2-5 ml of heparinized peripheral blood plus 3 unstained peripheral blood smears to the DCOG central laboratory. 6) SUPPORTIVE CARE The cytarabine courses are usually very well tolerated and do not result in neutropenia and its associated infectious problems, with the occasional exception of patients who have severe bonemarrow involvement of TMD. Therefore, no standard antibiotic prophylaxis is needed, nor antifungal prophylaxis. In case of repeated cytarabine courses, cotrimoxazole prophylaxis for pneumocystis carinii may be considered.

55

When the duration of neutropenia and thrombocytopenia following a cytarabine course exceeds 10 days, a bone marrow examination should reveal whether this is due to leukemic marrow infiltration or due to chemotherapy related side effects. In case of persisting leukemia, treatment should be continued with cytarabine; in case of aplasia, peripheral blood recovery should be awaited until the platelet count is 100x109/l and the neutrophils are over 1000x109/l. In these patients antibitiotic and/or anti-fungal prophyalxis may be indicated, which is left to the investigator’s discretion. Tumor-lysis syndrome prevention (hyperhydration and uricozyme) may be indicated in case of large effusions or high WBC (>20x10.9/l), according to institutional guidelines. Before starting hyperhydration a cardiologist should be consulted, to discuss potential risks of hyperhydration associated with cardiac abnormalities. Anti-emetic prophylaxis may be given according to nstitutional guidelines. 7) DCOG ADD-ON STUDIES The approved add-on studies are attached to this protocol. Left over material from TMD samples will be used for these studies. This concerns a study from Zwaan et al, entitled ”Clinical relevance of genetic alterations in Myeloid Leukemia of Down syndrome”, and a study from Cloos et al., entitled “Chromosomal instability as potential risk factor for the development of TMD and subsequent leukemia in Down syndrome children”. 8) SPONSORSHIP This concerns an investigator initiated study. The coordinating sponsor is the “Medizinische Hochschule Hannover”. For The Netherlands, Erasmus MC will be the Dutch co-sponsor for this study. 9) ETHICAL ASPECTS. Please also read the paragraph on ethical aspects in section A of this protocol. In this study, patients with symptomatic TMD will be treated according to best available treatment guidelines according to a standardized protocol. In the past, these children were also treated, but not according to uniform treatment and evaluation guidelines. The systematic follow-up of patients with TMD for the detection of DS-ML is a new and experimental approach, as well as treating children with persisting minimal residual disease levels with low-dose chemotherapy. However, given the potential to prevent leukemia, as suggested by the pilot data (see introduction section of the protocol), we feel there may be therapeutic benefit for these children. Moreover, treatment with low-dose cytarabine only has modest toxicity. The protocol has obtained ethical approval from the Medizinische Hochschule Hannover in Germany, dated November 7, 2006. BfArM (Bundesinstitut for Arzneimittel und Medizinprodukte) was obtained March 15th, 2007. In The Netherlands this protocol will be submitted to the ethical committee of Erasmus MC.

56

APPENDIX 1. CYTARABINE COURSES

Course no: 1. Start date 2. Start date 3. Start date

..-..-….(dd-mm-yyyy) ..-..-….(dd-mm-yyyy) ..-..-….(dd-mm-yyyy)

Cytarabine 1.5 mg/kg/day In 15 minutes IV day

1

2

3

4

5

6

7

57

APPENDIX 2. FLOW CHART TMD-B STUDY PROTOCOL

Screen for TMD week 1-4; CBC and flow

Treat symptomatic TMD week 1-8. Repeat in case of persisting PB blasts

Birth

Week 4

Assess TMD MRD level; CBC, flow, RQ-PCR

Repeat MRD level (CBC, flow, RQ-PCR) when treated at week 8

Repeat CBC, flow and RQPCR MRD level

Treat again in case of high MRD

Treat in case of high MRD

Week 8

Repeat MRD level (CBC, flow, RQPCR)

Week 10

High MRD is: Flow: >1x10-2 RQ-PCR: >1x10-3

Week 12

6, 9, 12 months 18, 24, 30, 36 months

High MRD is: Flow: >1x10-3 RQ-PCR: 1x10-4

58

APPENDIX 3. PATIËNTEN INFORMATIEBRIEF EN INFORMED CONSENT (PART B) Informatie over behandeling en wetenschappelijk onderzoek bij kinderen met Down syndroom en transiënte myeloproliferatieve ziekte Officiële titel: ”SKION- protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiënte leukemie” Geachte ouder(s), Inleiding Onlangs is na screening vastgesteld dat er bij uw kind sprake is van ‘Transiente Myeloproliferatieve Ziekte’ (TMZ). Dit wordt ook wel Transiënte Leukemie (TL) genoemd, of in het Engels 'Transient Myeloproliferative Disease (TMD). Daarom bent u met uw kind verwezen naar een kinderoncologisch centrum. Uw kind zal daar gecontroleerd en zonodig behandeld worden volgens het SKION protocol voor kinderen met Down syndroom (DS) en TMD. De behandelend arts van uw kind heeft u hier inmiddels over geïnformeerd. Met het SKION-DS-TMD protocol hopen wij ook enkele belangrijke wetenschappelijke vragen te beantwoorden over de behandeling van kinderen met Down syndroom. Voor toestemming of weigering daarvoor is goede voorlichting van onze kant nodig en een zorgvuldige afweging van uw kant. Vandaar dat u deze schriftelijke informatie ontvangt. U kunt die rustig (her)lezen en in eigen kring bespreken. Ook daarna kunt u nog altijd vragen stellen aan de artsen die aan het eind van deze informatie genoemd staan. Kinderen met Down syndroom en leukemie De behandelend arts heeft u in de afgelopen tijd op de hoogte gebracht van de medische aspecten van het syndroom van Down. Eén van die aspecten is dat kinderen met het syndroom van Down een verhoogde kans hebben op het krijgen van TMZ en leukemie. Dit betreft zowel een verhoogde kans op het krijgen van Acute Lymfatische Leukemie (ALL) als Acute Myeloide Leukemie (AML). In deze informatiebrief gaat het verder alleen over TMZ en AML. TMZ is een aandoening met afwijkende cellen die op leukemiecellen lijken, die alleen voorkomt bij kinderen met Down syndroom. De meeste kinderen krijgen gelukkig geen leukemie, de TMZ gaat bij hen vanzelf over. Helaas gaat bij ongeveer 15-20% van de kinderen de aanwezigheid van TMZ cellen wel gepaard met klachten. In zulke gevallen is behandeling met chemotherapie (cytostatica) noodzakelijk. Het kan bij deze klachten gaan om vochtophoping achter de longen, leverproblemen (sommige vormen van geelzucht), of klachten die te maken hebben met het aanwezig zijn van heel veel TMZ cellen in het bloed. Inmiddels weten we dat bij 20% van de kinderen die TMZ hebben doorgemaakt later (meestal tussen de leeftijd van 6 maanden en 4 jaar) alsnog een leukemie (AML) ontstaat. Mogelijk kan AML ook ontstaan bij kinderen die geen TMZ hebben doorgemaakt, maar dat is niet goed bekend. Bloedcellen worden tijdens de zwangerschap en bij een pasgeborene in de lever gemaakt, maar daarna in het beenmerg. Beenmerg zit in alle botten van het lichaam. AML is een vorm van kanker van bloedcellen die in het beenmerg gemaakt worden. TMZ ontstaat dan ook in de lever, terwijl de eventueel latere AML een beenmergziekte is. De zieke cellen heten blasten. Normaal gesproken ontstaan de bloedcellen eerst als onrijpe cellen en rijpen ze vervolgens uit, om daarna losgelaten te worden in het bloed. Via het bloed kunnen de cellen vervolgens door het hele lichaam vervoerd worden om hun functies uit te voeren. De verschillende soorten normale bloedcellen in het menselijk lichaam zijn: rode bloedcellen (erythrocyten), witte bloedcellen (leukocyten) en bloedplaatjes (trombocyten). AML bij kinderen met Down syndroom verschilt van AML bij kinderen die geen Down syndroom hebben. Hieronder staan een aantal van die verschillen benoemd:  Deze vorm van AML vaak al op jonge leeftijd voor: tussen de leeftijd van 6 maanden en 4 jaar.  Deze vorm van AML wordt meestal voorafgegaan door TMZ.  Er zijn lage aantallen witte bloedcellen bij diagnose  Er is minder vaak uitbreiding van de AML in het centraal zenuwstelsel  Er is een verhoogde gevoeligheid van de TMZ- en leukemie cellen voor chemotherapie  In de blasten zien we een afwijking op een gen (het GATA1 gen), die alleen voorkomt bij kinderen met Down syndroom en TMZ of AML.

59

Diagnose Als de definitieve diagnose TMZ is gesteld is de eerste vraag die beantwoord moet worden of er bij uw kind klachten zijn die behandeling noodzakelijk maken. Dat zal bij ongeveer 15-20% van de kinderen het geval zijn. Als er geen klachten zijn krijgt uw kind geen behandeling. Dat heet afwachtend beleid. Wel wordt uw kind regelmatig op de polikliniek gecontroleerd. Er wordt dan ook bloed geprikt om vast te stellen of de blasten uit het bloed verdwijnen. Er zijn aanwijzingen dat kinderen die behandeld zijn voor TMZ omdat ze klachten hadden, later minder vaak AML kregen dan kinderen die niet behandeld werden. Ook zijn er aanwijzigen dat kinderen bij wie de TMZ cellen lang in het bloed aantoonbaar blijven, een verhoogd risico lopen op het krijgen van AML op latere leeftijd. Daarom willen we met speciale laboratorium technieken kijken of er nog kleine aantallen TMZ cellen aantoonbaar zijn in het bloed op verschillende tijdstippen na de diagnose TMZ. Dat noemen we minimale restziekte (Minimal Residual Disease, afgekort MRD). Kinderen bij wie 8 weken na de geboorte deze cellen nog in te grote mate in het bloed aanwezig zijn, en dus te hoge MRD waarden hebben, willen we gaan behandelen. Bij de behandeling kunnen we bestuderen of de cellen snel verdwijnen. Daarnaast willen we alle kinderen vervolgen om te kijken of de behandelde kinderen later minder vaak AML ontwikkelen. De patiënten waarbij een TMZ wordt vastgesteld, zijn onder te verdelen in 3 groepen. Uw behandelend arts zal u vertellen wat van toepassing is voor uw kind: Groep 1:

Ongeveer 70% van de kinderen met een TMZ zal niet behandeld worden. Zij hebben geen klachten, en we zien dat de TMZ cellen voldoende verdwenen zijn op de leeftijd van 8 weken.

Groep 2:

Ongeveer 15-20% van de kinderen heeft ziekteverschijnselen. Deze kinderen zullen behandeld worden, zoals in het verleden gebruikelijk was. Hierbij werd altijd het middel cytarabine gebruikt, maar elk ziekenhuis had hiervoor een eigen schema. In het huidige protocol ligt precies vast hoe kinderen met TMZ en klachten behandeld moeten worden, zodat we beter kunnen beoordelen hoe effectief de behandeling is.

Groep 3:

Ongeveer 15% van de kinderen heeft geen ziekteverschijnselen, maar heeft na 8 weken nog wel aantoonbare TMZ cellen (MRD) in het bloed. Tot op heden kregen deze kinderen geen behandeling. Door kinderen zonder symptomen, maar met langdurig aantoonbare TMZ cellen toch met medicijnen te behandelen, kan worden bestudeerd of deze vroegtijdige behandeling ertoe leidt dat kinderen die behandeld zijn voor TMZ minder vaak AML ontwikkelen dan kinderen die niet behandeld zijn voor TMZ.

Een enkele keer kan het voorkomen dat een kind eerst behandeld moet worden voor klachten, en later nog een keer omdat de TMZ cellen onvoldoende snel verdwijnen. Aansluitend aan deze periode met TMZ willen we bij alle kinderen elke 3 maanden een bloedafname doen om zo vast te stellen of er wel of geen AML ontstaat bij uw kind. Hiervoor zijn 2 buisjes bloed nodig. Van belang is nog dat als er wel AML ontstaat dit meestal goed te behandelen is, waarbij een groot deel van de kinderen beter kan worden. Het gaat hierbij echter wel om een zware behandeling met chemotherapie die ongeveer een half jaar duurt. Dat is de reden dat we willen onderzoeken of dat te voorkomen is door in een vroeg stadium een lichtere behandeling te geven.

60

Behandeling De Stichting Kinderoncologie Nederland (SKION) is het samenwerkingsverband van de Nederlandse kinderartsen die zorg dragen voor kinderen met kanker. Hier is besloten om kinderen met TMZ en het syndroom van Down volgens het SKION-DS-TMD protocol te behandelen. De SKION doet dit in samenwerking met een Duitse onderzoeksgroep (de AML-BFM Studie groep). De SKION heeft een centraal bureau waar gegevens over de ziekte en de behandeling van kinderen met kanker worden verzameld en geregistreerd. Via de SKION worden deze gegevens gerapporteerd aan de AML-BFM Studie Groep in Hannover, waar gegevens over de ziekte en de behandeling van kinderen met TMD en het syndroom van Down worden verzameld en geregistreerd. Het SKION-DS-TMD protocol is een handboek voor de behandelend kinderoncoloog met richtlijnen voor behandeling en onderzoek. De standaard behandeling voor TMD bij kinderen met het syndroom van Down is gebaseerd op de resultaten van eerder onderzoek. Het SKION-DS-TMD protocol biedt naar de huidige inzichten de beste kans op genezing en bestaat uit een behandeling met laag gedoseerde chemotherapie. De chemotherapie die we geven heet Cytarabine. Met dit medicijn werden voorheen kinderen met TMZ die verschijnselen van de ziekte hadden al behandeld. Voor de groep kinderen met TMZ die na 8 weken nog aantoonbare zieke bloedcellen is deze behandeling echter nieuw. Het kan zijn dat uw kind voor deze behandeling in het ziekenhuis wordt opgenomen. Dit wordt bepaald door de klachten die uw kind heeft. Uw behandelend arts zal dit met u bespreken. We beginnen met 1 kuur Cytarabine. Controle van het bloed van uw kind zal daarna uitwijzen of er wellicht een tweede en misschien een derde kuur nodig is. Soms is echter 1 kuur voldoende om de ziekte te behandelen. Bijwerkingen Chemotherapie is zeer effectief in het kapot maken van leukemiecellen. Dit kan echter gepaard gaan met bijwerkingen. Daarom wordt de gezondheidstoestand van uw kind nauwlettend in de gaten gehouden. Bij de meeste patiënten zullen naar verwachting weinig bijwerkingen optreden; de cytarabine dosering is immers niet erg hoog. De bijwerkingen van Cytarabine bestaan uit een verhoogde kans op bloedarmoede, infecties en/of bloedingen. Andere bijwerkingen kunnen zijn verminderde eetlust, misselijkheid, braken, obstipatie of diarree, haaruitval (tijdelijk), beschadiging van het mondslijmvlies en koorts. De mogelijke bijwerkingen kunnen per kind verschillen. We dienen Cytarabine via een infuus toe, uw kind moet daar dan ook voor geprikt worden. Voor meer informatie over de verschillende soorten medicijnen verwijzen we u naar de dagboekagenda van de vereniging ouders, kinderen en kanker (VOKK) die u bij het begin van de behandeling krijgt. Aanvullende onderzoeksprojecten Indien u daar toestemming voor geeft wordt restmateriaal verzameld. Dit restmateriaal is bloed dat overblijft nadat dit al bij u kind was afgenomen in het kader van de behandeling. Uw kind wordt er dus niet extra voor geprikt. Reden voor het verzamelen van restmateriaal is dat voor de verbetering van de behandeling van een zeldzame ziekte als TMD bij kinderen met Down syndroom altijd onderzoek nodig zal zijn. Vooral het laboratoriumonderzoek naar de biologische eigenschappen van de leukemiecellen is hierbij van groot belang. Het doel van dergelijk aanvullend onderzoek is het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor kinderen met TMD of leukemie en het syndroom van Down. Voor- en nadelen Door aan dit behandelingsprotocol deel te nemen, kan TMZ bij uw kind tijdig behandeld worden. Het doel van de vroege behandeling is ernstiger vormen van TMZ en om AML te voorkomen. Dat kan een voordeel zijn. In het nieuwe protocol ligt precies vast hoe kinderen met TMZ en klachten behandeld moeten worden, zodat we kunnen zien hoe effectief de behandeling is. Dat kan een voordeel zijn. Kinderen bij wie de op de leeftijd van 8 weken nog teveel TMZ cellen aantoonbaar zijn (MRD) kregen voorheen geen behandeling. In dit protocol krijgen deze kinderen nu een behandeling die ze in het verleden niet gekregen zouden hebben. Ze worden dus ook aan de eventuele bijwerkingen daarvan blootgesteld. Dat kan een nadeel zijn. De verwachting is echter dat kinderen die voor TMZ behandeld worden minder vaak AML ontwikkelen, terwijl de behandeling die dan nodig is, over het algemeen zwaarder en langduriger is.

61

Alle kinderen met TMZ zullen vervolgd worden op het optreden van AML door middel van driemaandelijks bloedonderzoek totdat de leeftijd van 3 jaar is bereikt. Dat betekent dat uw kind daarvoor geprikt moet worden door de kinderarts. Uw kind heeft geen direct voordeel van deelname aan onderzoek aan de aanvullende laboratorium onderzoeksprojecten met restmateriaal van het bloed. Wel vergroot het de mogelijkheid om de kwaliteit van behandeling van kinderen met TMD of leukemie en het syndroom van Down in de toekomst te verbeteren. Vrijwillige deelname en toestemming Voordat we met de behandeling van uw kind beginnen vragen we u een toestemmingsformulier te ondertekenen waarin staat dat u weet wat de behandeling inhoudt. Tevens vragen wij uw toestemming voor het verzamelen van de gegevens van uw kind over het verloop van de behandeling en voor het bewaren van restmateriaal. We zullen de huisarts van uw kind op de hoogte brengen van de behandeling. Ook hiervoor dient u apart toestemming te geven. Het behandelteam van de afdeling kinderoncologie begeleidt u en uw kind gedurende de behandeling zo goed mogelijk. Dit team is multidisciplinair samengesteld en bestaat onder meer uit gespecialiseerde artsen, verpleegkundigen en een psycholoog. Het behandelteam ziet nauwlettend toe op de belasting die deelname aan het onderzoek voor uw kind met zich mee brengt. Indien de belasting voor uw kind groter is dan verwacht, zal de deelname van uw kind aan het onderzoek worden gestopt. We werken daarbij volgens de landelijke afspraken zoals die door de Nederlandse Vereniging voor Kindergeneeskunde (NVK) zijn vastgelegd ter bescherming van minderjarige onderzoeksdeelnemers. Voor meer informatie hierover verwijzen wij u naar de volgende website: www.ccmo.nl (wet- en regelgeving/gedragscode verzet: minderjarigen). Als u besluit om uw kind niet aan dit behandelingsprotocol en het bewaren van restmateriaal mee te laten doen, dan krijgt uw kind de behandeling die tot op heden gebruikelijk was. Dat betekent dat als uw kind door TMZ veroorzaakte klachten of symptomen heeft, de behandeling (dus met uitzondering van de gegevensverzameling en het bewaren van restmateriaal) toch gewoon volgens het SKION-DS-TMD protocol gegeven zal worden. Dat is namelijk de standaard behandeling voor kinderen met TMZ en daardoor veroorzaakte problemen. Indien uw kind wel TMZ, maar geen symptomen heeft, wordt afgewacht, omdat dat tot het verschijnen van deze studie het gebruikelijke beleid was. U krijgt voldoende tijd om hierover na te denken en u kunt te allen tijde om extra informatie vragen of op eenmaal genomen beslissingen terugkomen. Verantwoording en vertrouwelijkheid Tot uw kind herleidbare onderzoeksgegevens kunnen slechts met uw toestemming door daartoe bevoegde personen worden ingezien. Deze personen zijn medewerkers van het onderzoeksteam, medewerkers van de Inspectie voor de Gezondheidszorg of bevoegde inspecteurs van een buitenlandse overheid, en leden van de Medisch Ethische Toetsings Commissie (METC). Inzage kan nodig zijn om de betrouwbaarheid en kwaliteit van het onderzoek na te gaan. Onderzoeksgegevens zullen worden gehanteerd met inachtneming van de Wet Bescherming Persoonsgegevens en het privacyreglement van het Erasmus MC. Persoonsgegevens die tijdens deze studie worden verzameld, zullen worden vervangen door een code, bestaande uit een studienummer en de initialen van uw kind. De sleutel van deze code zal alleen toegankelijk zijn voor de onderzoeker, de behandelend arts of de researchverpleegkundige/ datamanager. Alleen deze gecodeerde gegevens zullen gebruikt worden voor studiedocumentatie, in rapporten of publicaties over dit protocol. De vertrouwelijkheid van de gegevens blijft hierbij gewaarborgd. De gecodeerde gegevens worden opgeslagen in een computerbestand en verwerkt bij de SKION. De gegevens worden, indien u daar toestemming voor geeft, gedurende minimaal 15 jaar bewaard. Lichaamsmaterialen die tijdens deze studie worden verzameld, worden gecodeerd opgeslagen. Na afloop van het protocol worden het opgeslagen bloed als u daarvoor toestemming geeft langdurig bewaard. Het opgeslagen lichaamsmateriaal kan dan eventueel in een later stadium worden gebruikt voor onderzoek met als doelstelling de toekomstige behandeling van kinderen met leukemie verder te verbeteren. De resultaten van dit protocol worden gerapporteerd in medisch-wetenschappelijke literatuur en/of op medische congressen.

62

Voor dit onderzoek is goedkeuring verkregen van de Raad van Bestuur na een positief oordeel van de Medisch Ethische Toetsing Commissie Erasmus MC Rotterdam. De voor dit onderzoek geldende internationale richtlijnen zullen nauwkeurig in acht worden. Verzekering Voor deelneming aan dit onderzoek is een verzekering afgesloten waaruit eventuele schade als gevolg van dit onderzoek betaald kan worden. Wanneer u vindt dat uw kind schade heeft ondervonden als gevolg van deelname aan het onderzoek kunt u contact opnemen met de hoofdonderzoeker. Informatie over de afgesloten verzekering treft u aan in bijlage 1. Slotopmerking Hoewel de patiënten worden onderzocht en behandeld volgens een van tevoren opgesteld plan (het protocol) kunnen er zich in individuele gevallen omstandigheden voordoen, die een afwijking van het protocol gewenst maken. In die gevallen zal het belang van de patiënt altijd worden gesteld boven het belang van het volgen van het protocol. De behandelende arts heeft te allen tijde de plicht aan de patiënt de beste medische zorg te verlenen. Contactpersonen Bij vragen of opmerkingen kunt u contact opnemen met dr. C.M. Zwaan, kinderarts-oncoloog, tel. 010-7036691, of met de researchverpleegkundigen van de afdeling kinderoncologie, Inekee van der Vaart of Eline Visser, tel. 010-4636402. Als u twijfelt over deelname van uw kind aan deze studie dan kunt u een onafhankelijke arts raadplegen die zelf niet bij het onderzoek is betrokken maar wel deskundig is op dit gebied: Dr. J.B. van Goudoever, kinderarts, tel. 010 7036077. Ook indien u voor of tijdens het onderzoek vragen heeft die u liever niet aan de onderzoekers stelt dan kunt u contact opnemen met de onafhankelijke arts. Neemt u de tijd om deze informatie door te spreken en aarzel niet de behandelend arts van uw kind te raadplegen als u vragen heeft. Wanneer u besluit deel te nemen ontvangt u een kopie van dit document, nadat u en de behandelend arts van uw kind beiden voor deelname getekend hebben.

Met vriendelijke groet, Dr. C.M. Zwaan, Kinderarts-oncoloog

63

Toestemmingsformulier ouders/voogd behorende bij de patiënteninformatie over behandeling en wetenschappelijk onderzoek bij kinderen met Down syndroom voor het optreden van transiënte leukemie Titel van het onderzoek: ”SKION- protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiënte leukemie”

Mij is gevraagd toestemming te verlenen voor deelname aan bovengenoemd protocol ten behoeve van: Naam kind:

Geboortedatum: __ / __ / __

Ik bevestig, dat ik het informatieformulier voor mijn kind heb gelezen. Ik begrijp de informatie. Ik heb de gelegenheid gehad om aanvullende vragen te stellen. Deze vragen zijn naar tevredenheid beantwoord. Ik heb voldoende tijd gehad om over deelname van mijn kind na te denken. Ik weet dat deelname geheel vrijwillig is en dat ik mijn toestemming op ieder moment kan intrekken zonder dat ik daarvoor een reden hoef te geven. Ik geef toestemming voor deelname van mijn kind aan behandeling volgens het SKION-DS-TMD protocol onder de omstandigheden zoals die mij zijn uitgelegd. Ik geef wel/geen* toestemming om de gegevens van mijn kind gedurende minimaal 15 jaar na afloop van het protocol te bewaren. Ik geef wel/geen* toestemming voor het langdurig bewaren van restweefsel, waar mogelijk in de toekomst verder onderzoek naar leukemie mee gedaan wordt. Ik geef toestemming om de huisarts van mijn kind op de hoogte te brengen van zijn/haar deelname aan dit protocol. Ik geef toestemming voor het gecodeerd verzamelen en verwerken van de gegevens over het verloop van de behandeling, zoals in deze informatiebrief beschreven is. De gegevens zullen worden opgeslagen in een database. De resultaten zullen voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt waarbij de vertrouwelijkheid gewaarborgd wordt. Ik geef toestemming, dat daartoe bevoegde medewerkers van het onderzoeksteam, bevoegde personen van de SKION, medewerkers van de Inspectie voor de Gezondheidszorg, bevoegde inspecteurs van een buitenlandse overheid of leden van de medisch-ethische toetsingscommissie inzage kunnen krijgen in de medische gegevens en onderzoeksgegevens van mijn kind.

Naam ouder/voogd **: Handtekening:

Datum :

__ / __ / __

Naam ouder/voogd **: Handtekening:

Datum :

__ / __ / __

Naam onderzoeker/behandelend arts: Handtekening:

Datum :

__ / __ / __

*

Doorhalen wat niet van toepassing is.

64

APPENDIX 4. METC VERKLARING

65

66

67

68

APPENDIX 5. GOEDKEURING BEVOEGDE INSTANTIE -----Oorspronkelijk bericht----Van: [email protected] [mailto:[email protected]] Verzonden: maandag 3 september 2007 13:40 Aan: [email protected] CC: [email protected] Onderwerp: besluit NL17304.078.07 BI Geachte Dr. CM Zwaan, De Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) heeft zich als Bevoegde instantie voor de marginale beoordeling van geneesmiddelenonderzoek in Nederland, op grond van artikel 13i, van de Wet medischwetenschappelijk onderzoek met mensen (WMO), beraden over het onderzoeksprotocol Transiente leukemia bij kinderen met Down syndroom: Deel A: Protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiente leukemie Deel B: Protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiente leukemie , NL17304.078.07, Eudractnummer 2006-002962-20. Op 29-8-07 is het onderzoeksvoorstel ter beoordeling bij de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) ingediend. De Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) heeft als Bevoegde instantie geen bezwaar tegen uitvoering van het onderzoek in Nederland op basis van haar marginale toets. De marginale toets van de Bevoegde instantie betreft het controleren van de Clinical Trial Module van de Eudravigilance database op onverwachte ernstige bijwerkingen en het controleren van de EudraCT database op inspectiegegevens. Wellicht ten overvloede wijzen wij u er op dat, voordat het onderzoek in Nederland van start kan gaan, het onderzoek tevens positief beoordeeld moet worden door een daartoe bevoegde erkende Medisch Ethische Toetsingscommissie. Deze verklaring van geen bezwaar verliest haar geldigheid als met het uitvoeren van het onderzoek niet is begonnen binnen een jaar nadat deze verklaring is afgegeven. Tot slot wijst de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) erop dat, op grond van artikel 7:1 van de Algemene wet bestuursrecht (Awb), degene wiens belang rechtstreeks bij het besluit is betrokken daartegen binnen zes weken na de dag waarop dit besluit bekend is gemaakt, bezwaar kan maken bij de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO). Met vriendelijke groet, Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) 3-9-07 DIT IS EEN AUTOMATISCH GEGENEREERD BERICHT --------------Dear Dr. CM Zwaan, The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO), as Competent Authority for the review of clinical trials in the Netherlands, has performed a marginal assessment of the clinical trial application Transiente leukemia bij kinderen met Down syndroom: Deel A: Protocol voor het screenen van pasgeborenen met Down syndroom voor het optreden van transiente leukemie Deel B: Protocol voor de behandeling en het vervolgen van kinderen met Down syndroom en transiente leukemie , NL17304.078.07, Eudractnumber 2006-002962-20, under section 13i of the Medical Research in Human Subjects Act (WMO). The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) received the clinical trial application at 29-8-07 for an assessment. Based on a marginal assessment, the Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO), as Competent Authority, found no objection against the execution of the clinical trial within the Netherlands. The marginal assessment of the Competent Authority involves a check of the Clinical trial Module of the Eudravigilance database for suspected unexpected serious adverse reactions (SUSARs) and a check of the EudraCT database on inspections.

69

The Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) would like to point out that before the clinical trial commences approval from a competent accredited Ethics Committee is required. This approval loses it's validity if the study has not been started within a year after this declaration of no objection. Based on section 7:1 of the General Administration Law Act (Awb), the person whose interest is directly associated with the decision can lodge an appeal with the Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) within 6 weeks after the day the decision has been announced. With kind regards, Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO) 3-9-07 THIS IS AN AUTOMATED EMAIL

70

APPENDIX 6. DUITSE GOEDKEURING

71

72

73

74

APPENDIX 7. MATERIAAL AANLEVEREN AAN SKION 1. Cytologische diagnostiek (uitstrijkpreparaten) Benodigd materiaal  Voorafgaande aan de behandeling worden 6 ongekleurde bloed uitstrijkjes (eventueel ook beenmerg uitstrijkjes als een beenmergpunctie is gedaan) gestuurd naar het laboratorium van de SKION. De uitstrijkjes moeten bij voorkeur zijn afgenomen vóór eventuele transfusie van bloed of bloedprodukten.  Tijdens en na behandeling volstaan 3 ongekleurde bloedpreparaten. Bij (verdenking) progressie naar ML DS dient de procedure te worden gevolgd zoals gemeld in het ML DS protocol Richtlijnen voor het vervaardigen van bloed- en beenmerguitstrijken Ter realisatie van de gewenste uniformiteit van bloed- en beenmergpreparaten gaarne aandacht voor de volgende richtlijnen voor bloed- en beenmerguitstrijken:  het opbrengen van slechts een kleine druppel op het objectglas.  het uitstrijken met een glaasje dat smaller is dan het objectglas onder een hoek van 45°, langzaam uitstrijken.  zodanig uitstrijken dat het einde van de film ongeveer halverwege het objectglas komt te liggen. Pathologische cellen zijn vaak erg kwetsbaar en vallen spoedig uiteen bij snelle verplaatsing. De hoeveelheid plasma dient gering te zijn. Indien het plasma meer dan enkele seconden nodig heeft om op te drogen, gaan de cellen door osmotische invloed schrompelen. Men gebruike een geslepen dekglaasje van een telkamer of een geslepen objectglas. Doel Op de uitstrijkpreparaten wordt standaard een May-Grünwald-Giemsa kleuring gedaan voor het tellen van het percentage blasten. Voor het classificeren van de blasten kan tevens een SudanBlack B, een Peroxidase en een gecombineerde naftol AS-D chloroacetaat esterase en α-naftylacetaat-esterase worden verricht. Uitslag De uitslag wordt telefonisch en schriftelijk doorgegeven aan de behandelend kinderarts. 2. Immunophenotypering (Haemoblok – SKION) Benodigd materiaal  heparine bloed: 5 ml. voor MRD studies, 2 ml voor follow-up samples. Werkwijze Hiervoor zijn in het zgn. haemoblok heparinebuizen aanwezig; na afname goed mengen om stolling te voorkomen. Het materiaal dient te worden bewaard en getransporteerd op kamertemperatuur. Werkwijze Immunofenotypering geschiedt op het laboratorium van de SKION in meervoudige labeling en volgens de richtlijnen van de SKML (www.skml.nl) in een gefaseerde aanpak. Uitslag De uitslag wordt schriftelijk aan de behandelend arts meegedeeld. 75

3. Cytogenetisch onderzoek Bij de diagnose van TMD dient chromosomenonderzoek ingezet te worden van het perifere bloed. Het chromosomenonderzoek geschiedt in 9 cytogenetische laboratoria in Nederland. Deze zijn hiervoor een gezamenlijk te volgen procedure overeengekomen voor het verkrijgen van materiaal. Voor het doen verrichten van cytogenetisch onderzoek neme men telefonisch contact op met één der onderstaande personen en instituten: Dr C Mellink Academisch Medisch Centrum Afd. Klinische Genetica Meibergdreef 15 1105 AZ Amsterdam ZO Tel: 020 - 566 51 69 / 566 52 27 Fax 020 - 691 86 26 e-mail: [email protected]

Mw. Dr. M. Stevens-Kroef UMC St.Radboud 848 sectie Cytogenetica Postbus 9101 6500 HB Nijmegen Tel: 024 - 366 89 34 Fax:: 024 – 366 97 51 e-mail: [email protected]

Mw. Dr. E. van den Berg, klinisch cytogeneticus Hoofd Tumor Cytogenetisch Laboratorium UMCG Dept. of Genetics Ingang 47 (Oostersingel) 2e verdieping, kamer E2.018 P.O. Box 30.001 9700 RB Groningen Tel : 050 - 361 71 34 Fax : 050 – 361 72 30 e-mail: [email protected]

Mw. Dr. H.B. Beverloo Erasmus Universiteit Afd. Klinische Genetica Postbus 1738 3000 DR Rotterdam Tel: 010 - 704 83 40 Fax: 010 - 704 94 92 e-mail: [email protected]

Mw. Dr. J. Janssen Afd. Klinische Genetica AZM Postbus 5800 6202 AZ Maastricht Tel: 043 - 387 58 44 Fax: 043 - 387 78 77 e-mail: [email protected]

Dr. A. Buijs UMC, locatie WKZ Huispostnr. KC 04.084.2 Postbus 85090 3508 AB Utrecht Tel: 030 - 250 38 62 Fax: 030 - 250 38 01 e-mail: [email protected]

Mw. Drs. W Kroes Laboratorium voor diagnostische Genoomanalyse (LDGA) Cytogenetica LUMC gebouw 2 Postzone S-6-P Postbus 9600 2300 RC Leiden Tel: 071 - 526 98 26 Fax: 071 - 526 69 20 e-mail: [email protected]

Mw. Dr. J. Janssen Afd. Klinische Genetica AZM Afd. Klinische Cytogenetica Postbus 108 5500 AC VELDHOVEN Tel. 040 - 888 83 00 Fax: 040 - 888 83 03 e-mail: [email protected]

Mw. Drs A.W.M. Nieuwint VU medisch centrum Laboratorium voor Chromosomen onderzoek O. Westerbinnen 28 Postbus 7057 1007 MB Amsterdam Tel: 020 - 444 01 57 Fax: 020 - 444 07 44 e-mail: [email protected]

De uitslagen worden rechtstreeks aan de behandelend kinderarts toegestuurd. De SKION ontvangt eveneens de uitslag van het desbetreffende cytogenetisch laboratorium.

76

4. Checklist SKION bij diagnose en follow-up Patient telefonisch aanmelden bij de SKION (070-3674545). Hierbij worden naam, geboortedatum en indien van toepassing de (voorlopige) diagnose gemeld, alsmede gegevens over het afgenomen materiaal. Afnames bij diagnose en follow-up: Tijdstip

Diagnose Overige MRD tijdstippen

Preparaten (ongekleurd) Bloed

Hemoblok Bloed (heparine buis)

3 3

5 ml 5 ml

3

2-3 ml

Follow-up 5. Verzenden per Fiege (BLS koerier) naar het SKION laboratorium Instructies voor verzenden materiaal naar de SKION: Hemoblok: Bloed en/of beenmerg kunnen in een, door de SKION verstrekt hemoblok worden verstuurd. Controle preparaten: Deze kunnen in de daartoe ontworpen goedgekeurde verpakking per gewone post worden verstuurd. Telefonisch wordt de verzending vóóraf gemeld aan de SKION: Op werkdagen van 09.00-17.00 uur: telefoon 070 - 367 45 45 (buiten deze uren kan een boodschap worden ingesproken op het antwoordapparaat). Op zaterdag van 08.30-17.30 uur via telefoon 06 - 5120 12 97 de dienstdoende analist(e) waarschuwen. Indien de analist(e) niet reageert via dit telefoonnummer (b.v. omdat ze bezig is), dan graag uw boodschap op de voice-mail inspreken, opdat u kan worden teruggebeld. Verzending hemoblokken en diagnosepreparaten via Fiege (BLS-Koerier): Aanmelding voor vervoer dient te geschieden per fax 075 - 650 16 98 of per e-mail ([email protected]) bij voorkeur vóór 16.00 uur en met een speciaal daarvoor ontworpen opdrachtformulier. Eventueel tot 21.00 uur bellen naar nummer: 075 - 650 16 19; bgg 06 – 432 71 741, of 06 – 432 71 751. Formulieren en verpakkingsmateriaal zijn indien nodig aan te vragen bij het SKION laboratorium. U dient ervoor te zorgen, dat het pakket in SKION verpakking, lekdicht en met absorberend materiaal verpakt, klaar ligt op de met de koeriersdienst afgesproken plaats. 77

APPENDIX 8. ADD-ON STUDY

Title study: Clinical relevance of genetic alterations in Myeloid Leukemia of Down syndrome (ML DS) Name applicant:

Ch.M. Zwaan and M.M. van den Heuvel-Eibrink

In collaboration with: Dept. of Pediatric Oncology: ML den Boer, Prof.dr R. Pieters In collaboration with the AML-BFM SG investigators (headed by D. Reinhardt). To be performed as an add-on study of the “International cooperative childhood AML study group” European DS AML 2006 study Institute

Erasmus MC-Sophia Children’s Hospital Department of Pediatric Oncology Dr. Molewaterplein 60, NL-3015 GJ, Rotterdam The Netherlands 010-7036691, E-mail: [email protected]

INTRODUCTION Children with Down syndrome (DS) have an increased risk of developing both acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL).1,2 Of interest, prognosis of children with AML and DS is much better (80-90% survival) than AML in children without DS (50-70% survival).3,4 However, in DS ALL prognosis is worse than for children with sporadic ALL.5 This may be related to the unique type of myeloid leukemia that children with DS develop, which is referred to as “Myeloid Leukemia of Down syndrome (ML DS)”.2,3,6-9 Before the 1980s, children with ML DS were often treated with palliative care only. Ravindranath and Lie were the first to report stable remissions in ML DS patients who were treated with chemotherapy.10,11 However, when full dose chemotherapy was applied, many children developed severe side-effects, and the incidence of treatment related mortality was increased compared to sporadic AML.3,12 Of interest, chemotherapy dose-reductions appeared to be safe in terms of anti-leukemic efficacy, and also diminished treatment related mortality, leading to the current excellent outcome of approximately 80% survival for ML DS patients.3,4 This may be due to the sensitivity of the ML DS blasts for chemotherapeutic drugs when compared with sporadic AML cells, as demonstrated by us and others using in vitro total cell-kill assays.13-16 The dose-reductions in the clinic, however, were introduced empirically and, so far, no prognostic factors have been identified which allow stratification of therapy for ML DS patients. Moreover, it is unknown which subgroup of patients may still be cured with further therapy reduction, nor what characterizes the subgroup of approximately 10-20% of ML DS patients with poor treatment outcome due to refractory disease or relapse, who might benefit from more regular AML chemotherapy. Therefore, one of the aims of this project is to study ML DS samples for secondary genetic abnormalities that may potentially be used for identification of risk-groups in ML DS. In addition, information about abnormally expressed genes may identify drugable targets – which could, in the long run, lead to the introduction of targeted therapy in ML DS. Some children with DS develop ML following a transient leukemia in the neonatal period, which is usually a self-limiting disease, and which is referred to as ‘transient myeloproliferative disorder’ (TMD) or ‘transient leukemia (TL)’.17,18 It occurs in approximately 5-10% of neonates with DS, although the true frequncy is unknown as only selected populations have been studied. It is not understood why this leukemia is transient – nor is it understood why only 20% of these children subsequently develop ML DS at later age and others do not. It is anticipated that this is due to secondary genetic abnormalities, but the identity of these genetic abnormalities is

78

currently unknown.18 Therefore, we want to study which genetic alterations may play a role in the progression from TL to ML DS. BACKGROUND OF RESEARCH-OBJECTIVES Genetic background of AML AML can be classified according to morphological or (cyto-)genetic criteria. Recently, genetic abnormalities in AML have been further subdivided in type I and type II abnormalities.19-21 The type 1 abnormalities consist of mutations in tyrosine kinases, phosphatases or oncogenes such as RAS, which promote cellular proliferation and survival. Type 2 abnormalities result in differentiation/maturation defects, and typically consist of either mutations in transcription factors [such as C/EPB, GATA1 or PU.1], or chromosomal translocations [such as t(8;21) or inv(16)], resulting in loss of function of such transcription factors. Type 1 and 2 abnormalities by themselves are not sufficient to induce leukemia, and it is hypothesized that overt AML only results from cooperative genetic alterations in both classes.19,22-24 The collaboration between type 1 and type 2 abnormalities is not a random process, but certain type 1 abnormalities cluster with certain type 2 abnormalities. For instance, Flt3/ITD is mainly found in AML with normal karyotype and in APL, whereas KIT-mutations occur predominantly in core-binding factor leukemias [CBF-AML, i.e. (t8;21) and inv(16)].21 Type 1 abnormalities in ML DS In previous studies, focusing at receptor-tyrosine kinase (RTK) abnormalities (e.g. FLT3 and KIT), RAS oncogenes (K and N-RAS) and phosphatase (PTPN-11) mutations, Goemans et al. found mutations in only 2 out of 14 tested (14%) ML DS samples, versus 44% in sporadic AML.21,21 The mutations in ML DS samples consisted of one N-RAS and one K-RAS mutation. No FLT3, KIT or PTPN11 mutations were found. Other studies on RTK-abnormalities in DS AML are lacking.25 However, in sporadic AML M7, mutations in JAK-2 have been described in 18% of samples, and recently also mutations in JAK3 have been described.26,27 In the majority of the ML DS cases the proliferation enhancing type 1 mutations are still unknown, although they may play a role in progression from TL to ML DS. In addition, they may have important prognostic impact or may represent drugable targets, similar to FLT3 or KIT mutations. Therefore, we aim at identifying such abnormalities in these DS patients. Type 2 abnormalities in ML DS It was recently discovered that GATA1, a gene that encodes an essential hematopoietic transcription factor, is mutated in the leukemic of patients with ML DS, but not in other leukemias.28 This concerns various deletions, insertions and point mutations in exon 2, which result in a premature stop codon. GATA1 mutations result in the synthesis of a shorter GATA1 protein (GATA1s), which is characterized by a dysfunctional transactivation domain. Further studies have shown that GATA1 mutations can also be found in DS TL-samples, and already arise in utero in the fetal hematopoietic cells from which TL originates.28-31 Therefore these mutations are not involved in the progression of TL to ML DS, nor does it provide a possibility to stratify patients. In a BFM series of 137 ML DS patients, 94 samples were successfully karyotyped. In 25 patients no additional abnormalities (apart from constitutional trisomy 21) were found, whereas in 69 patients various additional abnormalities were detected: 14 patients showed trisomy 8; 10 patients showed an extra non-constitutional copy of chromosome 21; 4 patients showed del 1q and 2 patients showed 7q-/-7 (Figure 1; Reinhardt et al, personal communication).

79

random abnormalities 26%

-7/7q2%

constitutional trisomy 21 only 26%

del1q 4%

MLL 1%

failures 31%

Figure 1. Type 2 genetic abnormalities in 137 ML DS samples (all have constitutional trisomy 21). In 31% no karyotype was available.

trisomy 8 10%

Hence, secondary abnormalities appear to be heterogeneous, and so far have not been linked to prognosis in ML DS. In this study we aim at identifying new genetic abnormalities (deletions and amplifications) by array-CGH in both TL and ML DS samples, to analyze whether they are associated with disease progression and/or prognosis. Drug resistance studies Using in-vitro total cell-kill assays, we and others have demonstrated hypersensitivity of the ML DS blasts for chemotherapeutic drugs regularly used in the treatment of ML DS.13-16 However, a large heterogeneity can be observed for individual sensitivity to these drugs. For instance for cytarabine, approximately 70% of the ML DS samples are hypersensitive (defined as an LC50 value below the 3rd percentile for sporadic AML patients), whereas the other 30% is in the same range as sporadic AML.15 For daunorubicin however, only 16% display hypersensitivity, whereas 84% of LC50 values is in the same range as sporadic AML. Studies from Taub et al. may explain some of the observed variations in drug sensitivity. They have shown that chromosome 21 localized genes involved in the metabolism of cytarabine and daunorubicin are differentially expressed between ML DS and sporadic AML cases.32 Of interest, transcript levels in ML DS cases varied from 0 to 12-fold higher levels, hence different from the expected 1.5fold as predicted by gene copy number. Taken together, these data suggest that ML DS itself is a heterogeneous disease, and that further therapy reduction may be warranted for some, but nor for all patients. MicroRNAs It was recently recognized that naturally occurring non-coding small RNAs – so called microRNAs – are involved in controlling gene expression at the posttranscriptional level.33 Approximately 50% of the genome is transcribed into RNA, but only 2% is being translated into proteins, which might be regulated by these microRNAs (miRNA). MiRNAs are 22 nucleotide RNAs that bind to the target mRNA and prevent its translation. miRNAs inhibit target gene expression at the protein level, and loss of miRNA expression results in increased expression of proto-oncogene proteins.34 Hence, these miRNAs may function as tumor suppressor or oncogenes. Knowledge on miRNAs and their relevance for hematological malignancies is still very limited, but some of the miRNAs have been associated with hematopoiesis. For example, CLL is characterized by 13q14 deletions in >50% of cases, and this region was recently discovered to encode for 2 different miRNAs (miR-15 and 16).33,35 A recently published study showed differential expression of miRNAs across cancer subtypes, and paralleled the developmental origin of tissues.34 Differential miRNA expression was detected between BCR-ABL, TELAML1, T-ALL and MLL-rearranged ALL samples.34 80

Intriguingly, four of the recently discovered miRNAs, miR-99a, miR-125b, miR-155 and let-7c, are encoded on chromosome 21.36 MiR-125b and miR-155 are overexpressed in megakaryoblastic leukemias. Interestingly, among the miR-125b and miR-155 target genes, there are several hematopoietic transcription factors and regulators such as PU.1, FLI1, LIF, c-myc, IL13, IL6, which have been shown to be involved in the development of different leukemias.36 In ALL, we recently cloned new miRNAs and identified 87 known and 43 new human mature miRNAs.37 Quantification of miRNA expression (RT-PCR) revealed that miRNAs were expressed at higher levels in MLL and B-ALL cells when compared to normal CD34+ bone marrow cells.37 In this project we want to identify whether miRNAs are involved in DS ML, and whether they play a role in the transformation from TL to ML DS. AIMS OF THE STUDY

The main aims of this study are: 1. To identify new genetic markers (mutations, deletions, amplifications) that allow stratification of patients with ML DS in different risk groups, and that provide a biological rationale in which patients further therapy reduction may be warranted 2. To detect genetic abnormalities related to the progression from TL to ML DS 3. To identify microRNAs that may be involved in ML DS pathogenesis or in the progression from TL to ML DS. 4. To identify drugable targets that may lead to targeted therapy in ML DS patients, which may allow further reduction of intensive chemotherapy and reduce side effects. MATERIALS AND METHODS AND PRELIMINARY RESULTS IN OTHER SUBSETS OF LEUKEMIA To answer the questions raised above we will apply the following techniques: 1. Array-CGH, to detect deletions and/or amplifications that are currently unknown. Subsequent FISH studies will be performed to study which genes may be affected. 2. We will seek for mutations in tyrosine kinases (identification of kinases on interest will be derived from the literature and our earlier gene expression profiling study38), using dHPLC technology, followed by sequencing, and also determine mRNA expression levels by Taqman technology. In case new tyrosine kinase abnormalities are identified, we will study their sensitivity to known tyrosine kinase-inhibitors (Western blot, cell-kill assays). 3. MicroRNA identification by cloning and expression analysis using stem-loop based realtime Taqman technology for the currently well-characterized and novel miRNAs. These techniques will be applied in both ML DS and TL samples, addressing the following issues: 1) To identify subgroups of ML DS patients with different prognosis, which may lead to a better classification of patients with ML DS in risk-groups, 2) To detect genetic abnormalities that may explain the progression from TL to ML DS, 3) To detect genetic abnormalities that may be involved in response to chemotherapeutics. BACKGROUND TECHNIQUES Comparative genomic hybridization (CGH) The recent applicability of the array-CGH technique with a much higher resolution than conventional CGH (10-20 Mb), may further lead to the identification of prognostically important chromosomal regions. This technique is currently being used in the PhD-project of Peter van Vlierberghe “Genetic determinants for treatment outcome in pediatric Acute Lymphoblastic 81

Leukemia”, and in 2 AML projects. Various abnormalities were found, that were in agreement with previous karyotypic data, thereby confirming the specificity of this technique. Interestingly, many clonal and subclonal chromosomal amplification and deletion areas were found that have never been linked to human T-ALL. A particular abnormality that was found in 12 out of 36 TALL patients was a subclonal chromosomal duplication involving the 9q34 region.39 It was demonstrated that this 9q34 duplication was independent from the presence of activating mutations in the NOTCH1 gene, as present in about 50% of T-ALL, and also independent from the recently described episomal amplified NUP214-ABL1 fusion gene in human T-ALL. In a recent paper, we report on a cryptic deletion in chromosome 11, which leads to LMO2 activation in T-ALL.40 In brief, labeled DNA samples are hybridized in a one to one ratio onto a DNA-chip that contains about 100.000 oligo-nucleotide probes (Agilent oligo-array-CGH). For each chromosomal abnormality that will be identified by array-CGH, a specific FISH procedure will be developed for validation and further pinpointing of the exact chromosomal regions involved, as described in more detail before.40 Tyrosine kinase activation Tyrosine kinases of interest will be studied by direct sequencing or dHPLC technology. These methods are fully operational at our laboratory, as we characterize most AML samples for molecular abnormalities, such as mutations in KIT, RAS, FLT3, NPM1, etc.41 Micro-RNAs RNA will be extracted using Trizol reagents (Gibco, NL), and RNA integrity will be checked before proceeding with miRNA expression analysis. The mature miRNA fraction (~22mer) will be isolated by gel electrophoresis using 32P-labeled size markers. After sequential ligation of 3’ 20mer and 5’ 18mer adaptor sequences and purification of ligated miRNAs using mobility shift gel electrophoresis, the resulting small RNA (~60mer) is subjected to reverse transcriptase-PCR and, after digestion with Ban-I, small dsDNA fragments are concatemerized using T4 DNA ligase. Gel purified concatemers (200-700mer) are isolated and ligated into a bacterial cloning vector which is used to transform competent E.coli bacteria. The concatemers-containing vector will be purified out of positive E.coli clones, which then can be used for sequence analysis of inserted miRNAs. The sequence will be used to localize encoded miRNAs in the genome using bio-informatic analyses (sequence comparison of our cloned miRNAs to the total human genome). Next, the sequence of each miRNA is used to identify the target gene using complementary, thermodynamic and evolutionary conservation rules.[Lewis, Cell 2003; He & Hannon, Nat Rev Genetics, 2004]. Applying this procedure, we found 94 novel and 101 known miRNAs for which the frequency of expression differed between pilot patients with different genetic subtype (Figure 2).37 It is the aim of this project to identify miRNAs relevant to TL and ML DS. Figure 2. Selection of miRNAs that are differentially expressed between 2 patients with ALL. White bars represent a patient with an MLLrearrangement, black bars represent a patient with a t(1;9) translocation. Expression of 3 newly identified miRNAs are included at the right part of the X-axis.

40 30 20 10 0 le t-7 le a - 1 t-7 le a - 2 t- 7 a le -3 t- 7 le f- 1 tm 7f-2 ir1 m 6 -1 ir16 m -2 ir m -2 1 irm 15 ir- 0 18 m 1a ir2 m 13 ir2 no mir 22 ve -2 no l (c 23 v h no el ( r 3 ve ch ) l( r4 ch ) r1 6)

expression of miRNA (frequency in concatemers)

50

m iR g en es

82

Once identified, the expression of miRNAs and targeted genes will be analyzed in a larger number of patients representing both TL and ML DS. Preferably, we would like to use a miRNA array to detect expression differences between these subgroups. However, at present, the miRNA array technology is not quantitative due to non-linear amplification efficiency and, hence, we prefer to use real-time quantitative (RTQ) PCR. Since mature miRNAs are too small (~22mer) for a traditional RTQ-PCR, a special stem-loop based primer will be used (Applied Biosystems, USA). MiRNA and targeted gene mRNA expression will be quantified by RTQ-PCR. Differences in protein expression levels of targeted genes will be determined by Western blot. The miRNAs, targeted genes and pathways will be identified by applying biostatistical tools similar to the gene expression profiling studies we previously performed to classify leukemias and find drug resistance associated genes.42,43 RELEVANCE OF STUDY FOR ML DS PATIENTS Although many children with ML DS are cured with current modified treatment regimens, this is still achieved at the expense of considerable acute and long-term morbidity. It is currently not known whether for some children with ML DS therapy could be further reduced without compromising anti-leukemic efficacy. The availability of genetic or other markers may be very useful in this respect. Moreover, some of these markers may be drugable and allow molecularly targeted therapy, for instance drugs directed against activated tyrosine kinases. This might in the long run improve prognosis and reduce chemotherapy-related morbidity. This study may also provide further insight in the underlying biology of the progression from TL to true leukemia in children with DS, which so far is not very well understood. NUMBER OF REQUESTED SAMPLES AND DATA Requested samples

1) TL peripheral blood samples will be obtained from a population-based study in the Netherlands (organized by the Dutch Childhood Oncology Group) which aims to screen 811 children with DS (in approximately 3 years) for the occurrence of TL, which is estimated to be 5-10%. In addition, samples will be provided by our collaboration with the AML-BFM-SG (principal investigator D. Reinhardt). Samples are shipped to the central laboratory in Hannover, and will also be made available for this study. We aim at studying approximately 30 patients with TL, including at least 10 paired TL and ML DS samples. This will allow us to study differences between TL samples that either undergo spontaneous disappearance versus those that progress to ML DS at a later stage. 2) ML DS samples from bone marrow and or peripheral blood will be obtained from the collaborative groups participating in this European ML DS study, which will include 150 patients. Children with ML DS often have myelofibrosis, complicating the harvest of sufficient amounts of marrow. In addition, the blast percentages may be relatively low. However, in a previous study using a total cell-kill assay, we were able to test 59% of ML DS samples successfully (this test requires samples to have at least 80% blast purity at the start of cellculture).15 Therefore we expect to be able to include at least 30 samples of ML DS with sufficient cells to perform the above mentioned studies. Additional samples may come from the cell-bank form the DCOG and AML-BFM SG. 3) Sporadic, FAB-type matched, AML samples (controls) will be obtained from the DCOG and the AML-BFM SG cell banks. These samples may be needed to prove whether abnormalities are specific for ML DS, or also occur in sporadic AML FAB-type matched samples.

83

4) Normal BM-cells as well as remission samples are available through a collaboration with H. Hasle from the NOPHO, as well as the minimal residual disease studies performed in both the TL and the ML DS studies mentioned before. Number of cells needed For array CGH 50µg of DNA is needed, which can usually be obtained from 10x106 viable leukemic cells. This will also allow us to extract sufficient RNA for mRNA and miRNA expression and mutation analysis. For the tyrosine kinase activation assay we need only small amounts of DNA for sequencing of dHPLC analysis. For FISH analysis of genetic deleted/amplified regions we will run prepare cytospin slides. For Western blotting approximately 10x10.6 cells are needed. Therefore these studies can be done with 20x10.6 viable leukemic cells in total, corresponding with approximately 30-40x10.6 cryopreserved cells. In case further sensitivity testing to RTK-inhibitors is warranted (in selected samples with new tyrosine kinase mutations only), we would need 5x106 additional cells per tested inhibitor. In such cases we will ask for additional cells from the cell-bank. Clinical and cell-biological data We would like to obtain clinical and cell-biological data for all included patient samples, consisting of: date of birth, date of diagnosis, WBC, CNS-status, sex, FAB-type, cytogenetic and molecular genetic data, date of CR, date and type of event, date of last follow-up. REFERENCES ADD-ON STUDY (1) Hasle H, Clemmensen IH, Mikkelsen M. Risks of leukaemia and solid tumours in individuals with Down's syndrome. Lancet. 2000;355:165-169. (2) Zeller B, Gustafsson G, Forestier E et al. Acute leukaemia in children with Down syndrome: a population-based Nordic study. Br J Haematol. 2005;128:797-804. (3) Creutzig U, Reinhardt D, Diekamp S et al. AML patients with Down syndrome have a high cure rate with AML-BFM therapy with reduced dose intensity. Leukemia. 2005;19:1355-1360. (4) Lange BJ, Kobrinsky N, Barnard DR et al. Distinctive demography, biology, and outcome of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome in children with Down syndrome: Children's Cancer Group Studies 2861 and 2891. Blood. 1998;91:608615. (5) Whitlock JA, Sather HN, Gaynon P et al. Clinical characteristics and outcome of children with down syndrome and acute lymphoblastic leukemia: a children's cancer group study. Blood. 2005;106:4043-4049. (6) Ravindranath Y. Down syndrome and acute myeloid leukemia: the paradox of increased risk for leukemia and heightened sensitivity to chemotherapy. J Clin Oncol. 2003;21:3385-3387. (7) Chessells JM, Harrison G, Richards SM et al. Down's syndrome and acute lymphoblastic leukaemia: clinical features and response to treatment. Arch Dis Child. 2001;85:321-325.

84

(8) Hasle H, Niemeyer CM, Chessells JM et al. A pediatric approach to the WHO classification of myelodysplastic and myeloproliferative diseases. Leukemia. 2003;17:277-282. (9) Gamis AS, Woods WG, Alonzo TA et al. Increased age at diagnosis has a significantly negative effect on outcome in children with Down syndrome and acute myeloid leukemia: a report from the Children's Cancer Group Study 2891. J Clin Oncol. 2003;21:3415-3422. (10) Ravindranath Y, Abella E, Krischer JP et al. Acute myeloid leukemia (AML) in Down's syndrome is highly responsive to chemotherapy: experience on Pediatric Oncology Group AML Study 8498. Blood. 1992;80:2210-2214. (11) Lie SO, Jonmundsson G, Mellander L et al. A population-based study of 272 children with acute myeloid leukaemia treated on two consecutive protocols with different intensity: best outcome in girls, infants, and children with Down's syndrome. Nordic Society of Paediatric Haematology and Oncology (NOPHO). Br J Haematol. 1996;94:8288. (12) Creutzig U, Ritter J, Vormoor J et al. Myelodysplasia and acute myelogenous leukemia in Down's syndrome. A report of 40 children of the AML-BFM Study Group. Leukemia. 1996;10:1677-1686. (13) Taub JW, Stout ML, Buck SA et al. Myeloblasts from Down syndrome children with acute myeloid leukemia have increased in vitro sensitivity to cytosine arabinoside and daunorubicin. Leukemia. 1997;11:1594-1595. (14) Taub JW, Huang X, Ge Y et al. Cystathionine-beta-synthase cDNA transfection alters the sensitivity and metabolism of 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine in CCRF-CEM leukemia cells in vitro and in vivo: a model of leukemia in Down syndrome. Cancer Res. 2000;60:6421-6426. (15) Zwaan ChM, Kaspers GJL, Pieters R et al. Different drug sensitivity profiles of acute myeloid and lymphoblastic leukemia and normal peripheral blood mononuclear cells, in children with and without Down syndrome. Blood. 2002;99:245-251. (16) Frost BM, Gustafsson G, Larsson R, Nygren P, Lönnerholm G. Cellular cytotoxic drug sensitivity in children with acute leukemia and Down's syndrome: an explanation to differences in clinical outcome? [letter]. Leukemia. 2000;14:943-944. (17) Zipursky A. Transient leukaemia - a benign form of leukaemia in newborn infants with trisomy 21. Br J Haematol. 2003;120:930-938. (18) Hitzler JK, Zipursky A. Origins of leukaemia in children with Down syndrome. Nat Rev Cancer. 2005;5:11-20. (19) Deguchi K, Gilliland DG. Cooperativity between mutations in tyrosine kinases and in hematopoietic transcription factors in AML. Leukemia. 2002;16:740-744. (20) Kelly LM, Gilliland DG. Genetics of myeloid leukemias. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002;3:179-198. (21) Goemans BF, Zwaan C, Miller M et al. Mutations in KIT and RAS are frequent events in pediatric core-binding factor acute myeloid leukemia. Leukemia. 2005;19:1536-1542. 85

(22) Chan IT, Kutok JL, Williams IR et al. Conditional expression of oncogenic K-ras from its endogenous promoter induces a myeloproliferative disease. J Clin Invest. 2004;113:528538. (23) Kelly LM, Liu Q, Kutok JL et al. A constitutively activated mutant flt3 causes a myeloproliferative disease in mice [abstract]. Blood. 2001;98:469a. (24) MacKenzie KL, Dolnikov A, Millington M, Shounan Y, Symonds G. Mutant N-ras induces myeloproliferative disorders and apoptosis in bone marrow repopulated mice. Blood. 1999;93:2043-2056. (25) Meshinchi S, Stirewalt DL, Alonzo TA et al. Activating mutations of RTK/ras signal transduction pathway in pediatric acute myeloid leukemia. Blood. 2003;102:1474-1479. (26) Walters DK, Mercher T, Gu TL et al. Activating alleles of JAK3 in acute megakaryoblastic leukemia. Cancer Cell. 2006;10:65-75. (27) Jelinek J, Oki Y, Gharibyan V et al. JAK2 mutation 1849G >T is rare in acute leukemias but can be found in CMML, Philadelphia-chromosome negative CML and megakaryocytic leukemia. Blood. 2005;106:3370-3373. (28) Wechsler J, Greene M, McDevitt MA et al. Acquired mutations in GATA1 in the megakaryoblastic leukemia of Down syndrome. Nat Genet. 2002;32:148-152. (29) Rainis L, Bercovich D, Strehl S et al. Mutations in exon 2 of GATA1 are early events in megakaryocytic malignancies associated with trisomy 21. Blood. 2003;102:981-986. (30) Greene ME, Mundschau G, Wechsler J et al. Mutations in GATA1 in both transient myeloproliferative disorder and acute megakaryoblastic leukemia of Down syndrome. Blood Cells Mol Dis. 2003;31:351-356. (31) Shimada A, Xu G, Toki T et al. Fetal origin of the GATA1 mutation in identical twins with transient myeloproliferative disorder and acute megakaryoblastic leukemia accompanying Down syndrome [letter]. Blood. 2004;103:366. (32) Taub JW, Huang X, Matherly LH et al. Expression of chromosome 21-localized genes in acute myeloid leukemia: differences between Down syndrome and non-Down syndrome blast cells and relationship to in vitro sensitivity to cytosine arabinoside and daunorubicin. Blood. 1999;94:1393-1400. (33) Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:15524-15529. (34) Lu J, Getz G, Miska EA et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005;435:834-838. (35) Calin GA, Liu CG, Sevignani C et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:1175511760. (36) Klusmann JH, Janikova K, Reinhardt D, and et al. Expression of chromosome 21 encoded miRNAs in Down Syndrome and acute myeloid leukemia. [abstract]. 5th Biannual Symposium on Childhood Leukemia. 2006;33-34. 86

(37) Schotte D, Chau JCK, Sylvester G et al. Unique micro-RNA profiles in childhood acute lymphoblastic leukemia [abstract]. Blood. 2006;ASH 2006 meeting. (38) Bourquin JP, Subramanian A, Langebrake C et al. Identification of distinct molecular phenotypes in acute megakaryoblastic leukemia by gene expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;3339-3344. (39) Van Vlierberghe P, Meijerink JP, Lee CM et al. A new recurrent 9q34 duplication in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2006;20:1245-1253. (40) Van Vlierberghe P, Van Grotel M, Beverloo HB et al. The cryptic chromosomal deletion del(11)(p12p13) as a new activation mechanism of LMO2 in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2006;108:3520-3529. (41) Stam RW, Den Boer ML, Schneider P et al. Targeting FLT3 in primary MLL gene rearranged infant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2005;106:2484-2490. (42) Holleman A, Cheok MH, Den Boer ML et al. Gene-expression patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia cells and response to treatment. N Engl J Med. 2004;351:533-542. (43) Lugthart S, Cheok MH, Den Boer ML et al. Identification of genes associated with chemotherapy crossresistance and treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 2005;7:375-386.

87

Title add-on study: Chromosomal instability as potential risk factor for the development of TMD and subsequent leukemia in Down syndrome children Applicant: Institute:

Dr. J. Cloos en Prof. Dr. G.J.L. Kaspers VU medisch centrum Cancer Center Amsterdam Department of Pediatric Oncology/Hematology De Boelelaan 1117, 1081 HV Amsterdam The Netherlands Tel: 31 20 4447413, e-mail [email protected]

In collaboration with: Dr. Ch. M. Zwaan Institute: Erasmus MC-Sophia Children’s Hospital Department of Pediatric Oncology Dr. Molewaterplein 60, NL-3015 GJ, Rotterdam The Netherlands 010-7036691, E-mail: [email protected] Dr. D Reinhardt Kooperative AML-BFM Therapiestudien Medizinische Hochschule Hannover Klinik und Poliklinik für Kinderheilkunde Pädiatrische Hämatologie/ Onkologie Carl-Neuberg-Str. 1 D-30625 Hannover Tel: +49 (0)511/532 6720 Fax: +49 (0)511/532 9029 E-mail E-mail: [email protected]

88

1.

Algemeen overzicht van het onderzoeksveld

Etiology of cancer in children and in particular in Down syndrome children Little is known about the etiology of the various cancer types that predominantly develop in children. The prerequisite to develop cancer may be inherited but several events need to occur (such as mutations or chromosomal aberrations) before the cells become tumorigenic. It is hypothesized that the risk of developing cancer is different in each individual and one important factor for this so-called cancer susceptibility is chromosomal instability after exposure of cells to DNA damaging agents. This characteristic of chromosomal instability has extensively been studied in adult individuals with cancer, but little is known about its role in the development of childhood cancer. However, there are important indications that chromosomal instability in children is related to cancer risk. Known inherited chromosomal instability syndromes are associated with an increased risk of childhood cancer (e.g. Ataxia telangiectasia and Fanconi anemia). Moreover, children with Down syndrome are supposed to have a relatively high level of chromosomal instability compared to normal controls indicative of a role for chromosomal instability in their increased susceptibility to leukemia. It is known that Down syndrome children can develop transient myeloproliferative disease (TMD) and are at increased risk for subsequent developing acute myeloid leukemia (AML). Thus far it is not known which factors play a role in the development of TMD and/or the subsequent AML but chromosomal instability may be a risk factor predictive for individual susceptibility to TMD and/or AML development in these Down syndrome children. Chromosomal instability as measured with the mutagen sensitivity test More than a decade ago it was hypothesized that a variable degree of imperfections in DNA maintenance exists among the general population (Perera 2000). Those individuals with the highest level of persistent DNA damage after exposure to DNA damaging agents would be the most susceptible to cancer development. In particular much experience is gained with a functional mutagen sensitivity assay (Hsu, 1991) that measures chromosomal instability in peripheral blood lymphocytes after damage induction with bleomycin or gamma-irradiation. The chromosomal instability outcome is the mean number of chromatid breaks measured in cells in metaphase (Figure 1). This breaks per cell (b/c) score shows a normal distribution among the normal population and the individuals that have a very sensitive phenotype (the upper 15%) have an increased risk to develop various types of cancer.

Figure 1 Metaphase spread of normal lymphocytes exposed to the DNA damaging drug bleomycin. The arrows indicate chromatid breaks. The mean of 100 metaphases is a measure for mutagen sensitivity

89

It has been elucidated that a relatively high chromosomal instability combined with specific exposures (such as smoking or alcohol exposure) leads to an increased cancer risk (Cloos 1996). It is of particular interest to note that this chromosomal instability measure has a hereditary basis (Roberts 1999; Cloos 1999), and that all cell types of the body are affected (thus it is constitutional). The findings of these studies support the notion that a heritable susceptibility to DNA damage and thereby a susceptibility to cancer exists. This characteristic of chromosomal instability has extensively been studied in adult individuals with cancer and there are important indications that this also may play a role in the etiology of childhood cancer (Kennedy, 2006). In particular, known inherited chromosomal instability syndromes are associated with an increased risk of childhood cancer (e.g. Ataxia telangiectasia and Fanconi anemia (Rosenberg 2003)). Cells of individuals with these syndromes have spontaneous chromatid breaks and the mutagen sensitivity score of these children is about 10 times higher as compared to normal controls. When these children survive long enough, they are also at risk of developing solid tumors. Children with Down syndrome are also chromosomal instable, but this is hidden (hence this is only visible after DNA damage induction, but spontaneous breaks are not observed). They have a relatively high mutagen sensitivity value (± 2 times higher) as compared to normal controls (unpublished observations, Cloos et al.). Those Down syndrome children who have had AML are the most chromosomal instable, indicative of a role for chromosomal instability in their susceptibility to childhood cancer (Ankathil 1997). As described in the proposed DCOG TMD-protocol by Zwaan et al. it is currently unknown what factors are involved in the risk of developing TMD in Down syndrome children, and the possible subsequent development of AML. Chromosomal instability might play a role in the identification of those Down syndrome children that are at risk and in order to elucidate this we should measure mutagen sensitivity in the children that will be studied in that protocol including Down syndrome children with and without TMD and possible subsequent AML. Doel / vraagstelling van het onderzoek 2. The aim of this add-on study is to investigate whether increased chromosomal instability, as determined by the mutagen sensitivity assay, is an important factor for the identification of Down syndrome children at risk for developing TMD and to investigate whether those that develop subsequent leukemia are the most chromosomal instable. De relevantie van het onderzoek voor leukemie op de kinderleeftijd Down syndrome children develop TMD at a very early age (median age of 7 days) while the possible subsequent AML commonly develops before the age of four years. Since we want to determine the value of chromosomal instability in predicting the development of AML, the test is preferably performed before leukemia has developed, hence on normal peripheral blood cells. Although there is a weak relation between chromosomal instability and age, the individual chromosomal instability is considered constitutional. Therefore it is not necessary to determine the chromosomal instability at diagnosis (on leukemic cells) but can best be determined at follow-up of at least 6 months. 3.

4. Eventuele preliminaire resultaten Most published results with the mutagen sensitivity test to measure chromosomal instability related to cancer development have been obtained in adults. We have recently started a pilot study of measuring chromosomal instability in children. Children with Down syndrome were reported to have a relatively high chromosomal instability and to confirm this we also included 4 non-cancer patients with Down syndrome and 3 AML patients with Down syndrome. The mean b/c value in healthy Down syndrome children (mean b/c= 0.78) was significantly higher compared to control non-Down children (mean b/c= 0.50; p=0.026). The three Down syndrome patients with AML were even more sensitive (mean b/c=0.94). This confirms the chromosomal instability in Down syndrome children and indicates the possible relation between an increased

90

chromosomal instability and the risk of cancer development, and needs further confirmation in a large group of children. Een (korte) beschrijving van de te gebruiken onderzoekmethoden Chromosomal instability will be determined in peripheral blood cells. For this test we need 1.5 ml heparinized whole blood that needs to be processed within 48 hrs. We will set up three cultures per patient; one control and two cultures, which will be exposed to bleomycin for DNA damage induction. This will allow us to determine both spontaneous chromosomal damage and response to induced DNA damage. The cells will be cultured for 67 hrs before bleomycin is added for 5 hrs. At t=71 hr colcemid is added to all cultures to inhibit the formation of the mitotic spindle and the enrichment of cells in metaphase. At t= 72 hr the cells are washed and fixed using methanol and acetic acid (3:1). Cell suspensions are dropped on wet slides and air dried before staining with Giemsa. The slides are pooled, coded and 50 metaphases are scored for the presence of chromatid breaks. The mean number of chromatid breaks per cell is a measure of chromosomal instability. 5.

6.

Kwantificering van het gevraagde materiaal/gegevens

Chromosomal instability as risk factor for TMD and or AML For this study we apply for 2-5 ml of heparinized whole blood of the patients that are enrolled in the protocol (part B; Treatment and follow-up of children with down syndrome and TMD) at the follow up time point of at least 6 months after diagnosis of TMD, before potential subsequent leukemia development. The mutagen sensitivity test will be performed on all samples, and we expect to have 35 children who have developed TMD, and about 7 of them may progress to AML. Therefore we will also include Down syndrome patients that have developed myeloid leukaemia in order to enlarge that study group that is relatively small in the prospective part of the study. For this we will collect samples of Down syndrome children with AML in our own Institute and collaborate with Dr. C.M. Zwaan, Erasmus MC-Sophia Children’s Hospital Rotterdam and Dr. D. Reinhardt, BFM-AML study group, Hannover, Germany for which we will apply for a separate METC approval. Chromosomal instability in Down syndrome children without TMD For comparison we will also include 35 Down syndrome children that did not develop TMD. These samples will be collected from the children that are included in the first part of the protocol (part A; Screening newborns with Down syndrome on TMD) because we can then be sure that those children have not developed TMD and that it was not missed since they have not been tested for TMD. On average Down syndrome patients have a more than 1.5 times higher hypersensitive phenotype (b/c=0.78) as compared to normal non-DS children (b/c=0.5), and this significant difference (<0.026) can be found in very few children (± n=5). We expect on basis of our preliminary results that difference between non-TMD vs TMD and or leukaemia is expected to be a relatively smaller (b/c= 0.78 and 0.94 respectively) and will be comparable to the differences we found in specific sub-groups of adult patients. Assuming the same co-efficient of variation in these children, we would need at least 20 children in each group to detect statistically significant differences between children with DS without TMD, with TMD alone, and with TMD and subsequent AML.

91

7. Literatuurlijst van het onderzoekveld Ankathil R, Kusumakumary P, Nair MK. Increased levels of mutagen-induced chromosome breakage in Down syndrome children with malignancy. Cancer Genet Cytogenet.1997;99:26-8. Cloos J, Spitz MR, Schantz SP, Hsu TC, Zhang ZF, Tobi H, Braakhuis BJ, Snow GB. Genetic susceptibility to head and neck squamous cell carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1996;88:530-5. Cloos J, Nieuwenhuis EJ, Boomsma DI, Kuik DJ, van der Sterre ML, Arwert F, Snow GB, Braakhuis BJ. Inherited susceptibility to bleomycin-induced chromatid breaks in cultured peripheral blood lymphocytes. J Natl Cancer Inst. 1999;91:1125-30. Kennedy RD, D'Andrea AD. DNA repair pathways in clinical practice: lessons from pediatric cancer susceptibility syndromes. J Clin Oncol. 2006;24:3799-808. Perera FP. Molecular epidemiology: on the path to prevention? J Natl Cancer Inst. 2000;92:602-12. Roberts SA, Spreadborough AR, Bulman B, Barber JB, Evans DG, Scott D. Heritability of cellular radiosensitivity: a marker of low-penetrance predisposition genes in breast cancer? Am J Hum Genet. 1999;65:784-94. Rosenberg PS, Greene MH, Alter BP. Cancer incidence in persons with Fanconi anemia. Blood. 2003;101:822-6.

92