Leucosep-csövek LTK.615
KEZELÉSI ÚTMUTATÓ In vitro diagnosztikai célra
PI-LT.615-HU-V3
Használati útmutató Javasolt alkalmazás A Leucosep-csövek a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtjek (Peripheral Blood Mononuclear Cells. PBMC) gyűjtésére és elkülönítésére szolgálnak teljes vérből. A csövek a PBMC elkülönítését könnyítik meg teljes vérből, a FICOLL-PAQUE* PLUS eljárás segítségével, e sejteknek az ELISPOT tesztekben történő alkalmazását megelőzően. Bevezetés Az ELISPOT eljárás a PBMC sejtekből szeparált T-sejteket használ, teljes vérből. E sejtek elkülönítésére szolgáló egyik eljáráshoz szükséges a FICOLL-PAQUE PLUS teszt. Az eljárás egy sor olyan lépést foglal magában, amelyeket az optimális teljesítmény biztosítása érdekében körültekintően kell elvégezni. A Leucosep-csövek alkalmazása csökkenti a lépések számát, megbízhatóbbá teszi az eljárást és csökkenti az elkülönítésre szolgáló időt. Az eljárás alapelve A Leucosep-csövek a PBMC sejtek gyűjtésére és elkülönítésére szolgálnak teljes vérből, sűrűséggradiens centrifugálással. A Leucosep-csövek porózus gátat tartalmaznak átlátszó polipropilén csőben. Ez a biológiai szempontból inaktív gát jó minőségű polietilénből áll. A Leucosep-cső révén kiküszöbölhető a mintaanyagnak az idő- és munkaigényes felvitele a FICOLLPAQUE PLUS közegre. Az antikoagulánssal kezelt teljes vért táptalajjal vegyítjük, majd a Leucosep-csőbe öntjük. A porózus gátnak köszönhetően a vér nem keveredik az elválasztóközeggel (FICOLL-PAQUE PLUS). A centrifugálás során a PBMC sejtek eltérő sűrűségüknek köszönhetően elkülönülnek a nemkívánt eritrocitáktól és az elválasztóközeg feletti határfelületi rétegben gyűlnek össze. Az elválasztás végeztével a gát védi a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtréteget az újrafertőződéstől ez utóbbinak az eltávolítása során. Figyelmeztetések és előírások 1. 2. 3. 4.
5.
6.
7.
8. 9. 10. 11. 12. 13.
Kizárólag in vitro diagnosztikai célra. Csak szakképesített személyek használhatják; a tesztet végző személynek megfelelő kiképzésben kell részesülnie. A vérmintákat potenciálisan veszélyes anyagnak kell tekinteni. A humán eredetű anyaggal elővigyázatosan kell bánni. A teljes vér minták és a tesztkomponensek felhasználása, tárolása és ártalmatlanítása a biológiailag veszélyes anyagokra vonatkozó, megfelelő nemzeti irányelvekben és szabályozásokban meghatározott módon kell történnie. Bármilyen eltérés az ajánlott pipettázási, mosási, centifugálási időbeli és/vagy hőmérsékletbeli eljárásoktól hatással lehet a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtek izolálására és befolyásolhatja a további tesztelési eredményeket. Tilos a vért a sejtpreparálási csövekben (CPT™, Cell Preparation Tubes, Becton Dickinson) vagy az EDTA tartalmú vérgyűjtő-csövekbe gyűjteni, mivel e két csőtípus nem kompatibilis a Leucosep-csövekkel. Ne hűtse és ne fagyassza a teljes vér mintákat. A vérminták 18°C és 25°C közötti hőmérsékleten szállítandók és tárolandók a laboratóriumban, vagy pedig 10 és 25°C között ha T-Cell Xtend reagenssel kell a mintákat kezelni. A vért nem szabad 8 órával tovább tárolni, vagy pedig 32 órával tovább ha később T-Cell Xtend reagenssel kezelik azt. Kizárólag egyszer használatos tartályokat szabad alkalmazni a vénás vérminta vételre. Ne használja a lejárati időn túl. E terméket csíramentes technikával kell kezelni. Tilos a Leucosep-csöveket közvetlen fényben tárolni. Tilos sérült Leucosep-csövet vagy rossz FICOLL-PAQUE PLUS közeget használni, ezt a megszokottól eltérő sárga szín vagy szemcsés anyag megjelenése jelzi az átlátszó oldatban.
Leucosep kezelési útmutató
2/6
PI-LT.615-HU-V3
Szállított anyagok Minden egyes doboz tartalma: 50 db FICOLL-PAQUE PLUS közeggel töltött Leucosep-cső. Kezelési útmutatót és adatbiztonsági adatlapot tartalmazó CD. Tárolás és stabilitás 4°C és 30°C közötti hőmérsékleten, a dobozon feltüntetett lejárati időpontig tárolandó. A megbontott termék szobahőmérsékleten (18°C és 25°C között) tárolandó és a külső zacskó felbontását követően 12 héten belül, vagy a dobozon feltüntetett lejárati időpontig használható fel (mindig ami előbb történik). Szükséges de nem szállított anyagok és berendezés 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Heparinizált vérvételi csövek. ® AIM V és RPMI sejtkultúra-táptalaj. 15 ml-es centrifugacsövek. Centrifuga a PBMC sejtek frakcionálásához, legalább 1000 RCF (g) teljesítménnyel és amely a mintákat szobahőmérsékleten (18°C és 25°C között) képes tartani. 2-es biológiai biztonsági szintű (BL2) fülke (ajánlott). Pipetták és steril pipettahegyek. ELISPOT-készlet. Ha a minta 8 óránál tovább lett tartva, akkor lehet, hogy T-Cell Xtend-et kell használni
Eljárás Megjegyzés: A helyes laboratóriumi gyakorlat elveinek megfelelően az alábbi lépéseket kell elvégezni: 1. 2.
3.
4. 5. 6. 7. 8. 9.
Bizonyosodjon meg arról, hogy a szükséges számú Leucosep-csövet használat előtt szobahőmérsékletűre (18°C és 25°C közötti hőmérsékletre) hozta. Ha FICOLL-PAQUE PLUS közeg gyűlt fel a porózus gát (szemcsék) felett, centrifugálja a Leucosep-csöveket 1 percig 350 x g sebességen, hogy a FICOLL-PAQUE PLUS a keverék a gát alá kerüljön. A teljes vérmintát forgassa meg, majd 15 ml-es centrifugacsőben hígítsa 5 rész vér és 3 rész AIM V vagy RPMI táptalaj arányban. A centrifugacsövet néhányszor forgassa meg, hogy felkeveredjen a tartalma. A felhígított vért öntse közvetlenül a Leucosep-csőbe és 10 percig, 18-25°C fokon 1000 x g sebességen, fék nélkül centrifugálja. Szívja fel PBMC sejtek zavaros rétegét és 15 ml-es centrifugacsőben egészítse ki AIM V vagy RPMI táptalajjal ~10ml-ig. A centrifugacsövet forgassa meg, hogy tartalma felkeveredjen. Centrifugálja 7 percig 600 x g sebességen. Dobja el a felülúszót. A sejtüledéket AIM V vagy RPMI táptalajjal szuszpendálja újra, ~10 ml-ig AIM V vagy RPMI táptalajjal egészítse ki és centrifugálja további 7 percig 350 x g sebessgégen. A felülúszót dobja el és a sejtüledéket az ELISPOT teszt szerint előírt AIM V térfogatban (nem RPMI) táptalajjal szuszpendálja újra. Ha az ELISPOT tesztben a sejtek antigén stimuláláshoz kellenek, ezeket AIM V (nem RPMI) táptalajjal hígítsa fel.
Korlátozás 1.
A többi elkülönítési eljáráshoz hasonlóan, a Leucosep-csövek módosíthatják egyes PBMC sejtek részegységeinek (pl. a T- és B-sejteknek) az arányát, a nem szeparált, teljes vérben levőkhőz viszonyítva. Ez az eltérés normális esetekben vélhetően viszonylag jelentéktelen.
Leucosep kezelési útmutató
3/6
PI-LT.615-HU-V3
Minőségellenőrzés A gyártó által elvégzett belső tesztek során nem tapasztaltak jelentősebb csökkenést a PBMC hozamban a Leucosep-csövek és a FICOLL-PAQUE PLUS eljárás összehasonlítása során. Az egyéni, laboratóriumban végzett minőségi ellenőrzés részeként a sejtszámláló módszereket úgy kell tervezni és jóváhagyni, hogy azokból az adott tesztrendszer számára elegendő számú PBMC sejtet kapjanak. A minőségellenőrzési tevékenységnek továbbá a T-sejtek várt teljesítményének az adott tesztrendszeren belüli biztosításához kifejlesztett pozitív és negatív ellenőrzést is alkalmaznia kell. Teljesítményjellemzők T-Cell Xtend reagenssel tárolt vér Két-két 6 ml-es vérmintát vettek 46 személytől. Az egyik mintát 8 órán belül kézi FICOLL* rétegezéssel kezelték. A második mintát pedig 29-32 órás tárolás után Leucosep cső és T-Cell Xtend segítségével kezelték. Mindkét esetben elég sejtet kaptak egy ELISPOT vizsgálat elvégzéséhez, és ebben a vizsgálatban az összes mintából származó sejt normálisan viselkedett. Friss vér Két-két 6 ml-es vérmintát vettek 52 személytől. A mintákat a vérvételtől számított 8 órán belül kezelték. Az egyik mintát 8 órán belül kézi FICOLL rétegezéssel, a második mintát pedig Leucosepcső segítségével. Mindkét esetben elég sejtet kaptak egy ELISPOT vizsgálat elvégzéséhez, a vizsgálatban az összes mintából származó sejt funkcionális maradt. Hibaelhárítási útmutató a PBMC begyűjtésére és elkülönítésére vonatkozóan az ELISPOT céljára Probléma Kevés sejtmennyiség
Lehetséges ok Leucopenia
Lehetséges megoldás Adjon hozzá egy további vérvételi csövet
Nem megfelelő gyűjtés
Az EDTA-t tartalmazó CPT (sejtpreparálási) és a vérvételi csövek nem kompatibilisak a Leucosep-csövekkel
vérminta-
A vérvételi cső nincs szobahőmérsékleten (18°C és 25°C között)
Hagyja felmelegedni szobahőmérsékletűre a vérvételi csövet
A vért nem a hőfokon tárolták
Győződjön meg arról, hogy a vér szállítása 18°C és 25°C közötti hőmérsékleten történt, vagy pedig 10 és 25°C között ha T-Cell Xtend-et használtak
megfelelő
Az előírttól eltérő térfogat vagy hígítás alkalmazása
Leucosep kezelési útmutató
4/6
Ellenőrizze, hogy az előírásokat betartották
PI-LT.615-HU-V3
Szennyeződés vörösvértesttel
A vért nem a megfelelő hőfokon tárolták
Győződjön meg arról, hogy a vért 18°C és 25°C közötti hőmérsékleten szállították, vagy pedig 10 és 25°C között ha T-Cell Xtend-et használtak
A vérvételi cső nincs szobahőmérsékleten (18°C és 25°C között)
Hagyja felmelegedni szobahőmérsékletűre a vérvételi csövet
A vért nem hígították
Győződjön meg arról, hogy a vért az előírásoknak megfelelően hígították
A vérminta megfordult a Leucosep-csőben
Győződjön meg arról, hogy a Leucosep-cső a centrifugálás előtt álló helyzetben marad
Nem megfelelő centrifugálás
Ellenőrizze, hogy a centrifugálási előírásokat betartották Ellenőrizze, hogy a centrifuga képes a hűtésre 18°C és 25°C között Ellenőrizze, hogy a centrifugafék ki legyen kapcsolva.
Nem jól meghatározott vagy különálló mononukleáris sejtréteg
Érvénytelen eredmény
Leucosep kezelési útmutató
A mintában az elkülönítés nem teljes
Növelje a centrifugálási lépés idejét 10 perccel.
A mintában az elkülönítés nem teljes
Növelje a centrifugálási lépés idejét 10 perccel.
A centrifuga nem megfelelően kalibrált
Kalibrálja a centrifugát
Nem megfelelő centrifugálás
Ellenőrizze, hogy a centrifugálási előírásokat betartották
Nagy mennyiségű vérzsírt tartalmazó minta A nem megfelelő mintakezelés érvénytelen eredményhez vezethet
A vérvétel éhgyomorra kell, hogy történjék További információt a előzőrészben talál
5/6
PI-LT.615-HU-V3
A szimbólumok jegyzéke » 3 4 ´ Ó i 1 j ²
Felhasználás/Lejárati idő (év-hónap-nap) Gyártási szám Katalógusszám Figyelem, kövesse a használati utasítást Gyártó „n” számú tesztre elegendő In vitro diagnosztikai készülék Hőmérsékletkorlátozás/Tárolás Nézzen utána a használati utasításban
A T-Cell Xtend és az Oxford Immunotec logo az Oxford Immunotec Limited cég védjegye. A AIM V a Invitrogen cég védjegye. A CPT a Becton Dickinson cég védjegye. * A FICOLL és a FICOLL-PAQUE a GE Companies cégek védjegye. A T-Cell Xtend reagens használatát az alábbi szabadalmak és folyamatban lévő szabadalmak védik: EP2084508; US13/253,598, CN101529221, AU2007-303994, JP2009-530943, IN2165/DELNP/2009, CA2665205. © Oxford Immunotec Limited, 2013. Minden jog fenntartva.
Gyártó cég: Oxford Immunotec Ltd 94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon Oxfordshire, OX14 4RZ, UK +44(0)1235 442796 www.oxfordimmunotec.com
Leucosep kezelési útmutató
6/6
PI-LT.615-HU-V3
