Single nucleotide polymorfismen in genen betrokken in miRNA biogenese en HPV status als biomerkers voor predictie van radiotherapie outcome in patiënten behandeld voor oropharynx kanker
Laura De Backer
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische Basiswetenschappen Academiejaar 2012-2013
1
2
Single nucleotide polymorfismen in genen betrokken in miRNA biogenese en HPV status als biomerkers voor predictie van radiotherapie outcome in patiënten behandeld voor oropharynx kanker
Laura De Backer
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische Basiswetenschappen Academiejaar 2012-2013
3
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
16 mei 2013
HANDTEKENING STUDENT
Laura De Backer
HANDTEKENING PROMOTOR
Prof. Dr. H. Thierens
4
Voorwoord Deze thesis is tot stand gekomen dankzij de hulp en steun van verschillende mensen die ik hier graag zou bedanken. Mijn eerste woord van dank gaat uit naar mijn promotor Prof. Dr. H. Thierens en mijn begeleidster Kim De Ruyck om mij de mogelijkheid te geven dit onderzoek uit te voeren. Dankzij hun heb ik ook de kans gekregen om een deel van dit onderzoek in Maastricht uit te voeren. Dit was nooit mogelijk geweest zonder hun steun en vertrouwen. Bedankt! Een speciaal woord van dank gaat hierbij uit naar mijn begeleidster Kim De Ruyck. Zij heeft met veel geduld alle technieken aangeleerd en was steeds bereid om vragen te beantwoorden en te helpen. Ook Sofie De Langhe zou ik graag bedanken voor de hulp wanneer nodig. Daarnaast ook een dikke ‘merci’ aan iedereen van de dienst Medische Fysica (INW). Door de aangename sfeer die steeds aanwezig was, was het zeer leuk werken op het labo. Bedankt aan de dienst Pathologie van het UZ Gent, om mee te willen werken aan dit project. Ook de Universiteit Maastricht, het Maastro Research Lab en de dienst Pathologie van het AZ Maastricht, bedankt om mij te verwelkomen in jullie labo en mij de technieken aan te leren. De meisjes van de Medische Stralingswetenschappen zijn de volgende die ik graag zou bedanken. We zaten elke dag samen in het labo te werken en te schrijven. Een leuke babbel, etentjes, muziek en het vele lachen tussendoor maakte het werken aan die thesis veel aangenamer. Mijn vrienden zou ik ook graag bedanken, omdat ze er steeds voor mij waren. Mijn kotgenoten verdienen hierbij een speciaal woord van dank. Dankzij hun had ik steeds een leuke ‘thuis’ om naar terug te keren na een lange dag in het labo. Mijn ouders. Bedankt om mij de kans te geven om Biomedische Wetenschappen te studeren. Zonder jullie steun was dit mij nooit gelukt. En als laatste Stijn. Om naar mij te luisteren, mij te steunen en in mij te geloven. Maar vooral bedankt om mij steeds weer aan het lachen te brengen.
Zonder jullie allemaal was deze thesis niet mogelijk geweest. - BEDANKT!
5
Inhoud Afkortingen ............................................................................................................................9 Samenvatting ..........................................................................................................................1 Inleiding .................................................................................................................................2 1. Hoofd- en halskanker .....................................................................................................2 1.1 Anatomie .................................................................................................................2 1.2 Risicofactoren..........................................................................................................3 1.2.1 Alcohol en tabak ..............................................................................................3 1.2.2 Virussen ...........................................................................................................3 1.2.3 Andere risicofactoren .......................................................................................3 1.3 Orofaryngeale kanker ..............................................................................................4 2. Het Humaan Papillomavirus ...........................................................................................5 2.1 Mechanisme van HPV-geïnduceerde carcinogenese .................................................5 2.1.1 Proteïne E5.......................................................................................................6 2.1.2 Proteïnen E6 en E7 ...........................................................................................6 2.1.2.1 Proteïne E6...........................................................................................6 2.1.2.2 Proteïne E7...........................................................................................7 2.1.2.3 Verdere interacties van E6 en E7 ..........................................................7 2.2 HPV gerelateerde tumoren en betere prognose .........................................................8 2.3 Detectie van HPV ....................................................................................................9 3. MicroRNA’s ................................................................................................................ 10 3.1 MicroRNA’s: functie ............................................................................................. 10 3.2 Biosynthese ........................................................................................................... 11 3.3 MicroRNA’s, HPV en orofaryngeale kanker .......................................................... 12 4. Single Nucleotide Polymorfismen ................................................................................ 12 4.1 SNPs in biosynthese genen .................................................................................... 12 4.2 SNPs in pre-microRNA genen ............................................................................... 13
6
4.2.1 pre-microRNA146a rs2910164 G>C .............................................................. 14 4.2.2 pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T ........................................................... 14 4.3 SNPs in target genen.............................................................................................. 14 4.3.1 KRAS rs61764370 T>G ................................................................................. 14 4.3.2 SMC1B rs3747238 A>G ................................................................................ 15 5. Probleem- en doelstelling ............................................................................................. 15 Materialen en methoden ....................................................................................................... 17 1. Introductie .................................................................................................................... 17 2. Studiepopulatie ............................................................................................................ 17 3. DNA purificatie (Puregene kit)..................................................................................... 17 4. DNA isolatie uit buffy coats ......................................................................................... 18 5. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA ........................................................ 19 6. Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................................... 20 6.1 Principe ................................................................................................................. 20 6.2 PCR mix ................................................................................................................ 20 6.3 PCR primers .......................................................................................................... 21 6.4 PCR controle ......................................................................................................... 22 7. SNP bepaling ............................................................................................................... 22 7.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) .................................................. 22 7.2 High Resolution Melting (HRM) ........................................................................... 23 7.3 Geoptimaliseerde protocols.................................................................................... 25 8. Linkage Analyse .......................................................................................................... 25 9. Kwaliteitscontroles....................................................................................................... 25 10. HPV status bepaling ................................................................................................... 26 10.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)....................................................................... 26 10.2.1 DNA isolatie uit tumormateriaal ................................................................... 26 10.2.2 PCR mix ...................................................................................................... 26
7
10.2.3 PCR controle ................................................................................................ 27 10.2.4 ELISA .......................................................................................................... 27 10.3 Chromogenic In Sity Hybridisatie ........................................................................ 28 10.4 p16-Immunohistochemie ..................................................................................... 28 11. Statistische analyse..................................................................................................... 29 Resultaten............................................................................................................................. 29 1. Optimalisatie protocols ................................................................................................ 30 1.1 XPO5 rs2227301 G>A........................................................................................... 30 1.2 XPO5 rs699937 C>T ............................................................................................. 31 1.3 SMC1B rs3747238 A>G........................................................................................ 31 1.4 Drosha rs17410035 C>A ....................................................................................... 32 1.5 Pre-microRNA146a rs2910164 G>C ..................................................................... 33 1.6 Pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T .................................................................. 33 2. Patiënt karakteristieken ................................................................................................ 33 3. Associatie met overleving (OS, DFS, DSS) .................................................................. 34 3.1 Univariate Kaplan-Meier analyse van patiënt-gerelateerde en klinische factoren met overleving. .................................................................................................................. 34 3.2 Univariate Kaplan-Meier analyse van associatie tussen miRNA genotypes en overleving ................................................................................................................... 37 4. Associatie met tumor HPV status ................................................................................. 40 4.1 Associatie van tumor HPV status met patiënt-gerelateerde en klinische factoren.... 40 3.4 Associatie van tumor HPV status met microRNA genotypes.................................. 42 5. Bepaling van de tumor HPV status met behulp van CISH en p16-IHC ......................... 42 Discussie .............................................................................................................................. 43 Besluit .................................................................................................................................. 46 Referentielijst ....................................................................................................................... 47
8
Afkortingen °C
Celsius
µl
Microliter
2j-OS
2jaar-Overall Survival
3’UTR
3’-Untranslated Regio
3DRT
3D Radiotherapie
3j-OS
3jaar-Overall Survival
A
Absorbantie
A
Adenine
AGO
Argonaut
AL
Antilichaam
AZ
Academisch Ziekenhuis
BC
Buffy Coat
Bp
Basepaar
BSA
Bovine Serum Albumine
C
Cytosine
Cdk-4
Cyclin-Dependent Kinase
CISH
Chromogenic In Situ Hybridisation
CSF1-R
Colony Stimulating Factor 1-Receptor
DFS
Disease Free Survival
DNA
DeoxyRiboNucleicAcid
DSS
Disease Specific Survival
E6AP
E6 Associated Protein
9
EBV
Epstein-Barr Virus
EGFR
Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
EtBr
Ethidiumbromide
FWD
Forward
G
Guanine
GP5+/6+
General Primers 5+/6+
H2O
Water
HPV
Humane Papillomavirus
HPV-
Humane Papillomavirus negatief
HPV+
Humane Papillomavirus positief
HR
High Risk
HRM
High Resolution Melting
hTERT
Human Telomerase Reverse Transcriptase
IHC
Immunohistochemistry
IMRT
Intensity-Modulated Radiation Therapy
ISH
In Situ Hybridisation
K-RAS
Kirsten Rat Sarcoma
KT
Kamertemperatuur
LD
Linkage Disequilibrium
MAF
Minor Allel Frequency
MgCl2
Magnesiumchloride
Min.
Minuut
10
miRNA
Micro Ribonucleic Acid
Ml
Milliliter
mRNA
Messenger Ribonucleic Acid
NFX1
Nuclear Transcription Factor, X-box binding 1
N-stage
Nodal-stage
Nt
Nucleotide
OPC
Oropharyngeal Cancer
OS
Overall Survival
PCR
Polymerase Chain Reaction
PDGFβ-R
Platelet-Derived Growth Factor β-Receptor
PFS
Progression Free Survival
Pre-miRNA
Precursor Micro Ribonucleic Acid
Pri-miRNA
Primair Micro Ribonucleic Acid
PY
Pack-Years
RAS
Rat Sarcoma
Rb
Retinoblastoma
RBC
Rode bloedcel
REV
Reverse
RFLP
Reverse Fragment Lenght Polymorphism
RISC
RNA Inducing Silencing Complex
RNA
Ribonucleic Acid
SMC1B
Structural Maintenance of Chromosomes 1B
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
11
T
Thymine
Ta
Annealing Temperatuur
TE-buffer
Tris-EDTA-buffer
Tm
Melting Temperatuur
TNF
Tumor Necrosis Factor
T-stage
Tumor-stage
U
Unit
UV
Ultraviolet
UZ
Universitair Ziekenhuis
V
Volt
XPO5/Ran-GTP complex
Exportin5/Ran-Guanosinetrifosfaat complex
12
Samenvatting Orofaryngeale kankerpatiënten kunnen ingedeeld worden in twee klinisch en biologisch verschillende groepen naargelang hun prognose na behandeling. Hierbij wordt een onderscheid gemaakt tussen HPV+ en HPV- orofaryngeale kankerpatiënten, waarbij de HPV+ patiënten een betere overleving vertonen in vergelijking met de HPV- patiënten. Om deze patiënten nog beter in te delen in verschillende groepen naar prognose na behandeling, wordt er in deze studie gezocht naar additionele, niet-tumorale biomerkers. Hiervoor worden 10 SNPs in microRNA genen bepaald in 72 orofaryngeale kankerpatiënten en worden de genotypes, samen met de tumor HPV status, gelinkt aan overleving (Overall Survival (OS), Disease Free Survival (DFS), Disease Specific Survival (DSS) ). De associatie tussen de miRNA SNPs, patiënt-gerelateerde factoren, klinische factoren en de tumor HPV status wordt eveneens bestudeerd. Er worden 6 SNPs in 2 biosynthese genen onderzocht, waarvan 4 SNPs in het Drosha gen (rs639174 , rs3805500, rs7719666 en rs17410035) en 2 SNPs in het XPO5 gen (rs2227301 en rs699937). Daarnaast worden 2 SNPs worden in 2 pre-microRNA genen onderzocht, pre-microRNA146a (rs2910164) en pre-microRNA196a2 (rs11614913), en 2 SNPs in microRNA targetgenen: KRAS (rs61764370) en SMC1B (rs3747238). De tumor HPV status werd bepaald met behulp van 2 technieken: p16-Immunohistochemische kleuring (p16-IHC) en In Situ Hybridisatie (ISH), die eveneens onderling met elkaar vergeleken worden. Enkele statistisch significante associaties werden terug gevonden. Allereerst werd een associatie gevonden tussen een SNP in het Drosha gen (rs3805500 T>C) en overleving (OS, DFS). Patiënten die drager zijn van het CC genotype vertonen een slechtere OS (3-jaar OS = 22,2 %) en DFS in vergelijking met patiënten drager van het TT/TC genotype (3-jaar OS = 69,6%). Patiënten met een T1/2/3 tumor vertonen een betere OS en DFS in vergelijking met patiënten met een T4 tumor. Het aantal drinks/week vertoont eveneens een significante associatie met overleving: patiënten die minder dan 10 drinks/week consumeerden, vertonen een betere OS, DFS en DSS in vergelijking met patiënten die 10 of meer drinks/week nuttigden. Sterk significante associaties werden gevonden tussen HPV status en rookgedrag, alcoholgebruik en de 2-jaar OS. HPV+ patiënten worden gekenmerkt door een betere 2j-OS en blijken eerder niet zware rokers en drinkers te zijn. Deze studie kon bevestigen dat HPV+ en HPV- patiënten als 2 aparte entiteiten met verschillende karakteristieken (overleving, rooken drinkgedrag) beschouwd kunnen worden. Daarnaast is een additionele biomerker gevonden, die toelaat patiënten nog beter in te delen naar overleving.
1
Inleiding 1. Hoofd- en halskanker Hoofd- en halskanker, waartoe orofaryngeale kanker behoort [1], is wereldwijd de zesde meest voorkomende kanker met meer dan 500 000 nieuwe gevallen die per jaar worden vastgesteld [2]. In 2008 kregen in België 2515 patiënten (1935 mannen en 580 vrouwen) de diagnose van hoofd- en halskanker. Dit maakte hoofd- en halskanker in België voor mannen de 4e en voor vrouwen de 9e meest frequente vorm van kanker [3]. In Nederland ging dit in 2008 om 2863 gevallen (1961 mannen en 902 vrouwen) [4]. De 5-jaaroverleving is 50% [2] en diegenen die overleven, hebben een levenslang verhoogd risico om te sterven aan cardiale en respiratorische ziekten en op het ontstaan van secundaire tumoren. Hierbij is de long de meest voorkomende plaats van metastase, gevolgd door de mediastinale lymfeknopen, lever en bot [5]. Hoofd- en halskanker wordt 2-4x meer bij mannen dan bij vrouwen vastgesteld [6] en de gemiddelde leeftijd van diagnose is 60 jaar [5]. 1.1 Anatomie Hoofd- en halskanker is een verzamelnaam voor kankers die ontstaan in verschillende anatomische regio’s: de mondholte, de orofarynx, de nasofarynx, de hypofarynx en de larynx [7]. Zo goed als al deze kankers zijn squameuze cel carcinoma’s [5].
Figuur 1. Hoofd- en halskanker: de anatomische regio’s [12]
2
1.2 Risicofactoren 1.2.1 Alcohol en tabak Naast besmetting met het Humane Papillomavirus zijn de voornaamste risicofactoren voor het ontwikkelen van hoofd- en halskanker het gebruik van tabak en consumptie van alcohol [5]. Dit door de directe effecten van nicotine en polycyclische aromatische hydrocarbonaten bij het gebruik van tabak [8] en acetaldehyde, een metaboliet in de afbraak van ethanol, bij alcoholconsumptie [9]. Hevige rokers hebben 5-25x meer kans op het ontwikkelen van hoofden halskanker en in combinatie met het gebruik van alcohol stijgt het risico verder [8]. Tabakgebruik en alcoholconsumptie verhogen dus afzonderlijk het risico, maar samen vertonen ze een multiplicatief gecombineerd effect [5]. Eveneens is aanzienlijke blootstelling aan zowel alcohol als tabak geassocieerd met mutaties in het p53 tumor suppressorgen [8]. 1.2.2 Virussen Er zijn twee types virussen die gelinkt worden aan het ontstaan van kanker in de hoofd- en halsregio: het Epstein-Barr virus (EBV) en het Humane Papillomavirus (HPV). Besmetting met het Epstein-Barr virus wordt geassocieerd met kanker ter hoogte van de nasofarynx, terwijl besmetting met het Humane Papillomavirus geassocieerd is met het ontstaan van orofaryngeale kanker [10]. Hoewel het gebruik van tabak en consumptie van alcohol de voornaamste risicofactoren zijn voor het ontwikkelen van hoofd- en halskanker, ziet men de laatste jaren een daling in incidentie van hoofd- en halskanker geassocieerd met het gebruik van tabak en alcohol [7,11], en een sterke toename van HPV+ orofaryngeale kanker (geïllustreerd in figuur 2) [7]. Deze verschuivingen in incidentie zijn vooral te verklaren door de bewustmaking van de volksgezondheid en de antitabak campagnes enerzijds en door de verandering in levensstijl en seksueel gedrag anderzijds [6]. Zo zijn HPV+ tumoren sterk geassocieerd met seksueel gedrag [10], waaronder het aantal vaginale en orale seksuele partners [7]. De prevalentie van HPV+ hoofd- en halskanker varieert van 20% tot 60% tussen de verschillende publicaties [11]. 1.2.3 Andere risicofactoren Andere risicofactoren die geassocieerd zijn met hoofd- en halskanker zijn vitamine A deficiëntie, ijzerdeficiëntie bij het Plummer-Vinson syndroom en blootstelling aan bepaalde stoffen zoals asbest, nikkel en radium [8].
3
Figuur 2. Incidentie HPV+ en HPV- orofaryngeale kanker [7]
1.3 Orofaryngeale kanker De orofarynx is het gedeelte van de farynx achter de mond en omvat het achterste 1/3e van de tong, het zachte verhemelte, de zij- en achterwanden van de keel en de keelamandelen [12]. Op basis van de risicofactoren kunnen er twee biologisch en klinisch verschillende groepen van elkaar onderscheiden worden: HPV+ orofaryngeale tumoren en HPV- orofaryngeale tumoren [7]. HPV+ orofaryngeale kankerpatiënten zijn doorgaans jonger bij aanvang van de eerste symptomen [1], blanke mannen, infrequente of niet-rokers en matige tot nietalcoholische drinkers. HPV- orofaryngeale kankerpatiënten daarentegen worden gekenmerkt door een oudere leeftijd en een grote associatie met het gebruik van tabak en consumptie van alcohol [7]. Een ander belangrijk verschil tussen deze groepen is de overleving na behandeling [13]. Zo vertonen HPV+ patiënten een betere Progression Free (PFS) en Overall Survival (OS) in vergelijking met de HPV- patiënten. In de studie van Ang et al. bedroeg de 3 jaar OS na chemoradiotherapie (cisplatine (100 mg/m2) in combinatie met radiotherapie) voor HPV+ patiënten 82,4%, terwijl deze voor de HPV- patiënten nog slechts 57,1% bedroeg. Eenzelfde tendens kon worden opgemerkt voor de 3 jaar PFS (73,3% vs. 43,4% respectievelijk) [6]. Bij HPV+ orofaryngeale kanker patiënten wordt de OS eveneens gedetermineerd door het aantal pakjaren tabak gebruik ( ≤ 10 vs. > 10) en de nodal stage (Nstage: N0-N2a vs. N2b-N3). De tumor stage (T-stage: T2-T3 vs. T4) en het aantal pakjaren tabakgebruik bepaalt de OS bij de HPV- orofaryngeale kankerpatiënten [14]. Op basis van
4
deze factoren konden beide studies de patiënten indelen in drie groepen, naargelang de kans op sterfte: laag, gemiddeld en hoog risico [6,14]. p16 wordt hier gebruikt als biomerker voor HPV infectie [14].
Figuur 3. Indeling van de patiënten in 3 categorieën naargelang HPV status, aantal pakjaren en N- of T-stage [14]
2. Het Humaan Papillomavirus Het Humaan Papillomavirus (HPV) is een circulair dubbelstrengig DNA virus [10] dat voornamelijk de basale squameuze epitheliale cellen van de orofarynx infecteert [15] met een voorkeur voor de cellen van de verhemelte- en tongamandelen [7]. Er zijn meer dan 100 unieke HPV types gekend, die onderverdeeld worden in de types die een voorkeur hebben om de huid te infecteren, en de types die een voorkeur hebben om de mucosa te infecteren. In deze laatste categorie kunnen de invasieve carcinoma’s ingedeeld worden. Verder worden de HPV types onderverdeeld in hoog-risico en laag-risico types. Goedaardige proliferaties zijn geassocieerd met de laag-risico types, terwijl maligniteiten geassocieerd worden met de hoogrisico types. Op basis van associatie met halskanker, zijn er zo’n 15 hoog-risico of oncogene HPV types geïdentificeerd [10], waaronder HPV 16, 18, 31, 33 en 35 [15]. HPV-16 is het meest voorkomende type en wordt in 87-90% van de HPV+ orofaryngeale kankers terug gevonden [10]. Deze hoog-risico types zijn in staat orale epitheliale cellen te transformeren via E6 en E7, de virale oncoproteïnen [15]. 2.1 Mechanisme van HPV-geïnduceerde carcinogenese HPV behoort tot de familie van de Papovaviridae: kleine icosahedrale virussen [16] die bestaan uit een viraal genoom dat ongeveer 8000 basenparen groot is [10]. Dit genoom is samengesteld uit 3 grote regio’s: de vroege genen (E1-8), de late genen (L1-2) en een lange coderende regio [15]. De vroege genen coderen voor 2 regulerende proteïnen (E1 en E2) en 3 oncoproteïnen (E5, E6 en E7), terwijl de late genen coderen voor 2 structurele capside proteïnen (L1 en L2) [10]. De capside proteïnen zijn verantwoordelijk voor de initiële binding
5
tussen het virus en target cel, door hun affiniteit voor proteoglycaan heparine sulfaat groepen op de basale membraan [7]. De oncoproteïnen zijn verantwoordelijk voor carcinogenese [10]. 2.1.1 Proteïne E5 Oncoproteïne E5 is een hydrofoob proteïne dat preferentieel terug gevonden wordt in het Golgi
apparaat
en
in
het
plasmamembraan.
E5
bindt
met
verschillende
transmembraanproteïnen, waaronder EGFR, PDGFβ-R en CSF1-R [17], en speelt een rol in de vroege infectie door het initiëren van de celproliferatie. Tijdens de integratie van het viraal genoom naar het gastheergenoom, wordt de coderende sequentie voor E5 vaak verwijderd, waaruit blijkt dat E5 enkel betrokken is bij de vroege infectie en niet bij de latere stadia van carcinogenese. Deze rol wordt vervuld door andere proteïnen, namelijk E6 en E7 [10]. 2.1.2 Proteïnen E6 en E7 Oncoproteïnen E6 en E7 zijn verantwoordelijk voor carcinogenese en behoud van een kwaadaardig fenotype [10] door degradatie van belangrijke signaalelementen. Dit doen ze door interactie met hun PDZ-domein, een structureel domein dat terug gevonden wordt in meer dan 400 proteïnen [7]. De belangrijkste targets van E6 en E7 zijn respectievelijk p53 en pRb, beide tumor suppressor proteïnen [10]. Deze proteïnen zijn verantwoordelijk voor het regelen van de celcyclus. Ze kunnen de celcyclus stoppen tijdens de G1 en G2 fase zodat de DNA schade gedetecteerd en hersteld kan worden. Wanneer dit proces verloren gaat, wordt de celcyclus niet gestopt en gaat deze gewoon door zonder herstel van schade. Dit kan dus bijgevolg leiden tot een accumulatie van DNA schade en een grotere kans op ontstaan van mutaties [18].
2.1.2.1 Proteïne E6 E6 is een oncoproteïne van 151 aminozuren lang [19] dat verschillende cellulaire targets heeft, waarvan de belangrijkste de tumor suppressor p53 is. E6, gebonden aan E6AP (E6 Associated Proteins), bindt met p53 [20] wat een ubiquitine-gemedieerde degradatie of directe inactivatie van p53 (via complexvorming) tot gevolg heeft [21]. Aangezien p53 een belangrijke rol heeft in het stoppen van de celcyclus en behoud van de DNA integriteit tijdens de celcyclus checkpoints [18], leidt degradatie van p53 tot disregulatie van deze celcyclus checkpoints (G1/S en G2/M). Bijgevolg leidt dit door een accumulatie van mutaties [21] tot genomische instabiliteit [10]. Dit proces wordt afgebeeld in onderstaande figuur (figuur 4).
6
2.1.2.2 Proteïne E7 E7 is een oncoproteine van 98 aminozuren lang, dat onder andere bindt met proteïnen van de Retinoblastoma familie (Rb, p107, p130) [19], ook gekend als de pocket proteïnen [20]. Deze proteïnen zijn verantwoordelijk voor de regulatie van de celcyclus op verschillende checkpoints [19]. In normale, niet geïnfecteerde cellen bindt pRb aan E2F [22], een transcriptiefactor die betrokken is in de progressie van de celcyclus naar de S-fase [21] alsook in differentiatie, ontwikkeling, proliferatie en apoptose [19]. Wanneer E2F niet gebonden is aan pRb, worden S-fase genen overgeschreven en vindt celproliferatie plaats [10]. Wanneer pRb E2F bindt, worden deze genen niet overgeschreven en blokkeert de celcyclus progressie. pRb kan geïnactiveerd worden op 2 manieren: via fosforylatie door cdk-4 [22] of door binding aan E7. In beide gevallen gaat de binding tussen pRb en E2F verloren en vindt progressie van de cel naar de S-fase plaats [21]. p16, een cdk-inhibitor, blokkeert de fosforylatie van pRb door cdk-4 en blokkeert dus op deze manier de G1-S fase progressie. Wanneer cellen geïnfecteerd zijn met HPV, gaan deze cellen p16 overexpresseren ter compensatie van het verlies van pRb door E7. Omwille van deze overepressie, kan p16 gebruikt worden als surrogaat marker voor HPV infectie [22]. Dit proces kan terug gevonden worden in figuur 4. 2.1.2.3 Verdere interacties van E6 en E7 Naast binding op p53 en pRb, binden E6 en E7 nog op tal van andere targets met oncogene effecten die verder bijdragen tot genomische instabiliteit. E7 bindt zo op verschillende andere leden van de Retinoblastoma familie, waaronder p107 en p130. Daarnaast is het eveneens in staat te binden op p21CIP1 en p27KIP1 die, net als p16, cdk-inhibitors zijn. Binding van E7 met de cdk-inhibitors en de overige leden van de Retinoblastoma familie leidt tot inactivatie van deze targets met ongecontroleerde celproliferatie en carcinogenese tot gevolg. Daarnaast zorgt E6, gebonden aan E6AP, voor degradatie van NFX1, een transcriptiefactor. Dit leidt tot activatie van hTERT en induceert telomerase activiteit. E6 bindt eveneens met Bak, waardoor Bak zijn apoptotische werking verliest [10]. Expressie van E6 en E7 zijn noodzakelijk voor kwaadaardige transformatie [23] maar dit is echter niet voldoende. Er vinden bijkomende processen plaats, maar deze zijn tot hiertoe ongekend [10].
7
Figuur 4. Mechanisme van HPV-geïnduceerde carcinogenese [10]
2.2 HPV gerelateerde tumoren en betere prognose Zoals reeds beschreven in 1.3 is er een belangrijk verschil tussen de OS en PFS voor patiënten met HPV+ orofaryngeale kanker en patiënten met HPV- orofaryngeale kanker. Er bestaan verschillende hypothesen voor het verschil in prognose na behandeling. Afwezigheid van ‘field cancarization’, bewaking van het immuunsysteem voor virus-specifieke antigenen en een intacte apoptotische respons op straling [24] kunnen als oorzaken voor een betere overleving bij HPV+ tumoren beschouwd worden. Ook zijn HPV+ kankers minder geassocieerd met het gebruik van tabak en alcohol, vertonen zij minder p53 mutaties, hebben ze de neiging om focaal te blijven en is er minder kans op het ontwikkelen van tumoren in de longen, slokdarm of elders in de hoofd- en halsregio [25]. De behandeling van orofaryngeale kanker gebeurt voornamelijk door radiotherapie en chemoradiotherapie [26] waarbij gebruik gemaakt wordt van stralingsgeïnduceerde celdood. Hierbij vertonen HPV+ tumoren een grotere gevoeligheid in vergelijking met HPV- tumoren [27]. Verschillende hypothesen worden hierrond gesteld. Vu et al. veronderstellen een verhoogde immuunrespons na radiotherapie via verschillende mechanismen, zoals opregulatie van TNF receptors [15] terwijl Pang et al. de verantwoordelijkheid van de stralingsgeïnduceerde gevoeligheid bij een isovorm van E6, E6*I leggen. E6*I zorgt er namelijk voor dat de cellen gevoeliger zijn aan stralingsgeïnduceerde apoptose door hun de toegang tot de G1 fase te verhinderen en hen in apoptose te laten gaan [27]. Lassen et al. stellen de hypothese dat tumorcellen die p16 expresseren minder hypoxisch zijn minder snel herbevolken na bestraling [28].
8
2.3 Detectie van HPV Aantonen van een infectie met HPV gebeurt doorgaans via 3 technieken: Polymerase Chain Reaction (PCR), In Situ Hybridisatie (ISH) en Immunohistochemie (IHC) [7]. De voor- en nadelen van deze technieken zijn opgesomd in tabel 1. PCR detecteert geamplificeerd viraal mRNA of viraal DNA [11,29] en wordt door zijn hoge gevoeligheid [11] gezien als de gouden standaard in research laboratoriums [30]. Ondanks dit grote voordeel, is deze techniek moeilijk praktisch uitvoerbaar in de meeste klinische laboratoriums [31] gezien het complexe weefselverwerking en expertise vereist [32]. Bovendien kan met de PCR techniek geen onderscheid gemaakt worden tussen HPV aanwezig in neoplastische cellen en HPV aanwezig in niet neoplastisch epitheel en stroma [29]. Zowel IHC als ISH zijn technisch minder veeleisende methodes [7]. Bij ISH wordt het HPV DNA gevisualiseerd met behulp van signaal amplificatie [31]. ISH overkomt bepaalde limitaties van PCR doordat ISH in staat is om aan te tonen dat het virus zich in de tumorcellen bevindt [11]. ISH toont op deze manier dus enkel de klinisch relevante infecties aan [29]. Hoewel ISH een hoge specificiteit kent, heeft het een lage sensitiviteit en is het duurder in vergelijking met IHC [11]. Steeds meer onderzoekers ijveren voor het gebruik van p16 als biomerker voor de bepaling van de HPVstatus omwille van de vele voordelen die hiermee verbonden zijn. De p16-IHC techniek is eenvoudig uitvoerbaar, kent een lage kost en heeft een hoge sensitiviteit [33]. Daarnaast zijn monoclonale antilichamen tegen p16 commercieel verkrijgbaar [29] en is deze techniek beschikbaar in de meeste routine pathologische laboratoria [11]. Tabel 1. Overzicht van de voor- en nadelen van de technieken voor HPV detectie Techniek
Voordelen
Nadelen
PCR
Hoge sensitiviteit
Moeilijk uitvoerbaar in klinische laboratoria Vals positieven wegens te sensitief [11] Lage specificiteit [29] Contaminatie errors Geen zekerheid over de aanwezigheid in tumorcellen Verknipt DNA kan primerbinding verhinderen
9
Vervolg tabel 1. Overzicht van de voor- en nadelen van de technieken voor HPV detectie Techniek
Voordelen
Nadelen
ISH
Technisch minder veeleisend
Lage sensitiviteit
Toont enkel klinisch relevante
Duur
infecties aan Hoge specificiteit p16-IHC
Technisch minder veeleisend
Lage specificiteit [34]: subset
Goedkoop
HPV-tumoren overexpresseren ook
Hoge sensitiviteit
p16
Monoclonale lichamen tegen p16 zijn commercieel verkrijgbaar
3. MicroRNA’s Op basis van de tumor HPV status, worden patiënten met orofaryngeale kanker ingedeeld in twee biologisch en klinisch verschillende groepen, zoals reeds vermeld in 1.3. Het verband tussen polymorfismen in microRNA genen en kankerrisico is reeds onderzocht in verschillende studies. Hoe deze polymorfismen bijdragen tot prognose is tot hiertoe echter weinig bestudeerd. Deze polymorfismen zouden gebruikt kunnen worden om orofaryngeale kanker patiënten nog beter in te delen naar prognose na behandeling. 3.1 MicroRNA’s: functie Mature microRNA’s zijn korte, niet-coderende [35], RNA moleculen van zo’n 19-22 nucleotiden lang [36] die betrokken zijn in belangrijke biologische processen zoals apoptose, proliferatie, differentiatie, angiogenese en immuunrespons [37]. Sequentiespecifieke binding van microRNA’s op hun target mRNA leidt tot inhibitie van translatie en/of degradatie van dit mRNA [36]. Op deze manier kan één enkele microRNA de expressie van 100den target mRNA’s controleren en wordt ongeveer 1/3e van de proteïne coderende genen in het menselijk genoom gecontroleerd door microRNA’s. Het spreekt voor zich dat disregulatie van de normale microRNA functie, en dus disregulatie van apoptose, proliferatie, differentiatie, angiogenese en immuunrespons, een cruciale rol speelt in het ontstaan van kanker. Zo kunnen microRNA’s zich gedragen als tumorsuppressors of als oncogenen. Gedereguleerde microRNA’s
zijn
op
deze
manier
geassocieerd
met
initiatie,
progressie
en
behandelingsoutcome van verschillende kankers [37], waaronder hoofd- en halskanker [38].
10
3.2 Biosynthese Een mature miRNA molecule wordt gevormd in 3 stappen. In een eerste stap wordt het primaire miRNA (pri-miRNA) gevormd door transcriptie van het miRNA gen met behulp van RNA polymerase II [39]. Dit pri-miRNA is 500-3000 nucleotiden lang [36] en wordt door een nucleair RNase, DROSHA, omgevormd tot een precursor miRNA (pre-miRNA) [39, 40] van ongeveer 70-100 nucleotiden lang [40]. Deze dubbelstrengige haarspeldstructuur [36] wordt getransporteerd naar het cytoplasma door het exportin 5 (XPO5)/Ran-GTP complex [40] waar de finale stap, de maturatie, plaats vindt [39]. Hier wordt het pre-miRNA verder gesplitst door een RNase III endonuclease, DICER, met vrijlating van 2 complementaire korte RNA sequenties tot gevolg [40]: de mature miRNA sequentie en zijn kortlevend complementaire sequentie aangeduid als miR* [36]. Argonaut proteïnen (AGO1-4) vormen een complex met GEMIN3 en GEMIN4 en binden selectief op 1 van de 2 sequenties wat leidt tot vorming van het RISC [40] (RNA-Inducing Silencing Complex [36]). De streng met het minst stabiele 5’ eind wordt preferentieel geselecteerd en geladen in het RISC [41]. Het RISC vergemakkelijkt de binding van het miRNA op zijn target mRNA doordat het de bindingsplaats in de 3’UTR van het target mRNA herkent en vervolgens het miRNA hierop richt [40]. Deze binding leidt tot inhibitie van translatie en/of degradatie van het target mRNA [36]. Dit proces kan terug gevonden worden in onderstaande figuur.
Figuur 5. MicroRNA biosynthese [36]
11
3.3 MicroRNA’s, HPV en orofaryngeale kanker Gezien de regulerende rol van microRNA’s in apoptose en immuunrespons, kunnen polymorfismen in microRNA’s zorgen voor een veranderde apoptotische en immuunrespons. Deze veranderende respons kan ervoor zorgen dat HPV enerzijds ontsnapt aan apoptose en anderzijds ontsnapt aan het immuunsysteem en op deze manier niet geklaard wordt. Op deze manier spelen microRNA polymorfismen een rol in de ontwikkeling van orofaryngeale kanker en verschillende outcomes zoals HPV status en overleving [42]. 4. Single Nucleotide Polymorfismen Een Single Nucleotide Polymorfisme (SNP) is een niet-repetitieve vorm van sequentie variatie dat grotendeels verantwoordelijk is voor de variatie tussen verschillende individuen [36]. SNPs worden geassocieerd met diversiteit binnen een populatie alsook met gevoeligheid voor bepaalde ziekten en individuele respons op medicatie [37]. Naargelang de basenverandering die plaats vindt, worden SNPs ingedeeld in verschillende klassen (klasse 14). Dit wordt weergegeven in tabel 2. SNPs met betrekking tot microRNA’s kunnen voorkomen in de microRNA genen zelf, in de bindingsplaats voor het microRNA en in de microRNA biosynthese genen [36]. Tabel 2. De SNP klassen. Bron: HRM Guide, Applied Biosystems SNP klasse
Basenverandering
Voorkomen in het menselijk genoom
1
C/T & G/A
64%
2
C/A & G/T
20%
3
C/G
9%
4
A/T
7%
4.1 SNPs in biosynthese genen SNPs in biosynthese genen zijn gelinkt met kankerrisico, prognose en respons op medicatie [36]. Verschillende studies deden reeds onderzoek naar het verband tussen SNPs in genen betrokken in de biosynthese van microRNA’s, waaronder AGO1, GEMIN3 en Dicer, en het ontstaan van kanker. De selectie van de biosynthese genen en de SNPs gebeurde op basis van de studie van Zhang et al., waarin het verband werd onderzocht tussen SNPs in biosynthese genen en het risico op secundaire tumoren en/of herval bij patiënten met hoofd- en halskanker
12
in een vroeg stadium. Er werd gekozen voor het 4 SNPs in het Drosha gen en 2 SNPs in het XPO5 gen. Zoals reeds vermeld in 3.1 is Drosha een nucleair RNase dat instaat voor de vorming van het pre-microRNA uit het pri-microRNA. Het gen dat codeert voor Drosha bevindt zich op chromosoom 5. Hierin worden 4 SNPs onderzocht (rs639174 G>A, rs3805500 T>C, rs7719666 C>T en rs17410035 C>A). Zhang et al. konden in hun studie een verband aantonen tussen de 4 SNPs en het ontstaan van een 2e primaire tumor en/of terugkeer in patiënten met hoofd- en halskanker in een vroeg stadium. Daarnaast konden zij ook vaststellen dat hoe meer risicovolle genotypes een persoon bezat, hoe groter het risico op herval werd. XPO5 is verantwoordelijk voor het transport van het pre-microRNA naar het cytoplasma. Het gen voor XPO5 is gelokaliseerd op chromosoom 6 waarin 2 SNPs (rs2227301 G>A en rs699937 C>T) onderzocht worden [43]. Een overzicht van de SNPs die in dit eindwerk onderzocht worden, wordt weergegeven in onderstaande tabel. Tabel 3. Overzicht van de SNPs in de biosynthese genen Gen
SNP
Locatie
Basenverandering
MAF *
Drosha
rs639174
Intron
G>A
24,6 %
Drosha
rs3805500
Intron
C>T
32,5 %
Drosha
rs7719666
Intron
C>T
49,1 %
Drosha
rs17410035
3’-UTR
C>A
33,2 %
XPO5
rs2227301
3’-UTR
G>A
26,5 %
XPO5
rs699937
Intron
C>T
34,8 %
LD **
rs10520985
MAF * = Minor Allele Frequency, in Kaukasische populatie / LD ** = Linkage Disequilibrium
4.2 SNPs in pre-microRNA genen Reeds vele studies toonden aan dat afwijkende expressie van microRNA’s geassocieerd is met etiologie, diagnose en prognose van verschillende kankers, waaronder orofaryngeale kanker [42]. Zo werd in de studie van Liu et al. het verband tussen 4 SNPs in 4 pre-microRNA genen (pre-microRNA146a, -149, -196a2 en -499) en het risico op het ontwikkelen van squameuze cell carcinoma’s in de hoofd- en halsregio onderzocht. Hoewel voor slechts 1 SNP (premicroRNA499 rs3746444 T>C) een significante associatie kon aangetoond worden, werd een gecombineerd risico gevonden voor de 4 SNPs. Wanneer een individu de 4 risicovolle
13
genotypes bezat, had deze 1,4x meer kans op het ontstaan van hoofd- en halskanker. Ook werd opgemerkt dat dit risico groter was voor patiënten met orofarynx kanker, wat kan wijzen op een mogelijke interactie tussen deze pre-microRNA genen en de HPV oncogene proteïnen [38]. Hierop ging de studie van Guan et al. verder. Zij onderzochten of bovenvernoemde SNPs de HPV-16 status en overleving kon voorspellen in patiënten met squameuze cel carcinoma ter hoogte van de orofarynx. Dit is de eerste studie die op zoek gaat naar biomerkers voor prognose van patiënten met orofarynx kanker. Zij konden een significante associatie aantonen tussen de SNPs in 2 pre-microRNA genen (pre-microRNA 146a rs2910164 G>C en pre-microRNA 196a2 rs11614913 C>T) en HPV-16 positieve orofaryngeale kanker alsook met overleving na behandeling [42]. Deze 2 SNPs worden in de volgende paragrafen verder besproken. 4.2.1 pre-microRNA146a rs2910164 G>C Deze SNP (G>C) komt voor in het pre-microRNA146a en heeft een MAF van 23,5%. Zoals eerder vermeld konden Liu et al. geen verband aantonen tussen deze SNP en het risico op het ontstaan van hoofd- en halskanker [38] terwijl dit door Orsos et al. wel aangetoond kon worden [44]. Een associatie met het ontstaan van gliomen [45] en borstkanker [46] kon door andere onderzoekers eveneens aangetoond worden. Zoals eerder vermeld, werd in studie van Guan et al. een positieve associatie gevonden tussen deze SNP en verschillende klinische eindpunten, waaronder OS, DFS en DSS. Een associatie kon ook aangetoond worden tussen deze SNP en een grotere kans op aanwezigheid van een HPV-16 positieve tumor [42]. 4.2.2 pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T Deze SNP (C>T) komt voor in het pre-microRNA196a2 en heeft een MAF van 44,2%. Ook hier konden Liu et al. [38] geen rechtstreeks verband aantonen tussen de SNP en het risico op squameuze cel carcinoma’s in de hoofd- en halsregio. Twee andere studies deden onderzoek naar deze SNP in relatie met het ontstaan van kanker, waarbij zij een significante associatie konden aantonen met het ontstaan van hoofd- en halskanker [35] en borstkanker [45]. Guan et al. konden voor deze SNP eveneens een associatie aantonen met OS, DFS en DSS alsook met een grotere kans op aanwezigheid van een HPV-16 positieve tumor [42]. 4.3 SNPs in target genen 4.3.1 KRAS rs61764370 T>G Deze SNP (T>G) komt voor in het 3’UTR van het KRAS gen met een MAF van 12,5%. RAS proteïnen zijn G-proteïnen die betrokken zijn in verschillende intracellulaire pathways,
14
betrokken in proliferatie, apoptose, differentiatie, celadhesie, cytoskeletale integriteit en celmigratie [47]. De expressie van deze proteïnen wordt op negatieve wijze gecontroleerd door let-7 [48], een lid van de microRNA familie [49]. Mutaties in RAS worden frequent terug gevonden in bepaalde tumoren. Wanneer deze signalisatie geïnhibeerd wordt, neemt de gevoeligheid voor stralingsgeïnduceerde celdood toe [48]. Verschillende studies konden een associatie aantonen tussen dragers van het variante allel en een toegenomen risico op kanker, waaronder colorectale kanker [50] niet-kleincellig longcarcinoom [51] en ovariumkanker [52]. Eén studie kon een associatie aantonen tussen deze SNP en overleving bij orale kanker patiënten. Zo toonden Christensen et al. aan dat dragers van het variante allel een verminderde overleving vertoonden in vergelijking met dragers van het wild type allel [53]. 4.3.2 SMC1B rs3747238 A>G Deze SNP (A>G) komt voor in de 3’UTR van het SMC1B gen, gelegen op chromosoom 22, met een MAF van 46%. SMC1B, Structural Maintenance of Chromosomes proteïnen [54], zijn proteïnen die een belangrijke rol spelen in de dynamiek van chromosoom cohesie en condensatie [55] tijdens de meiose en de mitose. Slechts één studie deed onderzoek naar het verband tussen SNPs in het SMC1B gen en het risico op het ontwikkelen van kanker. Zhang et al. konden hierbij een significante associatie aantonen tussen het homozygoot variante genotype en het risico op secundaire tumoren en/of herval bij patiënten met hoofd- en halskanker. Personen die homozygoot variant waren voor dit genotype, hadden 1,74x meer risico op het ontwikkelen van hoofd- en halskanker. Het variante genotype creëert miRNA bindingsplaatsen
voor
transcripten
die
getarget
worden
door
microRNA609
en
microRNA124a. Deze nieuwe bindingsplaatsen resulteren in een verminderde expressie van SMC1B wat kan leiden tot genomische instabiliteit en een groter kankerprogressie risico [43]. 5. Probleem- en doelstelling Gezien de toenemende incidentie van HPV+ orofaryngeale kanker en de betere prognose na chemoradiotherapie voor deze patiënten, wordt de bepaling van de HPV status voor orofaryngeale kanker patiënten steeds belangrijker. Er is echter nog geen duidelijkheid over welke techniek het best aangewezen is voor HPV status bepaling. Additionele biomerkers die toelaten patiënten verder in te delen naar hun respons op therapie zijn cruciaal. Voornamelijk voor HPV- patiënten, die een minder goede prognose hebben na chemoradiotherapie, zou verdere stratificatie op basis van deze biomerkers zinvol zijn. SNPs in microRNA biosynthese genen, pre-microRNA genen en target genen zijn mogelijke nieuwe biomerkers. In dit eindwerk zullen SNPs in microRNA genen, microRNA biosynthese genen, microRNA target
15
genen en HPV status geassocieerd worden met de outcome van orofaryngeale kanker patiënten, behandeld met radiotherapie.
16
Materialen en methoden 1. Introductie In deze thesis wordt de HPV status van orofaryngeale kankerpatiënten vastgesteld, in combinatie met de bepaling van 10 SNPs. Er worden 6 SNPs bepaald in genen die betrokken zijn in de biosynthese van microRNA’s (4 SNPs in het Drosha gen, 2 SNPs in het XPO5 gen), 2 SNPs in microRNA target genen (1 SNP in het KRAS gen, 1 SNP in het SMC1B gen) en 2 SNPs in 2 pre-microRNA genen (pre-microRNA 146a en 196a2). Voor de SNP bepaling wordt het DNA geïsoleerd uit bloedstalen. De plaats van interesse in het gen wordt vervolgens geamplificeerd met behulp van specifieke primers (de Polymerase Chain Reaction (PCR)). De SNP bepaling zelf gebeurt vervolgens met behulp van Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) en High Resolution Melting (HRM). De HPV status wordt bepaald aan de hand van twee technieken: In Situ Hybridisatie (ISH) en Immunohistochemie (IHC).
2. Studiepopulatie De populatie die gebruikt wordt voor deze studie bevat in totaal 136 orofaryngeale kankerpatiënten (72 patiënten uit Gent, 64 patiënten uit Maastricht). Deze patiënten werden geselecteerd uit een groep hoofd- en halskanker patiënten die aan de volgende eisen voldoen: kanker ter hoogte van de orofarynx, curatieve (chemo)radiotherapie voor de primaire tumor, aanwezigheid van DNA en tumor materiaal en beschikbaarheid van follow-up data. Voor de patiënten die in Gent behandeld werden, werden bloedstalen verzameld in samenwerking met de dienst Radiotherapie van het UZ Gent. Tumormateriaal werd beschikbaar gesteld via de dienst Pathologie van het UZ Gent. Voor de patiënten die in Maastricht behandeld werden, werden buffy coats verzonden naar de dienst Medische fysica van de Universiteit Gent. Het tumormateriaal werd ter beschikking gesteld op de dienst Pathologie van het AZ Maastricht. Wegens het te laat doorkrijgen van de follow-up data van de patiënten uit Maastricht, werd beslist om enkel de data te gebruiken van de patiënten uit Gent. Er worden dus uiteindelijk 72 orofaryngeale kankerpatiënten beschouwd in deze studie.
3. DNA purificatie (Puregene kit) Om de cellen te lyseren wordt 9 ml RBC (Rode bloedcel) lyse toegevoegd aan 3 ml vol bloed. Hierna worden de buisjes enkele malen omgedraaid en vervolgens 5 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur. Gedurende de incubatie worden de buisjes opnieuw enkele malen
17
omgekeerd. Vervolgens worden de buisjes gecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 2000xg en het supernatans verwijderd, zodat ongeveer 200 µl vloeistof over blijft. Om de cellen opnieuw op te lossen in de overgebleven vloeistof, worden de buisjes gevortext. Nadien wordt 3 ml cellyse oplossing toegevoegd en opnieuw gevortext. Na deze stap kunnen de stalen gedurende 2 jaar bewaard worden op kamertemperatuur. De volgende stap is de proteïne precipitatie. Er wordt 1 ml proteïne precipitatie buffer toegevoegd aan het cellysaat en dit geheel wordt gevortext aan hoge snelheid gedurende 20 seconden. De stalen worden 10 minuten op ijs geïncubeerd en vervolgens gecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 2000xg. Na deze stap zijn de eiwitten geprecipiteerd en vormen ze een donkerbruin pellet. Als dat niet zo is, worden de laatste stappen van de proteïne precipitatie (vortexen, incuberen op ijs en centrifugeren) herhaald. Het supernatans wordt overgegoten in een 15 ml buisje dat 3 ml 100% isopropanol bevat. De buisjes worden ongeveer 50x omgedraaid tot het DNA, onder de vorm van witte draden, zichtbaar wordt. Het geheel wordt gedurende 3 minuten gecentrifugeerd aan 2000xg waarna het supernatans wordt afgegoten. De buisjes laat men kort afdruipen op absorberend papier. Vervolgens wordt 3 ml van 70% ethanol toegevoegd en worden de buisjes enkele malen omgedraaid om het DNA pellet te wassen. De buisjes worden gecentrifugeerd aan 2000xg gedurende 1 minuut en het supernatans wordt opnieuw afgegoten, zodat enkel het pellet overblijft. De overgebleven vloeistof wordt afgepipetteerd en de buisjes worden 10 minuten gedroogd aan de lucht. In de laatste stap wordt het DNA gehydrateerd door toevoegen van 500 µl DNA hydratie oplossing en zacht te vortexen gedurende 5 seconden. Nadien worden de buisjes 1 uur geïncubeerd op 65°C en daarna overnacht op kamertemperatuur. De dag nadien worden de buisjes kort gecentrifugeerd en wordt de DNA oplossing overgebracht in een 1,5 ml buisje en bewaard op -20°C. 4. DNA isolatie uit buffy coats Buffy coats (BC) van ongeveer 500 µl worden bereid uit 9 ml bloed. DNA wordt geïsoleerd uit 40 µl van deze BC’s. Voor de cellyse wordt 40 µl BC toegevoegd aan 120 µl RBC lyse in 1,5 ml epjes. De buisjes worden gemengd door deze enkele malen om te keren of kort te vortexen. Vervolgens worden de epjes geïncubeerd gedurende 5 minuten op kamertempertuur (KT) en enkele malen omgekeerd tijdens de incubatie. Nadien worden de epjes gecentrifugeerd gedurende 20 seconden aan 16.000xg en het supernatans verwijderd tot er 1020 µl vloeistof overblijft. De buisjes worden hevig gevortext om de cellen opnieuw op te lossen in de overblijvende vloeistof. 600 µl cellyse oplossing wordt toegevoegd en op en neer gepipetteerd om de cellen te lyseren. Indien celklompjes aanwezig zijn, worden de epjes
18
geïncubeerd op 37°C of op KT tot de oplossing homogeen is. De epjes worden afgekoeld tot KT vooraleer verder gegaan wordt. Na deze stap kan het protocol onderbroken worden gedurende 2 jaar. Voor de proteïne precipitatie wordt 200 µl proteïne precipitatie buffer toegevoegd aan het cellysaat. De epjes worden gevortext aan hoge snelheid gedurende 20 seconden. Vervolgens wordt het geheel gecentrifugeerd gedurende 3 minuten aan 16.000xg. Na deze stap vormen de neergeslagen eiwitten een donkerbruin pellet, indien dit niet het geval is, worden de epjes opnieuw gevortext aan hoge snelheid gedurende 20 seconden, 5 minuten geïncubeerd op ijs en vervolgens opnieuw gecentrifugeerd gedurende 3 minuten aan 16.000xg. Voor de DNA precipitatie wordt het supernatans overgegoten in een 1,5 µl epje dat 600 µl 100% isopropanol (KT) en 1 µl glycogen (20 mg/ml) bevat. De epjes worden 50x omgedraaid zodat het DNA pellet zichtbaar wordt en worden gecentrifugeerd gedurende 1 minuut aan 16.000xg. Na deze stap is het DNA zichtbaar als een klein wit pellet. Het supernatans wordt afgegoten en op absorberend papier wordt het epje kort afgedropen zonder dat het pellet mee wordt weggegoten. Om het DNA pellet te wassen, wordt 800 µl 70% ethanol (KT) toegevoegd en de buisjes enkele malen omgekeerd. De epjes worden gecentrifugeerd gedurende 1 minuut aan 16.000xg en het supernatans wordt afgepipetteerd. De buisjes worden gedurende 8-10 minuten gedroogd aan de lucht. Voor de DNA hydratie wordt 40 µl DNA hydratie oplossing toegevoegd en zacht gevortext gedurende 5 seconden. De epjes worden gedurende 1 uur geïncubeerd op 65°C en daarna overnacht op KT. De epjes worden zacht gevortext op verschillende tijdstippen (na 30 minuten en na 1 uur tijdens de incubatie op 65°C, en ongeveer om het uur tijdens de incubatie op KT). De volgende dag worden de epjes kort gecentrifugeerd en de DNA oplossing overgebracht in een 1,5 ml buisje met schroefdop. De epjes worden bewaard op -4°C.
5. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA De DNA kwantiteit en kwaliteit wordt bepaald met fotospectrometrie. De kwaliteit van het DNA wordt bepaald door de ratio van de absorbantie bij 260 nm en bij 280 nm (A260/A280). Deze waarde moet tussen 1,8 en 2,0 liggen. Uitgaande van de stockoplossing wordt een werkoplossing van 25 ng/µl gemaakt door toevoegen van een bepaalde hoeveelheid TE (TrisEDTA) buffer.
19
6. Polymerase Chain Reaction (PCR) 6.1 Principe Polymerase Chain Reaction (PCR) wordt gebruikt om een bepaalde DNA sequentie te amplificeren met behulp van een specifiek primerpaar. PCR berust op een thermische cyclus, waarbij er verschillende keren in temperatuur gestegen en gedaald wordt, zodat het DNA wordt gedenatureerd en enzymatische replicatie van het DNA plaats kan vinden. Deze thermische cyclus bestaat uit 3 stappen: denaturatie, annealing en elongatie. In de denaturatiestap wordt de temperatuur verhoogd tot 95°C, waardoor de dubbele DNA helix uit elkaar valt en het DNA gesplitst wordt in 2 enkele strengen. Tijdens de annealingsstap wordt de temperatuur verlaagd tot de Ta, een primer specifieke temperatuur. De Ta kan berekend worden aan de hand van de formule Ta = Tm-2, waarbij Tm = [(#T/A x2) + (#G/C x4)]. Door deze verlaging in temperatuur, binden de primers aan hun complementaire sequentie op het enkelstrengig DNA. In de laatste stap, de elongatiestap, wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot 72°C zodat het Taq polymerase een nieuwe DNA streng, complementair aan de template streng, kan synthetiseren. Er zijn 2 PCR programma’s die gebruikt kunnen worden: een algemeen programma en een touchdown programma. Een vergelijking tussen de beide programma’s kan terug gevonden worden in onderstaande tabel. Tabel 4. PCR programma’s Algemeen
Touchdown
95°C (5min)
94°C (2min)
95°C (30sec), Ta (30sec), 72°C (30sec) : 35x
94°C (20sec), Ta (15sec) - 1°C per cyclus, 72°C (1min) : 12x
72°C (10min)
94°C (40sec), Ta-12 (40sec), 72°C (30sec) : 24x
15°C (10min)
72°C (10min) 15°C (10min)
6.2 PCR mix Er wordt gebruik gemaakt van een standaard PCR mix, weergegeven in onderstaande tabel. De mix bevat dNTP’s, Buffer Kappa, MgCl2 Kappa, Forward Primer (FWD), Reverse Primer (REV), Kappa Taq, DNA en H2O in een eindvolume van 15 µl.
20
Tabel 5. PCR Standaardmix Reagens
Concentratie
Hoeveelheid (µl)
Eindconcentratie
dNTPs
1 mM
3
200 µM
Buffer Kappa
5X
3
1X
MgCl2 Kappa
25 mM
0,9
1,5 mM
Forward Primer
50 µM
0,3
1 µM
Reverse Primer
50 µM
0,3
1 µM
Kappa Taq
5 U/µl
0,0072
0,36 U
DNA
25 ng/µl
2
50 ng
H2O
-
5,43
-
Er wordt steeds een negatieve controle mee geanalyseerd. Deze negatieve controle kent dezelfde samenstelling als de te analyseren stalen, maar er wordt 2 µl H2O toegevoegd in de plaats van het DNA. 6.3 PCR primers Voor bepaalde SNPs waren de protocols, en de primers, reeds geoptimaliseerd en beschikbaar op de dienst Medische Fysica van de Universiteit Gent. Voor de overige SNPs, moesten de protocols nog geoptimaliseerd worden en dus de primers ontworpen worden. Deze primers moeten aan enkele eisen voldoen. Zo is de ideale primerlengte ongeveer 20 nucleotiden lang en bevatten de primers best niet veel herhalingen van eenzelfde nucleotide om lusvormingen te vermijden. Een DNA fragment van ongeveer 600 nucleotiden is ideaal voor een PCR gevolgd door RFLP. Voor HRM is de lengte van het geamplificeerd fragment best tussen 80 en 200 nucleotiden. De forward primer begint en de reverse primer eindigt preferentieel met een G of C. De Tm van de forward en reverse primer ligt best zo dicht mogelijk bij elkaar. De sequentie van het gen waarin de SNP zich bevindt, kan worden opgezocht via Ensembl [56] of NCBI [57]. De locatie van de SNP in deze sequentie kan teruggevonden worden via zijn specifieke rs code. Wanneer de primers gekozen zijn, kunnen deze getest worden via In Silico PCR. Dit programma kan online terug gevonden worden (UCSC Genome Bioinformatics [58]). Voor PCR gevolgd door RFLP worden de geleverde primers gebracht op een concentratie van 250 µM door een bepaalde hoeveelheid TE buffer toe te voegen. Vervolgens wordt een
21
werkoplossing gemaakt van 50 µM door de stockoplossing 5x te verdunnen. Voor HRM wordt een stockoplossing gemaakt van 100 µM en wordt deze 20x verdund naar een werkoplossing van 5 µM.
6.4 PCR controle Om na te gaan of de PCR reactie juist is doorgegaan, wordt deze gecontroleerd op een agarose gel. Deze gel wordt gemaakt door 1,5 g agarose toe te voegen aan 100 ml buffer en vervolgens te laten opkoken in de microgolf tot de oplossing volledig doorzichtig is. De oplossing wordt uitgegoten in een houder met kammetjes, die de lanen zullen vormen. Van zodra de gel is afgekoeld en opgesteven, worden de stalen geladen op de gel. In de eerste laan wordt 1 µl DNA ladder geladen, in de overige lanen worden de stalen en de negatieve controle geladen door een mix van 2 µl staal, 1 µl ladingsbuffer en 8 µl H2O in de laantjes op de gel te brengen. Het elektroforesetoestel wordt ingesteld op 135V voor 25 minuten en na afloop wordt de gel gekleurd met Ethidiumbromide (EtBr) gedurende 30 minuten. Om het resultaat te bekijken wordt de gel onder een UV-lamp geplaatst. Aan de hand van de ladder kan bepaald worden of de PCR reactie juist doorgegaan is. Aan de hand van de negatieve controle kan bepaald worden of er al dan niet contaminatie opgetreden is. 7. SNP bepaling De SNP bepaling gebeurt via PCR-RFLP, via HRM of via spike-in HRM. 7.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) RFLP is gebaseerd op het fragmenteren van de DNA streng doordat een restrictie enzym een specifieke DNA sequentie herkent en deze knipt. Het restrictie enzym wordt geselecteerd zodat afhankelijk van het genotype, al dan niet meer of minder geknipt wordt. Selectie van het restrictie enzym gebeurt in silico via RestrictionMapper [59]. Voor RFLP wordt er standaard gewerkt in een eindvolume van 30 µl. De hoeveelheid restrictie enzym en PCR product dat moet worden toegevoegd, wordt bepaald in de optimalisatie. De buffer die wordt toegevoegd is afhankelijk van het enzym en bedraagt steeds 10% van het eindvolume. Eveneens afhankelijk van het enzym, is of al dan niet Bovine Serum Albumine (BSA) moet worden toegevoegd. Indien dit het geval is, is de hoeveelheid BSA steeds 10% van de hoeveelheid buffer dat toegevoegd is. Dit alles wordt aangelengd met H2O tot een eindvolume van 30 µl. Hierna worden de epjes gevortext en gecentrifugeerd en gedurende een bepaalde periode, dat vastgelegd is tijdens de optimalisatie, geïncubeerd in een warmwaterbad op een specifieke
22
temperatuur, afhankelijk van het gebruikte enzym. Na deze incubatie is het DNA geknipt in verschillende fragmenten door het restrictie enzym en kan dit geanalyseerd worden met behulp van gelelektroforese. Hiervoor wordt een 2% agarose gel gemaakt door 2 g agarose in 100 ml buffer op te lossen. Opnieuw wordt eerst 1 µl ladder geladen en om te kijken of het PCR product effectief geknipt werd, wordt ongeknipt product op de gel geladen (1 µl ladingsbuffer + 2 µl ongeknipt PCR product + 8 µl H2O). In de overige lanen wordt 20 µl digest product + ladingsbuffer (10% van het eindvolume) op de gel geladen. Het elektroforesetoestel wordt ingesteld op 135V gedurende 30 min. Opnieuw wordt de gel gekleurd gedurende 30 minuten met EtBr en het resultaat bekeken onder een UV-lamp.
7.2 High Resolution Melting (HRM) HRM is een high-troughput methode gebaseerd op PCR smeltcurves. De PCR reactie zorgt ervoor dat de regio van interesse geamplificeerd wordt in aanwezigheid van een kleurstof die bindt op het dubbelstrengige DNA. Op dit moment is de kleurstof sterk fluorescerend. Vervolgens wordt de temperatuur opgedreven zodat het dubbelstrengige DNA denatureert. Door dit proces wordt de kleurstof losgelaten en daalt de fluorescentie. Dit hele verloop wordt in real time geregistreerd en kent als resultaat een karakteristieke smeltcurve, dat afhankelijk is van verschillende factoren zoals de GC-inhoud, de lengte, de sequentie en de heterozygositeit. Er wordt standaard gewerkt in een eindvolume van 20 µl. Een standaard PCR-HRM mix wordt weergegeven in onderstaande tabel. Tabel 6. Standaard PCR-HRM mix Reagens
Concentratie
Hoeveelheid (µl)
dNTP mix
10 mM
0,4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
Forward primer
5 µM
1,2
23
Vervolg tabel 6. Standaard PCR-HRM mix Reagens
Concentratie
Hoeveelheid (µl)
Reverse primer
5 µM
1,2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM Dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11,95
Bepaalde moeilijkheden zoals een hoge GC inhoud of een moeilijke SNP (klasse 3 of 4) kunnen ervoor zorgen dat de genotypes moeilijker onderscheiden kunnen worden. Wanneer een sequentie een hoge GC inhoud heeft, kan dit probleem verholpen worden door de MgCl2 concentratie op te drijven en al dan niet GC-enhancer toe te voegen. In het geval van een klasse 3 of 4 SNP, waarbij de homozygoten niet goed van elkaar onderscheiden kunnen worden op de smeltcurve, kan er gewerkt worden via vorming van heteroduplexen om ze op deze manier wel te kunnen onderscheiden. Hiervoor worden twee HRM’s uitgevoerd. Op basis van de eerste HRM kan een onderscheid gemaakt worden tussen de heterozygoten en de homozygoten. In een tweede HRM, waarbij de heterozygoten buiten beschouwing gelaten worden, wordt aan de PCR-HRM mix 1 µl spike-in DNA meer en 1 µl H2O minder toegevoegd. Het spike-in DNA is DNA waarvan men weet dat deze homozygoot normaal is voor de SNP. Dit DNA vormt heteroduplexen met het DNA van de homozygoot varianten, waardoor deze een afwijkende vorm vertonen op de smeltcurve. Op deze manier zijn de homozygoten van elkaar te onderscheiden op de smeltcurve. De HRM smeltcurve wordt bekomen door het uizetten van de fluorescentie (%) in functie van de temperatuur (°C). Typisch worden er 3 soorten smeltcurven gevormd: 2 die eenzelfde verloop en vorm hebben maar door een verschil in smelttemperatuur een verschuiving vertonen ten opzichte van elkaar (de homozygoten) en 1 die een andere vorm en verloop kent in vergelijking met de homozygoten (de heterozygoten). Een voorbeeld van zo’n HRM-grafiek wordt weergegeven in figuur 6.
24
Figuur 6. SNP bepaling SMC1B
7.3 Geoptimaliseerde protocols Een overzicht van de protocols die reeds geoptimaliseerd waren binnen de onderzoeksgroep wordt weergegeven in onderstaande tabel. De protocols kunnen terug gevonden worden in bijlage. De SNP in KRAS werd bepaald aan de hand van 2 methoden: HRM en PCR-RFLP. De stalen die niet duidelijk waren via HRM, werden gegenotypeerd aan de hand van PCRRFLP. Tabel 7. Geoptimaliseerde SNPs SNP
Gebruikte methode
Drosha rs639174 (G>A) Drosha rs3805500 (T>C)
PCR-RFLP PCR-RFLP
Drosha rs10520985 (C>T) KRAS rs61764370 (T>G)
HRM PCR-RFLP & HRM
8. Linkage Analyse Om na te gaan of en hoe sterk bepaalde SNPs met elkaar gelinkt zijn werd een analyse uitgevoerd met Haploview waarbij sequentie-informatie vanuit HapMap wordt opgeladen. Indien twee SNPs een r² hebben hoger dan 0.8 dan wordt slechts één van beide SNPs onderzocht. 9. Kwaliteitscontroles Vijftien procent van alle bepalingen wordt opnieuw gedaan om te controleren of de genotypes juist bepaald zijn. Indien dit niet het geval is, wordt de reeks opnieuw uitgevoerd.
25
10. HPV status bepaling Drie verschillende technieken om HPV infectie aan te tonen zijn beschikbaar: Chromogenic In Situ Hybridisatie, Immunohistochemie en Polymerase Chain Reaction. 10.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) Om na te gaan of er een infectie met HPV aanwezig is, kan gebruik gemaakt worden van de PCR. Deze PCR wordt gerund met GP5+ en GP6+ primers, die een breed spectrum HPV types amplificeren. De GP6+ primer is gekoppeld aan biotine, dat nodig is wanneer men een typering wenst uit te voeren via ELISA. Indien een infectie met HPV aanwezig is, wordt een fragment van ongeveer 150 bp geamplificeerd. De HPV status bepaling via PCR werd uitgevoerd op de dienst Pathologie van het AZ Maastricht. Details van de primers en het gebruikte PCR programma worden in tabel 8 en tabel 9 weergegeven. Tabel 8. Details PCR primers GP5+
5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’
GP6+-biotine
5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’
Tabel 9. PCR programma PCR-programma GP5+/GP6+ 94°C : 4min 94°C (4min) – 40°C (2min) – 72°C (1,30 min) : 40x 72°C (4min) 4°C (∞)
10.2.1 DNA isolatie uit tumormateriaal De DNA isolatie uit tumormateriaal (paraffine coupes) is uitgevoerd op de dienst Pathologie van het AZ Maastricht. Dit gebeurt op volledige automatische wijze met het Maxwell 16 toestel. De gebruikte isolatiekit voor deze DNA isolatie is de Maxwell® 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit (Promega). 10.2.2 PCR mix De PCR mix die wordt gemaakt voor de PCR wordt beschreven in onderstaande tabel. Er wordt gewerkt in een eindvolume van 100 µl. Het aantal µl DNA en water (MilliQ) dat moet worden toegevoegd, wordt berekend aan de hand van de concentratie van het DNA, gemeten na fotospectrometrie. De mix wordt steeds in duplo gemaakt en er worden steeds twee
26
positieve controles (een high risk en een low risk), een negatieve controle (DNA geïsoleerd uit een tonsil, zonder HPV infectie) en een blanco controle (water, bevat geen DNA) mee geanalyseerd. Details van de PCR mix worden weergegeven in tabel 10. Tabel 10. PCR mix Concentratie stockoplossing
Absolute hoeveelheid
Aantal µl in 100 µl eindvolume per monster
10x PCR reaction buffer
1x
10,0
MgCl2 (25nmol/µl)
2,0 nmol/µl (200nmol)
8,0
dNTPs (25 nmol/µl)
0,4 nmol/µl (40 nmol)
1,6
GP5+ (100 pmol/µl)
1,0 pmol/µl (100 pmol)
1,0
GP6+-biotine (100 pmol/µl)
1,0 pmol/µl (100 pmol)
1,0
JumpStart Red Taq (1U/µl)
0,02 U/µl (2 U)
2,0
Totaalvolume
23,6
10.2.3 PCR controle Om na te gaan of het fragment geamplificeerd is, wordt een agarose gelelectroforese uitgevoerd op een 2% agarose gel. Van zodra de gel opgekookt is in de microgolfoven, wordt SYBR Safe toegevoegd aan de gel, alvorens deze wordt uitgegoten in een houder met kammetjes. Van zodra de gel afgekoeld en opgesteven is, worden de stalen op de gel geladen: 10 µl van elk PCR product, gevolgd door de positieve en negatieve controles. De ladder wordt steeds in het midden van de gel geladen. Het elektroforese toestel wordt ingesteld op 130V gedurende 18min. Na deze stap zijn de stalen aangekleurd en kan het resultaat direct via de computer afgebeeld worden. Aan de hand van de ladder kan bepaald worden of een bandje gevormd is rond 150 bp. Indien dit zo is, wordt de staal als HPV positief beschouwd. HPV positieve stalen worden getypeerd via ELISA (zie 10.2.4). 10.2.4 ELISA Wanneer na PCR een staal als positief beschouwd wordt, kan een typering via ELISA uitgevoerd worden, om het juiste HPV type te bepalen. Hiervoor wordt gewerkt met 3 verschillende probe(mixen): een probe voor HPV type 16, een high risk probemix (HPV type 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 en 68) en een low risk probemix (HPV type 6, 11, 40 en 42).
27
10.3 Chromogenic In Sity Hybridisatie Bij Chromogenic In Situ Hybridisatie (CISH) wordt gebruik gemaakt van een gelabelde probe (een complementaire DNA sequentie) om een specifieke DNA sequentie in een weefsel aan te tonen. Hierbij maakt het gebruik van peroxidase of alkaline fosfatase reacties, die gezien kunnen worden onder een standaard microscoop. De CISH techniek wordt toegepast op paraffine coupes [60]. De HPV status bepaling aan de hand van deze techniek werd uitgevoerd op de dienst Pathologie van het UZ Gent en de data werden ter beschikking gesteld aan de dienst Medische Fysica van de Universiteit Gent. 10.4 p16-Immunohistochemie Immunohistochemie (IHC) maakt gebruik van antilichamen (AL) die specifieke antigenen herkennen en binden. In dit geval is het AL gericht tegen p16 INK4a, dat betrokken is in de celcyclus. In de klinische praktijk correleert p16 met HPV infectie. De p16-IHC kleuring gebeurt op volledig automatische wijze op de dienst Pathologie van het AZ Maastricht. De aankleuring is nucleair en cytoplasmatisch. De techniek wordt eveneens toegepast op paraffine coupes. De gegevens van het AL en de condities van de kleuring worden weergegeven in onderstaande tabellen. Tabel 11. Gegevens antilichaam p16-IHC Naam Fabrikant Art. Nr.
p16 Santa Cruz sc-56330
Isotype Clone Clonaliteit
IgG22a JC8 Monoclonaal
Tabel 12. Condities p16-IHC kleuring Endogeen peroxidase Antigen retrieval Blocking Verdunning Incubatie primair AL Secundaire detectie Substraat Tegenkleuring Controle weefsel
Envision FLEX peroxidase blocking reagent (Dako) (5 min.) FLEX TRS High (Dako) Nvt 1:400 Kamertemperatuur (20 min.) Envision FLEX (20 min.) + Mouse Linker (Dako) (15 min.) Liquid DAB+ (Dako) Gill II hematoxiline Positieve tumor
De bepaling van de HPV status aan de hand van de p16-IHC kleuring voor de stalen uit Gent werd uitgevoerd op de dienst Pathologie van het UZ Gent, waarna de gegevens ter beschikking gesteld werden aan de dienst Medische Fysica van de Universiteit Gent.
28
11. Statistische analyse De verschillende eindpunten die in dit eindwerk onderzocht worden zijn Overall Survival (OS), Disease Free Survival (DFS) en Disease Specific Survival (DSS). OS en DSS worden beiden gedefinieerd als het verschil in tijd tussen de diagnose en sterfte of laatste follow-up. Bij OS wordt geen rekening gehouden met de reden van de doodsoorzaak. Dit wordt wel gedaan bij de DSS, waarbij enkel sterfte ten gevolge van kanker progressie of ziekte gerelateerde oorzaak wordt beschouwd. De DFS wordt gedefinieerd als de kans om vrij te blijven van ziekte na een bepaalde behandeling voor een groep van individuen die aan kanker lijden. De DFS geeft op deze manier aan hoe effectief een bepaalde behandeling is. Tijd tot herval wordt berekend uitgaande van het einde van radiotherapie tot de laatste follow-up of optreden van herval (lokaal, regionaal, op afstand). Vervolgens worden deze eindpunten geassocieerd met verschillende factoren, zoals geslacht, rookgedrag en alcoholgebruik maar ook met de SNPs in de microRNA genen en de tumor HPV status. Er wordt gewerkt met het programma SPSS versie 20. Voor associatie van verschillende factoren (patiënt-gerelateerde, klinische en microRNA SNPs) met overleving (OS, DFS en DSS) wordt gebruik gemaakt van de univariate Kaplan-Meier analyse. Associatie van diezelfde factoren met de tumor HPV status, wordt uitgevoerd met behulp van de Chi-square analyse. Associatie van de leeftijd wordt geanalyseerd aan de hand van de Mann-Whitney test. De associatie tussen tumor HPV status en microRNA SNPs wordt geanalyseerd aan de hand van logistieke regressie. Een resultaat wordt als statistisch significant beschouwd wanneer de p-waarde kleiner of gelijk is aan 0,05.
29
Resultaten Aanvankelijk werd deze studie opgestart met een groep orofaryngeale kankerpatiënten behandeld met (chemo)radiotherapie in het UZ Gent of in het AZ Maastricht. Uiteindelijk werd uit deze grote groep patiënten slechts een kleine groep patiënten overgehouden. Doordat de follow-up data van de patiënten behandeld in het AZ Maastricht te laat ter beschikking gesteld werd, werd besloten om enkel verder te werken met de patiënten behandeld in het UZ Gent. Enkel patiënten die een curatieve (chemo)radiotherapie behandeling ondergingen voor een primaire orofarynx tumor werden in beschouwing genomen. 1. Optimalisatie protocols De protocols voor de SNP bepalingen in Drosha rs639174 G>A, rs10520985 C>T, rs3805500 T>C en in KRAS rs61764370 T>G werden reeds geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep en zijn terug te vinden in bijlage. Voor de overige 5 SNPs werd de genotypering geoptimaliseerd binnen deze studie. Voor één SNP (XPO5 rs2227301 G>A) gebeurde deze genotypering aan de hand van de PCR-RFLP reactie. Voor de overige SNPs (XPO5 rs699937 C>T, SMC1B rs3747238 A>G, Drosha rs17410035 C>A, pre-microRNA146a rs2910164 G>C en pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T) werd het genotype bepaald met behulp van HRM. 1.1 XPO5 rs2227301 G>A De PCR reactie werd geoptimaliseerd door het zoeken naar geschikte primers. Deze primers worden beschreven in onderstaande tabel (tabel 13). Er werd gebruik gemaakt van een standaard PCR mix die getest werd met het algemeen PCR programma (56°C) en het touchdown PCR programma (58°C). Na beide programma’s werd als resultaat een bandje terug gevonden op 542bp, wat verwacht wordt na amplificatie met deze primers. Beide programma’s kunnen gebruikt worden voor de PCR reactie. Tabel 13. Details optimalisatie primers XPO5 rs2227301 G>A Primernummer
Primersequentie (5’-3’)
Primerlengte
Tm
F. primer 446
TATATCCTGAACTTCACTGAC
21 nt
58 °C
R. primer 447
CACTGTCCCTTCGTGGAC
18 nt
58 °C
Fragmentlengte 542 nt
Vervolgens werd gezocht naar een geschikt restrictie enzym via RestrictionMapper. Er werd
30
gekozen voor het BsrI enzym. Dit enzym knipt 1x wanneer het homozygoot normale genotype (GG) aanwezig is zodat 2 fragmenten gevormd worden met een grootte van 265 en 277 bp. In aanwezigheid van het variante genotype (AA) blijft het fragment ongeknipt met een grootte van 542 bp. Wanneer een individu drager is van het heterozygote type (GA) worden er fragmenten gevormd van 265, 277 en 542 bp. De digestmix wordt gemaakt met 2U van het restrictie enzym en gedurende 3 uur geïncubeerd op de optimale incubatietemperatuur van BsrI (65°C). Het aantal units nodig van het restrictie enzym en het aantal uur incubatie werd reeds geoptimaliseerd voor een ander protocol met hetzelfde restrictie enzym binnen de onderzoeksgroep. Na afloop wordt
het
resultaat
gecontroleerd met
behulp
van
gelelektroforese. De drie verschillende genotypes kunnen duidelijk op de gel onderscheiden worden. Het protocol voor deze SNP kan in bijlage B terug gevonden worden. 1.2 XPO5 rs699937 C>T De genotypering van deze SNP werd geoptimaliseerd aan de hand van HRM. Voor de optimalisatie werd gebruik gemaakt van 2 standaard HRM mixen, met elk een andere forward primer maar eenzelfde reverse primer. Er wordt steeds gewerkt met een standaard HRM mix. De verschillende mixen met hun primers staan beschreven in onderstaande tabel. Tabel 14. Details primers optimalisatie XPO5 rs699937 C>T Mix 1 2
Primernr. F.primer 448 R.primer 450 F.primer 449 R.primer 450
Primersequentie (5’-3’) TTCTTCAGTTTCTTCATCCATG ACAGTGCCTAATCAGAGATTC CCATTTAGCCAATACTTACTGA ACAGTGCCTAATCAGAGATTC
Primerlengte 22 nt 21 nt 22 nt 21 nt
Tm 60 °C 60 °C 60 °C 60 °C
Fragmentlengte 170 nt 105 nt
Het standaard HRM programma werd ingesteld (Ta = 60°C). Voor de optimalisatie worden 6 stalen per mix met gekend genotype geanalyseerd met de HRM. Na afloop van de HRM reactie kon gezien worden dat met behulp van de eerste mix de verschillende genotypes het best van elkaar gescheiden kunnen worden. Het protocol voor deze SNP kan in bijlage terug gevonden worden. 1.3 SMC1B rs3747238 A>G Voor de optimalisatie van deze SNP werd eveneens gekozen voor een HRM reactie in plaats van een PCR-RFLP reactie. Dit omdat geen geschikt restrictie enzym gevonden kon worden. Ook hier werd gebruik gemaakt van 2 standaard HRM mixen, beschreven in onderstaande tabel.
31
Tabel 15. Details primers optimalisatie SMC1B rs3747238 A>G Mix 1 2
Primernr. F.primer 451 R.primer 452 F. primer 451 R.primer 454
Primersequentie (5’-3’) ATCTTCACTCTGATCTTGCC CAATACTAACATAGTTTCTCTG ATCTTCACTCTGATCTTGCC GTTCAACAGTTTATTAACAATC
Primerlengte 20 nt 22 nt 20 nt 22 nt
Tm Fragmentlengte 58°C 142 nt 58°C 58°C 100 nt 56°C
Voor de optimalisatie van deze SNP werd eerst gestart met een standaard HRM programma op een Ta = 58°C. Gezien op basis van deze HRM reactie de verschillende genotypes niet van elkaar onderscheiden konden worden, werd de HRM reactie herhaald met een Ta = 60°C. Dit resultaat was echter nog slechter dan de eerste HRM, waardoor gekozen werd om de HRM nog eens te herhalen maar om nu te dalen in temperatuur (Ta = 56°C). Ook dit gaf een slecht resultaat. Een nieuw optimalisatie experiment werd opgesteld waarbij gewerkt met 3 mixen met een stijgende hoeveelheid MgCl2. Mix 1 bevatte 1,4 µl MgCl2 per staal, mix 2 1,6 µl MgCl2 en mix 3 1,8 µl MgCl2. Op basis van de resultaten van de vorige HRM’s, werd besloten om verder te werken met mix 2 (forward primer 451 en reverse primer 454) en met een Ta van 58°C. Uit het resultaat van deze optimalisatie kon afgeleid worden dat de mix met het hoogste gehalte aan MgCl2 (1,8 µl) het beste resultaat gaf. Dit protocol kan terug gevonden worden in bijlage C. 1.4 Drosha rs17410035 C>A Ook voor deze SNP werd gekozen voor een genotypering aan de hand van HRM. Voor de optimalisatie werd gewerkt met 2 standaard HRM mixen met eenzelfde forward primer, maar een verschillende reverse primer. Er werd eveneens gebruik gemaakt van een standaard HRM programma (Ta = 60°C). Na afloop van de HRM reactie kon gezien worden dat met behulp van de 2e mix een betere scheiding tussen de verschillende genotypes bekomen werd. Het protocol kan terug gevonden worden in bijlage C. Tabel 16. Details primers optimalisatie Drosha rs17410035 C>A Mix 1 2
Primernr. F. primer 420 R. primer 421 F. primer 420 R. primer 422
Primersequentie (5’-3’) ATCACTGTGGTAATTTGCAAG AAATCTTACAAGAGCTGTACC ATCACTGTGGTAATTTGCAAG TGGCACCAACCTAACAGAG
Primerlengte 21 nt 21 nt 21 nt 19 nt
Tm Fragmentlengte 58°C 130nt 58°C 58°C 96 nt 58°C
32
1.5 Pre-microRNA146a rs2910164 G>C De HRM voor deze SNP werd geoptimaliseerd door een medestudent. Na optimalisatie bleek dat deze HRM echter geen onderscheid kon maken tussen de homozygoot varianten en de wildtypes. Op basis hiervan, werd gekozen om deze SNP te genotyperen met behulp van spike-in HRM. Allereerst wordt een standaard HRM uitgevoerd waaruit 2 groepen afgeleid kunnen worden: de heterozygoten en de homozygoten (varianten en wildtypes). Na afzonderen van de heterozygoten, wordt een tweede HRM uitgevoerd met 1 µl spike-in DNA, zodat heteroduplexen gevormd worden. Na deze HRM kunnen de homozygoot varianten en wildtypes van elkaar onderscheiden worden. Het protocol voor deze HRM kan in bijlage C terug gevonden worden. 1.6 Pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T Voor de optimalisatie van deze SNP werd gebruik gemaakt van twee mixen zoals beschreven in onderstaande tabel. Met behulp van de standaard HRM mix (Ta = 60°C) werd deze HRM geoptimaliseerd. Hierbij vertoonde de HRM met mix 2 een beter resultaat. Het protocol kan in bijlage C terug gevonden worden.
Tabel 17. Details primers optimalisatie pre-microRNA196a2 rs11614913 C>T Mix 1 2
Primernr. F. primer 410 R. primer 412 F. primer 411 R. primer 412
Primersequentie (5’-3’) CAGCTGATCTGTGGCTTAG AACCGACTGATGTAACTCAG AGATGCAAAGCTGAATCTCC AACCGACTGATGTAACTCAG
Primerlengte 19 nt 20 nt 20 nt 20 nt
Tm Fragmentlengte 58°C 90 nt 58°C 58°C 123 nt 58°C
2. Patiënt karakteristieken
De gemiddelde leeftijd van de 72 orofaryngeale kanker patiënten opgenomen in deze studie is 58,7 jaar (± 9,3 jaar). 77% van deze groep patiënten is mannelijk, 90% is of was gebruiker van tabak en 93% consumeert of consumeerde alcohol. Het aantal pack-years wordt berekend door de volgende formule: (aantal sigaretten gerookt per dag x het aantal jaren gerookt)/20. De 2-jaar OS, DFS en DSS bedragen respectievelijk 73,6%, 63,9% en 85,9%. De 3-jaar OS, DFS en DSS bedragen 68,1%, 59,7% en 82,8% respectievelijk. De overige karakteristieken worden weergegeven in onderstaande tabel.
33
Tabel 18. Patiënt karakteristieken Variabele Geslacht Man Vrouw
Aantal
%
56 16
77,8% 22,2%
Type roken Current/Former Never
65 7
90,3% 9,7%
Pack-years ≤ 10 PY > 10 PY Niet gekend
15 56 1
20,8% 77,8% 1,4%
Type alcoholgebruik Current/Former Never
67 5
93,0% 7,0%
Drinks/week < 10 dranken/week ≥ 10 dranken/week
25 47
34,7% 65,3%
Subsite Tonsil Andere Niet gekend
33 36 3
46,0% 50,0% 4,0 %
T-stage 1-2-3 4
56 16
77,8% 22,2%
N-stage 0 1-2-3
13 59
18,0% 82,0%
3. Associatie met overleving (OS, DFS, DSS) Tot survival behoort OS (overall survival, dood door eender welke oorzaak), DSS (disease specific survival, dood door kanker progressie of ziekte gerelateerde dood) en DFS (disease free survival, dood of herval of metastase). 3.1 Univariate Kaplan-Meier analyse van patiënt-gerelateerde en klinische factoren met overleving. Verschillende klinische factoren worden geanalyseerd en geassocieerd met OS, DSS en DFS. De resultaten van deze analyse kunnen terug gevonden worden in onderstaande tabel.
34
Het aantal drinks/week en T-stage van de tumor vertonen een significante associatie met overleving. Het aantal drinks/week (< 10 drinks/week vs. ≥ 10 drinks/week) vertoonde een significante associatie met OS, DSS en DFS (p-waarden 0,051, 0,019 en 0,010 respectievelijk). Orofaryngeale kankerpatiënten die minder dan 10 drinks/week nuttigden, vertoonden een betere OS, DSS en DFS in vergelijking met patiënten die 10 of meer drinks/ week nuttigden. Voor de T-stage kon een significante associatie aangetoond worden met OS en DFS (p-waarden 0,019 en 0,047 respectievelijk). Patiënten met een T4 tumor vertoonden een slechtere OS en DFS in vergelijking met patiënten met een T1/2/3 tumor. Deze associaties kunnen terug gevonden worden in figuur 7 en figuur 8. Enkele klinische factoren vertonen een ‘borderline’ significante associatie met survival. Dit geldt voor associatie van N-stage (N0 vs. N1/2/3) met DSS (p-waarde = 0,094), chemotherapie met OS (p-waarde = 0,074), type radiotherapie (3DRT vs. IMRT) met OS en DFS (p-waarden = 0,097 en 0,092 respectievelijk) en HPV p16-IHC status met DFS (p-waarde = 0,086). Tabel 19. Associatie van patiënt-gerelateerde en klinische factoren met overleving Variabele
Aantal
Sterfte (eender welke oorzaak)
p
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)*
p
Sterfte, herval of metastase
p
Geslacht m v
56 16
26 6
0,610
11 1
0,362
30 7
0,829
Type roken current/former never
65 7
30 2
0,212
11 1
0,525
35 2
0,169
Packyears ≤ 10 PY > 10 PY
15 56
5 27
0,209
2 10
0,440
5 32
0,103
Type alcoholgebruik current/former never
67 5
30 2
0,893
12 0
0,370
35 2
0,896
35
Vervolg tabel 19. Associatie van patiënt-gerelateerde en klinische factoren met overleving Variabele
Aantal
Sterfte (eender welke oorzaak)
Drinks/week < 10 drinks/week ≥ 10 drinks/week
25 47
8 24
0,051
1 11
0,019
8 29
0,010
T-stage T4 T1-2-3
16 56
9 23
0,019
3 9
0,244
6 27
0,047
N-stage N0 N1-2-3
13 59
5 27
0,235
0 12
0,094
5 32
0,155
Chemotherapie Ja Nee
42 30
21 11
0,074
9 3
0,225
23 14
0,272
Heelkunde Ja Nee
21 51
11 21
0,395
4 8
0,944
12 25
0,479
Halsevidement Ja Nee
47 25
22 10
0,420
10 2
0,294
24 13
0,240
Type radiotherapie 3DRT IMRT
15 57
8 24
0,097
1 11
0,218
8 29
0,092
14 55 19
4 27 6
0,235
2 10 3
0,370
4 32 13
0,110
48
24
HPV status - CISH Positief Negatief HPV status - p16IHC Postitief Negatief
p
0,250
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)*
2
p
0,472
Sterfte, herval of metastase
p
0,086
29
*Totaal aantal patiënten voor analyse naar DSS toe bedroeg in totaal 64 patiënten. De resultaten in bovenstaande tabel werden bekomen aan de hand van de Kaplan-Meier analyse.
36
A
B
C Figuur 7. Associatie tussen aantal drinks/week (< 10 drinks/week vs. ≥ 10 drinks/week) en OS (A), DSS (B) en DFS (C)
A
B
Figuur 8. Associatie tussen T-stage (T4 vs. T1/2/3) en OS (A) en DFS (B)
3.2 Univariate Kaplan-Meier analyse van associatie tussen miRNA genotypes en overleving De resultaten na univariate analyse met Kaplan-Meier worden weergegeven in tabel 20. Wegens het lage aantal patiënten worden enkel de resultaten van het dominante model weergegeven. Er werden geen statistisch significante associaties gevonden tussen een SNP in
37
een microRNA gen en overleving. Voor de SNP in het SMC1B gen en associatie met DSS kon geen statistische analyse uitgevoerd worden, aangezien in de homozygoot normale groep, geen enkele patiënt gestorven is ten gevolge van kanker progressie of de ziekte. Volgens het recessieve model werd een statistisch significante associatie gevonden tussen een SNP in Drosha (rs3805500 (T>C)) en survival (OS en DFS). Orofaryngeale kanker patiënten die drager zijn van het TT/TC genotype vertonen een betere OS en DFS in vergelijking met dragers van het homozygoot variante genotype (CC). Zo bedraagt de 3j-OS voor patiënten die drager zijn van het TT/TC genotype 69,6%, terwijl dit voor dragers van het CC genotype nog slechts 22,2% bedraagt. Na correctie voor multiple testing met de Bonferroni correctie, bleef dit resultaat statistisch significant. Alle SNPs zijn in Hardy-Weinberg equilibrium. De resultaten worden weergegeven in tabel 21 en figuur 9. De tabel met de overige resultaten van de univariate Kaplan-Meier analyse volgens het recessieve model kunnen terug gevonden worden in bijlage E. Tabel 20. Associatie miRNA genotypes en overleving volgens het dominant model miRNA genotypes
Totaal aantal patiënten
Sterfte (eender welke oorzaak)
p
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)**
p
Sterfte, herval of metastase
p
GG
48
19
1*
8
1
22
1
GA+AA
22
12
0,311
3
0,972
14
0,284
CC
23
10
1
3
1
12
1
CT+TT
45
21
0,831
8
0,928
23
0,909
TT
31
13
1
3
1
16
1
TC+CC
39
18
0,180
8
0,303
20
0,350
CC
31
15
1
7
1
15
1
CA+AA
31
15
0,917
3
0,217
18
0,518
Drosha rs639174
rs10520985
rs3805500
rs17410035
38
Vervolg tabel 20. Associatie miRNA genotypes en overleving volgens het dominant model miRNA genotypes
Totaal aantal patiënten
Sterfte (eender welke oorzaak)
p
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)**
p
Sterfte, herval of metastase
p
41 29
21 10
1 0,293
5 6
1 0,491
24 12
1 0,450
29 41
14 17
1 0,373
3 8
1 0,441
16 20
1 0,609
GG GC+CC 196a2 rs11614913
36 33
15 15
1 0,444
6 5
1 0,998
17 18
1 0,463
CC CT+TT
26 44
13 18
1 0,756
5 6
1 0,476
15 21
1 0,977
17 55
7 25
1 0,546
0 12
/ /
9 28
1 0,369
56 14
25 6
1 0,088
10 1
1 0,350
29 7
1 0,129
XPO5 rs2227301 GG GA+AA rs699937 CC CT+TT pre-microRNA 146a rs2910164
SMC1B rs3747238 AA AG+GG KRAS rs61764370 TT TG+GG
* 1 wordt gebruikt als referentie. De resultaten uit bovenstaande tabel werden gevonden via Kaplan-Meier analyse. / ** Totaal aantal patiënten voor analyse naar DSS toe bedroeg in totaal 64 patiënten.
39
Tabel 21. Associatie tussen Drosha rs3805500 (T>C) met overleving volgens recessief model
Sterfte (eender welke oorzaak)
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)*
Totaal miRNA aantal Sterfte, herval of genotypes patiënten p p metastase p Drosha rs3805500 TT+TC 64 27 0,003 10 0,435 32 0,050 CC 6 4 1 4 Deze resultaten werden gevonden na analyse via Kaplan-Meier. / *Totaal aantal patiënten voor analyse naar DSS toe bedroeg in totaal 64 patiënten.
Figuur 9. Associatie Drosha rs3805500 (T>C) met OS
4. Associatie met tumor HPV status
Hierbij worden de patiënten ingedeeld in twee groepen naargelang de tumor HPV status (HPV+ vs. HPV-). De tumor HPV status wordt hierbij geassocieerd met de patiëntgerelateerde en klinische factoren enerzijds en met de microRNA SNPs anderzijds. 4.1 Associatie van tumor HPV status met patiënt-gerelateerde en klinische factoren Wanneer de patiënten ingedeeld worden in twee verschillende groepen naargelang de tumor HPV status (HPV+ vs. HPV-) en geassocieerd worden met verschillende klinische factoren, komen hier enkele factoren uit als statistisch significant. Rookgedrag (aantal pakjaren, p < 0,001), type drinken (p = 0,001), alcohol gebruik (aantal dranken/week, p < 0,001) en de 2jaar OS (p = 0,018) kunnen geassocieerd worden met de HPV status (bepaald volgens CISH). Dit wordt weergegeven in onderstaande tabel. Voor de tumor HPV status bepaald met p16IHC kleuring, wordt een significatie associatie gevonden met type roken (p = 0,036), aantal packyears (p < 0,001), type drinken (p = 0,010) en het aantal drinks/week (p < 0,001). HPV+ hebben een verschillend rookgedrag (≤10 PY) en drinkgedrag (<10 drinks/week) in
40
vergelijking met HPV- patiënten. Na 2 jaar zijn alle HPV+ patiënten nog in leven, terwijl dit aantal bij de HPV- patiënten nog slechts 67% bedraagt. Dit wordt weergegeven in tabel 22. Tabel 22. Associatie van patiënt-gerelateerde en klinische factoren met HPV status (CISH, p16-IHC) HPV+ (CISH)
HPV(CISH)
p
HPV+ (p16)
HPV(p16)
0,332
p
Leeftijd Geslacht m v
0,856
12 2
44 11
0,238
18 2
37 11
0,217
Type roken Current/former Never
11 3
52 3
0,058
16 4
46 2
0,036
Roken (PY) ≤10 PY >10 PY
8 6
6 48
< 0,001
10 10
4 43
< 0,001
Type drinken Current/former Never
10 4
54 1
0,001
16 4
47 1
0,010
Drinks/week <10 ≥10
11 3
13 42
< 0,001
14 6
9 39
< 0,001
Subsite tonsil other
9 5
24 28
0,228
12 8
21 24
0,321
T-stage T4 T1-2-3
2 12
14 41
0,377
4 16
12 36
0,658
N-stage N0 N1-2-3
2 12
9 2
0,850
2 18
9 39
0,372
Chemo ja nee
11 3
31 24
0,128
15 5
27 21
0,147
2j-OS 100% 67% 0,018 84,2% 66,7% 0,129 3j-OS 84,6% 60,1% 0,084 73,3% 60,7% 0,248 2j-DSS 100% 78,1% 0,071 89,2% 79;9% 0,363 3j-DSS 91,7% 74,8% 0,169 83,2% 76,1% 0,481 De resultaten in deze grafiek werden bekomen na Chi-Square analyse. Met uitzondering van de OS en DSS, die bekomen werd na Kaplan-Meier analyse.
41
3.4 Associatie van tumor HPV status met microRNA genotypes De associatie van de verschillende microRNA genotypes en tumor HPV status (bepaald door CISH of p16-IHC) werd uitgevoerd aan de hand van logistieke regressie. Deze analyse leverde echter geen statistisch significante resultaten op wegens te lage aantallen in de verschillende groepen. De tabel met resultaten kan terug gevonden worden in bijlage.
5. Bepaling van de tumor HPV status met behulp van CISH en p16-IHC
In deze studie werd de tumor HPV status bepaald aan de hand van 2 technieken: CISH en p16-IHC. De resultaten hiervan worden weergegeven in tabel 23. Na bepaling van de tumor HPV status met behulp van CISH wordt in deze studiepopulatie 20% van de orofaryngeale kankerpatiënten als HPV positief bevonden. Na bepaling van de tumor HPV status met behulp van p16-IHC worden er 30% van de patiënten als HPV positief bevonden. 11% van de HPV negatieven, bepaald volgens CISH, wordt als positief beschouwd na bepaling met p16-IHC. Een derde techniek, PCR, werd eveneens toegepast op de stalen uit Maastricht. De techniek kon niet worden toegepast op de stalen van de patiënten uit Gent wegens gebrek aan tijd. Tabel 23. Resultaten tumor HPV status bepaling volgens CISH en p16-IHC kleuring Techniek
HPV+
HPV-
CISH
14 (20%)
55 (80%)
p16-IHC
20 (30%)
48 (70%)
42
Discussie Vooraleer gestart kon worden met het genotyperen van de patiëntenstalen moesten enkele SNPs geoptimaliseerd worden. Voor 1 SNP (XPO5 rs2227301 G>A) werd gekozen voor een optimalisatie met PCR-RFLP. De PCR optimalisatie verliep vlot. Hoewel er bij controle van de PCR een fractie smeer op de gel waargenomen kon worden, werden er toch duidelijke bandjes, van de verwachtte grootte, gevormd bij de twee verschillende programma’s. De optimalisatie voor RFLP verliep eveneens vlot. Het gebruikte restrictie enzym werd reeds gebruikt voor een andere SNP in een ander protocol. Hetzelfde aantal units en dezelfde incubatietijd werden uitgeprobeerd na de PCR reactie. Bij controle van de RFLP konden de verschillende genotypes duidelijk op gel bepaald worden. Voor de overige 5 SNPs werd gekozen voor een optimalisatie met HRM. De optimalisaties voor XPO5 (rs699937 C>T), Drosha (rs17410035 C>A) en pre-microRNA196a2 (rs11614913 C>T) verliepen vlot. Er werd telkens gebruik gemaakt van 2 standaard HRM mixen, met verschillende primercombinatie, waarbij steeds 1 van de 2 mixen een goed resultaat gaf en gebruikt kon worden. Een mogelijke reden voor de vlotte optimalisaties zou kunnen zijn dat de SNPs (C>T en C>A) respectievelijk behoren tot klasse 1 en klasse 2 SNPs. Deze basenveranderingen leiden tot een grotere verschuiving in smelttemperaturen, waardoor de verschillende genotypes op de smeltcurve makkelijker te onderscheiden zijn, in vergelijking met klasse 3 of 4 SNPs. Voor de optimalisatie van de SMC1B SNP (rs3747238 A>G) moest verschillende keren in temperatuur veranderd worden en de MgCl2 concentratie aangepast worden vooraleer een goede scheiding van de verschillende genotypes bekomen kon worden. De SNP in premicroRNA146a (rs2910164 G>C) werd initieel geoptimaliseerd door een medestudent voor een standaard HRM reactie. Deze standaard HRM reactie kon de verschillende genotypes echter niet van elkaar onderscheiden, waardoor besloten werd om over te gaan op de spike-in HRM techniek. Een groot voordeel verbonden aan deze techniek is dat de homozygoot normalen en varianten goed van elkaar gescheiden worden zodat geen twijfel mogelijk is. Een nadeel verbonden met deze techniek is dat, omwille van het gebruik van spike-in DNA, veel materiaal en consumables vereist zijn. Een tweede aspect van dit eindwerk is de associatiestudie met overleving. In deze studie werd een 2-j OS en 3j-OS gevonden van 73,6% en 68,1% respectievelijk. Deze percentages verschillen licht met wat in de literatuur terug gevonden kan worden. In de studie van Perisanidis et al. werd een 2j-OS terug gevonden van 66% bij patiënten met orofaryngeale kanker die behandeld zijn met preoperatieve chemoradiotherapie [62]. Een andere studie vond
43
een 3j-OS bij orofaryngeale kanker patiënten behandeld met chemoradiotherapie terug van 79,7% [63]. Verschillende patiënt-gerelateerde en klinische factoren werden vervolgens geassocieerd met overleving. Twee statistisch significante associaties werden hierbij gemaakt: het aantal drinks/week en de T-stage. De kleine studiepopulatie groep is een zeer beperkende factor in de analyse van deze factoren met overleving. Associatie van de microRNA SNPs met overleving leverde een statistisch significant resultaat op. Zo vertoonde Drosha rs3805500 T>C een statistisch significante associatie met overleving (OS en DFS). Door de kleine studiepopulatie is het aantal homozygoot varianten dat binnen één SNP teruggevonden wordt steeds zeer laag. Hierdoor verkleint de kans dat een statistisch significant resultaat gevonden kan worden. Het verband tussen SNPs in microRNA biosynthese genen, target genen en pre-microRNA genen en overleving werd tot hiertoe weinig bestudeerd, waardoor voor selectie van de SNPs vooral gebaseerd werd op studies die de relatie tussen deze SNPs onderzochten met het risico op het ontwikkelen van hoofd- en halskanker. Voor de beschouwde SNPs in de pre-microRNA genen (146a en 196a2) en in KRAS zijn er wel studies uitgevoerd naar overleving. Zo werd in de studie van Guan et al. een statistisch significant verband gevonden tussen de SNP in het pre-microRNA146a en premicroRNA196a2 en OS, DFS en DSS [42]. Deze studie kon dit resultaat echter niet bevestigen, waarschijnlijk door de te kleine studiepopulatie. In de studie van Christensen et al. kon een statistisch significante associatie aangetoond worden tussen de SNP in het gen voor KRAS en overleving bij orale kanker patiënten, waarbij dragers van het variante genotype een verminderde overleving vertoonden [53]. Ook dit resultaat kon niet bevestigd worden in deze studie. Voor de associatie van deze SNPs, patiënt-gerelateerde factoren en klinische factoren met de tumor HPV status werd de HPV status bepaald aan de hand van 2 technieken (ISH en p16IHC). Hieruit blijkt dat 20% van de orofaryngeale kanker patiënten als HPV positief beschouwd kunnen worden na bepaling met CISH terwijl dit 30% is na bepaling met p16IHC. In de literatuur wordt eveneens een verschillend aantal HPV positieven gevonden na analyse met de twee verschillende technieken. Zo wordt in de studie van Singhi en Westra een vergelijking gemaakt tussen de resultaten na CISH en p16-IHC. Zij vonden een infectie met HPV terug in 69% van alle hoofd- en halskanker patiënten, bepaald aan de hand van CISH, terwijl dit 76% werd na bepaling met p16-IHC. 24% van alle HPV- (bepaald met CISH) werd positief bevonden na bepaling met p16-IHC [61]. In deze studie worden 11% van de HPV negatieven (bepaald met CISH) positief bevonden na kleuring met p16-IHC. Het aantal HPV
44
positieve patiënten in deze studie ligt lager dan de cijfers die worden gerapporteerd in de literatuur. Een oorzaak hiervoor zou kunnen zijn dat er in deze studie gewerkt is met patiëntenstalen die dateren van voor 2010. Het is immers pas sinds de laatste jaren dat een stijging van het aantal HPV+ patiënten waargenomen wordt, onder meer door een veranderende levensstijl. Een reden voor het verschil in aantal HPV positieven na de twee verschillende technieken, zou kunnen zijn dat CISH gebruik maakt van probes die enkel gericht zijn tegen High Risk (HR) types. Besmetting met een ander HPV type, wordt aan de hand van CISH niet gedetecteerd op deze manier [61]. Een andere verklaring zou kunnen zijn dat IHC p16 detecteert, en dat p16 overexpressie aanwezig kan zijn zonder de aanwezigheid van een HPV infectie [31]. De associaties die gevonden werden met de tumor HPV status, verschilt naargelang de gebruikte techniek. HPV status bepaling aan de hand van de CISH techniek, wordt geassocieerd met de 2j-OS, rookgedrag en drinkgedrag. Patiënten die HPV+ zijn, vertonen in deze studie een betere 2j-OS in vergelijking met HPV- patiënten. Dit is een bevestiging van wat reeds veel onderzocht en bewezen werd in andere studies. In de studie van Guan et al. werd eveneens een significante associatie aangetoond met overleving en rookgedrag. Daarnaast werd in de studie van Guan et al., net zoals in andere studies, een associatie aangetoond met geslacht en leeftijd, wat in deze studie niet bevestigd kon worden. HPV+ patiënten zijn immers doorgaans jonger en mannelijk. Guan et al. konden echter geen significante associatie aantonen met alcoholgebruik, wat in deze studie wel gevonden werd. Associatie van de SNPs met de tumor HPV status leverde geen significante resultaten op. Dit werd wel aangetoond in de studie van Guan et al. voor de SNPs in het pre-microRNA146a en pre-microRNA196a2. Ook hier ligt een mogelijke verklaring in het feit dat deze studie slecht 72 patiënten telde, terwijl de studie van Guan et al. 309 patiënten telde. Voor de overige SNPs is geen vergelijkende literatuur beschikbaar.
45
Besluit Deze studie kon enkele statistische significante associaties aantonen. Zo is een statistisch significante associatie tussen een SNP in het gen voor Drosha (rs385500 T>C) en overleving (OS en DFS) aangetoond. Patiënten met het homozygoot normaal (TT) of het heterozygoot (TC) genotype vertonen hierbij een betere OS en DFS in vergelijking met patiënten met het homozygoot variante genotype (CC). Daarnaast werd een associatie gevonden tussen T-stage en OS en DFS: patiënten met een T4 tumor vertoonden een significant slechtere overleving in vergelijking met patiënten met een T1/2/3 tumor. Ook het aantal drinks/week kon geassocieerd worden met de overleving (OS, DFS en DSS). Hierbij vertoonden matige alcoholdrinkers (< 10 drinks/week) een betere overleving in vergelijking met patiënten die 10 of meer drinks/week nuttigden. Verschillende andere factoren, waaronder de N-stage en type radiotherapie, vertoonden een borderline significantie met overleving. Associatie met de tumor HPV status leverde eveneens enkele statistisch significante associaties op. Zo kon de tumor HPV status, bepaald met CISH, geassocieerd worden met rookgedrag, alcoholgebruik en de 2j-OS. De tumor HPV status, bepaald met p16-IHC, kon geassocieerd worden met rookgedrag en alcoholgebruik. De 2j-OS en 3j-OS dat terug gevonden werd voor deze studiepopulatie bedroeg 73,6% en 68,1%, respectievelijk. Deze verschilt licht met hetgeen in de literatuur terug gevonden wordt voor orofaryngeale kankerpatiënten, behandeld met (chemo)radiotherapie. De HPV status werd bepaald aan de hand van 2 technieken: CISH en p16-IHC. Hoewel het aantal HPV positieven in deze studie lager ligt dan in de meeste andere gepubliceerde studies, bevestigt deze studie dat de CISH techniek leidt tot hogere HPV positiviteit in vergelijking met de p16 IHC techniek. Onze huidige studie heeft verschillende beperkingen waarvan de grootste de grootte van de studie populatie is. Het feit dat er weinig tot geen voorgaand genetisch onderzoek uitgevoerd werd naar overleving vormt een tweede beperkende factor. De keuze van de genen en de SNPs werd hierdoor voornamelijk gebaseerd op associatiestudies naar kankerpredispositie. Daarnaast is deze studie een retrospectieve studie, waarbij de patiënt-gerelateerde factoren, zoals rookgedrag en alcoholgebruik, gebaseerd was op vragenlijsten die de patiënten zelf moesten invullen. Naar de toekomst toe zou deze studie uitgevoerd moeten worden op een groter aantal patiënten. Wanneer de patiëntengroep uit Maastricht toegevoegd kan worden aan deze studie, levert dit al een verdubbeling op van de studiepopulatie.
46
Referentielijst [1] Epidemiology and Clinical Aspects of HPV in Head and Neck Cancers (Anil K. Chaturvedi) [2] Babu JM, Prathibha R, Jijith VS, Hariharan R, Radhakrishna Pillai M (2011). A miR-centric view of headand neck cancers. Biochimica et Biophysica Acta-Reviews on Cancer 1816(1): 67-72. [3] www.kankerregister.org/media/docs/stK_publicatie.pdf [4] www.cijfersoverkanker.nl/selecties/Dataset_2/img50f6ac9b16348 [5] Argiris A, Karamouzis MV, Raben D, Ferris RL (2008). Head and neck cancer. Lancet 371(9625): 16951709. [6] Ang KK, Sturgis EM (2012). Human Papillomavirus as a Marker of the Natural History and Response to Therapy of Head And Neck Squamous Cell Carcinoma. Seminars In Radiation Oncology 22(2): 128-142. [7] Howard JD, Chung CH (2012). Biology of Human Papillomavirus-Related Oropharyngeal Cancer. Seminars in Radiation Oncology 22(3): 187-193. [8] Marur S, Forastiere A (2008). Head And Neck Cancer: Changing Epidemiology, Diagnosis And Treatment. Mayo Clinic Proceedings 83(5): 489-501 [9] Haas SL, Ye WM, Lohr JM (2012) Alcohol consumption and digestive tract cancer. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 15(5): 457-467. [10] Chung CH, Gillison ML (2009). Human Papillomavirus in Head And Neck Cancer: Its Role in Pathogenesis and Clinical Implications. Clinical Cancer Research 15(22): 6758-6762. [11] Thomas J, Primeaux T (2012). Is p16 immunohistochemistry a more cost-effective method for identification of human papillomavirus-associated head and neck squamous cell carcinoma? Annals Of Diagnostic Pathology 16(2): 91-99. [12] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/Patient/page1 [13] Ang KK, Harris J, Wheeler R, Weber R, Rosenthal DI, Nguyen-Tân PF, Westra WH, Chung CH, Jordan RC, Lu C, Kim H, Axelrod R, Silverman C, Redmond KP, Gilison ML (2010). Human Papillomavirus and Survival of Patients with Oropharyngeal Cancer. The New England Journal Of Medicine 363(1): 24-35. [14] Granata R, Miceli R, Orlandi E, Perrone F, Cortelazzi B, Franceschini M, Locati LD, Bossi P, Bergamini C, Mirabile A, Mariani L, Olmi P, Scaramellini G, Potepan P, Quattrone P, Ang KK, Licitra L (2012). Tumor stage, human papillomavirus and smoking status affect the survival of patients with oropharyngeal cancer: an Italian validation study. Annals of Oncology 23(7): 1832-1837. [15] Vu HL, Sikora AG, Fu SB, Kao J (2010). HPV-induced oropharyngeal cancer, immune response and response to therapy. Cancer Letters 288(2): 149-155. [16] www.who.int/vaccine_research/diseases/viral_cancers/en/index3.html [17] Zur Hausen H (2000). Papillomaviruses causing cancer : Evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis. Journal Of The National Cancer Institute 92(9) : 690-698. [18] Vozenin MC, Lord HK, Hart D, Deutsch E (2010). Unravelling the biology of human papillomavirus (HPV) related tumors to enhance their radiosensitivity. Cancer Treatment Reviews 36(8): 629-636. [19] Laborde RR, Janus JR, Olsen SM, Wang VW, Garcia JJ, Graham RP, Moore EJ, Olsen KD, Kasperbauer JL, Price DL, Berres M, Halling G, Smith DI (2012). Human papillomavirus in oropharyngeal cancer carcinoma: Assessing virus presence in normal tissue and activity in cervival metastasis. Laryngoscope 122(12): 2707-2711. [20] Chan PKS, Picconi MA, Cheung TH, Giovannelli L, Park JS (2012). Laboratory and clinical aspects of human papillomavirus testing. Critical Reviews In Clinical Laboratory Sciences 49(4): 117-136. [21] Hoffmann M, Tribius S, Quabius ES, Henry H, Pfannenschmidt S, Burckhardt C, Gorogh T, Halec G, Hoffmann AS, Kahn T, Rocken C, Haag J, Waterboer T, Schmitt M (2012). HPV DNA E6*I mRNA expression and p16(INK4A) immunohistochemistry in head and neck cancer – How valid is p16(INK4A) as surrogate marker? Cancer Letters 232(1): 88-96. [22] Park WS, Ryu J, Cho KH, Choi MK, Moon SH, Yun T, Chun BS, Lee GK, Ahn HJ, Lee JH, Vermeer P, Jung YS (2012). Human papillomavirus in oropharyngeal squamous cell carcinoma in korea: Use of G1 cycle markers as new prognosticators. Head And Neck-Journal For The Sciences And Specialities Of The Head And Neck 34(10): 1408-1417. [23] Snow AN, Laudadio J (2010). Human Papillomavirus Detection in Head and Neck Cancer. Advances In Anatomic Pathology 17(6): 394-403. [24] Fakhry C, Westra WH, Cmelak SLA, Ridge JA, Pinto H, Forastiere A, Gillison ML (2008). Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma in aprospective clinicl trial. Journal of the national cancer institute 100(4): 261-269. [25] Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, Zahurak ML, Daniel RW, Viglione M, Symer DE, Shah KV, Sidranksy D (2000). Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. Journal of the national cancer institute 92(9): 709-720. [26] Furness S, Glenny AM, Worthington HV, Pavitt S, Oliver R, Clarkson JE, Macluskey M, Chan KKW (2011). Interventions for the treatment of oral cavity and oropharyngeal cancer: chemotherapy. Cochrane
47
database of systematic reviews 4: Art. Nr.:CD006386. doi: 10.1002/14651858.CD006386. [27] Pang E, Delic NC, Hong A, Zhang M, Rose BR, Lyons JG (2011). Radiosensitization of oropharyngeal squamous cell carcinoma cells by humanpapillomavirus 16 oncoprotein E6*I. International journal of radiation oncology biology physics 79(3): 860-865. [28] Lassen P, Eriksen JG, Hamilton-Dutoit S, Tramm T, Alsner J, Overgaard J (2009). Effect of HPVAssociated p16(INK4A) Expression on Response to Radiotherapy and Survival in Squamous Cell Carcinoma of The Head and Neck. Journal Of Clinical Oncology 27(12): 1992-1998. [29] Venuti A, Paolini F (2012). HPV detection methods in head and neck cancer. Head and neck pathology 6(suppl 1): S63-74. [30] Schace AG, Liloglou T, Risk JM, Filia A, Jones TM, Sheard J, Woolgar JA, Helliwell TR, Triantafyllou A, Robinson M, Sloan P, Harvey-Woodworth C, Sisson D, Shaw RJ (2011). Evaluation of Human Papilloma Virus Diagnostic Testing in Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma: Sensitivity, Specificity, and Prognostic Discrimination. Clinical cancer research 177(19): 626-6271. [31] Jordan RC, Lingen MW, Perez-Ordonez B, He X, Pickard R, Koluder M, Jiang B, Wakely P, Xiao WH, Gillison ML (2012). Validation of Methods for Oropharyngeal Cancer HPV Status Determination in US Cooperative Group Trials. American Journal Of Surgical Pathology 36(7): 945-954. [32] Bishop JA, Ma XJ, Wang HW, Luo YL, Illei PB, Begum S, Taube JM, Koch WM, Westra WH (2012). Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. Amercian Journal Of Surgical Pathology 36(12): 1874-1882. [33] Lassen P, Overgaard J (2012). Scoring and classification of oropharyngeal carcinoma based on HPV-related p16-expression. Radiotherapy and Oncology 105(2): 269-270. [34] Robinson M, Schache A, Sloan P, Thavaraj S (2012). HPV Specific Testing: A Requirement for Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Patients. Head and Neck Pathology 6(1): 83-90. [35] Christensen BC, Avissar-Whiting M, Ouellet LG, Butler RA, Nelson HH, McClean MD, Marsit CJ, Kelsey KT (2010). Mature MicroRNA Sequence Polymorphism in MIR196A2 Is Associated with Risk and Prognosis of Head and Neck Cancer. Clinical Cancer Research 16(14): 3713-3720. [36] Ryan BM, Robles Al, Hariss CC (2010). Genetic variation in microRNA networks: the implications for cancer research. Nature reviews cancer 10(6): 389-402. [37] Wang JB, Wang QW, Liu H, Shao N, Tan BX, Zhang GY, Wang K, Jia YB, Ma W, Wang NN, Cheng YF (2012). The association of miR-146a rs2910164 and miR-196a2 rs11614913 polymorphisms with cancer risk: a meta-analysis of 32 studies. Mutagenesis 27(6): 779-788. [38] Liu Z, Li G, Wei S, Niu J, El-Naggar AK, Sturgis EM, Wei Q (2010). Genetic Variants in Selected PreMicroRNA Genes and the Risk Of Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck. Cancer 116(20): 47534760. [39] Gong J, Tong Y, Zhang HM, Wang K, Hu T, Shan G, Sun J, Guo AY (2012). Genomde-Wide Identification of SNPs in MicroRNA Genes and the SNP Effects on MicroRNA Target Binding and Biogenesis. Human Mutation 33(1): 254-263. [40] Slaby O, Bienertova-Vasku J, Svoboda M, Vyzula R (2012). Genetic Polymorphisms and microRNAs: new direction in molecular epidemiology of solid cancer. Journal of Cellular and Molecular Imaging 16(1): 8-21. [41] Gong J, Tong Y, Zhang HM, Wang K, Hu T, Shan G, Sun J, Guo AY (2012). Genomde-Wide Identification of SNPs in MicroRNA Genes and the SNP Effects on MicroRNA Target Binding and Biogenesis. Human Mutation 33(1): 254-263. [42] Guan XX, Sturgis EM, Song XC, Liu ZS, El-Naggar AK, Wei QY, Li GJ (2013). Pre-microRNA variants predict HPV16-positive tumors and survival in patients with squamous cell carcinoma of the oropharynx. Cancer letters 330(2): 233-240. [43] Zhang XF, Yang HS, Lee J, Kim E, Lippman SM, Khuri FR, Spitz MR, Lotan R, Hong WK, Wu XF (2010). MicroRNA-related genetic variations as predictors for risk of second primary tumor and/or recurrence in patients with early-stage head and neck cancer. Carcinogenesis 31(12):2118-2123. [44] Orosos Z, Szanvi I, Csejtei A, Gerlinger I, Ember I, Kiss I (2013). Association of pre-miR-146a rs2910164 Polymorphism with the Risk of Head and Neck Cancer. Anticancer research 33(1): 341-346. [45] Permuth-Wey J, Thompson RC, Nabors LB, Olson JJ, Browning JE, Madden MH, Chen YA, Egan KM (2011). A functional polymorphism in the pre-miR-146a gene is associated with risk and prognosis in adult glioma. Journal of neuro-oncology 105(3): 639-646. [46] Zhang M, Jin M, Yu J, Zhang S, Wu Y, Liu H, Liu H, Chen B, Li Q, Ma X, Chen K (2012). Associations of miRNA polymorphisms and female psychological characteristics with breast cancer risk in Chinese population. European journal of cancer care 21(2): 274-280. [47] Poulogiannis G, Luo FJ, Arends MJ (2012). RAS signalling in the colorectum in health and disease. Cell communication and adhesion 19(1): 1-9. [48] Oh JS, Kim JJ, Byun JY, Kim IA (2010). Lin28-Let7 modulates radiosensitivity of human cancer cells with
48
activation of K-RAS. International journal of radiation oncology biology physics 76(1): 5-8. [49] Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom M, Jarvis R, Cheng A, Labourier E, Reinert KL, Brown D, Slack FJ (2005). RAS is regulated by the let-7 MicroRNA family. Cell 120(5): 635-647. [50] Smits KM, Paraniape T, Nallur S, Wouters KAD, Weijenberg MP, Schouten LJ, van den Brandt PA, Bosman FT, Weidhaas JB, van Engeland M (2011). A Let-7 MicroRNA SNP in the KRAS 3’UTR Is Prognostic in Early-Stage Colorectal Cancer. Clinical cancer research 17(24): 7723-7731. [51] Chin LJ, Ratner E, Leng S, Zhai R, Nallur S, Babar I, Muller RU, Straka E, Su L, Burki EA, Crowell RE, Patel R, Kulkarni T, Homer R, Zelterman D, Kidd KK, Zhu Y, Christiani DC, Belinsky SA, Slack FJ, Weidhaas JB (2008). A SNP in a let-7 microRNA complementary site in the KRAS 3′ untranslated region increases nonsmall cell lung cancer risk. Cancer Research 68(20): 8535–8540. [52] Ratner E, Lu L, Boeke M, Barnett R, Nallur S, Chin LJ, Pelletier C, Blitzblau R, Tassi R, Paranjape T, Hui P, Godwin AK, Yu H, Risch H, Rutherford T, Schwartz P, Santin A, Matloff E, Zelterman D, Slack FJ, Weidhaas JB (2010) A KRAS-variant in ovarian cancer acts as a genetic marker of cancer risk. Cancer Res 70(16): 6509-6515. [53] Christensen BC, Moyer BJ, Avissar M, Ouellet LG, Plaza SL, McClean MD, Marsit CJ, Kelsey KT (2009). A let-7 microRNA-binding site polymorphism in the KRAS 3’UTR is associated with reduced survival in oral cancers. Carcinogenesis 30(6): 1003-1007. [54] Revenkova E, Eijpe M, Heyting C, Gross B, Jessberger R (2001). Novel meiosis-specific isoform of mammalian SMC1. Molecular and cellular biology 21(20): 6984-6998. [55] Cobbe N, Heck MMS (2000). SMCs in the world of chromosome biology – From prokaryotes to higher eukaryotes. Journal of structural biology 129(2-3): 123-143. [56] http://www.ensembl.org/index.html [57] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ [58] http://encodeproject.org/cgi-bin/hgPcr [59] http://www.restrictionmapper.org/ [60] http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Diagnostics-ClinicalResearch/Clinical-Pathology/CP-Misc/SPOT-Light-HER2-CISH-Kit/CISH-Technology-Overview.html [61] Singhi AD, Westra WH (2010). Comparison of Human Papillomavirus In Situ Hybridization and p16 Immunohistochemistry in the Detection of Human Papillomavirus-Associated Head and Neck cancer Based on a Prospective Clinical Experience. Cancer 116(9): 2166-2173. [62] Perisanidis C, Wrba F, Brandstetter A, Kornek G, Mitchell D, Seemann R, Selzer E, Ewers R, Filipits M (2013). Impact of epidermal growth factor receptor, mesenchymal-epithelial transition factor, and insulin-like growth factor receptor 1 expression on survival of patients with oral and oropharyngeal cancer. British journal of oral & maxillofacial surgery 51(3): 234-240. [64] Loo SW, Geropantas K, Wilson P, Martin WMC, Roques TW (2013). Target Volume Definition for Intensity-modulated Radiotherapy after Induction Chemotherapy and Patterns of Treatment Failure after Sequential Chemoradiotherapy in Locoregionally Advanced Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma. Clinical oncology 25(3): 162-170.
49
Bijlage A : Patiëntengegevens 1. Patiënt-gerelateerde gegevens Code RT066 RT071 RT080 RT081 RT083 RT084 RT103 RT134 RT144 RT148 RT163 RT169 RT171 RT189 RT225 RT234 RT245 RT249 RT256 RT273 RT274 RT275 RT286 RT301 RT311 RT316 RT380 RT406 RT426 RT427 RT494 RT512 RT514 RT528 RT541 RT554 RT562 RT564
Geslacht Leeftijd v m v m m m m m m v m m m v m m m m m v m m v m v m m m m m m m m v m m m v
37 66 54 47 77 54 58 63 70 68 41 55 58 61 48 49 58 62 41 73 63 66 48 47 64 60 66 41 48 73 58 70 55 52 60 53 68 66
Type roken current current former former former former former never current current former current former current current former current never current never current former former current current current former never never former former former former current former never former never
Packyears 30 25 60 23 7 4 53 0 63 13 20 8 28 44 50 28 50 0 25 0 54 45 60 38 50 12 55 0 0 40 60 23 35 135 0 28,5 0
Type alcoholgebruik never current current former current current current never current never former current current current current current current current current current current former current current former former current current current former current current current current current never former current
Drinks/week 0 35 50 40 12 8 35 0 70 0 70 21 6 12 28 60 40 5 44 11 7 60 30 45 12 60 10 2 25 14 10 24 7 35 2 0 130 8
Code RT575 RT579 RT585 RT596 RT600 RT608 RT614 RT620 RT657 RT664 RT672 RT679 RT681 RT688 RT692 RT697 RT700 RT727 RT736 RT737 RT745 RT748 RT772 RT780 RT791 RT799 RT808 RT814 RT833 RT847 RT854 RT855 RT862 RT879
Geslacht Leeftijd m m m m v m m m m m v m v m m m m m v m m m m m m m v m m m m m v v
68 67 54 68 73 66 52 50 78 43 56 62 66 52 61 50 67 59 57 55 62 57 71 66 56 70 61 55 57 60 51 64 54 38
Type roken former former former former current former current current former former former former current current former former former former current current current former former former current former current former former current current current current current
Packyears 28,7 10 22 37,5 37,5 30 37,5 40 22,5 50 30 27 38 18 25 7,5 80 39,5 45 25 50 10 10 20 123 40 22,5 12 41,3 21 35 60 37,5 10
Type alcoholgebruik former current current former current current former current current current current current current current current current former current current current current current current current current current current current former current current current current never
Drinks/week 75 1 21 60 7 1 56 12 1 60 21 2 1 7 3 20 100 50 14 70 20 2 7 70 110 4 28 28 45 28 45 15 3 0
2. Klinische gegevens Code RT066 RT071 RT080 RT081 RT083 RT084 RT103 RT134 RT144 RT148 RT163 RT169 RT171 RT189 RT225 RT234 RT245 RT249 RT256 RT273 RT274 RT275 RT286 RT301 RT311 RT316
Subsite tonsil multiple subsites: mondbodem posterior wall maxilla multiple subsites: superior wall tonsil superior wall base of tongue multiple subsites: multiple subsites: tonsil multiple subsites: tonsil multiple subsites: tonsil tongbasis uvula soft palate tongrand base of tongue tongbasis en tongrand
Tstage 4 3 3 4 4 4 1 1 4 4 3 3 1 3 2 4 4 3 4 1 1 3 2 4 2
Nstage 2 3 0 2 0 2 2 2 0 3 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 0 2 0
Chemo
Heelkunde Halsevidement
ja ja nee ja nee ja nee ja ja ja ja ja ja ja nee ja ja ja nee ja ja nee ja ja nee
nee nee ja nee ja nee ja ja nee nee nee nee ja nee ja nee nee nee nee nee ja nee ja nee ja
3
3
ja
nee
Type RT
Status
ja ja ja ja nee ja ja ja ja nee ja ja ja ja ja ja nee ja nee ja ja ja ja nee nee
3DRT IMRT 3DRT IMRT 3DRT IMRT IMRT 3DRT IMRT IMRT IMRT IMRT 3DRT IMRT 3DRT IMRT IMRT IMRT IMRT 3DRT 3DRT IMRT 3DRT IMRT 3DRT
dead dead dead dead dead alive dead alive alive dead dead dead alive dead alive dead dead dead dead alive dead dead alive dead dead
ja
IMRT
dead
Code
RT380 RT406 RT426 RT427 RT494 RT512 RT514 RT528 RT541 RT554 RT562 RT564 RT575 RT579 RT585 RT596 RT600 RT608 RT614 RT620 RT657 RT664 RT672 RT679 RT681
Subsite
Tstage
Nstage
Chemo
Heelkunde Halsevidement
tonsil lateral wall lateral wall tonsil tonsil en weke verhemelte tonsil tonsil soft palate tonsil lateral wall tonsil tongbasis base of tongue tonsil soft palate tonsil tonsil base of tongue tonsil tonsil tonsil lateral wall posterior wall tonsil tonsil
2 2 1 3 2
2 2 2 0 2
nee ja nee nee nee
ja nee nee ja nee
2 3 3 4 3 1 1 2 3 1 2 3 2 3 2 3 2 1 2 4
0 2 0 2 2 2 2 2 2 3 1 0 2 1 3 0 2 0 3 2
nee nee ja ja ja nee nee nee ja ja nee nee ja ja ja nee nee nee ja ja
ja ja nee nee nee ja nee nee nee nee ja nee nee ja nee ja ja ja nee nee
Type RT
Status
ja ja ja nee ja
3DRT IMRT IMRT IMRT 3DRT
dead dead alive alive alive
ja ja nee ja ja ja ja ja ja nee ja nee ja nee ja ja ja nee nee nee
3DRT 3DRT IMRT IMRT IMRT IMRT 3DRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT
dead dead alive alive alive dead alive alive alive dead alive dead alive alive dead alive alive alive alive alive
Code
RT688 RT692 RT697 RT700 RT727 RT736 RT737 RT745 RT748 RT772 RT780 RT791 RT799 RT808 RT814 RT833 RT847 RT854 RT855 RT862 RT879
Subsite
Tstage
Nstage
Chemo
tonsil tonsil tonsil base of tongue tonsil posterior wall posterior wall base of tongue tonsil tonsil base of tongue tonsil base of tongue posterior wall base of tongue tonsil tonsil tonsil tonsil tonsil tonsil
4 2 2 2 3 3 3 2 2 2 3 2 2 2 1 2 1 4 4 4 2
2 2 2 2 1 1 2 1 2 0 2 2 1 0 2 2 1 2 2 2 2
ja nee ja ja ja ja ja nee nee nee nee nee nee nee ja ja nee ja ja ja ja
Heelkunde Halsevidement
nee nee ja nee nee nee nee nee nee nee nee nee nee nee nee ja nee nee nee nee nee
nee ja ja ja nee nee nee nee ja nee ja nee nee nee ja ja nee nee ja ja ja
Type RT
Status
IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT IMRT
dead alive dead alive dead alive alive alive alive alive alive alive alive alive dead dead alive alive alive alive alive
Bijlage B : Gebruikte RFLP protocols 1. Reeds geoptimaliseerde protocols binnen de onderzoeksgroep Drosha rs639174 (G>A) PCR - Primers Forward : Drosha/98361F Reverse: Drosha/98831R
5'-GATTACAGGAGGTAAGCCGA-3'
(270)
5'-GAGCAAGAGTTTATACTAGAATA-3' (271)
- PCR mix: Standard - PCR conditions: Touchdown 70°C - PCR fragment size: 493 bp Digest - Enzyme: TatI - Incubation: 65°C for 4 hours Digest volume
30 µl
dH2O
17,9 µl
PCR product
10 µl
Buffer tango
2 µl
TatI (0,5 U)
0,1 µl
Expected digest product: GG: 493 - GA: 493/273/220 -AA: 273/220
Drosha rs3805500 (T>C) PCR - Primers Forward Drosha/69198F
5’-CTGATGATCTCAGTGATAAGTC-3’
(262)
Reverse: Drosha/69554R
5’-ACTGGAACAGATAATTCAGCAC-3’
(261)
- PCR mix: Standard - PCR conditions: Touchdown starting by 64°C - PCR fragment size: 378 bp Digest - Enzyme: ApoI - Incubation: 50°C for 2-3 hours Digest volume
30 µl
dH2O
19,5 µl
PCR product
7 µl
BSA
0,3 µl
NEB3
3 µl
ApoI (2U)
0,2 µl
Expected digest product: CC: 378 - CT: 378/272/106 - TT: 272/106
KRAS rs61764370 (T>G) PCR - Primers : 293/294 - PCR mix : standard + 10% DMSO - PCR conditions : touchdown program 72°C PCR fragment size : 762bp Digest
Enzyme : TfiI Fastdigest
Enzyme : TfiI
Incubation : 37°C for 20-30 minutes
Incubation : 37°C for 3 hours
Digest volume
30 µl
Digest
30 µl
volume dH2O
17 µl
dH2O
PCR product
10 µl
PCR product
10 µl
Fastdigest Green buffer
2 µl
Buffer O
2 µl
1 µl TfiI (Fast)
Expected digest product : TT :
83 / 101 / 135 / 167 / 276
TG:
83 / 101 / 135 / 167 / 276 / 411
GG : 83 / 101 / 167 / 411
17.75 µl
0.25 µl (2.5U) TfiI (10U/µl)
2. Geoptimaliseerd protocol binnen deze studie XPO5 rs2227301 (G>A) PCR - Primers Forward (446) 5'- TATATCCTGAACTTCACTGAC -3' Reverse (447) 5'- CACTGTCCCTTCGTGGAC -3' - PCR mix: Standaard - PCR conditions: Algemeen 56°C / Touchdown 58°C - PCR fragment size: 542 bp Digest - Enzyme: BsrI - Incubation: 65°C (3u) Digest volume
30 µl
dH2O
17,6 µl
PCR product
9 µl
NEB3
3 µl
BsrI (2U)
0,4 µl
Expected digest product: GG : 265 / 277 - GA : 265 / 277 / 542 - AA : 542
Bijlage C : Gebruikte HRM protocols 1. Geoptimaliseerde protocols binnen de onderzoeksgroep KRAS rs61764370 (T>G) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia: Reagent
Concentration
dNTP mix
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
primer 290
5 µM
1.2
primer 292
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95 20
- PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 60° 1 min
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
- PCR fragment size : 107 nt
: 40 cycli
Drosha rs10520985 (C>T) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent
Concentration
dNTP mix
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1.2
primer 280
5 µM
1.2
primer 282
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95 20
PCR mix: Standard HRM mix + 1.5µl DMSO per sample
- PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 62° 1 min
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
- PCR fragment size: 162bp
: 40 cycli
2. Geoptimaliseerde protocols binnen de studie XPO5 rs699937 (C>T) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent dNTP mix
Concentration
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1.2
primer 448
5 µM
1.2
primer 450
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95 20
PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 60°
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
1 min
PCR fragment size : 173 nt
Drosha rs17410035 (C>A) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent
Concentration
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
primer 420
5 µM
1.2
primer 422
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95
dNTP mix
20
: 40 cycli
PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 60° 1 min : 40 cycli
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
PCR fragment size : 96 nt
SMC1B rs3747238 (A>G) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent dNTP mix
Concentration
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1.8
primer 451
5 µM
1.2
primer 454
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.35 20
PCR conditions :
95° 95°
10 min 15 sec - 58°
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
PCR fragment size : 100 nt
1 min :
40 cycli
Pre-microRNA196a2 rs11614913 (C>T) PCR-HRM - Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent
Concentration
dNTP mix
Amount (µl)
10mM
0.4
buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
primer 411
5 µM
1.2
primer 412
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
HRM dye
20X
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95 20
PCR conditions :
95° 95°
10 min 15 sec - 60°
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
PCR fragment size : 123 nt
1 min :
40 cycli
Pre-microRNA146a rs2910164 (G>C) – spike in HRM Step 1:discrimination between homozygous and heterozygous genotypes
Reagent (Meltdoctor) Concentration dNTP mix
Amount (µl)
Reagent (Syto9)
concentration Amount (µl)
10 mM
0.4
dNTPmix
10 mM
0.4
buffer
10X
2
Buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
MgCl2
25 mM
1.2
primer 416
5 µM
1.2
Primer 416
5 µM
1.2
primer 417
5 µM
1.2
Primer 417
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
Amplitaq
5 U/µl
0.05
HRM dye
20X
1
Syto9
50 µM
0.6
DNA
25 ng/µl
1
DNA
25 ng/µl
1
H2O
-
11.95
H2O
-
12.35
20
PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 60°
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
PCR fragment size : 132 nt
20
1 min
: 40 cycli
Step2: only the homozygous genotypes are being used, discrimination between GG and CC genotypes
Reagent (Meltdoctor) dNTP mix
Concentration Amount (µl)
Reagent (Syto9)
concentration
Amount (µl)
10 mM
0.4
dNTPmix
10 mM
0.4
buffer
10X
2
Buffer
10X
2
MgCl2
25 mM
1,2
MgCl2
25 mM
1.2
primer 416
5 µM
1.2
Primer 416
5 µM
1.2
primer 417
5 µM
1.2
Primer 417
5 µM
1.2
AmpliTaq
5 U/µl
0,05
Amplitaq
5 U/µl
0.05
HRM dye
20X
1
Syto9
50 µM
0.6
25 ng/µl
1
DNA
25 ng/µl
1
25 ng/µl
1
25 ng/µl
1
Spike-in DNA
-
10.95
H2O
-
11.35
DNA
Spike-in DNA H2O
20
20
PCR conditions :
95°
10 min
95°
15 sec - 60°
95°
10 sec
60°
1 min
95°
15 sec
60°
15 sec
PCR fragment size : 132 nt
1 min
: 40 cycli
Bijlage D : Resultaten SNP analyse Code
RT066 RT071 RT079 RT080 RT081 RT083 RT084 RT103 RT131 RT134 RT141 RT144 RT148 RT163 RT165 RT169 RT171 RT176 RT189 RT225 RT232 RT234 RT243 RT245
DROSHA rs639174 GA GG GG GG GG GA GG GG GA GG GG GA GA GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GA
rs3805500 CT TT TT TT CT TT CT TT CT CT CT TT TT TT TT CT CT CC TT CT TT CT TT CT
PRE-MICRO RNA rs10520985 rs17410035 146a 196a2 CC CC / CC CT CA GC CT CT CC GG CT CT CC GG TT CT CC GG CC CT CA GG CT CT CC GG CT TT CA CC CT CT CA GG CT CC CC GG CT CC CC GC CT TT CA GG CC TT AA GC CT CC CC GG CC TT CA GC CT CT AA GC TT CT CA GG TT CC CA / TT CT CC GC TT CC CC GG CT TT CA GG TT CC CC GG CC TT CA GG CC CT CC GC CC
KRAS
XPO5
SMC1B
rs61764370 rs2227301 rs699937 rs3747238 TT GG CC AA TT GG CC AA TT GA CT AA TG GA CT AG TT GG CC AG TT GG CC AA TT GA CT AG TT GA CT AG TT GA CT AG TT GA CT GG TT GA CT GG TT GG CT AG TT GG CT AG TG GG CC AG GG GG CC AA TT GG CC AG TT GA CT AA TT GA / / TT GA CT AG TT GG CC AG TT GG CT AA TT GA CT GG TT GA CT AG TT GA CT GG
Code
RT246 RT249 RT256 RT258 RT267 RT273 RT274 RT275 RT286 RT301 RT304 RT305 RT311 RT316 RT329 RT352 RT380 RT406 RT416 RT426 RT427 RT494 RT495 RT503 RT512 RT514 RT519
DROSHA rs639174 GG GG AA GA GG GG GG GG GA GA GA GA GG GA GG GA GG GA GG GA GG GG GA GG GG AA GA
rs3805500 TT TT CC CT TT TT CT TT TT CC CT CT CT CT TT CC CT CT TT CT TT TT CT CT CT TT CT
PRE-MICRO RNA rs10520985 rs17410035 146a 196a2 TT CC GC CC CT CA GC TT CC CC GC CC CT CC CC CC TT AA GG TT CT CC CC CT CT CA GG CC TT AA GC CT CT CA GG CT CC CA GC CT CT CC GC CT CT CA GG CC CT CA GG CT TT CC GG CT CC CA GC CT CC CA GC CT CT CA GG CT CT CA GG CT TT CA GG CT CT CC GC CC TT AA GG CT TT CA GG CT CC CC GC CT CT CA GC CC TT CC GC CC CC CA GC CC CC CC GG CT
KRAS
XPO5
SMC1B
rs61764370 rs2227301 rs699937 rs3747238 TT GA CT GG TT GG CC AG TT GG CC AA TT GG CC AG TT GG CC AA TT GG CC AG TT GA CT AG TG GG CT GG TT GG CC AA TT GG CT AG TT GG CC AG TT GG CC AG TT GG CT AG TT GA CT AA TG GG CC AG TT GA CT AG TT GG CC AG TT AA TT AG TT GA CT AG TT GA CT AA TT GA CT GG TT GG CC GG TG GG CC AA TT GG CC AG TT GG CC AG TG GG CT GG TT GG CT AG
Code
RT528 RT531 RT532 RT541 RT543 RT554 RT562 RT564 RT575 RT579 RT584 RT585 RT586 RT590 RT592 RT593 RT596 RT597 RT600 RT608 RT614 RT618 RT620 RT636 RT657 RT664 RT672
DROSHA rs639174 GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GG GA GA GA GG GA GG GG
rs3805500 CT TT TT TT CT CT CC CT TT TT TT CT TT CT TT TT CT CT TT TT CT CT CT CT CT CT TT
PRE-MICRO RNA rs10520985 rs17410035 146a 196a2 CT CA GG CC CT CC GG CC CT CA GG TT TT CA GC CT CT CA GC CT CC CC GC CC CC / GC CC CC CC GG CT / CC GC CT TT AA GC TT CT CA GC CC CT CC GC CT CT CC GG TT CT CA GC CT / CC GG CT TT AA GC CT CT CC GC TT CC CC GG TT TT CA GG CT CT / GG CC CT CC GC CT CC CC GC CC CC CC GG CT CT CA GG CT CC CC GG CT CC CA GG CC CC CC GG TT
KRAS
XPO5
SMC1B
rs61764370 rs2227301 rs699937 rs3747238 TT GG CC AG TG GG CT AA TT GG CC AG TT GG CT AG TT GA TT AA TT GA CT AA TT GG CT AG TT GA TT AG TT GA CT GA TT GA CT GA TG GG CC GA TG GA CT GG TT GA CT GA TT GG CC AA TT GA CT AA TT GG CC AA TG GG CC GA TT GA CT GA TT GG CC GA TT GG CC GG TT GA CT GA TT GA TT GA TG GG CC GA TT GG CC AA TG GG CT GA TG GG CT GA TT GG CC GA
Code
RT679 RT681 RT688 RT692 RT694 RT700 RT703 RT709 RT727 RT736 RT737 RT740 RT745 RT748 RT759 RT760 RT772 RT780 RT783 RT791 (op) RT793 RT799 RT808 RT814 RT824 RT833
DROSHA rs639174 GG GG GA GG GA GG GG GG GG GG GA GG GG GG GA GG GG GG GG / GA GA GG GG GG GA
rs3805500 CT TT CC TT CT TT CT TT TT TT CT CT CT CT CT TT TT TT CT / CT CC TT CT CT TT
PRE-MICRO RNA rs10520985 rs17410035 146a 196a2 CT / GC CT CT / GG TT CC CC GG CC TT / GG CC CT CA GG CT CT CA GC CT CT CC GC CC CC CC GG CT CT CC GG CT / AA CC CC CT CA GC TT CT CC GG CT CT / GC CC CT CC GC CC CT CA GC CT CT / GG TT CC AA GG CC CT / GG CT CT / GG / / / / / CT CC CC CT CC CC
CA CC CA CC CC CA
GG GC GG GC GC GG
CC CC CT CC CC CC
KRAS
XPO5
SMC1B
rs61764370 rs2227301 rs699937 rs3747238 TG GG CT AA TG GG CC GA TT GG CC AA TT GA CT GA TT GG CT AA TT GG CC AA TT GG / GA TG GG CC GA TT GG CT GA TT GA CT AA TT GA CT GA TT GG CT AA TT AA TT GG TT GG CC GA TT GG CC AA TT GA CT GA TG AA TT GA TT GG CC GA TT GG CC GA / / / / TG TT TG TT TT TT
GG GG GA GA GG GG
CC CC CT CT CC CC
AA GA AA GA AA AA
Code
RT846 RT847 RT854 RT855 RT860 RT862 RT879
DROSHA rs639174 GA GA GA GG GA AA GG
rs3805500 CT TT CT CT CT CC CT
PRE-MICRO RNA rs10520985 rs17410035 146a 196a2 CT CA GG TT CC / GC CT CT CA GC CT CT CA GG CT TT CA GG CT CC CC GG CC CC CC GC CT
KRAS
XPO5
SMC1B
rs61764370 rs2227301 rs699937 rs3747238 TT GG CC GG TT GA TT GA TT GG CC AA TG GA CT GA TT GA CT GA TT GA CT GA TT GG CC AA
Bijlage E : Resultaten Analyses 1. Associatie microRNA genotypes met overleving volgens het recessief model
miRNA genotypes Drosha rs639174 GG+GA AA
Sterfte Totaal (eender aantal welke patiënten oorzaak)
p
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)* p
Sterfte, herval of metastase
p
67 3
29 2
0,456
11 0
0,561
34 2
0,376
rs10520985 CC CT+TT
56 12
25 6
0,805
10 1
0,387
29 6
0,750
rs3805500 TT+TC CC
64 6
27 4
0,003
10 1
0,435
32 4
0,050
rs17410035 CC+CA AA
55 7
27 3
0,799
10 0
0,267
29 4
0,699
XPO5 rs2227301 GG+GA AA
67 3
30 1
0,883
10 1
0,604
35 1
0,682
rs699937 CC+CT TT
65 5
30 1
0,410
10 1
0,927
34 2
0,759
premicroRNA 146a rs2910164 GG+GC CC
66 3
29 1
0,929
10 1
0,301
33 2
0,425
196a2 rs11614913 CC+CT TT
60 10
27 4
0,487
10 1
0,538
32 4
0,473
25
miRNA genotypes SMC1B rs3747238 AA+AG GG
Sterfte Totaal (eender aantal welke patiënten oorzaak)
62 10
27 5
p
0,515
Sterfte (kanker progressie of ziekte gerelateerd)* p
10 2
KRAS rs61764370 TT+TG 70 31 11 GG 0 0 0 * Totaal aantal patiënten voor analyse naar DSS toe bedroeg 64
Sterfte, herval of metastase
0,911
32 5
p
0,361
36 0
26
2. Associatie tumor HPV status met microRNA genotypes HPV+ (CISH)
HPV- (CISH)
p
OR
HPV+ (p16)
HPV- (p16)
p
OR
Drosha rs639174 GG GA+AA
10 3
35 19
1* 0,408
0,553
14 5
31 13
1 0,543
0,692
rs10520985 CC CT+TT
6 7
15 37
1 0,238
0,473
7 12
13 32
1 0,532
0,696
rs3805500 TT TC+CC
7 6
23 31
1 0,465
0,636
7 12
23 24
1 0,374
1,643
rs17410035 CC CA+AA
6 5
23 25
1 0,692
0,767
11 6
17 24
1 0,112
0,386
XPO5 rs2227301 GG GA+AA
7 6
32 22
1 0,723
1,247
10 9
28 19
1 0,606
1,326
rs699937 CC CT+TT
5 8
23 31
1 0,786
1,187
8 11
19 28
1 0,9
0,933
HPV+ (CISH)
HPV- (CISH)
p
OR
HPV+ (p16)
HPV- (p16)
p
OR
146a rs2910164 GG GC+CC
7 6
26 27
1 0,757
0,830
10 9
23 23
1 0,847
0,900
196a2 rs11614913 CC CT+TT
4 9
22 32
1 0,510
1,547
9 10
16 31
1 0,315
0,573
SMC1B rs3747238 AA AG+GG
3 11
14 41
1 0,755
1,252
6 14
11 37
1 0,540
0,694
16 3
36 11
1 0,496
0,614
pre-microRNA
KRAS rs61764370 TT 10 43 1 TG+GG 3 11 0,830 1,173 *1 = referentie. / De resultaten uit deze tabel werden bekomen via logistieke regressie
