Lapp-top cursus Natuurkunde 2. Beweging in de cel op nanoschaal bekeken

Lapp-top cursus Natuurkunde 2 Beweging in de cel op nanoschaal bekeken

1

2

3

Voorwoord

2

Cellen in beweging 1.1 Inleiding

3 3

1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3

De opbouw van de cel Prokaryoten en eukaryoten De onderdelen van de cel Het cytoskelet

3 3 3 8

1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3

Beweging Beweging van een hele cel Chemotaxis Beweging in de cel

11 11 15 17

1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5

Microscopie Lichtmicroscopie Specifieke methoden Resolutie Single-molecule microscopie Electronenmicroscopie

18 18 20 22 24 26

Diffusie 2.1 Inleiding

28 28

2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3

Diffusie en verspreiding Random walk Diffusieconstante Diffusiesnelheid en concentratie

29 29 34 35

2.3

Diffusie in cellen

37

2.4

Thermische beweging

39

2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3

Wrijving Wrijving en viscositeit Wrijving op nanoschaal Leven bij laag Reynolds getal

40 40 42 44

Gerichte beweging en motoreiwitten 3.1 Inleiding

46 46

3.2 3.2.1 3.2.2

Motoren en filamenten Motoreiwitten Filamenten

46 46 47

3.3

Beweging van motoreiwitten

50

3.4

Kinesine

53

3.5 3.5.1 3.5.2

Gerichte beweging van E. coli De rotatiemotor van E. coli De voortbeweging van E. coli

57 57 60

1

Voorwoord Voor je ligt de syllabus van de cursus “Beweging in de Cel op Nanoschaal Bekeken” van natuurkunde in Leiden. Het lijkt wellicht vreemd dat natuurkundigen zich met cellen bezig houden. Echter, in de afgelopen 50 jaar is de studie van levensprocessen een steeds grotere plaats in de natuurkunde gaan innemen. Dit geldt in het bijzonder voor Leiden, waar de biofysica in 1956 werd opgericht. Aanvankelijk werd vooral de fotosynthese bestudeerd, vanwege de belangrijke rol die licht, een natuurkundig verschijnsel, bij dit proces speelt. Tegenwoordig is het onderzoeksgebied uitgebreider, met speciale aandacht voor beweging, sterkte en structuur van biologische moleculen. Het thema van deze lapptop sluit nauw aan bij het Leidse onderzoek. Wij hopen dat jullie “Beweging” net zo’n aansprekend onderwerp zullen vinden als wij. Het woord “nanoschaal” roept misschien het modewoord ‘nano’op, dat tegenwoordig voor zoveel technologische ontwikkelingen wordt gebruikt. De cel wordt dan ook regelmatig als voorbeeld gezien voor mensgemaakte nanotechnologie. De hoeveelheid organisatie en structurering die in een cel te vinden is, blijft telkens weer verbazen. Een aanzienlijk deel van deze organisatie en structuur heeft te maken met beweging. Tegelijkertijd wordt beweging in de cel, veel meer dan op menselijke schaal, geregeerd door niet-georganiseerde toevalsprocessen zoals diffusie. Het leuke van de natuurkunde is dat het ons de handvaten geeft om ook deze toevallige processen nauwkeurig te beschrijven. Dat hopen we in deze cursus te laten zien. We zullen in deze cursus eerst op de cel zelf inzoomen om de hoofdrolspelers van het celtransport in kaart te krijgen. Daarna bekijken we diffusie en wrijving, beiden op nanoschaal veel dominanter dan in onze macroscopische wereld. Het theoretische gedeelte wordt afgesloten met een gedetailleerde kijk op het functioneren van motoreiwitten, die voor gerichte beweging zorgen. We gaan vervolgens praktisch aan de slag met de nieuwe kennis. We bestuderen de groei van koloniën van de Escherichia coli bacterie, die door een nauwgezette combinatie van diffusie en gerichte beweging wordt bepaald. Daarnaast zullen we het functioneren van motoreiwitten onder de loep nemen met de microscoop. De cursus wordt afgesloten met een bezoek aan de biofysisch onderzoekslaboratoria van het Amolf Instituut in Amsterdam. De colleges en de proeven zullen plaatsvinden op de vakgroep biofysica van natuurkunde in Leiden. We hopen hiermee een indruk te geven van de gang van zaken op een biofysische onderzoeksgroep.

Jante Salverda Thomas Schmidt Marileen Dogterom Januari 2011

2

1

Cellen in beweging

1.1 Inleiding De cel is de basiseenheid van alle levende wezens. Van bacterie tot walvis, van schimmel tot duizendjarige eik, allemaal zijn ze uit cellen opgebouwd. Meercellige organismen zoals wij bestaan uit miljarden cellen die op een ongelofelijk ingewikkelde manier met elkaar samenwerken. De basis voor deze complexiteit wordt al gelegd op het nivo van de enkele cel. De basisprocessen van het leven zoals eten, voedsel verteren, de omgeving waarnemen, zich verplaatsen, zich vermenigvuldigen... allemaal vinden ze op het nivo van de enkele cel plaats. Aan eenvoudige eencellige organismen zoals de Escherichia (E.) coli bacterie valt dan ook nog ontzettend veel ingewikkelds te ontdekken, zoals we zullen zien. In deze syllabus gaat het speciaal om die celprocessen die in het bijzonder met beweging te maken hebben. Beweging, kracht, energie: allemaal begrippen die je al wel uit de natuurkunde kent. We zullen ons dan ook toespitsen op de natuurkunde van de celbeweging. Om deze natuurkunde in een context te plaatsen beginnen we in dit hoofdstuk met het schetsen van de opbouw van de cel. We bespreken enkele gebruikelijke vormen van beweging, van zowel een gehele cel, als van onderdelen binnen een cel. De kennis die in dit dictaat wordt behandeld, is grotendeels met behulp van microscopische technieken verkregen. Daarom eindigt dit hoofdstuk met de beschrijving van belangrijke technieken en grootheden uit de microscopie. 1.2 De opbouw van de cel 1.2.1 Prokaryoten en eukaryoten De cel is dus de bouwsteen van alle organismen. De meest fundamentele basisindeling van het leven is dan ook gebaseerd op het karakter van de cel. Dit betreft de indeling tussen prokaryoten en eukaryoten. De prokaryoten, ofwel bacteriën, bestaan uit één enkele eenvoudige cel. Alle moleculen, zelfs het DNA, liggen gewoon los in de cel. Er is geen celkern en geen structuur. De enige stevigheid komt van de celwand die de bacterie omgeeft. Prokaryoten zijn klein, ongeveer 1 micrometer groot. Eukaryoot is grieks voor ‘goede kern’ en de eukaryoten hebben dan ook als onderscheidend kenmerk een celkern, waarin zich de chromosomen met het DNA bevinden. Daarnaast bevatten ze nog veel meer gespecialiseerde onderdelen, de zgn. organellen, die elk een eigen functie hebben. Eukaryoten kunnen ook eencellig zijn net als prokaryoten. Meercellige organismen bestaan altijd uit eukaryote cellen. 1.2.2 Onderdelen van de cel Alle cellen hebben een aantal onderdelen gemeen. Dit zijn de celmembraan aan de buitenkant, en de basisinhoud, het cytoplasma. Bij de prokaryote cel, te zien in Figuur 1.1, is dit al bijna alles. Alleen aan de buitenkant heeft deze cel nog een celwand, waarop meestal nog kleine haartjes zitten. Plus in veel gevallen een flagella, dit is een zwiepstaart waarmee de bacterie kan zwemmen. Deze staart gaan we nog vaker tegenkomen. 3

Figuur 1.1 Bouw van de prokaryote cel: aan de buitenkant de celwand, haartjes (Pili), flagella, en celmembraan, binnenin het cytoplasma met daarin een losse streng DNA en losse ribosomen. Alle cellen worden omgeven door een membraan, net als veel organellen in de eukaryote cel. Zo’n membraan bestaat altijd uit een dubbele laag vetten, een lipide dubbellaag genaamd, met hierin diverse membraaneiwitten (zie Figuur 1.2). Sommige van deze eiwitten, de receptoren, kunnen signaleren wat er buiten de cel gebeurt en deze informatie naar binnen doorgeven. Andere hebben een rol als porie voor het passief doorlaten van stoffen, of als pomp voor het actief stoffen naar binnen of buiten brengen.

Figuur 1.2 De bouw van de celmembraan, bestaande uit een lipide dubbellaag met daarin diverse soorten membraaneiwitten. 4

In de eukaryote cel is alles anders dan bij de prokaryoot, deze cel is enorm gestructureerd. Zie de schematische weergave in Figuur 1.3. Als meest opvallende organel is er een celkern waarin het DNA opgeborgen zit, het erfelijk materiaal, dat bij elke celdeling wordt gekopieerd. De kern wordt door een eigen membraan afgescheiden van de rest van de cel. De code van een gen uit het DNA kan worden overgeschreven naar RNA. Vervolgens wordt het RNA via een porie uit de celkern getransporteerd. Buiten de celkern wordt het RNA afgelezen om eiwitten te produceren.

Figuur 1.3 Doorsnede van een plantencel. Op de celwand en chloroplasten na is de opbouw typerend voor alle eukaryote cellen. De synthese van eiwitten wordt buiten de kern geregeld, door ribosomen. Bij prokaryoten liggen de ribosomen los in de cel. Bij eukaryoten zitten ze meestal vast aan een grotere structuur, het endoplasmatisch reticulum (ER). Het ER is een grote membraanstructuur die bij de celkern begint en vaak een aantal keer om zichzelf heengevouwen zit. In Figuur 1.4a zie je een elektronenmicroscopie-opname van het ER. Bij de productie en sortering van eiwitten zijn behalve het ER nog meer membraanstructuren betrokken. In het Golgi-apparaat (zie Figuur 1.4b) worden zowel ter plaatse als elders geproduceerde eiwitten gesorteerd voor gebruik op verschillende plaatsen in de cel, of voor uitscheiding uit de cel. Die uitscheiding vindt plaats met behulp van blaasjes (engels ‘vesicles’), die ook weer uit een membraan bestaan (eveneens te zien in Figuur 1.4b). Deze blaasjes fuseren met de celmembraan, en vervolgens wordt de inhoud naar buiten gekeerd. Dit proces verloopt ook de andere kant op: een cel kan stoffen opnemen door naar binnen toe een blaasje te vormen vanuit de membraan.

5

(a)

(b)

Figuur 1.4 Elektronenmicroscopie-opnamen van membraanstructuren in de cel. (a) Endoplasmatisch reticulum (gevouwen structuur) met daaraan gehecht de ribosomen (zichtbaar als donkere puntjes) en linksonder de celkern. (b) Het Golgi-apparaat (donkere gelaagde structuur) met blaasjes (zwarte omtrek met wit binnenste) die eruit gevormd en losgemaakt worden voor het eiwittransport. De eukaryote cel heeft aparte brandstoffabrieken, de mitochondriën (zie de elektronenmicroscopie opname in Figuur 1.5a). Hierin worden voedingsstoffen zoals suikers met behulp van zuurstof omgezet (‘geoxideerd’) in water en CO2. Bij deze reactie komt energie vrij, die gebruikt wordt om uit adenosine difosfaat (ADP) en een fosfaatgroep (P) adenosine trifosfaat, ATP, te maken. Dit molecuul is in alle organismen de energie-opslag van de cel. Mitochondriën zijn waarschijnlijk ooit bacterien geweest, die in een ver verleden met de eukaryote cel zijn gefuseerd. Ze bevatten dan ook eigen DNA. De struktuur binnenin een mitochondrie bestaat grotendeels uit membraanlagen waaraan de oxiderende enzymen vastzitten. Voor plantencellen geldt overigens dat de voornaamste energiebron licht is, met suikers als hulpbron. Voor deze lichtomzetting, de fotosynthese, heeft de cel een apart organel, de chloroplast (Figuur 1.5b). In de chloroplast wordt zowel glucose (uit water en CO2) als ATP gemaakt. Net als in de mitochondrie worden deze omzettingen gedaan met behulp van aan een interne membraan gebonden eiwitten. De chloroplast is vermoedelijk ook een voormalige bacterie, met eigen DNA. In Figuur 1.6 zie je een schematische weergave van de fusie, endosymbiose genaamd, van eukaryote cellen met mitochondriën en chloroplasten.

(a)

(b)

Figuur 1.5 Elektronenmicroscopie-opnamen van (a) mitochondrie en (b) chloroplast.

6

Figuur 1.6 Hypothese van de endosymbiose: het samengaan van eukaryote cellen met gespecialiseerde bacterien, die vervolgens de mitochondrien en chloroplasten vormen. Als eerste werden de mitochondrien opgenomen, en vervolgens heeft alleen bij planten de tweede fusiestap plaatsgevonden. Het deel van de cel dat ‘overblijft’ rondom alle organellen is het cytoplasma. Bij de eukaryote cel is dit niet een oplossing waarin alle moleculen en organellen los ronddrijven. Integendeel, het cytoplasma bevat een groot aantal structuurelementen, die samen onder de noemer ‘cytoskelet’ vallen. In Figuur 1.7 (a en b) zie je een tekening en een fluorescentiemicroscopie-opname van een cytoskelet. Het cytoskelet vervult een aantal verschillende rollen. Het geeft de cel stevigheid - in het bijzonder van belang voor dierlijke cellen zonder celwand - en verbindt de organellen met elkaar. Het cytoskelet speelt ook een hoofdrol bij verplaatsing in de cel: gespecialiseerde motoreiwitten hechten zich aan het cytoskelet en lopen erover heen. Hierbij kunnen ze grote objecten met zich mee dragen. Vaak gaat het daarbij om blaasjes, maar ook hele organellen kunnen zo binnen de cel verplaatst worden. Een derde functie is het verplaatsen van de cel als geheel, door te groeien aan één uiteinde van de cel, en vervolgens aan het andere einde te krimpen. Vanwege de belangrijke rol van het cytoskelet bij beweging in en van de cel gaan we er hieronder wat uitgebreider op in.

7

(a)

(b)

Figuur 1.7 Het cytoskelet. (a) Schematische weergave met de drie verschillende typen filament, de microtubuli, de actine filamenten en de intermediate filaments. (b) Fluorescentie-microscopie-opname van een cel met microtubuli (groen) en actine (rood), en blauwe celkern. 1.2.3 Het cytoskelet Het cytoskelet bestaat uit drie verschillende typen filamenten, elk met een eigen structuur en functie. Dit zijn de microtubuli, de actine filamenten en de intermediaire filamenten (zie ook Figuur 1.8a). Bij elke soort filament hoort een eigen type motoreiwit, om de bewegingen uit te voeren waar het filament voor verantwoordelijk is. Het dikste filament is de microtubulus, een soort buis (Figuur 1.8b). Microtubuli worden met behulp van ATP gevormd uit het eiwit tubulin, om precies te zijn uit een dubbel-molecuul (een zgn. dimeer) van α en β-tubulin. De microtubuli beginnen vanuit een centraal startpunt in de cel, het centrosoom of spoellichaampje. Aan het andere uiteinde vindt voordurende krimp en groei van de microtubuli plaats, doordat de reacties voor het toevoegen en voor het weghalen van tubulin-dimeren ongeveer even snel gaan. Pas als een ander organel wordt bereikt, blijft de microtubulus intact. Hiermee is een soort snelwegsysteem gevormd, waarlangs gericht transport in de cel kan plaatsvinden. In Figuur 1.8c zie je een cartoon van deze celsnelweg. Het transport langs microtubuli wordt verzorgd door de motoreiwitten kinesine en dyneine. De structuur van deze eiwitten is speciaal geschikt voor het verplaatsen van allerlei soorten cargo (lading).

(a)

8

(b)

(c) Figuur 1.8 (a) De drie typen filament van het cytoskelet. (b) De structuur van het dikste filament, de microtubulus. (c) Cartoon van de rol van ‘snelweg’ die de microtubuli vervullen in de cel. Op de voorgrond zie je het stappende motoreiwit dat een blaasje met zich meedraagt. Microtubuli spelen ook een hoofdrol bij de beweging van hele cellen: ze verzorgen zowel de stevigheid als de beweging van cilia en flagella, twee typen uitsteeksels die door cellen gebruikt worden om te kunnen zwemmen. Dit geldt overigens alleen voor eukaryote flagella. De variant die hierboven voor bacteriën werd genoemd bestaat uit filamenten van het eiwit flagellin. Microtubuli worden ook gebruikt bij de celdeling, de mitose (Figuur 1.9). Hierbij worden de chromosomen uit elkaar getrokken naar de twee polen die de nieuwe cellen zullen vormen. Dit uit elkaar trekken wordt verzorgd door het krimpen van microtubuli.

9

Figuur 1.9 Fluorescentiemicroscopie-opname van een cel tijdens de mitose met de microtubuli van de spindel (groen) en de chromosomen (blauw) vlak voor het uitelkaar trekken. Een tweede filamenttype is het actine (zie Figuur 1.10 a en b). Actine is ook een eiwitpolymeer, dat uit het monomeer actine wordt gevormd, met behulp van ATP. Actine filamenten vormen een netwerk aan de binnenkant van de celmembraan, dat de cel in vorm houdt. Daarnaast hebben ze een vergelijkbare rol voor de algemene stevigheid en het celintern transport als de microtubuli. Tenslotte is actine het filament dat de samentrekking van spieren verzorgt, samen met het motoreiwit myosine.

(a) Figuur 1.10 Het filament actine. (a) Weergave van de opbouw van actine uit in elkaar gedraaide strengen van actine monomeren. (b) Elektronenmicroscopie-opname van actine waarin de helixstructuur duidelijk te herkennen is.

10

Actine is het dunste filament en de microtubulus het dikste. Het derde type ligt er dus qua dikte tussenin, vandaar de naam intermediair filament (Figuur 1.11). Hiervan zijn allerlei verschillende typen. Eén soort, het lamine, zit als enige filament in de celkern en zorgt daar voor stevigheid. Andere typen zoals keratine zorgen voor de stevigheid van huid- en haarcellen. Bij het transport spelen deze filamenten geen rol, in tegenstelling tot de microtubuli en de actine filamenten.

Figuur 1.11 Het intermediaire filament. Linksboven een elektronenmicroscopieopname en linksonder een schematische weergave van de opbouw van één filament. Rechts een tekening van huidcellen waarin keratine-filamenten de stevigheid van de cellen en de binding tussen cellen regelen. 1.3 Beweging 1.3.1 Beweging van een hele cel Hele cellen die bewegen, doen dat op een manier die op het eerste gezicht erg lijkt op het zwemmen of kruipen wat wij doen. Maar schijn bedriegt. De grootte van een cel ligt ongeveer tussen de 1 en de 20 micrometer, en cellen hebben een gewicht van minder dan 0.001 tot 1 nanogram. Op die kleine schaal wordt alle beweging volkomen gedomineerd door wrijving. De krachten die door massa bepaald worden, inertiaalkrachten genaamd - een voorbeeld hiervan is de zwaartekracht -, doen er juist weer helemaal niet toe. Inertiaalkrachten spelen op de menselijke schaal wel een grote rol. Door de grote vrijwing lijkt dezelfde vloeistof enorm veel viskeuzer, ofwel stroperiger, dan bij bewegingen op grote schaal. Voor een bacterie is het zwemmen door water dan ook ongeveer vergelijkbaar met door stroop zwemmen voor ons. Hier hoort bij dat stoppen met zwemmen ook meteen stilstaan betekent, een stukje uitdrijven is er niet bij. Naast actieve beweging is er nog een andere vorm van beweging die op de micrometerschaal een grote rol speelt, namelijk diffusie. Bij kamertemperatuur bewegen moleculen1 met een snelheid die kan oplopen tot enkele honderden meters per seconde, de zogenaamde thermische snelheid. Door deze beweging zullen moleculen zich vanzelf verspreiden in een oplossing, zie Figuur 1.12. Een bacterie kan dan ook meestal gewoon afwachten tot zijn eten toevallig voorbij komt

1

Dit geldt voor moleculen in gassen en vloeistoffen, die vrij kunnen bewegen.

11

diffunderen. Of, met iets meer geduld, tot hij zelf toevallig in de goede richting diffundeert.

Figuur 1.12 Verspreiding van moleculen door een oplossing als gevolg van diffusie. Toeval is hier het cruciale woord: diffusie wordt geheel bepaald door toevallige bewegingen en botsingen. Overigens zijn het ook deze botsingen die de wrijving veroorzaken die bij actieve beweging in de cel zo’n grote rol speelt. De hoeveelheid botsingen is zo hoog dat een molecuul in vloeistof gemiddeld 1012 (1000 miljard) keer per seconde van richting verandert. De nieuwe richting heeft geen enkele relatie met de richting voor de botsing, dus het bewegingspatroon van zo’n molecuul is volkomen grillig en willekeurig. Ondanks deze willekeurigheid kan er toch heel precies over diffusie worden gesproken, en daarover gaat dan ook het tweede hoofdstuk van deze syllabus. Als diffusie toch niet snel genoeg gaat, zal er actieve beweging moeten plaatsvinden. Hiervoor hebben cellen allerlei speciale onderdelen ontwikkeld. Bijvoorbeeld de cilia, kleine flexibele haartjes die in bosjes aan de buitenkant van de cel zitten (Figuur 1.13a). Sommige eencelligen gebruiken cilia om zichzelf voort te bewegen. In meercellige organismen zoals wij worden cilia gebruikt om juist de omgeving in beweging te brengen: bijvoorbeeld om slijm uit ons ademhalingssysteem te werken. Om echt flink te kunnen zwemmen maken eencellige organismen vaak gebruik van een grotere staart, de flagella (Figuur 1.13b). Cilia en flagella bewegen op een bijzondere manier, vanuit macroscopisch standpunt, die wordt bepaald door de hoge viscositeit.

12

(a)

(b)

Figuur 1.13 Externe structuren voor celbeweging. (a) Elektronenmicroscopieopname van cilia op bronchiale cellen. (b) Elektronenmicroscopie-opname van een flagella met twee close-ups van de doorsnede, waarin de opbouw uit een ring van microtubule-buizen zichtbaar wordt. Gerichte beweging gaat niet vanzelf, in tegenstelling tot diffusie. Er zijn altijd motoreiwitten bij betrokken, die ervoor zorgen dat een flagella draait, zoals bij de E. coli bacterie, of dat de cilia buigen en weer terugzwiepen. De stevigheid van de bewegingsonderdelen komt van microtubuli of actine filamenten, en daartussenin zitten de motoreiwitten. Deze kunnen zich op zo’n manier over de filamenten verplaatsen dat twee naast elkaar liggende filamenten krom getrokken worden. In Figuur 1.14 zie je hoe dit werkt. Uit zo’n vervorming komt dan de golvende of zwiepende beweging voort. Voor al deze actie is energie nodig. De beweging van een motoreiwit is dan ook altijd gekoppeld aan de hydrolyse van ATP, de reactie waarbij ATP wordt opgesplitst in ADP en fosfaat (P). Op het hoe en wat van deze koppeling komen we nog terug.

Figuur 1.14 Illustratie van het buigen van cilia en flagella door motoreiwitten. Doordat naburige microtubuli aan elkaar vast zitten zorgt het lopen van de motoren voor een vervorming (rechts) in plaats van een verschuiving, zoals zou gebeuren bij losse tubuli (links).

13

Behalve door in gespecialiseerde zwemstructuren te zitten, is er nog een andere manier waarop filamenten voor beweging kunnen zorgen. In een cel is een voortdurende strijd tussen opbouw en afbraak van filamenten gaande. Een cel kan een stukje kruipen door aan één kant van de cel de groei van actine filamenten actief te bevorderen en aan de andere kant deze af te breken, of actief weg te trekken (Figuur 1.15). Aan de groeikant heeft de cel vlakke uitsteeksels waarin de actine polimerisatie plaatsvindt, de lamellipodia. Voor hulp bij het kruipen kan de cel zich hechten aan een externe structuur. Ook deze zogenaamde focale adhesie wordt verzorgd door een bundel actinefilamenten.

Figuur 1.15 Verplaatsing van een cel dankzij specifieke groei en afbraak van actinefilamenten in lamellipodia en punten van focale adhesie. Tot nu toe hebben we gesproken over bewegingen van enkele cellen. Maar ook macroscopische bewegingen van hele organismen maken gebruik van dezelfde elementaire onderdelen. Een spier is namelijk niets anders dan een enorme hoeveelheid precies in elkaar passende actine filamenten en clusters van motoreiwitten (Figuur 1.16a). Deze kunnen allemaal tegelijk ten opzichte van elkaar bewegen (Figuur 1.16b) en daardoor de spier inkorten, als er maar een sein naar de spier wordt gestuurd dat dit moet gebeuren.

14

(a)

(b) Figuur 1.16 De opbouw en werking van een spier. (a) Een spier bestaat uit een groot aantal spiervezels, die elk weer uit spiercellen bestaan. Rechtsonder is de structuur van de spiercel te zien met lichte banden waar alleen actinefilamenten zitten, en donkere banden waar de myosine-eiwitten filamenten vormen. (b) De samentrekking van een spierelement door het verplaatsen van de myosine-filamenten ten opzichte van de omliggende actinefilamenten. 1.3.2 Chemotaxis Het vorige stuk eindigde met het begrip ‘sein’. Bij gerichte beweging hoort eigenlijk altijd een sein, waardoor de beweging wordt ingezet of voortgezet. De E. coli bacterie wil bijvoorbeeld weten, of de hoeveelheid voedsel toeneemt of afneemt terwijl hij een stuk zwemt. Vervolgens past hij zijn zwemgedrag aan op de waargenomen verandering in concentratie, uiteraard met het doel om in de buurt te komen van meer eten. Het hele proces tussen het signaleren van een voedingsstof en de reactie erop door een cel wordt chemotaxis genoemd. Dit begrip is ook van toepassing op het waarnemen van gevaarlijke stoffen en maken dat je wegkomt, op het waarnemen van indringers door je immuuncellen, of bijvoorbeeld op het weten van een cel welke kant hij op moet om een nieuw bloedvat te gaan vormen. In Figuur 1.17 zie je een voorbeeld van chemotaxis. Cellen van de slijmschimmel dictyostelium discoideum verplaatsen zich naar een micropipet waar de stof cyclische AMP (cAMP) uit komt. De slijmschimmel gebruikt deze stof als communicatiemiddel om de cellen tot

15

clustering aan te zetten. Het cluster vormt dan als het ware een meercellig organisme dat als geheel op zoek kan gaan naar voedingsstoffen.

Figuur 1.17 Chemotaxis van dictyostelium discoideum: de cellen verplaatsen zich in de richting van een micropipet waaruit een oplossing met hoge concentratie cyclisch AMP stroomt. Het proces van chemotaxis wordt in drie hoofdstappen verdeeld: het waarnemen van de stof, de vervolgstappen in de cel die doorgeven dat de stof is gesignaleerd, en het in gang zetten van de gewenste beweging. Het waarnemen gebeurt uiteraard aan de buitenkant van de cel. Hiervoor zitten in de celmembraan receptoren. Dat zijn eiwitten die specifiek aan de belangrijke stof kunnen binden. Hierbij speelt beweging overigens ook weer een belangrijke rol. De receptoreiwitten ondergaan tweedimensionale diffusie door de membraan, en juist deze diffusie blijkt flink in snelheid toe te nemen als de gezochte stof aanwezig is. Dat is dan weer een sein voor de cel om de vervolgcascade van signalering in gang te zetten. Hoe deze cascade in zijn werk gaat is meer een vraag van de moleculaire biologie en daar zullen we dan ook niet echt op terugkomen. De derde stap uit chemotaxis is het omzetten van de gemeten stof in een beweging van de cel. Het karakter van deze gerichte beweging op nanoschaal wordt bepaald door diffusie en wrijving. In de beweging van E. coli zijn alle thema’s uit deze lapptop terug te zien. We komen daar nog op terug in verdere hoofdstukken, en geven hieronder alvast een korte beschrijving. Als E. coli in een omgeving met te weinig voedingsstoffen verkeert, is hij voortdurend aan het rondzwemmen. Hierbij schroeft hij zich door zijn stroperige omgeving met zijn draaiende flagella. Bij die schroefbeweging zijn uiteraard motoreiwitten betrokken. Ondertussen meet de bacterie voortdurend of de concentratie van voedingsstoffen toe- of afneemt. Naast rechtdoor zwemmen (‘run’) kan de bacterie met behulp van zijn bundel flagella ook draaien (‘tumble’). In Figuur 1.18 zie je hoe de bacterie de flagella voor deze twee bewegingsmethoden kan gebruiken. Dit draaien gebeurt met vaste tussenpozen, en de bacterie verandert daardoor willekeurig van richting. Tenzij, en dat is de crux, er een toename van voedingsstoffen wordt waargenomen. Dan wordt er niet gedraaid, en E. coli blijft nog een tijdje rechtdoor zwemmen de goede kant op. Zo ontstaat een patroon dat de naam ‘biased random walk’ heeft gekregen en dat netto tot een migratie naar hogere concentratie voedingsstof leidt.

16

Figuur 1.18 Flagella-rotatie van E. coli. Links de rotatie van alle flagella tegen de klok in, waardoor ze in elkaar gedraaid worden en een grote zwembeweging (run) kunnen maken. Rechts rotatie met de klok mee, waardoor de bacterie een willekeurige draaiing (tumble) maakt, om vervolgens in een andere richting verder te zwemmen. 1.3.3 Beweging in de cel Ook binnenin de cel is weer sprake van zowel diffusie als actief transport. Voor kleine moleculen zoals suikers, zouten, ATP, werkt diffusie binnenin een cel uitstekend en is het zonde van de energie om er een hele transportmachinerie voor op te zetten. Dit is bijvoorbeeld te zien in de calciumgolf in het bevruchte zeesterei in Figuur 1.19. We zullen verderop ook gaan rekenen aan de snelheden van diffusie en actief transport en zien dat deze voor kleine moleculen enigszins vergelijkbaar zijn op de schaal van een enkele cel.

Figuur 1.19 Verspreiding van een golf van calciumionen door een zeesterei na de bevruchting, vanuit de rechterbovenhoek. Maar diffusie alleen is niet genoeg. Binnen een cel moeten veel grote onderdelen verplaatst worden, waarvoor diffusie te langzaam zou gaan. Bijvoorbeeld vers gesynthetiseerde eiwitten, in hun eentje of zelfs hele blaasjes vol. In Figuur 1.20 zie je een leuk tekeningetje dat schetst hoe het innemen en afscheiden van stoffen door een cel in zijn werk gaat. Er ontbreekt alleen het een en ander. Het cytoskelet waar het langs gesleept wordt, en de motoreiwitten die dit slepen op zich nemen, worden niet getoond. Chromosomen moeten verplaatst worden, bij de celdeling. Ook moeten organellen regelmatig van plek worden verschoven. 17

Figuur 1.20 Opname en afgifte van stoffen door een cel met behulp van blaasjes. De blaasjes worden afgesplitst en verplaatsen zich vervolgens door de cel totdat ze kunnen fuseren met de membraan van de lokatie waar ze hun inhoud moeten afleveren. Het bewegen van motoreiwitten over een microtubule of actine ‘snelweg’ met een cargo op hun ‘rug’ is de manier waarop veel actief transport in de cel plaatsvindt. Het is overigens goed om te bedenken waarom zo’n snelweg nodig is. Door de enorme wrijving die het motoreiwit ondervindt binnenin de cel, kan het zich zonder vaste ondergrond nauwelijks bewegen. Zwemmen gaat veel moeilijker dan lopen op deze schaal. Behalve door iets te verslepen met motoreiwitten is er ook nog een andere veelgebruikte transportmethode: als er aan een organel eenmaal een filament vastzit, kan het filament vanaf het andere uiteinde ingekort of verlengd worden, en dan wordt het organel vanzelf meegesleept. Ongeveer zoals het verplaatsen van de hele cel (zie Figuur 1.15) ook in zijn werk gaat. Een derde soort celintern transport, dat we hier verder niet zullen behandelen, is het door een membraan heen trekken of pompen van stoffen, die hier niet vanzelf doorheen komen. 1.4 Microscopie 1.4.1 Lichtmicroscopie Uitzonderingen daargelaten zijn cellen te klein om met het blote oog gezien te worden. Het oog kan details van minimaal 0.1 mm onderscheiden terwijl cellen ongeveer 10 x zo klein zijn. Er zijn dus hulpmiddelen nodig. Het eenvoudigste middel is het vergrootglas, dat ongeveer tien keer kan vergroten. Voor hogere vergrotingen heb je een combinatie van meerdere lenzen nodig. Zo’n lenzencombinatie zit in een microscoop. Hiermee kunnen vergrotingsfactoren van boven de 1000 worden bereikt.

18

In Figuur 1.21 zie je een foto van een microscoop waarin de belangrijkste onderdelen staan aangegeven. Het betreft hier een inversiemicroscoop, waarin het preparaat van onderaf wordt bekeken. Dit type zul je veel in onderzoekslaboratoria aantreffen.

5 4

1 3 2 6

(a)

(b)

Figuur 1.21 (a) Inversiemicroscoop. De belangrijkste onderdelen, die ook in de tekst genoemd worden, zijn het eyepiece (1), het objectief (2), de tafel voor het preparaat (3), de condensor (4), de lichtbron (5) en de scherpstelknop (6). (b) 100 x objectief met numerieke apertuur (N.A.) 1.4. Het hart van een microscoop bestaat uit het objectief. Dit is een samengestelde lenzenset die heel sterk vergroot. Bij onderzoeksmicroscopen is een 60x of 100x objectief niet ongebruikelijk (zie Figuur 1.21b). Het objectief vangt het licht van het preparaat op. In het eenvoudigste type microscoop wordt de lichtbundel achter het objectief opgevangen door een oculair (vaak eyepiece genoemd), dat nog eens 10 x vergroot. Door het eyepiece kun je met je oog het uitvergrote preparaat bekijken. De totale vergroting is gelijk aan het produkt van de afzonderlijke vergrotingsfactoren van objectief en eyepiece. In Figuur 1.22a zie je het lichtpad voor deze combinatie.

(a)

19

(b) Figuur 1.22 Lichtpaden in de microscoop. (a) Basismicroscoop met objectief en eyepiece. Het af te beelden object wordt weergegeven met de groene pijl. Het oog ziet de vergrote afbeelding die met de oranje stippellijn-pijl wordt aangegeven. (b) ‘Infinity’ systeem waarbij de bundel tussen objectief en tube lens evenwijdig is. Ter plaatse van het ‘Intermediate Image Plane’ zou een camera kunnen staan. Het eyepiece kan ook met het Infinity systeem worden gecombineerd zoals in deze figuur aangegeven. Voor geavanceerdere microscopie is het ‘Infinity’ systeem ontwikkeld, zie Figuur 1.22b. Hierbij maakt het objectief de lichtbundel vanuit het preparaat evenwijdig. De naam ‘Infinity’ verwijst naar het feit dat lichtstralen uit een oneindig ver object altijd evenwijdig zijn. Bij dit systeem wordt een tube lens gebruikt, die het licht weer focuseert. Tussen objectief en tube lens kunnen nu allemaal optische elementen zoals polarisatoren of prisma’s worden geschoven zonder dat de afbeeldingskwaliteit wordt beïnvloed. Achter de tube lens kan weer een eyepiece worden geplaatst. Door een camera op het focus van de tube lens te plaatsen kan er een beeld van het preparaat worden opgenomen. De vergroting van dit beeld tov. het oorspronkelijke object is gelijk aan de verhouding tussen de brandpuntsafstanden van de tube lens en van het objectief. Deze verhouding ligt vaak in de buurt van een factor 100. Veel sterker vergroten is niet functioneel voor foto-opnamen. De kleinste details die het objectief kan afbeelden hebben een minimale grootte, die bepaald wordt door de lichtgolflengte (zie verder § 1.4.3). Dit minimum moet na de vergroting passen bij de pixelgrootte van de camera, anders wordt er onnodig licht over te veel pixels uitgesmeerd, wat de beeldkwaliteit negatief beinvloedt. Naast de afbeeldende lenzen is er natuurlijk nog meer nodig in een microscoop. Er is een houdertafel voor het preparaat. Diafragma’s om de hoeveelheid licht van en naar het preparaat te kunnen regelen. Een knop om scherp te stellen door de afstand tussen objectief en preparaat te veranderen. En een lichtbron, waarvan het licht op het preparaat wordt geconcentreerd door een aparte lens, condensor geheten. Bij de hoogste vergrotingen is het niet ongebruikelijk dat het objectief zelf deze rol vervult. De afstand tussen lens en preparaat is bij een grote vergroting namelijk heel klein. Twee lenzen zo dicht op het preparaat is niet altijd mogelijk. Veel microscopen bevatten nog allerlei extra onderdelen voor geavanceerde methoden. Hieronder gaan we kort op een paar van zulke methoden in. 1.4.2 Specifieke methoden De basismethode voor microscopie is de zogenaamde helderveld microscopie. Onbewerkt lamplicht schijnt op het preparaat en het doorvallende of gereflecteerde 20

licht wordt bekeken. Biologische preparaten worden vaak bekeken met doorvallend licht. De meeste figuren die je ziet in deze syllabus of in een boek over celbiologie zijn echter met meer geavanceerde methoden gemaakt. Dit is nodig omdat het contrast tussen de verschillende structuren in een cel heel laag is. De hele cel is vaak grotendeels doorzichtig. Een afbeelding lijkt door dit lage contrast veel minder gedetailleerd dan ze zou kunnen zijn. Om het contrast te verhogen worden diverse technieken gebruikt, zoals fasecontrastmicroscopie of DIC (Differentieel Interferentie Contrast). Hierbij worden kleine verschillen tussen de brekingsindices van twee stukjes van het preparaat benut. Met speciale ringen of prisma’s kun je deze brekingsindex-verschillen zichtbaar maken. Het voert te ver om hier op de werking van deze methoden in te gaan. Ter illustratie zie je in Figuur 1.23 de standaard helderveld microscopie vergeleken met de fasecontrastmethode voor één en dezelfde cel.

Figuur 1.23 Helderveld-opname van een enkele cel vergeleken met een fasecontrastopname van dezelfde cel (celtype onbekend). Een andere veelgebruikte methode om biologische preparaten beter zichtbaar te maken is fluorescentiemicroscopie. Hierbij wordt een fluorescerende kleurstof aan het preparaat toegevoegd. De kleurstof neemt licht op van de lichtbron van de microscoop, en zendt vervolgens zelf weer licht uit met een iets langere golflengte dan de oorspronkelijke. Dit principe wordt afgebeeld in Figuur 1.24. Door dit golflengteverschil kan de fluorescentie goed van het oorspronkelijke licht worden gescheiden. Bij voorkeur hecht de kleurstof zich alleen aan bepaalde celonderdelen of stoffen in de cel, bijvoorbeeld aan DNA of microtubuli. Zie bijvoorbeeld de opname van de celdeling in Figuur 1.25, waarin het actineskelet (rood), de microtubuli (groen) en de chromosomen (blauw) te herkennen zijn. Met fluorescentiemicroscopie kunnen vele celonderdelen en stoffen zichtbaar gemaakt worden die van zichzelf niet groot genoeg of absorberend genoeg zijn om gezien te worden.

21

(a)

(b)

Figuur 1.24 (a) Absorptie van licht door een molecuul (blauwe pijl) brengt het molecuul in een hogere energietoestand (‘excited state’). Het molecuul valt weer terug naar de laagste toestand (‘ground state’) en zendt daarbij zelf fluorescentielicht uit (groene pijl). (b) Absorptie- en fluorescentiespectra van een typische groene en rode kleurstof.

Figuur 1.25 Fluorescentiemicroscopie-opname van een delende cel met de chromosomen (blauw), de microtubuli die de twee sets chromosomen uit elkaar trekken (groen) en het actineskelet (rood). 1.4.3 Resolutie Wat zijn de kleinste details die je met een microscoop kunt onderscheiden? Het criterium hiervoor is de resolutie ofwel het scheidend vermogen (een derde term hiervoor is optische diffractielimiet). De resolutie wordt fundamenteel beperkt door de golflengte van het licht. Licht wordt namelijk altijd afgebogen aan objecten waar het langs gaat. Bij grote objecten valt dit niet op, maar bij heel kleine objecten (kleiner dan de golflengte) is het afbuigingspatroon (‘diffractiepatroon’) groter dan het object zelf. In Figuur 1.26a zie je een buigingspatroon ten gevolge van lichtverstrooiing aan een kleine spleet. De grootte van dit patroon hangt niet af van de grootte van het object, maar alleen van de lichtgolflengte en de eigenschappen van de afbeeldende lens. De afstand d0 van het maximum tot het eerste minimum is gelijk aan d0 =

λ 2 NA

(1.1)

22

met λ de golflengte van het licht en NA de zogenaamde numerieke apertuur van de lens. Dit is een weergave van de openingshoek van de lens. Met α gelijk aan de halve openingshoek (zie Figuur 1.26b) geldt dat NA = n sin α

(1.2)

met n de brekingsindex van het medium tussen preparaat en objectief. Hoe groter de hoek, des te meer licht de lens van het preparaat kan opvangen en des te scherper daarmee de afbeelding.

(a)

(b)

(c) Figuur 1.26 Optische resolutie. (a) Het buigingspatroon van licht aan een voorwerp dat kleiner is dan de golflengte, met afstand d0 tussen maximum en eerste minimum van het patroon. (b) Close-up van het objectief met halve openingshoek α. (c) Het scheidend vermogen tussen twee objecten wordt bepaald door de buigingspatronen en daarmee door d0. De grootte van het buigingspatroon bepaalt ook het scheidend vermogen. Als twee objecten binnen een afstand d0 van elkaar liggen kun je ze niet meer van elkaar onderscheiden, omdat de buigingspatronen dan samenvallen. Je ziet dit principe weergegeven in Figuur 1.26c. Bij een typische onderzoeksmicroscoop is de resolutie gelijk aan een paar honderd nanometer. Het objectief in Figuur 1.21a heeft een NA van 1.4, één van de hoogste bestaande waarden. Met zichtbaar licht van 550 nm golflengte vinden we voor dit objectief een d0 van 240 nm. Hiermee komen we bij een heel belangrijke, zo niet de belangrijkste, beperking van de lichtmicroscopie voor de celbiologie. Details van structuren in de cel zijn veel kleiner dan een paar honderd

23

nanometer en kunnen met gewone lichtmicroscopie niet afzonderlijk waargenomen worden. Daarvoor zijn andere methoden nodig, waarover hieronder meer. 1.4.4 Single-molecule microscopie Met fluorescentiemicroscopie aan één molecuul kun je de fundamentele resolutielimiet ontduiken. De afbeelding van één molecuul is weliswaar nog altijd even groot als in Figuur 1.26. Maar doordat er geen andere moleculen in de buurt zijn met overlappend buigingspatroon kan de positie van de piek van het patroon heel nauwkeurig bepaald worden. De precisie waarmee je de molecuulpositie weet, is gelijk aan de onzekerheid in de bepaling van deze piekpositie. Dit principe zie je afgebeeld in Figuur 1.27. De grootste precisie waarmee gemeten kan worden is tot dusver ongeveer een nanometer. Het gaat hierbij overigens altijd om fluorescentiemicroscopie. Onder de naam FIONA (Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy) is deze methode bijvoorbeeld gebruikt om stapgroottes van motoreiwitten te bepalen. Ook bestaat er een methode, PALM (Photo Activation Localization Microscopy) genaamd, waarbij om beurten dicht bij elkaar in de buurt liggende moleculen op een grotere structuur worden bekeken. Hiermee kan van deze structuur een veel nauwkeuriger beeld worden gereconstrueerd dan bij het gelijktijdig waarnemen van alle moleculen met hun overlappende buigingspatronen. In Figuur 1.27b zie je een voorbeeld van een PALM opname van microtubuli.

∆r

(b) (a) Figuur 1.27 (a) Precisie van de positiebepaling voor één enkel molecuul. De door het buigingspatroon bepaalde afbeelding van het molecuul (alleen de binnenste felle spot van het ringenpatroon is zichtbaar) komt overeen met de grote donkergrijze spot (breedte d0). De blauwe spot (breedte ∆r) geeft de nauwkeurigheid weer waarmee de positie van het molecuul bepaald kan worden uit de piek van het buigingspatroon. De curve onderaan is een gaussische kromme die het intensiteitsverloop binnen het patroon aangeeft. Het fitten van deze kromme aan het gemeten buigingspatroon wordt gebruikt om de piekpositie te bepalen.(b) PALM opname (onder) van microtubuli, gereconstrueerd uit single-molecule metingen van hieraan gebonden kleurstoffen, die om beurten worden geactiveerd. Ter vergelijking (boven) een gewone fluorescentiemicroscopie-opname van dezelfde structuur. 24

Een andere truc die je kunt toepassen bij het kijken naar enkele moleculen is het vasthouden van het molecuul. Het molecuul kan dan bijvoorbeeld gekoppeld worden aan een mechanisch systeem dat veel preciezer ingesteld kan worden dan de optische diffractielimiet. Je meet dan niet waar het molecuul zit, maar waar je preparaathouder staat. Een andere mogelijkheid is het binden van het molecuul aan iets groters, waarvan de positie makkelijker gemeten kan worden. Een voorbeeld daarvan is de optische pincet (zie Figuur 1.28). Hierbij wordt het molecuul (bijvoorbeeld een motoreiwit) aan een veel groter balletje (‘bead’) gebonden. De enigszins doorzichtige bead bevindt zich in een gefocuseerde lichtbundel. Door de breking van licht in de bead verandert het licht van richting. Deze richtingverandering staat gelijk aan een verandering van impulsmoment van de fotonen, en daarmee aan een kracht. Deze lichtkracht werkt op de bead, en wel zo dat ze deze altijd zal terugduwen naar het focus van de bundel. Als het molecuul beweegt, wordt de bead meegetrokken, tegen de lichtkracht in. De verplaatsing van de bead als gevolg van de stap van het molecuul wordt gemeten met een camera of een quadrant fotodiode. De pincetpositie wordt meeverplaatst na elke stap, zodat de uitgangssituatie niet verandert. Omdat de bead zo groot is kan het buigingspatroon heel precies worden geregistreerd en de positie heel nauwkeurig worden bepaald. Deze methode kan overigens ook met een los bolletje dat niet in een optische pincet zit, maar dan zal het balletje veel toevallige bewegingen maken die het effect van het molecuul minder goed zichtbaar maken.

Figuur 1.28 Optische pincet/ optische val met de bead (blauw) in het midden van de bundel (rood), maar boven het focus. De lichtstralen (bruin) breken in de bead en oefenen daarmee een optische kracht (zwart)op de bead uit. Het netto resultaat van de getekende krachten is een kracht die de bead naar beneden trekt. Dit gaat door totdat het focus is bereikt.

25

1.4.5 Elektronenmicroscopie We zagen hierboven dat de resolutie van de lichtmicroscopie door de golflengte van licht wordt bepaald. Om een hogere resolutie te halen, zou je elektromagnetische straling met een kortere golflengte kunnen gebruiken zoals röntgenstraling. Dit is echter moeilijk te realiseren, omdat er geen geschikte optica voor bestaat. Nu wil het geval, dat niet alleen fotonen, maar ook materiedeeltjes zoals elektronen een golflengte hebben. Deze golflengte is i.h.a. veel korter dan die van zichtbaar licht. Dit verschijnsel, de zogenaamde golf-deeltje dualiteit, is een onderdeel van de quantummechanica, een deel van de natuurkunde waarop we hier niet verder in gaan. Met elektronen kan wel een microscoop gebouwd worden, met magneten als lenzen. In Figuur 1.29a zie je een elektronenmicroscoop afgebeeld met het schema van de elektronenbundel erbij (Figuur 1.29b). In plaats van een lichtbundel wordt er een bundel elektronen naar het sample gestuurd, en met magnetische lenzen gefocuseerd. Door de botsing met het sample buigen de elektronen af, en de grootte van de afbuiging laat zien hoe de structuur van het preparaat is. Er bestaat een versie die naar doorgelaten elektronen kijkt, de Transmission Electron Microscope (TEM), en een versie die naar gereflecteerde elektronen kijkt en daarbij de bundel over het preparaat scant, de Scanning Electron Microscope (SEM).

(a)

(b)

Figuur 1.29 Elektronenmicroscoop. (a) Foto van een Transmission Electron Microscope (TEM) en (b) schema van een Scanning Electron Microscope (SEM). De golflengte van een deeltje is omgekeerd evenredig met de energie van het deeltje. Met een goed gekozen spanning in de elektronenmicroscoop is het mogelijk om een biologisch preparaat in groot detail te bekijken. De electronenmicroscoop wordt dan ook zeer veel gebruikt om structuren van celonderdelen en zelfs eiwitten mee te bestuderen. In deze syllabus zie je dan ook een heel aantal elektronenmicroscopieopnamen voorbij komen. Zie bijvoorbeeld de opnamen met een TEM in Figuur 1.5 a en b en de SEM opname in Figuur 1.13. De elektronenmicroscoop heeft echter ook enkele grote nadelen ten opzichte van de lichtmicroscopie. Ten eerste bevinden preparaat en electronenbundel zich in vacuum. Daarnaast moet het preparaat extreem dun zijn, want de elektronen komen nog geen micrometer ver het materiaal in. Een hele cel van 10 µm is dus al veel te dik

26

om doorheen te kijken. Alleen de buitenkant kan worden bestudeerd. Voor interne details moet de cel in plakjes van ca. 0.1 µm worden gesneden. Bovendien moet het preparaat bevroren worden om beschadigingen door de energierijke elektronen te beperken. Een functionerend biologisch systeem kan dan ook niet met elektronenmicroscopie worden bestudeerd.

27

2

Diffusie

2.1 Inleiding Diffusie komt uit het latijn en betekent verspreiding. Door diffusie zullen deeltjes altijd zo veel mogelijk de hele ruimte opvullen die ze ter beschikking hebben. Je ziet dit bijvoorbeeld aan het mengen van stoffen, zoals een druppel inkt die zich vermengt met water totdat er een vloeistof met een egale kleur ontstaat (Figuur 2.1a en b). Het begrip diffusie wordt overigens niet alleen gebruikt voor verspreiding van deeltjes, maar ook voor verspreiding van fysische grootheden zoals warmte. In dit hoofdstuk zullen we het alleen hebben over deeltjesverspreiding. De term diffusie wordt ook gebruikt voor de bewegingen die aan deze verspreiding ten grondslag liggen. Bewegingen die altijd doorgaan, ook als de gelijkmatige verspreiding allang een feit is en je op grote schaal geen veranderingen meer ziet. De bewegingen die verspreiding veroorzaken, bestaan uit een combinatie van thermische bewegingen van enkele deeltjes en onderlinge botsingen tussen deeltjes. Hoe hoger de temperatuur, hoe sneller de deeltjes bewegen en dus hoe sneller diffusie zal verlopen. Hoe vlot diffusie verloopt, hangt ook af van de toestand van de stof: zowel in gassen, vloeistoffen als vaste stoffen vindt diffusie plaats, maar in gassen gaat het verreweg het snelste bij dezelfde temperatuur. Bij cellen en organismen gaat het uiteraard vooral om diffusie in vloeistoffen.

(a)

28

(b) Figuur 2.1 Diffusie van kleurstof in water. (a) Foto-opnamen van inkt in water aan het begin van het diffusieproces. (b) Schematische weergave van de verspreiding van de kleurstofmoleculen. 2.2 Diffusie en verspreiding 2.2.1 Random walk De eerste waarnemingen van diffusiebewegingen werden gedaan door Robert Brown in 1827, toen hij stuifmeelkorrels (Figuur 2.2a) in water willekeurige bewegingen zag maken onder de microscoop. Dit gedrag wordt dan ook de Brownse beweging genoemd. Alle deeltjes ondergaan deze beweging, maar hoe groter het deeltje is, hoe langzamer het gaat. In water zal bijvoorbeeld de botsing tussen 2 watermoleculen een groot effect op de beweging van beide moleculen hebben. Bij grotere deeltjes zoals stuifmeelkorrels of sigaretterook-roetdeeltjes vinden er een groot aantal botsingen tegelijk plaats tussen de korrel en de water- of luchtmoleculen eromheen (zie Figuur 1.2b voor het idee van zo’n groter deeltje). Alleen als er toevallig even niet precies evenveel botsingen aan beide kanten van het deeltje plaatsvinden, zal het deeltje in beweging worden gebracht. Zo’n toevalligheid doet zich altijd wel een keer voor. Maar hoe groter het deeltje, hoe minder vaak het verschil groot genoeg is voor een zichtbaar effect. Dat je een stuifmeelkorreltje, dat ongeveer een miljoen keer groter is dan een watermolecuul, iets kunt zien doen is eigenlijk al ongelofelijk.

29

(a)

(b)

Figuur 2.2 Brownse beweging. (a) Elektronenmicroscopie-opname van stuifmeelkorrels. (b) Schematische weergave van een groter deeltje temidden van vele kleinere snel bewegende deeltjes. Kijken we naar het bewegingspatroon van een deeltje tijdens het diffusieproces, dan zien we dat het deeltje een zogenaamde random walk volgt. Hierbij beweegt het deeltje telkens een stukje, verandert vervolgens willekeurig van richting, beweegt weer een stuk, enzovoort. In Figuur 2.3 zie je een voorbeeld van zo’n random walk in drie dimensies. Kenmerkend is het grillige patroon, waarbij de positie lange tijd nauwelijks verandert, en vervolgens ineens heel veel. Dit laatste is vergelijkbaar met heel vaak een dobbelsteen gooien, en ineens een lange reeks van zessen krijgen. Als je maar lang genoeg blijft gooien gebeurt dit vanzelf.

Figuur 2.3 Simulatie van een driedimensionele random walk. We vereenvoudigen het voorbeeld uit Figuur 2.3 door de random walk in 1 dimensie te laten plaatsvinden met een vaste stapgrootte L en een vaste staptijd ∆t (Figuur 2.4). Bij echte diffusie zullen de stapgrootte en de tijd tussen twee botsingen natuurlijk per 30

keer variëren. Bij elke stap is de kans 50% dat deze naar links wordt gezet, en 50% kans naar rechts. Deze aanname is wel vrij realistisch: pas bij een netto beweging van alle deeltjes in een richting (‘drift’) zal de kansverdeling anders liggen.

−4L

−3L −2L

−L

0

L

2L

3L

4L

Figuur 2.4 As waarlangs een deeltje zich beweegt tijdens een eendimensionale random walk met stapgrootte L. Om een gevoel te krijgen voor het resultaat van zo’n 1D random walk moet je je voorstellen dat je per stap kop of munt gooit voor links of rechts, en alle kop/muntcombinaties eens opschrijven voor een paar verschillende stapaantallen. In Tabel 2.1 zie je dit voor 2 en 4 stappen uitgewerkt. In totaal levert dat vier respectievelijk 16 mogelijke stapcombinaties op, met dezelfde kans voor alle combinaties. Het eindresultaat, de bereikte positie, is natuurlijk hetzelfde voor meerdere combinaties, omdat het niet uitmaakt of je eerst rechts gaat, en dan links, of andersom.

31

Eéndimensionale random walk met 2 stappen Realisaties

Positie

Afstand

Kwadratische afstand

rr

2L

2L

4L2

rl

0

0

0

lr

0

0

0

ll

-2L

2L

4L2

Aantal: 4

Gemiddelde: 0

Maximum: 2L

Gemiddelde: 2L2

Eéndimensionale random walk met 4 stappen Realisaties

Positie

Afstand

Kwadratische afstand

rrrr

4L

4L

16L2

rrrl

2L

2L

4L2

rrlr

2L

2L

4L2

rrll rlrr

0 2L

0 2L

0 4L2

rlrl

0

0

0

rllr

0

0

0

rlll

-2L

2L

4L2

lrrr

2L

2L

4L2

lrrl lrlr

0 0

0 0

0 0

lrll

-2L

2L

4L2

llrr

0

0

0

llrl

-2L

2L

4L2

lllr llll

-2L -4L

2L 4L

4L2 4L2

Aantal: 16

Gemiddelde: 0

Maximum: 4L

Gemiddelde: 4L2

Tabel 2.1 Uitwerking van alle mogelijke ééndimensionale random walks voor 2 en 4 stappen. Wat is het gemiddelde resultaat van een random walk? Hiervoor geven we in Tabel 2.1 de maximale afstand tot het beginpunt, de gemiddelde positie, en de gemiddelde afstand tot het beginpunt. De maximale afstand, zie Tabel 1, is gelijk aan 2*L resp. 4*L, oftewel het aantal stappen N, keer de stapgrootte L, dus N*L. De gemiddelde positie is daarentegen gewoon 0! Het deeltje komt gemiddeld even vaak rechts als 32

links van de beginpositie uit, vandaar. Ook bij hogere waarden van het stapaantal N blijft dit gelden. Misschien denk je al bijna dat er dus helemaal geen verspreiding optreedt, nu de netto verplaatsing gemiddeld nul is. Dat er wel degelijk verspreiding plaatsvindt zie je vooral aan de meest belangrijke maat van de drie: de gemiddelde afstand tot het beginpunt. Hierbij tellen de beide zijden van het nulpunt positief, zodat deze elkaar niet opheffen. In de voorbeelden van Tabel 1 vinden we voor 2 stappen een gemiddelde afstand van ( 2)*L, en voor 4 stappen vinden we 2*L. De toename van de gemiddelde afstand lijkt dus evenredig te zijn met N! We zullen zometeen aantonen dat dit inderdaad voor alle waarden van N geldt. De toename van de gemiddelde afstand tot het beginpunt is dus evenredig met de wortel van de tijdsduur van het diffusieproces. Dit is een heel fundamentele diffusie-eigenschap zoals we zullen zien. De relatie die de volledige statistiek van de random walk beschrijft is de zogenaamde binomiaalverdeling. Deze verdeling laat zien hoe groot de kans is op k keer de gebeurtenis g, voor een N aantal keer proberen met per keer een kans p op g. De vorm van de binomiaalverdeling wordt gegeven door:

P ( N , k , g ) = p gk (1 − p g ) N − k

N! k!( N − k )!

(2.1)

Het symbool ! betekent faculteit en N! bestaat uit het produkt van alle getallen tot N. (3!=3x2x1=6; 4!=4x3x2x1=24). De binomiaalverdeling is op veel kansprocessen van toepassing, voor kop of munt gooien geldt ze bijvoorbeeld even goed als voor de 1D random walk. In Figuur 2.5 zie je een experimenteel bepaalde benadering voor de binomiaalverdeling voor N = 120, gemiddeld over 100 verschillende random walks. De voorbeelden in Tabel 1 zijn ook binomiaalverdelingen voor N = 2 en N = 4. Als de gebeurtenis g ‘naar links stappen’ betekent, is P(4, 2, links) de kans op twee keer naar links gaan, bij in totaal vier stappen. Invullen in de formule voor de 4! binomiaalverdeling vinden we dat P(4, 2, links) = (0.5)2 * (0.5)2 * en dit is 2!∗ 2! 24 gelijk aan 0.25*0.25* = 0.375. Dit is ook precies wat je vindt als je het aantal 2∗2 mogelijkheden uit tabel 1 met 2 x links (llrr, lrlr enzovoort) deelt door het totaal aantal mogelijkheden: 6/16 = 0.375.

33

Figuur 2.5 Experimentele benadering van de binomiaalverdeling voor 100 random walks van 120 stappen. 2.2.2 Diffusieconstante Zoals we hierboven al konden zien uit de twee voorbeelden in Tabel 1, lijkt de gemiddelde afstand tot het beginpunt voor een diffunderend deeltje evenredig te zijn met de wortel uit het aantal stappen. Dit kan als volgt op een algemene manier afgeleid worden voor de 1D random walk met stapgrootte L en staptijd ∆t. Neem het aantal stappen gelijk aan N. Voor één bepaalde random walk is de bereikte positie na N stappen gelijk aan xN (met beginpunt x0 = 0). Bij middeling over een groot aantal random walks is de positie gelijk aan <xN> met < > het gebruikelijke symbool voor ‘gemiddelde’. Zoals hierboven al genoemd is deze waarde 0. De gemiddelde afstand tot het beginpunt is gelijk aan

x N2 . Voor het gemak

zullen we vooral kijken naar het kwadraat van de gemiddelde afstand, <(xN)2>. De officiele term voor deze grootheid is gemiddelde kwadratische afstand ofwel ‘Mean square displacement’ (MSD). We bepalen nu het verschil tussen de MSD voor N en die voor N+1:

(x N +1 )2

= ( x N + k N +1 L )

2

(2.2)

met kN+1 gelijk aan 1 of −1, beide met 50% kans; dit geeft aan of de (N+1)-de stap naar links of naar rechts gaat. Uitwerken van het kwadraat van de som geeft: <(xN + kN*L)2> = <( (xN)2 + 2L (xN*kN+1) + L2 (kN+1)2 ) > Een gemiddelde van een som is gelijk aan de som van de gemiddelden en bovendien kunnen konstanten altijd uit middelingshaakjes worden gehaald. Daarmee krijg je:

(x N +1 )2

= x n2 + 2 L x N k N +1 + L2 (k N +1 )

2

(2.3)

34

Een basisuitgangspunt is van het begrip ‘random walk’ is dat alle stappen onafhankelijk van elkaar zijn. In dat geval hoort bij elke waarde van xN een vervolgstap die zowel naar links (kN+1 = −1) als naar rechts (kN+1 = 1) kan gaan met een even grote kans. Het gemiddelde van xN*kN+1 is daarmee gelijk aan 0. Het gemiddelde van kN+12 is altijd 1, want (−1)2 = 12 = 1. Daarmee vinden we:

(x N +1 )2

= x n2 + L2

(2.4)

Het verschil tussen twee opeenvolgende waarden voor de MSD is dus altijd L2. Daaruit kun je concluderen dat wel moet gelden <(xN)2> = N * L2, ofwel de MSD is evenredig met het aantal stappen N. Over het algemeen zal men de gemiddelde afstand of de verspreiding eerder als functie van de tijd willen definieren dan als functie van het aantal stappen. Voor ons voorbeeld met staptijd ∆t geldt dat het aantal stappen N in een tijd t, gelijk zal zijn aan t/∆t. We vinden dan

(

)

x 2 (t ) = L2 ∆t ∗ t

(2.5)

De evenredigheidsfactor tussen de MSD <x2(t)> en t staat bekend als de diffusieconstante (D). Van oudsher is deze zo gedefinieerd dat voor de 1D random walk geldt: x 2 (t ) = 2 D t

(2.6)

waarmee voor ons voorbeeld de diffusieconstante gelijk is aan D = (L2/2∆t). De factor 2 in vergelijking 6 heeft te maken met de definitie van D in historisch eerdere vergelijkingen. De diffusieconstante is een grootheid die de snelheid van verspreiding aangeeft, hoe groter, hoe sneller de diffusie. Omdat het om een kwadratische afstand gaat is de eenheid van D gelijk aan m2/s. 2.2.3 Diffusiesnelheid en concentratie Diffusie is een proces wat over gemiddelden en grote getallen gaat. Als je één enkele random walk van één enkel molecuul volgt, zal deze zeker niet aan de vergelijking (2.6) voor de MSD voldoen. Je vindt pas een goede waarde voor de MSD als je middelt over grote aantallen. Precies zoals een dobbelsteen helemaal niet voor iedereen even vaak 6 lijkt te gooien... Als je het over grote aantallen moleculen hebt, spreek je vaak over de grootheid concentratie (c), die in aantal deeltjes per volume (N/V) of aantal mol per volume (eenheid molair) wordt uitgedrukt. Diffusie neigt naar het uitwissen van concentratieverschillen, zoals je in Figuur 2.6 ziet afgebeeld. Binnenin een celcompartiment of organel zal de concentratie van een in water oplosbare stof dan ook meestal constant zijn, tenzij er een verstoring optreedt zoals de bevruchting van het zeesterei (hoofdstuk 1 Figuur 1.19). Zodra de concentratie niet overal gelijk is, treedt een netto deeltjesstroom op ten gevolge van diffusie. De eenvoudigste vorm daarvan kennen jullie misschien uit de biologie, de wet van Fick:

35

j = −D

dc dx

(2.7)

Merk op dat hier géén factor 2 voor de D staat. De grootheid j is de flux, ofwel het aantal deeltjes per tijdseenheid en oppervlakte eenheid dat in een bepaalde richting beweegt. Er bestaan overigens ook fluxen van andere grootheden dan aantallen deeltjes, zoals elektrische lading. Diffusie zorgt altijd voor een flux van hoge naar lage concentratie, dit wordt uitgedrukt in het minteken in vergelijking (7).

Figuur 2.6 Diffusie zorgt voor verspreiding van hoge naar lage concentratie volgens de wet van Fick. Gecompliceerder wordt het als de concentratie niet alleen van de plaats (x) maar ook van de tijd (t) afhangt. De algemene diffusievergelijking hiervoor luidt:

∂c ∂ 2c =D 2 ∂t ∂x

(2.8)

Het symbool staat voor ‘partiële afgeleide’ en geeft aan dat de andere variabelen constant worden gehouden bij het differentiëren (dus x blijft constant bij differentiëren naar t en vice versa). We zullen niet verder op de ins en outs van deze vergelijking ingaan, maar we wilden hem hier toch even noemen, omdat veel diffusieprocessen in de cel met zo’n tijds- en plaatsafhankelijk concentratieprofiel moeten worden beschreven. Een bekend en relatief eenvoudig voorbeeld van een tijdsafhankelijk profiel is de verspreiding van een stof vanuit één enkel punt. Het model dat deze situatie beschrijft is precies de random walk vanuit één startpunt, en dan gemiddeld over heel veel realisaties. Ook zijn de stapjes zo klein en zijn het er zo veel, dat we een continue2 schaal x moeten gebruiken, in plaats van een discreet aantal stappen met een 2 Het begrip ‘continu’ houdt in dat alle waarden (eventueel binnen een bepaald bereik) kunnen worden aangenomen. ‘Discreet’ is de term voor een reeks waarden met vaste intervallen, waarbij tussenliggende waarden worden overgeslagen.

36

vaste grootte zoals in het voorbeeld uit Figuur 2.4/Tabel 2.1. Deze continue vorm van de binomiaalverdeling is de Gaussverdeling (ook normaalverdeling genoemd), die in één dimensie de volgende vorm heeft:

p ( x) =

1

σ 2π

e (− x

2

2σ 2

)

(2.9)

voor de waarschijnlijkheid p als functie van x. Hieruit volgt het concentratieprofiel dat verspreiding vanuit een puntbron beschrijft: c ( x, t ) =

N tot 2πDt

e (− x

2

4Dt

)

(2.10)

voor de deeltjesconcentratie c(x,t) = N(x,t)/V en Ntot het totaal aantal deeltjes. In Figuur 2.7 zie je hoe deze verspreiding er uit ziet. De breedte van het profiel neemt toe met de tijd, en de gemiddelde afstand tot het startpunt bij x=0 is gelijk aan σ met σ2= 2Dt. Concentratie op tijd t=1, 50, 500 s

Concentratie 3 (deeltjes/m )

3.00E+05 2.00E+05 1.00E+05 0.00E+00 -100

-50

0

50

100

Positie x (m)

Figuur 2.7 Diffusie vanuit één punt levert een voortdurend breder wordend gaussprofiel op voor de concentratie. Voor dit voorbeeld is een deeltjesaantal Ntot van 106 en een diffusieconstante D van 1 m2/s gebruikt. 2.3 Diffusie in cellen We zien dat diffusie wordt beschreven met een kwadratische afstand, de MSD, die lineair is met de tijd. Je ziet deze relatie in Figuur 2.8 afgebeeld in een grafiek. Deze kwadratische relatie betekent dat het vier keer zo lang duurt om twee keer zo ver te komen! Dit geeft al aan dat diffusie vooral op kleine schaal van belang is.

37

2

MSD (m )

80 60 40 20 0 0

10

20

30

Time (s)

Figuur 2.8 Gemiddelde kwadratische afstand (MSD) tot het beginpunt als functie van de tijd voor diffusie in één dimensie. Voor dit voorbeeld is een diffusieconstante D van 1 m2/s gebruikt. Binnen een cel van enkele tientallen micrometer zullen diffusie en gerichte beweging in veel gevallen vergelijkbaar zijn. Neem het volgende voorbeeld. Het motoreiwit kinesine loopt over de microtubulus met stappen van 8 nm en zet 100 stappen per seconde. De tijd die kinesine nodig heeft om een cel van 20 µm te doorkruisen wordt 20 ∗ 10 −6 m dan tkin = = 25 seconden. Voor diffusie is het bekend dat de 8 * 10 −9 m * 100 / s diffusieconstante voor kinesine in de cel ongeveer 10-10 m2/s is. Om gemiddeld 20 µm af te leggen met diffusie is een MSD van (20 µm)2 nodig. Dit wordt bereikt in tdiff = 400 *10 −12 m 2 = 2 seconden. 2 * 1 * 10 −10 m 2 / s Je zou je naar aanleiding van dit voorbeeld kunnen afvragen wat het nut van gerichte beweging is. Maar als je bedenkt dat er ook wel eens stoffen naar het andere uiteinde van een zenuwcel, over een afstand van ongeveer een meter, vervoerd moeten worden, komen de verhoudingen al heel anders te liggen. En er zijn nog meer redenen waarom gerichte beweging noodzakelijk is, die in het volgende hoofdstuk aan de orde zullen komen. Probeer er alvast een paar te bedenken! In het algemeen geldt, dat kleine en veel voorkomende moleculen door diffusie wel op de goede plekken in de cel terecht zullen komen. Denk hierbij aan ATP, suikers, water, ionen. Er wordt veel wetenschappelijk onderzoek verricht naar biologische processen waarbij diffusie een rol speelt. Een goede vraag is daarom, hoe je de diffusie meet. In het geval van de calciumgolf uit Figuur 2.19 van het vorige hoofdstuk, zie je dat er een duidelijke afstand is tot waar de verspreiding zich uitstrekt. Als je een groot aantal deeltjes tegelijk ziet diffunderen, zal de breedte van het concentratieprofiel, gekarakteriseerd met de mean square displacement (MSD) een 38goede maat zijn voor de diffusie. Afhankelijk van de wiskundige vorm van het profiel is de MSD een specifiek gedefinieerde maat. Voor het Gaussprofiel dat de verspreiding uit één punt beschrijft, is deze gelijk aan σ. In veel biofysisch onderzoek wordt echter helemaal niet naar een groot aantal deeltjes gekeken, maar naar enkele moleculen. Er zijn namelijk vaak maar weinig exemplaren van een bepaald molecuul aanwezig in de cel. Of je wilt wel het

38

diffusiegedrag weten, maar de cel verkeert in een evenwichtstoestand, waardoor je de concentratie als geheel dus niet kunt zien veranderen. Om de diffusie van enkele moleculen te beschrijven moet je de random-walk trajecten van veel moleculen meten. Vervolgens wordt per traject de kwadratische afstand als functie van de tijd bepaald en tenslotte wordt over alle trajecten gemiddeld. Een voorbeeld van zulk enkel-molecuulonderzoek vind je in Figuur 2.9. Je ziet hier twee diffusiebepalingen aan het receptoreiwit CAR1 (cyclic AMP receptor 1) van dictyostelium discoideum. Als er in één richting meer cyclische AMP (cAMP) te vinden is, zal de cel in deze richting gaan bewegen. De diffusie werd vergeleken tussen de twee uiteinden van de cel. Aan de voorkant van de cel, waar veel cAMP zit, neemt de MSD sneller toe met de tijd dan aan de achterkant. Daaruit kan worden geconcludeerd dat de receptor aan de voorkant van de cel sneller diffundeert. Deze snelle diffusie speelt waarschijnlijk een rol bij het signaleren van de cAMP moleculen. 0.07 0.06

2

MSD(µm )

0.05

(a)

0.04 0.03 0.02 0.01 0.00

(b) 0.1

0.2

tlag(sec)

Figuur 2.9 Diffusie van de CAR1 receptor in dictyostelium discoideum. (a) Fluorescentiemicroscopie-opname van een dictyostelium cel met de voorkant (rood) waar de concentratie van chemo-attractant cAMP het hoogste is, en de achterkant (blauw) aangegeven. (b) MSD als functie van de tijd voor receptoren aan de voorkant (grijs) en aan de achterkant (open cirkels) 2.4 Thermische beweging De molecuulbewegingen die voor diffusie zorgen zijn thermische bewegingen. Die heten zo omdat ze afhangen van de temperatuur: hoe hoger, hoe sneller. Ook zijn deze bewegingen in feite de oorzaak van allerlei bekende temperatuurverschijnselen zoals de toename van de druk bij hogere temperatuur, verdamping, enzovoort. Je kunt zelfs zeggen dat de definitie van temperatuur het thermisch bewegen van moleculen is. De temperatuurafhankelijkheid ziet er als volgt uit. De gemiddelde kinetische energie van een molecuul is evenredig met de temperatuur. Voor moleculen met massa m en snelheid v in een willekeurige richting, bijvoorbeeld de x-richting, luidt de precieze relatie:

39

E kin =

1

2

m v x2 =

1

2

(2.11)

kT

met k de zogenaamde constante van Boltzmann, gelijk aan 1.38 * 10-23 J/K, en T de temperatuur in Kelvin (de absolute temperatuur, die nul is op het absolute nulpunt van −273.16 °C). Het gaat in deze relatie met nadruk om de gemiddelde kinetische energie. Voor één enkel molecuul kan de energie heel anders zijn, en door botsingen zal deze energie bovendien voortdurend veranderen. Temperatuur is dan ook een statistische grootheid, waarvoor geen waarde aan één enkel molecuul kan worden toegekend. In drie dimensies is de kinetische energie gelijk aan E kin =

1

2

(

m v x2 + v y2 + v z2

)

(2.12)

en daarmee gelijk aan 1.5 kT. De relatie tussen beweging en temperatuur is bovendien veel algemener dan alleen voor kinetische energie: alle mogelijke bewegingsvormen van moleculen, de zogenaamde vrijheidsgraden, hebben een gemiddelde energie van 0.5 kT. Dit geldt bijvoorbeeld ook voor rotaties en vibraties van moleculen. De betekenis van deze relatie strekt zich tot ver buiten deze syllabus uit. Maar één belangrijke consequentie willen we hier wel noemen: de kinetische energie van de meeste moleculen ligt in de buurt van het gemiddelde en is dus iets in de orde van kT. Dit betekent ook dat er bij (botsings)interacties tussen moleculen ongeveer kT aan energie uitgewisseld kan worden. Bij veel chemische reacties in de cel zien we dan ook dat de hoeveelheid vrijkomende of verbruikte energie ergens in deze buurt ligt. Een belangrijk voorbeeld is de opsplitsing van ATP in ADP en P. Hierbij komt een energie van 8 * 10-20 J vrij, en bij T= 295 K, de zogenaamde kamertemperatuur, is dit ongeveer 20 kT. 2.5 Wrijving 2.5.1 Wrijving en viscositeit Deeltjes die zich verplaatsen in vloeistoffen ondervinden hierbij wrijving. Dit geldt zowel voor de vloeistofmoleculen zelf, als voor grotere deeltjes. Dit type wrijving heet viskeuze wrijving. Viskeuze wrijving houdt op diverse manieren verband met diffusie. In de eerste plaats is de oorzaak voor deze wrijving te vinden in dezelfde thermische bewegingen en botsingen die ten grondslag liggen aan diffusie. Ten tweede heeft het afremmen door de viskeuze wrijving niet alleen invloed op gerichte bewegingen, maar ook op de diffusie zelf. Diffusie is dus zowel vergelijkbaar met wrijving - beide zouden moeten toenemen met de temperatuur als de thermische beweging er de oorzaak van is - als er aan tegengesteld. Deze relatie vind je mooi terug in de vergelijking van Einstein voor diffusie en wrijving bij temperatuur T:

ζ D = kT

(2.13)

De grootheid ζ is de wrijvingscoëfficient. Deze geeft de grootte van de wrijvingskracht Fw aan volgens:

40

Fw = ζ v

(2.14)

met v de snelheid van het deeltje. Deze relatie is van toepassing op deeltjes die zich voortdurend in één bepaalde richting bewegen met een driftsnelheid v. Denk bijvoorbeeld aan een langzame beweging naar omlaag als gevolg van de zwaartekracht. Viskeuze wrijving is gerelateerd aan de viscositeit van de vloeistof - vandaar de naam. Hoe stroperiger de vloeistof, hoe groter de wrijving. De waarde hiervan wordt aangegeven met de viscositeit η, die de eenheid Pa*s heeft. In Figuur 2.10 zie je een afbeelding van vloeistoffen met verschillende viscositeit. Het druppeltje onder de middelste buis zal je misschien bekend voorkomen als je wel eens honing van een lepeltje af probeert te laten druipen.

Figuur 2.10 Vloeistoffen met verschillende viscositeit, van laag (links) naar hoog (rechts). De wrijvingscoëfficient ζ en de viscositeit η zijn evenredig volgens de relatie van Stokes:

ζ = 6π η R

(2.15)

voor een bewegend deeltje met straal R. Zoals je hieruit misschien al vermoed is viscositeit ook een eigenschap die te maken heeft met botsingen en thermische bewegingen, maar de precieze samenhang voert te ver voor deze syllabus. Via de vergelijkingen van Einstein (2.13) en Stokes (2.15) vinden we de volgende relatie tussen diffusie en viscositeit:

41

D=

kT

6π η R

(2.16)

Hier blijkt dus dat de diffusieconstante van de grootte van het deeltje afhangt met 1/R! Hoe groter het deeltje, hoe langzamer de diffusie, zoals we al aangaven bij het stukje over de Brownse beweging. Dit laat weer een reden zien voor gerichte beweging: waar moleculen als ATP, en misschien motoreiwitten, door diffusie nog wel overal terecht komen, zal dit voor een heel celorganel zeker niet gelden. 2.5.2 Wrijving op nanoschaal In hoofdstuk 1 is al gezegd dat viskeuze wrijving op de schaal van de cel een veel grotere rol speelt dan in de macroscopische wereld. We zullen hier proberen te laten zien waarom dit zo is. Uit vergelijking (2.14) en (2.15) leiden we af dat de wrijvingskracht evenredig is met de snelheid en de grootte van het deeltje volgens

Fw = 6π η R v

(2.17)

Veel andere krachten, zoals de zwaartekracht, zijn evenredig met de massa. Denk aan de bekende wet van Newton F = m*a. De massa is evenredig met het volume, dus met R3. De algemene term voor zo’n kracht die samenhangt met de massa is inertiaalkracht (Fi). Voor de verhouding tussen wrijvingskracht Fw en inertiaalkracht Fi geldt 4 π R3ρa Fi 4 aρ R 2 ma = = 3 = Fw 6π ηR v 6πηRv 18η v

(2.18)

met ρ de dichtheid van het deeltje waar de krachten op werken. Uit de evenredigheid met R2 zien we: hoe kleiner het deeltje hoe meer de wrijving domineert. Op dit argument is wel wat af te dingen, want niet alle krachten hebben een constante versnelling zoals de zwaartekracht: de versnelling en snelheid kunnen ook van de grootte afhangen. Als je het precies uitrekent blijkt echter inderdaad dat de viskeuze wrijving op moleculaire schaal verreweg één van de grootste krachten is. Nu we weten dat op ‘kleine’ schaal wrijving domineert, en op ‘grote’ schaal inertiaalkrachten, kunnen we ons afvragen waar de overgang tussen deze beide regimes ligt. Hiervoor werken we vergelijking (2.18) nog wat verder uit door deze toe te passen op een vloeistofelement dat een traject rondom een bolvormig deeltje vormt (zie ook Figuur 2.13). De inertiaalkracht is dan van toepassing op de versnelling van het vloeistofelement. Omdat dit element een cirkelvormig traject volgt, is de versnelling a gelijk te stellen aan de centrifugale versnelling. Deze is ongeveer v2/R, met R de straal van het deeltje en v de snelheid van het deeltje, oftewel van de vloeistof tov. het deeltje. We vinden dan (met weglating van de numerieke factor 4/18): Fi v2ρ R2 ρ v R ≈ = Fw Rη v η

(2.19)

42

met ρ en η de dichtheid en viscositeit van de vloeistof. Uit de hydrodynamica (de leer van beweging van vloeistoffen) is de rechterkant van deze vergelijking bekend als het Reynoldsgetal : =

ρvR η

(2.20)

De R in vergelijking (2.20) kan de straal zijn van een bewegend deeltje waar vloeistof omheenstroomt, en v de snelheid van het deeltje. Maar deze zelfde formule is ook van toepassing op de stroming van een vloeistof met snelheid v door een buis met straal R. Het Reynoldsgetal bepaalt de overgang van turbulente stroming bij hoge , naar laminaire stroming bij lage . Deze twee soorten stroming worden afgebeeld in Figuur 2.11.

Figuur 2.11 Turbulente stroming (boven) en laminaire stroming (onder) door een buis. Deze twee soorten stroming treden op bij hoog resp. laag Reynoldsgetal. verschilt voor de diverse processen die ermee worden De kritische waarde voor beschreven. Voor bewegende deeltjes kunnen we ongeveer <1 aanhouden als ‘nanoschaal’. In Figuur 2.12 zijn drie voorbeelden van bewegende ‘deeltjes’ te zien met een typische waarde voor hun Reynoldsgetal in water (dichtheid ρ = 103 kg/m3, viscositeit η=10−3 Pa*s). De eerder genoemde E. coli bacterie heeft een heel laag Reynoldsgetal van ongeveer 10−4 en zijn beweging wordt dus inderdaad door wrijving gedomineerd. Deze bacterie komt alleen vooruit als hij zich actief voortbeweegt. De mens en mammoettanker, met hoge Reynoldsgetallen, zullen van viskeuze wrijving weinig last hebben en flink uit kunnen drijven - gevaarlijk ver zelfs, in het geval van de mammoettanker die een remweg van meerdere kilometers heeft.

(a)

(b)

43

(c)

Figuur 2.12 Typische Reynoldsgetallen voor enkele objecten in water. (a) Mammoettanker, = 109. (b) Zwemmer, = 104 (c) E. Coli bacterie, = 10−4. 2.5.3 Leven bij laag Reynolds getal Op de schaal waar wrijving domineert, te herkennen aan het lage Reynoldsgetal, is beweging niet hetzelfde als wij gewend zijn. Een van de opvallendste kenmerken van dit regime is de omkeerbaarheid van de verplaatsing. Als een zwemonderdeel zoals een vin of staart langs één en hetzelfde traject heen en terug wordt bewogen, zal de zwemmer precies op dezelfde plek eindigen als waar hij was begonnen. Een zogenaamde reciproke beweging werkt dus niet. Dit klinkt misschien best herkenbaar: een roeispaan beweeg je liever ook niet door het water weer terug, maar door de lucht. Bij het zwemmen zorg je ervoor dat je armen ‘klein’ zijn bij het vooruit bewegen, en breed bij het terughalen. Toch is het anders. Op macroschaal werkt namelijk ook de ‘snel heen, langzaam terug’ truc bij repiproke beweging om netto vooruit te komen. Maar op nanoschaal maakt de snelheid van de beweging helemaal niets uit voor het effect. is de verplaatsing van vloeistoffen zelf ook anders, want er is Bij lage sprake van laminaire stroming. De vloeistof schuift in feite laagsgewijs (lamina = laag) over zichzelf heen. Bij laminaire stroming door een buis staat de laag direct aan de wand altijd stil door de hoge wrijving. De stroomsnelheid loopt lineair op met de afstand tot de wand. Hetzelfde geldt voor de laag direct om een object heen, zie Figuur 2.13. Als het object tov. de vloeistof beweegt, zal de vloeistof direct om het object heen meebewegen met dezelfde snelheid. Een bacterie sleept zijn omgeving dus gewoon met zich mee! Naar een hapje eten toe zwemmen, of van een belager weg zwemmen, is er dus niet bij. Een verschijnsel dat je misschien bekend voorkomt van het maken van een omelet: een stukje eierschaal dat per ongeluk met het ei mee is gekomen krijg je bijna niet te pakken. In plaats van naar een specifiek hapje eten te zwemmen, zal de bacterie moeten wachten totdat het toevallig naar hem toe diffundeert. Zwemmen is dan ook niet bedoeld om elk hapje eten te pakken dat er in de buurt is, maar om in een gebied met hogere concentratie voedsel terecht te komen. Bij voldoende eten in de buurt laat de bacterie het er lekker bij zitten, en zwemt helemaal niet.

44

Figuur 2.13 Laminaire stroming rondom een bolvormig deeltje. De vloeistof wijkt in laagjes uiteen tov. het object. Direct om het object heen staat de vloeistof stil. Om toch vooruit te komen bij laag Reynoldsgetal ondanks alle beperkingen, hebben micro-organismen gespecialiseerde zwemapparatuur ontwikkeld, zoals de cilia en flagella die we in het vorige hoofdstuk gezien hebben. In Figuur 2.14 zie je hoe de niet-reciproke beweging van deze onderdelen eruit ziet. De cilia maken er gebruik van dat de wrijvingscoëfficient voor een langwerpig voorwerp groter is bij beweging langs de korte as (= dwars op de lengte), dan voor beweging langs de lange as. De ene kant op maken de cilia een brede zwiep, waarbij ze zoveel mogelijk dwars op de lengte bewegen en de wrijving dus groot is. Bij het terugzwiepen zijn ze gebogen, zodat de beweging meer evenwijdig aan de lange as gaat. De wrijving bij het terugbewegen is daardoor minder zodat de cel niet helemaal terugschuift naar het beginpunt. Flagella van eukaryote micro-organismen, zoals hieronder afgebeeld, maken een golfbeweging. Bacteriële flagella roteren. Ook bij de flagellabewegingen speelt de precieze samenhang tussen de vorm en de wrijvingscoefficiënt een rol, maar op een minder rechtstreekse manier dan bij de cilia. De details van de beweging van E. coli flagella worden in het volgende hoofdstuk behandeld.

Figuur 2.14 Bewegingspatronen van de voortbewegingsorganellen van microorganismen, de cilia en de flagella.

45

3

Motoreiwitten en gerichte beweging

3.1 Inleiding Voor het functioneren van cellen is naast diffusie ook gerichte beweging nodig. Hiermee kunnen grotere afstanden overbrugd worden dan door diffusie. Gerichte beweging is ook essentieel om zeldzame stoffen of organellen zo te transporteren dat ze op de juiste plek terechtkomen. Als het goed is heb je zelf ook een of meer redenen bedacht voor gerichte beweging. Een nadeel aan gerichte beweging is dat het energie kost. Daarom maakt de cel voortdurend een afweging tussen gerichte beweging en diffusie. Voor het verplaatsen van kleine, veel voorkomende moleculen (zoals suikers of ATP) over korte afstanden zal de cel geen blaasje gebruiken. Daarvoor voldoet diffusie. Gerichte beweging wordt verzorgd door motoreiwitten. Dit geldt voor beweging op elke schaal - van de kleinste afstand binnen een cel, tot de beweging van een hele olifant door middel van zijn spieren. In dit hoofdstuk zullen we meer vertellen over deze eiwitten. Ook zal de fysica van de gerichte beweging van E. coli aan de orde komen. 3.2 Motoreiwitten en filamenten 3.2.1 Motoreiwitten Motoreiwitten zijn de kleinste motoren die er bestaan. Een belangrijk kenmerk van een motoreiwit is de omzetting van chemische energie in een beweging van (een deel van) het eiwit. Een tweede kenmerk is het gebruik van deze eigen beweging om iets anders, dat aan het eiwit vast zit, ook te laten bewegen. Meestal worden met de term motoreiwitten de echte stap-motoren bedoeld. Deze halen allemaal hun energie uit de hydrolysereactie van ATP, waarbij ATP wordt gesplitst in ADP en een losse fosfaatgroep P. Er zijn echter ook rotatiemotoren bekend, waaronder de motor die de flagella van de E. coli bacterie laat draaien. Deze motoren zitten in een membraan bevestigd en maken gebruiken van protontransport als energiebron. In het stuk over E. coli gaan we nader op de rotatiemotor in, hieronder behandelen we eerst de stapmotoren. De stap-motoren vallen in drie hoofdcategorieen: kinesine, myosine en dyneine, alledrie afgebeeld in Figuur 3.1. Elk motoreiwit hoort bij een specifiek filament. Myosine is het motoreiwit dat spieren laat samentrekken, en het hoort bij actine. Dyneine en kinesine verzorgen samen het transport door de cel door langs microtubuli te lopen. Als je Figuur 3.1 bekijkt, zien de motoreiwitten er heel bekend uit: myosine en kinesine lijken net op een lijf met de twee voeten van een lopend mens, met een beetje grote schoenen. Waarbij myosine vooral heel lange ‘benen’ heeft, en eigenlijk geen ‘lijf’, en kinesine juist een lang lijf met direct daaraan de ‘voeten’. Met drie voeten is dyneine iets exotischer dan de andere twee.

46

Figuur 3.1 Elektronenmicroscopie-opnamen van (a) kinesine, (b) myosine en (c) dyneine. Met de voeten binden de motoreiwitten aan de filamenten waar ze bij horen. De voeten worden in wetenschappelijk taalgebruik vaak de hoofden (heads) genoemd. In deze syllabus zullen we het meestal over voeten hebben. Een andere gebruikelijke naam is het motordomein, omdat hier de ‘brandstof’ ATP wordt opgesplitst en de vrijkomende energie in beweging wordt omgezet. De voeten zitten aan elkaar vast door middel van twee (of drie voor dyneine) in elkaar gedraaide strengen - overigens in Figuur 3.1b niet te zien voor myosine. Dit vlechtgedeelte (het ‘lijf’) heet in de literatuur de staart (tail). Aan het andere uiteinde van de staart zit een gedeelte dat kan binden aan de lading (cargo) die getransporteerd moet worden. Er zijn uiteraard heel veel verschillende soorten cargo, en dus bijna evenzoveel verschillende varianten van elke motoreiwit-soort. Voor myosine in spieren, dat geen cargo transporteert, is de structuur anders dan in Figuur 3.1: heel veel losse myosine eiwitten zitten in elkaar gedraaid tot één grote streng. In Figuur 1.16 in hoofdstuk 1 zie je zo’n streng. Met behulp van de ATP hydrolyse kan het motorgedeelte van het eiwit van vorm veranderen. Door deze vervorming, conformatieverandering genaamd, zwaait er een stuk van het eiwit naar voren, waardoor het een stap kan zetten. De kleine verandering in het motordomein wordt daarbij vertaald naar een veel grotere zwaai van de staart. Een soort van hefboomtruc. Hoewel de beweging gericht is, speelt wrijving een even grote rol als in het vorige hoofdstuk. Zowel de kleine veranderingen van vorm van een motoreiwit, als de grote gehele stap, worden gedomineerd door viskeuze krachten. De verplaatsing van het eiwit tegen de wrijvingskracht in, is de arbeid waarvoor ATP de energie moet leveren. 3.2.2 Filamenten Om zich te verplaatsen gebruiken motoreiwitten altijd een filament, waar ze stap voor stap overheen lopen. In hoofdstuk 1 hebben we al een kort overzicht gegeven van de verschillende filamenten in de cel. Het zogenaamde intermediaire filament wordt voorzover bekend niet door motoreiwitten gebruikt om overheen te lopen - de rol van dit type filament is dus puur structureel. Maar zowel actine als microtubuli hebben hun eigen soort motoreiwit. Hierboven is al genoemd dat myosine bij actine hoort. Het wordt dus op evenveel verschillende plaatsen gevonden als actine zelf. Het bekendste voorbeeld van deze combinatie is de spier, waar zowel actine als myosine in grote vezels in elkaar gedraaid zitten. Daar komt ook de naam vandaan, myo betekent spier.

47

Verschillende soorten spieren zoals skeletspieren, gladde spieren en hartspieren hebben elk hun eigen soort myosine. Daarnaast worden actinevezels in de cel gebruikt voor transport. Dit vindt ook plaats met behulp van myosine. Zo is er een mutatie in muizen bekend waarbij er een bepaald soort myosine ontbreekt. Dit leidt er toe dat de kleur van deze muizen heel licht is, doordat de vachtpigmenten niet goed worden getransporteerd. Bij het lopen over actine maakt het eiwit gebruik van de ‘groef’ die er tussen de strengen zit. Voor het blaasjestransporteiwit myosine V is bepaald dat de stapgrootte 74 nm is, wat vrijwel precies past bij de periodiciteit in de actinestructuur, die 36 nm is. Zie Figuur 3.2 voor de cover van de Science uitgave waarin dit werd beschreven.

Figuur 3.2 Science cover uit 2003 waarin het lopen van myosine V over actine wordt afgebeeld. De afstand tussen de voeten, gelijk aan een halve stapgrootte, past precies bij de actinestructuur. Kinesine en dyneine horen allebei bij de microtubuli. Ze verzorgen hierlangs het transport van organellen en blaasjes met stoffen binnenin de cel. Ook zijn ze beide betrokken bij de celdeling. Kinesine loopt hierbij altijd van de celkern af naar de rand van de cel, en dyneine juist naar de kern toe. In Figuur 3.3 zie je deze transportprocessen geillustreerd. Het kan hierbij om het transport van een los onderdeeltje gaan, maar ook om het uitrekken en vervormen van membranen van grote organellen zoals bijvoorbeeld het endoplasmatisch reticulum (ER).

48

Figuur 3.3 Transport van diverse celonderdelen over de microtubuli met behulp van kinesine en dyneine. Daarnaast heeft dyneine een unieke rol: de variant ‘axonemal dynein’ zorgt voor de beweging van eukaryote cellen door middel van cilia en flagella. De microtubuli in deze uitsteeksels zijn onderling verbonden door vaste bruggen en daarnaast door dyneine motoren. In Figuur 3.4 zie je de ciliastructuur met de dyneine verbindingen tussen de microtubuli. Als de dyneine motoren een stap zetten, moeten de microtubuli dus onderling verschuiven. Omdat ze tegelijkertijd aan elkaar vast blijven zitten met een verbinding van nexine, kan dit verschuiven alleen maar door te buigen (zie ook hoofdstuk 1 Figuur 1.14). Hierdoor buigt dus de hele cilia of flagella mee. Als de dyneines weer loslaten komen de microtubuli weer recht te zitten, en kan de beweging opnieuw beginnen. Dyneine is dus net zoals myosine ook in gebruik voor ‘grote bewegingen’, terwijl kinesine echt alleen maar voor het transport binnenin de cel gebruikt wordt. Dit kan overigens nog een aardige afstand zijn zoals we in een van de opgaven zullen zien.

Figuur 3.4 Cilium met dyneine (a) Doorsnede met daarin de microtubuli (groen) met vaste nexineverbindingen (blauw) en lopende dyneine motoren (rood). (b) Close-up van één microtubule met dyneines.

49

3.3 Beweging van motoreiwitten Over de beweging van motoreiwitten is in de laatste twintig jaar veel bekend geworden met behulp van experimenten die dankzij de ontwikkeling van supergevoelige microscopie kunnen worden uitgevoerd. Daarom hier eerst wat meer over twee belangrijke methoden. Deze experimenten, het zogenaamde ‘bead assay’ en ‘gliding assay’, zie je geschetst in Figuur 3.5a en b. Assay betekent iets als analyse, of proefopzet, maar het engelse woord is gebruikelijker.

(a)

(b)

Figuur 3.5 Gebruikelijke assays om de werking van motoreiwitten te observeren. (a) ‘Bead assay’ waarbij een balletje aan het motoreiwit (kinesine in dit voorbeeld) vast zit en zo over de microtubule wordt getrokken. (b) ‘Gliding assay’ waarbij de microtubule over een met kinesine bedekt glasoppervlak heen glijdt. Bij het beads assay is een klein balletje, een ‘bead’ (letterlijk: kraal), gebonden aan één of meer motoreiwitten. Deze verbinding wordt tot stand gebracht met een goed gekozen combinatie van moleculen op de bead en het cargo-bindingsuiteinde van het motoreiwit. De gemotoriseerde bead wordt op een microscoopglaasje gelegd dat met microtubule-ketens bedekt is. Hierdoor zal de bead over de microtubules gaan lopen. Met een zeer gevoelige microscoop en detector kan de beweging van de bead gevolgd worden. Deze detector kan een CCD camera zijn, maar ook een quadrant fotodiode, een detector met 4 vakjes waarbij de gemeten intensiteit van alle vakjes voortdurend wordt vergeleken. Dit geeft een heel precieze positie-indicatie omdat een kleine verschuiving een groot effect heeft op het verschil tussen de vakjes. De bead kan op twee manieren zichtbaar gemaakt worden: of met behulp van het buigingspatroon van licht rondom de bead, of door de bead met fluorescente kleurstoffen te bedekken. Het gliding assay maakt gebruik van de omgekeerde combinatie van motoren en filamenten. Juist de motoreiwitten zitten vast aan het microscoopglaasje. Ze staan dus ‘op hun kop’ en steken hun voeten de lucht in. Als er microtubuli in een oplossing op dit glaasje worden gedaan, zullen ze over de motoreiwitten heen gaan glijden. Dit experiment wordt over het algemeen uitgevoerd met fluorescerende microtubuli, die worden waargenomen met een CCD camera. Voor beide experimenten geldt uiteraard dat er ATP nodig is voordat er iets gebeurt. Met behulp van deze experimenten is het bestaan van kinesine überhaupt ontdekt. Hieronder volgen enkele algemene kenmerken van motoreiwit-beweging, die ook grotendeels met dergelijke assays bepaald. Om op kleine schaal te beginnen: hoe loopt het motoreiwit? Voor zowel kinesine als myosine V is ontdekt dat de voorste en achterste voet elkaar steeds afwisselen, net zoals onze voeten dat doen (zie ook Figuur 3.2). Dit klinkt misschien vanzelfsprekend, maar het steeds bijtrekken van de achterste voet, waarna de voorste voet weer vooruit stapt en dus altijd de voorste voet blijft, had ook een heel redelijk alternatief kunnen zijn. Het onderscheid tussen beide manieren van lopen kon gemaakt worden door naar de stapgrootte van één van beide voeten te kijken. In het

50

bijtrek-geval was de stap maar half zo groot geweest als bij de om-en-om (‘hand-overhand’) variant. Om de stapgrootte precies te kunnen bepalen moet er extreem nauwkeurig worden gemeten. Bij het stuk over kinesine, en in de opgaven, komen we hier nog op terug. Als we uitzoomen, zien we dat de beweging van een motoreiwit altijd een specifieke richting heeft. Deze richting hangt samen met de zogenaamde polariteit van het filament. Het begrip polariteit houdt in dat het filament niet identiek is aan beide uiteinden. Microtubuli zijn polair doordat ze bestaan uit twee verschillende eiwitten, het α- en het β-tubuline. Ze worden opgebouwd aan het losse uiteinde dat niet bij de celkern zit. Dit einde wordt de + kant van de microtubulus genoemd. De opbouw bestaat uit toevoeging van αβ-dimeren met de β-tubuline altijd aan het uiteinde (zie ook Figuur 1.8b in hoofdstuk 1). Waar kinesine altijd naar het + uiteinde van een microtubule loopt, dus van de celkern af, loopt dyneine altijd naar het − uiteinde. Ze zijn dus allebei nodig om transport binnenin de cel te verzorgen. In Figuur3. 5 zie je dat de polariteit van de microtubuli en de bewegingsrichting worden aangegeven. In het gliding assay lopen de microtubuli natuurlijk in de − richting! In Figuur 3.6 zie je een voorbeeld van een gliding assay waarbij de polariteit van de microtubule met een extra kleurstoflabel werd aangegeven.

Figuur 3.6 Fluorescentie-microscopie opnamen van een bewegende microtubule in een gliding assay op twee tijdstippen. Vlak bij het − uiteinde (aangegeven met de pijl) is de microtubule extra helder gelabeld. Actine bestaat maar uit één type monomeer, maar het is evengoed polair door de manier waarop de strengen van het filament in elkaar gedraaid zijn. Actine kan zowel aan het plus- als aan het min-uiteinde opgebouwd worden, al gaat het sneller aan de pluskant. De rol van actine in de cel is zo divers dat er geen algemene samenhang tussen de pluskant en de locatie in de cel gegeven kan worden. Wel geldt dat actine in uitsteeksels als lamellipodia altijd de pluskant aan de membraan heeft, en het ook vandaar uit wordt opgebouwd. Myosine beweegt zich in de + richting over het actine filament, met uitzondering van het type myosine VI. Hoe ver loopt één zo’n motor nou? In tegenstelling tot een mens, die altijd vanzelf op de grond blijft door de zwaartekracht, zit een motoreiwit alleen maar vast aan het filament doordat de binding energie oplevert. Er is altijd een kans dat deze verbinding wordt verbroken en de motor helemaal loskomt van het filament. Bij 51

sommige motoreiwitten gebeurt dit zelfs bij elke stap! Kinesine en dyneine verbreken de verbinding met de microtubulus ongeveer één keer per 100 stappen - kinesine kan daarmee ongeveer een micrometer lopen. Zo’n motor die een heel aantal stappen achter elkaar kan lopen wordt processief genoemd. Non-processieve motoreiwitten, die bij elke stap loslaten, zijn bijvoorbeeld de kinesine-achtige motor ncd, en de motor myosine-II uit spieren. Het aantal stappen per motor kan op een directe manier worden gemeten door de stappen van één enkel motoreiwit te volgen op enkelmolecuul-nivo. Daarnaast is het af te leiden uit de relatie tussen de motorendichtheid en microtubule-snelheid bij een gliding assay. Bij non-processieve motoren werkt dit assay vanaf een te lage dichtheid helemaal niet meer. De processiviteit van (bijvoorbeeld) kinesine suggereert maar al te gemakkelijk dat één kinesine-eiwit het hele werk doet. In Figuur 1.8c in hoofdstuk 1, en in vele andere cartoons van motoreiwitten, zien we dit ook afgebeeld, met één enkel motoreiwit dat als een soort Atlas heldhaftig met een enorme lading sleept. In de praktijk ziet het transport er waarschijnlijk ietwat anders uit. Om de verbinding met de microtubule over langere afstanden te garanderen ondanks de kans op loslating van de motor, zullen meestal vele motoren tegelijk actief zijn. Met meer motoren kunnen bovendien grotere krachten worden uitgeoefend en dus grotere ladingen worden versleept. In Figuur 3.7 zie je een schets van een onderzoek aan zulke motorenclusters. Bij dit onderzoek werden kunstmatige lipidenblaasjes gebruikt als model voor de membraan van een cel of organel. Door de motoreiwitten werden langs een microtubule dunne buisjes uit deze blaasjes getrokken. De eiwitten concentreerden zich allemaal aan het uiteinde van de buis.

Figuur 3.7 Het trekken van membraanbuisjes (‘membrane tubes’) uit grote lipidenblaasjes (GUV’s- ‘Giant Unilamellar Vesicles’) met behulp van motoreiwitten. (a) Schets van de experimentele opzet met een blaasje, een microscoopglaasje met microtubuli (MT’s) en de daarlangs getrokken membraanbuisjes. (b) Fluorescentiemicroscopie opname van een GUV met uitgetrokken buisjes. (c) Close-up van één membraanbuisje met een cluster van motoreiwitten aan het uiteinde.

52

3.4 Kinesine Als voorbeeld van een motoreiwit willen we hier kinesine wat uitgebreider behandelen. In Figuur 3.8 zie je de structuur van kinesine, bepaald met behulp van röntgenkristallografie. Zoals we al eerder zagen in de EM opname (Figuur 3.1) heeft het eiwit enorme voeten die vrijwel direct vastzitten aan een dun ‘lijf’. Het motordomein beslaat vrijwel de gehele voet. Dit domein bestaat uit een aantal zogenaamde beta-sheets, dat zijn de platte linten (grijs en blauw) die je in de structuur ziet. Eromheen zitten alfa-helices, dat zijn de gekrulde linten (rood, roze, groen en donkerblauw). Beta-sheets en alfa-helices zijn veelvoorkomende substructuren in eiwitten, die uit speciale combinaties van aminozuren gevormd worden. Aan de onderkant van de voet, zo’n beetje aan de hiel, bevindt zich de opening waar ATP of ADP kan binden. Je ziet ook een ADP molecuul zitten in de structuur.

Figuur 3.8 Structuur van de kinesine dimeer met ADP gebonden aan beide motordomeinen. Het motordomein van kinesine is evolutionair al oud. Het lijkt erg op het motordomein van myosine. Beide domeinen lijken bovendien weer op een centraal deel van een heel ander type eiwit, het G-eiwit. Dit eiwit heeft een functie in de celsignalerings-cascade, waarbij het een conformatieverandering ondergaat met behulp van ATP hydrolyse, die de interactie met andere eiwitten reguleert. Kortom, blijkbaar is deze structuur een bruikbaar motief voor de koppeling van ATP hydrolyse aan een mechanische verandering, dat in de evolutie werd behouden nadat het eenmaal was ontstaan. De structuur van dyneine is overigens wel behoorlijk anders dan van de andere twee stap-motoreiwitten. Kinesine heeft niet echt een grote hefboom in zijn structuur zoals de andere twee motoreiwitten dat wel hebben. De twee voeten zitten bijna direct aan elkaar vast met tussen elke voet en de gezamenlijke in elkaar gedraaide strengen van de staartt alleen een korte nek (dun grijs lijntje in Figuur 3.8). Ondanks de geringe lengte kan

53

deze nek er wel voor zorgen dat de conformatieverandering ten gevolge van ATP binding wordt ‘versterkt’, zoals we hieronder zullen zien. Om een idee te geven hoe het stappen van een motoreiwit precies verloopt, zullen we nu in detail op de bewegingscyclus van kinesine in gaan. Deze cyclus bestaat in ieder geval uit de volgende stappen: -het binden van ATP aan een lege voet (dwz. zonder ATP of ADP) -de omzetting van ATP in ADP en de fosfaatgroep P -het vervolgens loslaten van P, -het loslaten van ADP -het loslaten van de microtubule door de achterste voet, -het naar voren bewegen van deze voet, -het weer binden van deze voet waarna het van voren af aan kan beginnen. Kinesine gebruikt precies één ATP molecuul per stap. Wat is nu de meest logische volgorde van al deze stappen? Dit is uit een groot aantal onderzoeken met zowel biochemische als microscopische technieken bekend geworden. Om te beginnen blijkt dat de binding tussen kinesine en de microtubulus heel sterk is als ATP aan de voet gebonden is, of als de voet geen nucleotide bevat. De binding is daarentegen zwak wanneer ADP aan de voet bindt. Aan losse kinesine is ADP juist weer veel sterker gebonden dan ATP. Biochemisch onderzoek aan kinesine en microtubuli zonder ATP, maar met ADP, laat dan ook zien dat er één voet gebonden en leeg is, en de tweede voet ADP bevat en juist niet aan de microtubule bindt. Ook blijkt dat toevoeging van ATP, of van een ATP variant die niet kan worden gehydrolyseerd, tot het loslaten van de tweede ADP leidt. Logischerwijs moet de toegevoegde ATP binden aan de lege gebonden voet - de andere is immers al bezet en heeft een voorkeur voor ADP. Blijkbaar heeft deze binding tot gevolg dat de losse voet ook gauw zijn ADP zal loslaten en zich zal binden aan de microtubulus. Als de andere voet dan de ATP omzet in ADP en P, kan deze voet vervolgens loslaten, enzovoort. Uit deze gegevens is de volgende cyclus gedestilleerd, die je ziet in Figuur 3.9. De stapvolgorde lijkt naar de huidige inzichten als volgt te zijn. Als uitgangspunt nemen we de toestand E met een gebonden lege voorste voet en een losse achterste voet met ADP. Stap twee (ES1) is dan de binding van ATP aan de lege voorste voet. Dit leidt tot een conformatieverandering waardoor de voorste voet aan de nek vast komt te zitten, zodat het kinesine als geheel iets voorover buigt. In Figuur 3.10 zie je twee keer de kristalstructuur van een enkel motordomein van kinesine, met ATP gebonden en met ADP gebonden. Het kleine verschil tussen de binding van ATP en van ADP is de kern van de hele beweging van het motoreiwit. Door het vastzetten van de nek komt de achterste voet makkelijk in de buurt van de nieuwe bindingspositie als voorste voet (weergegeven als ES1’). Als de binding eenmaal een feit is (ES2) zal de ADP gauw loslaten - waarna we een nieuwe lege voorste voet hebben (ES3). Daarna (of eventueel gelijktijdig) kan de hydrolyse van ATP in de achterste voet plaatsvinden (EP). De ADP en P houden de conformatie met de gebonden nek nog in stand, maar zodra de losse fosfaatgroep eraf is, heeft de achterste voet alleen nog een ADP en zal dus loslaten. Dan zijn we weer terug bij het begin (E), maar wel een stap verder.

54

Figuur 3.9 Bewegingscyclus van kinesine in samenhang met de hydrolyse van ATP. De toestanden zijn gelabeld met verwijzing naar kinesine als enzym (E), ATP als substraat (S) en ADP als produkt (P).

Figuur 3.10 Kinesinestructuur in de toestand met ATP gebonden en voorovergebogen nek, en met ADP gebonden en losse nek. Hoe groot is zo’n stap nou? Dat is voor kinesine bepaald met behulp van het experiment dat je in Figuur 3.11 geschetst ziet. Dit is een bead assay gecombineerd met een optische pincet. In hoofdstuk 1, § 1.4.4 werd het werkingsprincipe van deze pincet besproken. Via de bead kan de verplaatsing van het kinesine-molecuul worden gevolgd. Om de stapgrootte te bepalen wordt er door de pincet heel zachtjes aan de bead getrokken, zodat kinesine harder aan de bead trekt dan de optische kracht en gewoon een stap kan zetten. De verplaatsing van de bead na de stap wordt gemeten

55

met een camera of een quadrant fotodiode. De pincetpositie wordt vervolgens meeverplaatst, en kinesine is klaar voor de volgende stap.

Figuur 3.11 Bead assay aan kinesine gecombineerd met een optische tweezer, die de bead in het focus van een lichtbundel vasthoudt. In Figuur 3.12 zie je het resultaat van de meting van de positie van de bead. De bead blijkt steeds precies 8 nm op te schuiven, en dat is dus de stapgrootte van kinesine. Merk op dat je in Figuur 3.11 ook meteen ziet dat kinesine processief is. De stapgrootte blijkt (net als voor myosine en actine) aan te sluiten bij de microtubulestructuur: ze is vergelijkbaar met de grootte van een αβ-tubulin dimeer.

Figuur 3.12 Bepaling van de stapgrootte van kinesine met behulp van een optische pincet.

56

Uit het bovenstaande experiment kan niet direct worden afgeleid dat er sprake moet zijn van hand-over-hand (om-en-om) beweging. De bead zit immers vast aan de staart. De beweging van de staart laat niet rechtstreeks zien hoe groot de stap van één voet is. De biochemische gegevens wijzen er wel op dat er wordt afgewisseld. De voeten moeten immers hoe dan beide loskomen om vooruit te stappen. Loskomen wijst op een toestand met ADP gebonden, en dus daaraan voorafgaand ATP hydrolyse. Dat beide voeten deze reactie uitvoeren, terwijl hun rol bij het lopen permanent verschillend van karakter is, zoals bij het bijtrekmodel (‘inchworm’) het geval is, lijkt niet heel voor de hand liggend. Doorslaggevend bewijs voor hand-overhand werd gevonden met behulp van single-molecule fluorescentiemicroscopie door de voeten te voorzien van een kleurstoflabel. Dit experiment is gedaan voor zowel kinesine als myosine V. In een van de opgaven zullen we hier nader op ingaan. 3.5 Gerichte beweging van E. coli 3.5.1 De rotatiemotor van E. coli Als tweede voorbeeld van een motoreiwit zullen we hier de rotatiemotor van E. coli iets uitgebreider behandelen. In Figuur 3.13 zien we de E. coli flagella met de rotatiemotor in close-up. De flagella zelf (‘filament’) is een holle buis van flagellin eiwitten met een diameter van ongeveer 15 nm. De spiraalvorm van de flagella is een vaste structuur, vergelijkbaar met die van een kurketrekker. Met een soort haak (‘hook’) is de flagella aan de buitenkant van de cel bevestigd aan de as (‘rod’) van de rotatiemotor. We zien dat de buitenkant van de bacteriecel uit 3 lagen bestaat: een binnenste membraan (‘cytoplasmic membrane’), een celwand-achtige tussenlaag (‘periplasm’) met daarin stevige polymeernetwerken (‘peptidoglycan’), en een buitenmembraan (‘outer membrane’). De as van de motor steekt door de drie lagen heen, met in elke laag een bevestigingsring, een holle cilinder waarin de as kan ronddraaien. De echte rotatiemotor bevindt zich in de binnenste membraan. Een macroscopische rotatiemotor ziet er eigenlijk heel vergelijkbaar uit.

57

Figuur 3.13 Structuur van de flagella-rotatiemotor van E. coli. De flagella is aan de as bevestigd, die kan ronddraaien in holle eiwitcilinders die in de membranen zijn bevestigd. In de binnenste membraan bevinden zich de rotatiemotor en de eiwitten die het wisselen van rotatierichting verzorgen. De flagellaire motor van E. coli werkt met behulp van protonen. Eerst heeft de bacterie gezorgd voor een gradient van protonen over het binnenste membraan. Daardoor staat er een elektrische spanning over het membraan die de protonen terug wil trekken naar de evenwichtssituatie. In Figuur 3.13 is deze spanning met + en − tekens aangegeven. De bijbehorende kracht, de pmf (proton motive force) wordt gebruikt door de rotatiemotor. De protonen worden in de motor gecontroleerd doorgelaten in de richting waarin de elektrische kracht werkt. Voor elk doorgegeven proton draait het binnenste deel (MS en C ringen in Figuur 3.13) een stukje tov. het buitenste deel (de Mot eiwitten). Hoe groter de pmf, hoe sneller de motor draait. Met gemak worden er 200 rotaties per seconde gehaald door de bacterie. Je zou de rotatiemotor als het meest basale motoreiwit kunnen beschouwen: ook de stof ATP zelf wordt geproduceerd met behulp van zo’n proton-gedreven rotatiepomp. In Figuur 3.14 zie je deze rotatiemotor afgebeeld. Het gedeelte in het membraan, Fo, is de proton-rotor vergelijkbaar met die van E.coli. De F1 motor buiten de membraan wordt hierdoor aangedreven. F1 roteert met slagen van 120 graden en produceert bij elke slag een ATP molecuul uit ADP en P. Aan ATP synthase is veel (single-molecule) onderzoek gedaan. Een voorbeeld zie je in Figuur 3.15a: aan de rotatiemotor is een stuk actinefilament bevestigd. Daarmee kan de rotatie goed worden waargenomen zoals de camera-opnames (Figuur 3.15b) van verschillende momenten tijdens de rotatie laten zien.

58

Figuur 3.14 Structuur van de proton-gedreven rotatiepomp ATP synthase. De protonunit Fo is waarschijnlijk vergelijkbaar met de Mot eiwitten uit de E. coli motor.

(a)

(b)

Figuur 3.15 Meting van de rotatie van één enkel ATP synthase molecuul met behulp van een actinefilament. (a) Principe van het experiment. (b) Opeenvolgende opnamen van het actinefilament. De rotatiemotor van E. coli kan beide kanten op draaien, zowel tegen de klok in (ccwcounter clock wise) als met de klok mee (cw - clock wise). In hoofdstuk 1 werd al genoemd dat de bacterie hiermee afwisselt tussen vooruitbewegen (run) en draaien (tumble) en dat de keuze tussen beide rotatierichtingen in verband staat met chemotaxis. De rotatiemotor bevat hiervoor speciale eiwitten, de Fli eiwitten (zie Figuur 3.13), die de richting van de rotatie kunnen switchen. De werking van de Fli eiwitten wordt beinvloed door de aanwezigheid van signaaleiwitten, die geproduceerd worden na registratie van aantrekkelijke of juist ongewenste stoffen door de receptoreiwitten in de celmembraan.

59

3.5.2 De voortbeweging van E. coli De E. coli bacterie kan bewegen door de flagella te roteren. Daarmee weet hij vooruit te komen in het enorm stroperige medium dat water op deze schaal is. De bacterie maakt hierbij juist gebruik van de viskeuze wrijving, en wel als volgt. De wrijvingscoëfficient ζ, die de viskeuze wrijvingskracht Fw = ζv op een met snelheid v bewegend object beschrijft, hangt af van de vorm van het object. Bij een langwerpig object zoals de cilinder in Figuur 3.16 is de wrijvingscoefficient groter voor beweging in de richting van de korte as, dan voor beweging langs de lange as. Bij de E. coli flagella is sprake van een netto beweging die tussen deze twee richtingen in ligt. De snelheid v is dan op te splitsen in de snelheden v|| en v⊥ parallel aan en loodrecht op de lange as (zie ook fig 16). Als we vervolgens de twee krachten F|| en F⊥ in de parallelle en loodrechte bewegingen uitrekenen, dan vinden we dat de netto kracht F naar de loodrechte richting afwijkt ten opzichte van de snelheid (de krachten worden aangegeven met een kleine f in deze figuur). De pijlen in Figuur 3.16 hebben betrekking op de kracht die het object uitoefent op zijn omgeving. De kracht op het object staat dus 180 graden de andere kant op.

Figuur 3.16 Viskeuze wrijvingskrachten parallel aan en loodrecht op de lange as van een cilindervormige staaf. Dankzij het verschil tussen de twee wrijvingscoëfficienten kan E. coli bewegen. In Figuur 3.17 zien we de flagella als geheel getekend met de rotatierichting aangegeven. Om te berekenen welke kracht er door wrijving op de flagella wordt uitgeoefend, splitsen we de flagella in gedachten op in allemaal kleine langwerpige stukjes die ongeveer overeenkomen met de cilindervorm in Figuur 3.16. De twee aangegeven stukjes in Figuur 3.17 hebben door de rotatie een snelheid die recht omlaag wijst. Voor deze stukjes vinden we dat de kracht van de flagella op zijn omgeving niet recht omlaag wijst, maar netto een stukje naar links. Voor de precies vergelijkbare stukjes aan de ‘achterkant’ van de flagellaschroef wijst de snelheid omhoog, en de kracht weer een stukje naar links. Als we de krachten op alle stukjes optellen, heffen de verticale componenten elkaar op en blijft er een netto kracht naar links over. De flagella duwt het omringende medium dus naar links voor de aangegeven rotatierichting. De flagella, en daarmee de bacterie, worden als gevolg daarvan naar rechts geduwd door het medium. De bacterie kan met deze schroefzwemmethode met gemak een snelheid van 30 µm/s halen, oftewel 30 van zijn eigen lichaamslengtes per seconde. Een cheetah haalt dat niet eens!

60

Figuur 3.17 Model van de flagella van E. coli met de richting van de rotatiesnelheid en de daaruit resulterende viskeuze krachten. Tot slot nog iets over het doel van de zwemtocht. We zagen in hoofdstuk 1 al dat het hierbij niet om het ophappen van elk stukje eten gaat – daarvoor moet de bacterie het van diffusie hebben – maar om een zoektocht naar een omgeving met hogere voedselconcentratie. Zo’n zoektocht heeft alleen zin als de bacterie de concentratieverhoging ook daadwerkelijk kan meten. Hiervoor moet de gerichte beweging van de bacterie concurreren met diffusie: als de bacterie te langzaam zwemt zal de concentratie bij het eindpunt van een run door diffusie al gelijk zijn geworden aan de concentratie bij het beginpunt. Een toename kan hij dan dus niet waarnemen. Voor de verhouding van gerichte beweging en diffusie valt een kwantitatieve maat te berekenen. Hiervoor vergelijken we de tijd die nodig is voor een gerichte beweging over een bepaalde afstand met de tijd die diffusie nodig heeft voor dezelfde afstand. Met een afstand d en een gerichte snelheid v vinden we voor de gerichte beweging een tijd tr:

tr =

d v

(3.1)

Voor diffusie met diffusieconstante D vinden we een tijd td

td =

d2 D

(3.2)

d d2 > . Dit v D criterium wordt ook wel omgeschreven naar het dimensieloze Peclet getal Pe:

Gerichte beweging is sneller dan diffusie zolang geldt dat tr > td oftewel

Pe =

vd D

(3.3)

dat groter moet zijn dan 1, wil gerichte beweging ‘winnen’.

61

Tijdens zijn runs moet E. coli dus snel en ver genoeg bewegen om aan dit criterium te voldoen. De bacterie heeft een snelheid van 30 µm/s en de diffusieconstante voor kleine moleculen (zoals de voedingsstoffen) in water is ongeveer 1 µm2/s. Daarmee vinden we dat moet gelden d > 30 µm. En dit blijkt inderdaad precies de afstand te zijn die E. coli aflegt tijdens 1 run, waarna weer een tumble optreedt. Als er tijdens de run een toename van voedingsstof is gemeten wordt de tumble onderdrukt. Zo blijkt E. coli als geheel dus een prachtig voorbeeld te zijn van de combinatie van gerichte beweging en diffusie, die beide van belang zijn voor het voortbestaan van de bacterie.

62