LAPORAN PENELITIAN
Penggunaan Metode PCR Tiga Primer Spesifik dalam Membedakan Antara Spesies Leptospira Patogen dengan Leptospira Saprofit dari Air Lingkungan Sekitar Pasar Tradisional di Kota Denpasar
PENELITI : dr.Made Agus Hendrayana,M.Ked dr.Wayan Surudarma,M.Si
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA 1
DAFTAR ISI Hal. Cover...................................................................................................
1
Daftar isi.........................................................................................................
2
Kata Pengantar......................................................................................
3
Ringkasan.......................................................................................................
4
1. PENDAHULUAN ...........................................................................
.
6
1.1 Latar Belakang...................................................................................
6
1.2 Rumusan Masalah..............................................................................
8
1.3 Tujuan Penelitian..............................................................................
9
1.4 Manfaat Penelitian............................................................................
9
2. KERANGKA KONSEP PENELITIAN................................................
10
3. METODE PENELITIAN..........................................................................
12
3.1 Rancangan Penelitian...........................................................................
12
3.2 Lokasi penelitian...................................................................................
12
3.3 Waktu penelitian..................................................................................
12
3.4 Populasi dan Sampel Penelitian...........................................................
13
3.5 Metode Pengambilan dan Besar Sampel.…………...........................
13
3.6 Definisi operasional variabel..................................................................
13
3.8 Prosedur penelitian…………………………………………………...
14
3.9 Alur Penelitian…………………………………………………………
19
4. HASIL PENELITIAN ................................................................................
20
4.1 Pengambilan Sampel air lingkungan pasar tradisional...........................
20
4.2 Deteksi Leptospira patogen dan saprofit metode PCR menggunakan 3 primer……………………………………………….
24
5. PEMBAHASAN……………………………………………………………
35
6. KESIMPULAN……………………………………………………………..
37
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………….
38
LAMPIRAN……………………………………………………………………
41
2
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat Beliau penelitian yang berjudul “Penggunaan Metode PCR Tiga Primer Spesifik dalam Membedakan Antara Spesies Leptospira Patogen dengan Leptospira Saprofit dari Air Lingkungan Sekitar Pasar Tradisional di Kota Denpasar” ini dapat diselesaikan dengan baik. Dalam pelaksanaan penelitian ini kami mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan selama pelaksanaan penelitian ini. 2. Ketua Unit Penelitian dan Pengembangan (Litbang) FK.Unud/RS.Sanglah atas kesempatan yang diberikan kepada saya. 3. Kepala Bagian/SMF.Mikrobiologi FK.UNUD/RS.Sanglah atas ijin serta bantuan dan fasilitas yang diberikan selama pelaksanaan penelitian ini. 4. Kepala Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP.Sanglah atas bantuan dan fasilitas yang diberikan selama pelaksanaan penelitian ini. 5. Para analis lab. Mikrobiologi FK.UNUD dan RSUP.Sanglah atas bantuan dan kerjasamanya. 6. Para mahasiswa FK.UNUD bimbingan spesial study semester atas kerjasama dan bantuan dalam pelaksanaan penelitian ini. 7. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini.
Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat dan sumbangan ilmiah dalam masalah Mikrobiologi dan dalam dunia kedokteran.
Penulis
3
RINGKASAN
Penggunaan Metode PCR Tiga Primer Spesifik dalam Membedakan Antara Spesies Leptospira Patogen dengan Leptospira Saprofit dari Air Lingkungan Sekitar Pasar Tradisional di Kota Denpasar
Leptospirosis adalah penyakit zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri yang berbentuk spiral dari genus
Leptospira, yang menyerang hewan dan manusia.
Leptospira dapat hidup di dalam air tawar, air selokan dan air kemih selama kurang lebih satu bulan. Penularan tidak langsung terjadi melalui genangan air, sungai, danau, selokan saluran air dan lumpur yang tercemar urin hewan seperti tikus, umumnya terjadi saat banjir. Pasar tradisional dengan begitu banyak kios tempat berjualan dan berbagai macam penyimpanan bahan makanan untuk dijual tentu aja menjadi tempat yang baik untuk berkembang-biaknya hewan pengerat liar seperti contohnya tikus. Tikus dapat berkembang biak dengan pesat di pasar tradisional. Tikus sebagai pembawa bakteri Leptospira dalam tubuhnya dapat mencemari lingkungan pasar tradisional terutama air lingkungan disekitar pasar melalui air kencing yang dikeluarkannya yang dapat mengandung bakteri Leptospira.Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri Leptospira saprofit dan Leptospira patogen dari air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional di Kota Denpasar. Pengambilan spesimen air dari lingkungan pasar tradisional dilaksanakan di sekitar 7 lokasi pasar tradisional di wilayah Kota Denpasar dengan keterwakilan di wilayah kota Denpasar yaitu wilayah Denpasar Pusat Kota, Denpasar Selatan dan Denpasar Timur. Sampel air lingkungan pasar tradisional yang telah dihomogenkan selanjutnya dilakukan pemeriksaan dengan metoda PCR untuk mendeteksi gen spesifik yang dapat membedakan leptospira yang patogen dengan yang saprofit menggunakan tiga spesifik primer yang didesain dari gen 16S rRNA yaitu : Lepto1(F) = 5’GTCAAACGGGTAGCAATACC
3’,
Lepto2(R)
=
5’GTCCGCCTA
CACACCCTTTAC3’ dan Lepto3(F)=5’AATACTGGATAGTCCCGAGAG GTC3’.
4
Untuk isolasi Gen spesifik dari sampel air dengan dilakukan tahapan-tahapan dimulai dari tahap ekstraksi DNA, amplifikasi dengan PCR dan deteksi DNA dengan eletroforesis dengan gel agarose 2%. Sampel dari air lingkungan genangan air depan toko kelontong Pasar Badung, selokan dekat tempat sampah Pasar Desa Sanur, genangan air komplek dagang timur Pasar Ketapian, genangan air dekat pintu keluar Pasar Ketapian, selokan kran air umum depan Pasar Renon mempunyai dua pita yang sejajar dengan kontrol K1 dan K2 dapat diduga terdapat gen spesifik pada DNA dari bakteri leptospira patogen. Hasil penelitian ini mendapatkan Sampel dari air lingkungan selokan samping Dagang Desa Yang Batu, selokan belakang Dagang Desa Yang Batu, selokan air kran untuk umum Pasar Kreneng, selokan kran air umum dekat toilet Pasar Surabi, selokan lorong penjual daging Pasar Badung, selokan kran air umum belakang Pasar Desa Sanur, genangan air komplek dagang di luar Pasar Surabi, genangan air komplek dagang di dalam Pasar Ketapian, selokan kran air umum timur Pasar Renon menunjukkan hasil PCR hanya 1 pita pada 503 bp dimana diduga ditemukan spesies leptospira saprofit. Sampel dari air lingkungan selokan depan Dagang Desa Yang Batu, selokan dekat penjual daging Pasar Kreneng, selokan disamping dagang sate parkiran Pasar Kreneng, genangan air depan pintu masuk Pasar Desa Kesiman, sungai besar pasar badung tidak menunjukkan kedua pita seperti kontrol dimana diduga tidak terdapat bakteri leptospira patogen dan saprofit. Pemeriksaan PCR pada penelitian ini yang menggunakan kombinasi tiga primer dapat membedakan adanya leptospira patogen, leptospira saprofit maupun yang tidak ada leptospira patogen dan saprofit dari sampel air lingkungan pasar tradisional.
5
BAB I PENDAHULUAN
I.1
Latar Belakang Leptospirosis adalah penyakit zoonosis yang disebabkan oleh infeksi bakteri yang
berbentuk spiral dari genus Leptospira, yang menyerang hewan dan manusia (Brooks GF et al, 2001). Penyakit ini masih menjadi masalah kesehatan masyarakat, terutama di daerah beriklim tropis dan subtropis, dengan curah hujan tinggi (kelembaban), khususnya di negara berkembang, dimana kesehatan lingkungannya kurang diperhatikan terutama. pembuangan sampah. Leptospirosis tersebar baik di Indonesia maupun di luar negeri. Di Indonesia Leptospirosis ditemukan antara lain di propinsi Jawa Barat, Jawa Tengah, DIY, Lampung, Sumatera Selatan, Bengkulu, Riau, Sumatera Barat, Sumatera Utara, Bali, NTB, Sulawesi Selatan, Sulawesi Utara, Kalimantan Timur, dan Kalimantan Barat. Leptospirosis umumnya menyerang para petani, pekerja perkebunan, pekerja tambang/selokan, pekerja rumah potong hewan dan militer. Angka kematian akibat penyakit Leptospirosis termasuk tinggi, bisa mencapai 2,5-16,45% (rata-rata 7,1%). Pada usia lebih dari 50th malah kematian bisa sampai 56%. (Widarso et al, 2005). Sebanyak 175 macam leptospira yang berbeda dari segi aspek antigeniknya (yang disebut serovars), baru tujuh macam yang berhasil diisolasi. Sampai saat ini ada dua spesies Leptospira yang paling dikenal yaitu
Leptospira interogans dan Leptospira
biflexa. Spesies pertama dikenal patogen terhadap manusia dan hewan, sedangkan spesies kedua merupakan safrofit yang hidup bebas di perairan dangkal dan jarang dihubungkan dengan infeksi pada manusia (Higgins R. 2004). Manusia terinfeksi leptospira melalui kontak dengan air, tanah atau tanaman yang telah dikotori oleh air seni hewan yang menderita leptospirosis. Bakteri masuk ke dalam tubuh manusia melalui selaput lendir (mukosa) mata, hidung, kulit yang lecet atau atau makanan yang terkontaminasi oleh urine hewan terinfeksi leptospira. Penularan leptospirosis pada manusia ditularkan oleh hewan yang terinfeksi kuman leptospira. Hewan yang menjadi sumber penularan adalah tikus (rodent), babi, kambing, domba, kuda, anjing, kucing, serangga, burung, kelelawar, tupai dan landak. Sedangkan penularan langsung dari manusia ke manusia jarang terjadi. Pejamu reservoar utama
6
adalah roden/tikus dengan kuman leptospira hidup di dalam ginjal dan dikeluarkan melalui urin saat berkemih. (Heath SE et al, 1994) Leptospira dapat hidup di dalam air tawar, air selokan dan air kemih selama kurang lebih satu bulan. Penularan tidak langsung terjadi melalui genangan air, sungai, danau, selokan saluran air dan lumpur yang tercemar urin hewan seperti tikus, umumnya terjadi saat banjir (Soejoedono RR. 2000). Beberapa pemeriksaan mikrobiologis telah biasa dilakukan untuk mendeteksi adanya bakteri Leptospira baik dari cairan tubuh maupun dari lingkungan. Pemeriksaan standar yang biasa dilakukan untuk mendeteksi adanya bakteri Leptospira patogen adalah dengan Microscopic Agglutination Test (MAT) dimana pemeriksaan ini memerlukan pemeriksaan labolatoris teknik khusus dan menghabiskan banyak waktu. Pemeriksaan langsung dengan kultur pada media sering menemui kendala dimana sulitnya bakteri ini untuk tumbuh dan sering pertumbuhannya diganggu dengan kontaminan yang sering tumbuh lebih cepat. Pemeriksaan yang sedang dikembangkan beberapa tahun belakangan ini adalah dengan pemeriksaan PCR dimana pemeriksaan ini telah berkembang sampai dapat membedakan antara spesies Leptospira yang patogen maupun yang non patogen (Uavechanichkul R et al,2011). Istilah pasar tradisional diartikan sebagai tempat berkumpulnya sejumlah penjual dan pembeli dimana terjadi transaksi jualbeli barang-barang yang ada disana. Proses perpindahan hak milik barang terjadi setelah penjual dan pembeli mencapai kesepakan harga, pasar yang demikian disebut juga pasar konkret/sandang. Ikhwal pasar tradisional sebagai tempat perdagangan sudah ada semenjak dahulu, sejak manusia mulai melakukan pola sistem dagang barter (tukar-menukar barang) dalam memenuhi kebutuhan hidupnya. Pasar tradisional sebagai tempat bertemunya para penjual dan pembeli, tempat penimbunan logistik barang dagangan serta tersedianya berbagai macam barang dari kebutuhan sehari-hari sampai dengan kebutuhan sandang dan pangan tentu menimbulkan masalah klasik bagi sistem lingkungan di sekitar pasar tradisional yaitu kesemerawutan dan lingkungan kotor. klasik karena faktor simultan yang terus menerus,dimana ada sebuah pasar tradisional beroperasi maka lingkungan kotor tidak akan terhindarkan sebagaimana tampak pada pada pasar-pasar tradisional (Deperindag RI,2007).
7
Pasar tradisional dengan begitu banyak kios tempat berjualan dan berbagai macam penyimpanan bahan makanan untuk dijual tentu aja menjadi tempat yang baik untuk berkembang-biaknya hewan pengerat liar seperti contohnya tikus. Tikus dapat berkembang biak dengan pesat di pasar tradisional karena tersedianya makanan bagi mereka dan banyak sudut dan lingkungan pasar yang menjadi sarang mereka. Tikus tidak hanya sebagai hama yang merusak bahan makanan yang diperjual belikan akibat digerogoti juga tentu saja membawa penyakit bagi manusia yang salah satunya adalah penyakit Leptospirosis (Heath SE et al, 1994). Tikus sebagai pembawa bakteri Leptospira dalam tubuhnya dapat mencemari lingkungan pasar tradisional terutama air lingkungan disekitar pasar melalui air kencing yang dikeluarkannya yang dapat mengandung bakteri Leptospira (Soejoedono RR, 2000). Masyarakat yang terlibat langsung di pasar tradisional baik pedagang, pembeli, buruh pasar maupun masyarakat yang tinggal disekitar pasar tradisional dapat saja terinfeksi oleh bakteri Leptospira akibat adanya kontak langsung dengan air di sekitar pasar tradisional yang sudah terkontaminasi oleh bakteri Leptospira. Maka dari itu perlu kiranya dilakukan penelitian yang mendeteksi keberadaan bakteri Leptospira pada air disekitar pasar tradisional dengan menggunakan metode yang lebih cepat dan akurat dimana salah satunya dengan menggunakan metode PCR.
1.2 Rumusan masalah Berdasarkan latar belakang di atas beberapa permasalahan yang akan dijawab dalam penelitian ini adalah : 1. Air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang terkontaminasi oleh bakteri Leptospira patogen? 2. Air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang terkontaminasi oleh bakteri Leptospira saprofit? 3. Air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang tidak terkontaminasi oleh bakteri Leptospira patogen dan Leptospira saprofit?
8
4. Bagaimanakah kemampuan metode PCR tiga primer dalam membedakan antara bakteri Spesies Leptospira patogen dengan Leptospira Saprofit dari air lingkungan sekitar pasar tradisional di Kota Denpasar ?
1.3 Tujuan Penelitian Tujuan umum : Untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri Leptospira saprofit dan Leptospira patogen dari air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional di Kota Denpasar Tujuan khusus : 1. Untuk mengetahui air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang terkontaminasi oleh bakteri Leptospira patogen? 2. Untuk mengetahui air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang terkontaminasi oleh bakteri Leptospira saprofit? 3. Untuk mengetahui air lingkungan di sekitar Pasar Tradisional mana saja di Kota Denpasar yang tidak terkontaminasi oleh bakteri Leptospira patogen dan Leptospira saprofit? 4. Untuk mengetahui bagaimana kemampuan metode PCR tiga primer dalam membedakan antara bakteri Spesies Leptospira patogen dengan Leptospira Saprofit dari air lingkungan sekitar pasar tradisional di Kota Denpasar
1.4 Manfaat Penelitian 1. Memberikan informasi tentang persentase dan lingkungan pasar tradisional mana saja yang terkontaminasi bakteri Leptospira saprofit dan Leptospira patogen pada air lingkungan sekitar pasar tradisional di Kota Denpasar 2. Memberikan pengetahuan dan ketrampilan kepada peneliti tentang isolasi dan identifikasi bakteri Leptospira pathogen dilihat dari aspek mikrobiologi dan biologi molekuler. 3. Memberikan informasi awal tentang kontaminasi bakteri Leptospira kepada instansi terkait sebagai upaya penanggulangan pencemaran dan upaya pencegahan penyakit menular pada masyarakat yang mengunjungi pasar tradisional di Kota Denpasar.
9
BAB II KERANGKA KONSEP PENELITIAN
Pasar tradisional sebagai tempat bertemunya banyak orang dengan aktifitas jual beli dan tempat penyimbanan barang dagangan yang berupa bahan makanan dan dengan begitu banyak kios tempat berjualan tentu aja menjadi tempat yang baik untuk berkembang-biaknya hewan pengerat liar seperti contohnya tikus. Tikus dapat berkembang biak dengan pesat di pasar tradisional karena tersedianya makanan bagi mereka dan banyak sudut dan lingkungan pasar yang menjadi sarang mereka. Tikus tidak hanya sebagai hama yang merusak bahan makanan yang diperjual belikan akibat digerogoti juga tentu saja membawa penyakit bagi manusia yang salah satunya adalah penyakit. Tikus sebagai pembawa bakteri Leptospira dalam tubuhnya dapat mencemari lingkungan di sekitar pasar tradisional seperti selokan, saluran pembuangan air limbah, sungai, kios atau toko, gudang tempat sampah dan terutama air lingkungan disekitar pasar melalui air kencing yang dikeluarkannya yang dapat mengandung bakteri Leptospira. Masyarakat yang terlibat langsung di pasar tradisional baik pedagang, pembeli, buruh pasar maupun masyarakat yang tinggal disekitar pasar tradisional dapat saja terinfeksi oleh bakteri Leptospira akibat adanya kontak langsung dengan air di sekitar pasar tradisional yang sudah
terkontaminasi oleh bakteri
menimbulkan penyakit leptospirosis.
10
Leptospira sehingga dapat
Gambar 3.1 Skema Kerangka Konsep Penelitian Bagan dengan dasar warna abu-abu merupakan ranah yang akan diteliti
11
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskritif yang merupakan studi eksploratif.
3.2 Lokasi Penelitian Pengambilan spesimen air dari lingkungan pasar tradisional dilaksanakan di sekitar 7 lokasi pasar tradisional di wilayah Kota Denpasar dengan keterwakilan di wilayah kota Denpasar yaitu wilayah Denpasar Pusat Kota, Denpasar Selatan dan Denpasar Timur seperti yang terlihat pada tabel di bawah.
Tabel 4.1 lokasi pengambilan sampel air di sekitar lingkungan pasar tradisional seluruh wilayah Kota Denpasar No. 1
Wilayah Denpasar pusat kota
2
Denpasar Selatan
3
Denpasar Timur
Pemeriksaan sampel air
Nama Pasar 1. Pasar Badung Kumbasari 2. Pasar Kreneng 1. Pasar Desa Sanur 2. Pasar Renon 1. Pasar Desa Kesiman 2. Pasar Ketapian 3. Pasar Surabi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Klinik
FK.Unud/RS.Sanglah Denpasar.
3.3 Waktu Penelitian Penelitian dimulai sejak proposal ini dinyatakan diterima dan berakhir diperkirakan 8 bulan setelahnya.
12
3.4 Populasi Penelitian Populasi Target Penelitian Populasi target penelitian ini adalah Lingkungan sekitar Pasar Tradisional seluruh wilayah Kota Denpasar
Sampel Penelitian Sebagai sampel dalam penelitian ini adalah air dari lingkungan sekitar pasar tradisional seperti : selokan, saluran pembuangan limbah, tempat penampungan air, genangan air maupun sungai yang ada di sekitar pasar tradisional. Dari setiap pasar tradisional minimal diambil dari dua lokasi tempat pengambilan air.
3.5. Metode pengambilan Sampel dan Besar sampel Pengambilan sampel menggunakan salah satu teknik non-random sampling yaitu quota sampling. Besar sampel ditentukan dengan cara quota sampling yaitu lokasi pengambilan dan jumlah sampel yang akan diambil telah ditentukan oleh peneliti sebelumnya. Besar sampel yang ditentukan sebanyak 7 pasar tradisional dengan masing-masing minimal 2 sampai 3 lokasi pengambilan air, sehingga diperkirakan besar sampel air yang diperoleh sebanyak 19 sampel air.
3.6 Definisi Operasinal Variabel 1. Pasar Tradisional adalah tempat berkumpulnya sejumlah penjual dan pembeli dimana terjadi transaksi jual-beli barang dengan tempat berjualan yang masih sederhana dimana antar penjual dan pembeli bertatap muka langsung dengan terjadi transaksi langsung dimana pembeli mendapatkan langsung barang yang dibeli dengan membayar sejumlah uang yang telah disepakati. 2. Air di Lingkungan sekitar pasar tradisional adalah sejumlah air sebagai sampel yang didapatkan dari lingkungan pasar tradisional seperti dari selokan, saluran pembuangan limbah, tempat penampungan air, genangan air maupun sungai yang ada di sekitar pasar tradisional.
13
3. Leptospira patogen adalah bakteri genus leptospira yang dapat menimbulkan penyakit infeksi pada manusia dengan spesies Leptospira interrogans dan Leptospira borgpetersenii 4. Leptospira saprofit adalah Leptospira jenis non-patogen dengan genus leptospira yang tidak menimbulkan penyakit infeksi pada manusia dengan spesies Leptospira biflexa 5. Hasil polymerase chain reactions (PCR) positif adalah apabila dari hasil ekstraksi DNA bakteri yang diamplifikasi pada regio gen spesifik menggunakan set primer spesifik, dimana pada visualisasi dengan proses elektroporesis dan pada ultra violet (UV) transiluminator tampak pita berwarna putih pada ukuran basepair yang sesuai dengan yang diharapkan.
3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Cara pengambilan sampel Untuk memperoleh sampel yang berasal dari air lingkungan di sekitar pasar tradisional dilakukan dengan memakai botol penampungan steril untuk lokasi dengan air yang banyak seperti sungai dan dengan menggunakan container steril ukuran 100 cc untuk pengambilan sampel pada air yang sedikit seperti selokan dan genangan air. Unutk lokasi dengan air yang banyak seperti sungai dilakukan dengan cara berikut; botol penampungan steril dibenamkan ke dalam tempat genangan air sampai air dapat masuk ke botol, ambil air dengan cara aseptik minimal 50 cc. Untuk air yang sedikit cukup diambil langsung dengan menggunakan wadah steril dan ditutup rapat untuk mencegah kontaminasi, lalu botol diberi label (nama/nomor, lokasi sumber air, tanggal pengambilan). Selanjutnya wadah dimasukkan kedalam cool box yang berisi ice pack lalu ditutup rapat dan segera dikirim ke laboratorium untuk diproses.
3.7.2 Filtrasi air dengan kasa steril untuk sampel air yang banyak. Telah disiapkan gelas kaca (becker) steril ukuran 1000 ml dan corong kaca dan kain kasa atau kertas saring yang juga telah disteril. Air sampel kemudian dituangkan kedalam corong kaca yang telah berisi kertas saring atau kasa steril dengan air hasil
14
saringan ditampung pada gelas kaca steril. proses penyaringan dilakukan dengan memperhatikan prosedur aseptik.
3.7.3 Filtrasi air dengan membran milipore untuk sampel air yang banyak Sampel air yang telah melalui filtrasi menggunakan kasa steril dilanjutkan dengan filtrasi dengan menggunakan membran milipore 0.4 µm. alat filtasi membran milipore berupa pompa, filter steril, gelas kaca steril dan milipore 0,4 µm disiapkan disiapkan. Air sampel kemudian dialirkan pada mesin filtrasi dan hasil filtrasi ditampung pada gelas kaca yang lain. Kemudian membran filter milipore 0.4 µm hasil filtrasi diresuspensi dengan 10 ml larutan NaCL 0.9%, kemudian dipotongpotong dengan gunting steril kemudian dilakukan vortex untuk proses homogenisasi, kemudian sampel resuspensi dialikuot, 1 ml untuk kultur tanpa diasamkan dan 1 ml untuk bahan PCR.
3.7.4 Ekstraksi DNA bakteri dari air DNA dari serum sampel diekstraksi menggunakan kit komersial QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Inc) dengan prosedur kerja sebagai berikut :
15
16
3.7.5 pemeriksan PCR 1. Dalam collection tube ukuran 200 µl, campur reagen PCR mix dengan komposisi :
Komponen
Volume (µl) Untuk 1 Reaksi
H2O
7
Master Mix
10
Primer Lepto1(F)
1
Primer Lepto2(F)
1
Primer Lepto3(F)
1
Primer yang digunakan adalah tiga spesifik primer yang didesain dari gen 16S rRNA yaitu : Lepto1(F) = 5’GTCAAACGGGTAGCAATACC 3’ Lepto2(R) = 5’GTCCGCCTACACACCCTTTAC3’ Lepto3(F) = 5’AATACTGGATAGTCCCGAGAGGTC3’ (Uavechanichkul R et al,2011).
Jumlah campuran ini hanya untuk 1 reaksi jadi hitung dengan baik
jumlah
campuran untuk menjalankan sampel, kontrol positif dan kontrol negatif. Spin beberapa detik
2. Pindahkan dalam semua campuran (20µl) ke dalam tabung 200µl, tambahkan template DNA atau sampel atau kontrol positif atau kontrol negatif (H2O) sebanyak 5µl (Total campuran = 25µl)
3. Masukkan dalam Thermal Cycler dengan program berikut : 1.
Initial PCR activation step (1 siklus) 92 ºC
2 menit
2. 3 step cycling (35 siklus) 94ºC
2 menit (denaturasi)
54ºC
1 menit (annealing)
17
72ºC
1 menit (ekstensi)
3. Final extension 72ºC
5 min
5. Tunggu hasil amplifikasi, lanjutkan dengan elektroforesis.
3.7.6 Membuat gel agarose 1,5% Pembuatan gel agarose 1,5% dilakukan dengan prosedur sebagai berikut : -
Timbang Agarose sebanyak 0,6 gram
-
Tuang kedalam tabung tahan panas
-
Tambahkan 40 ml TBE buffer
-
Didihkan Sampai larut dalam microwave selama 4 menit
-
Biarkan sampai suhunya 60ºC
-
Tambahkan 2 µl Etidium bromide gel staining
-
Tuang dalam tray yang telah dipasang comb
-
Biarkan Sampai mengeras, angkat comb
3.7.7 Prosedur elektroforesis -
Siapkan hasil PCR (sampel, Kontrol positif dan kontrol negatif) sebanyak masing-masing 5 µl tanpa loading dye.
-
Masukkan masing-masing hasil PCR kedalam sumuran pada gel agarose dalam elektroforesis chamber
-
Isi salah satu sumur dengan marker 100 bp
-
Nyalakan power suplay pada posisi 100 volt selama 40 menit
-
Baca hasil elektroforesis dengan menggunakan UV Transluminator/gel doc 18
3.7.8 Analisis dan Penyajian Data Data yang diperoleh pada penelitian ini akan disajikan dalam bentuk tabel serta narasi.
3.8 Alur Penelitian
19
BAB IV HASIL PENELITIAN
4.1 Pengambilan Sampel air lingkungan pasar tradisional Penelitian ini telah mengambil sampel dari air lingkungan sekitar pasar tradisional di Denpasar sebanyak 19 titik lokasi yang berasal dari 8 lokasi pasar radisional yang ada di Denpasar dengan meliputi wilayah Denpasar pusat kota, Denpasar Selatan dan Denpasar Timur seperti yang tampak pada Gambar 4.1. Hasil pengumpulan sampel dan lokasi daerah pengambilan sampel air lingkungan beserta kode sampel disajikan seperti pada Tabel 4.1 dan Tabel 4.2.
Tabel 4.1 Distribusi pasar tradisional tempat pengambilan sampel air No. 1
Wilayah Denpasar pusat kota
2
Denpasar Selatan
3
Denpasar Timur
Nama Pasar 3. Pasar Badung Kumbasari 4. Pasar Kreneng 3. Pasar Desa Sanur 4. Pasar Renon 4. Pasar Desa Kesiman 5. Pasar Ketapian 6. Pasar Surabi
20
Tabel 4.2 Lokasi pengambilan air lingkungan pasar tradisional No. 1
2
Nama Pasar
Lokasi pengambilan sampel
Pasar Badung Kumbasari
Selokan lorong penjual daging
BD 1
Sungai besar pasar badung
BD 2
Genangan air depan toko kelontong Selokan dekat penjual daging
BD 3
Pasar Kreneng
Kode Sampel
KR 1
Selokan disamping dagang sate KR 2 parkiran Selokan air kran untuk umum KR 3 3
4
Pasar Desa Sanur
Pasar Renon
5
Pasar Desa Kesiman
6
Pasar Ketapian
7
8
Pasar Surabi
Dagang Desa Yang Batu
Selokan kran air umum belakang Selokan dekat tempat sampah
SNR 1
Selokan kran air umum timur
RN 1
Selokan kran air umum depan
RN 2
Genangan air depan pintu masuk Genangan air komplek dagang timur Genangan air komplek dagang di dalam Genangan air dekat pintu keluar Genangan air komplek dagang di luar Selokan kran air umum dekat toilet Selokan depan
KM 1
Selokan Belakang
MD 2
Selokan samping
MD 3
21
SNR 2
KT 1 KT 2 KT 3 SR 1 SR 2 MD 1
A.
B.
22
C. Gambar 4.1. Titik lokasi Pengambilan sampel dari air lingkungan sekitar pasar tradisional A. Pasar Kreneng B. Pasar Badung C. Sungai di Pasar Badung
Semua sampel yang telah dikumpulkan kemudian di catat dengan pemberian kode sampel, sehingga sampel semua terkumpul menjadi sebanyak 16 sampel. Setiap sampel yang telah diambil kemudian disimpan dulu di dalam lemari pendingin untuk kemudian bersama-sama dilakukan pemeriksan lebih lanjut. (Gambar 4.2).
23
Gambar 4.2 Semua sampel yang telah dikumpulkan
Setiap sampel air yang diperoleh dipersiapkan untuk dilakukan ekstraksi DNA. Sebelum ektraksi DNA untuk sampel air yang diambil lebih dari 500 cc difiltrasi dengan membran milipore 0.2 µm, kemudian membran filter diresuspensi dengan 10 ml larutan NaCL 0.9%, dilakukan vortex untuk proses homogenisasi, kemudian sampel resuspensi dialikuot, 1 ml diambil untuk bahan pemeriksaan PCR. Untuk sampel yang kurang dari 500 cc cukup dihomogenkan dengan cara digoyang-goyangkan sampai tampak homogen.
4.2 Deteksi Leptospira patogen dan saprofit metode PCR menggunakan 3 primer Sampel air lingkungan pasar tradisional yang telah dihomogenkan selanjutnya dilakukan pemeriksaan dengan metoda PCR untuk mendeteksi gen spesifik yang dapat membedakan leptospira yang patogen dengan yang saprofit menggunakan tiga spesifik primer yang didesain dari gen 16S rRNA yaitu : Lepto1(F) = 5’GTCAAACGGGTAGCAATACC 3’, Lepto2(R) = 5’GTCCGCCTACACACCCTTTAC3’ dan Lepto3(F) = 5’AATACTGGATAGTCCCGAGAGGTC3’ untuk isolasi Gen spesifik dari sampel air dengan dilakukan tahapan-tahapan dimulai dari tahap ekstraksi DNA, amplifikasi dengan PCR dan deteksi DNA dengan eletroforesis dengan gel agarose 2%. Awalnya dilakukan optimasi PCR pada bakteri kontrol positif. Hasil elektroforesis dibawah sinar UV short wave disajikan seperti pada gambar dibawah: 24
Gambar 4.3 Gambar hasil elektroforesis produk PCR sampel kontrol bakteri patogen Leptospira interogans serovar bataviae dan Leptospira borgpetersenii serovar ballum untuk optimasi pemeriksaan PCR dengan hasil tampak adanya pita di atas 400 bp (409 bp) yang tampak pada kedua kontrol positif
Gambar 4.4 Gambar hasil elektroforesis produk PCR sampel kontrol bakteri patogen sebagai kontrol positif 1 yaitu Leptospira interogans serovar bataviae dan kontrol positif 2 yaitu Leptospira borgpetersenii serovar ballum untuk optimasi pemeriksaan PCR dengan hasil tampak adanya pita di atas 400 bp (409 bp) yang tampak pada kedua kontrol positif
25
Gambar 4.5 Gambar hasil elektroforesis produk PCR sampel kontrol bakteri patogen sebagai kontrol positif 1 yaitu Leptospira interogans serovar bataviae dan kontrol positif 2 yaitu Leptospira borgpetersenii serovar ballum untuk optimasi pemeriksaan PCR dengan A dan B menggunakan pengenceran DNA yang berbeda pada hasil ekstraksi DNA dimasil hasil PCR menunjukkan adanya pita di atas 400 bp (409 bp) yang tampak pada kedua kontrol positif dan pda masing-masing pengenceran yang menunjukkan hasil tidak ada perbedaan. Setelah dilakukannya optimasi pemeriksaanPCR pada kedua kontrol yaitu kontrol positif 1. Leptospira interogans serovar bataviae dan kontrol positif 2 yaitu Leptospira borgpetersenii serovar ballum kemudian metode ini dilanjutkan diterapkan pada semua sampel dengan dilakukan tahapan-tahapan dimulai dari tahap ekstraksi DNA, amplifikasi dengan PCR dan deteksi DNA dengan eletroforesis dengan gel agarose 2%. Hasil elektroforesis dibawah sinar UV short wave pada semua sampel disajikan seperti pada gambar dibawah:
26
Gambar 4.6 Gambar hasil elektroforesis produk PCR sampel air lingkungan pasar tradisional untuk mendeteksi adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) seperti yang tampak pada kontrol positif 1. Leptospira interogans serovar bataviae. Tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. 5, 8,10,11. Sedangkan beberapa sampel mennjukkan adanya hanya 1 pita yang diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no.1,3,6, 9 yang menunjukkan adanya DNA saprofit leptospira.
27
Gambar 4.7 Gambar hasil elektroforesis produk PCR sampel air lingkungan pasar tradisional untuk mendeteksi adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) seperti yang tampak pada kontrol positif 2. Leptospira borgpetersenii serovar ballum. Tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. 18, Sedangkan beberapa sampel mennjukkan adanya hanya 1 pita yang diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no.13,14,15,17,19 yang menunjukkan adanya DNA saprofit leptospira
28
Gambar 4.8 Gambar hasil elektroforesis ulangan produk PCR sampel air lingkungan pasar tradisional untuk mendeteksi adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) seperti yang tampak pada kontrol positif 1. Leptospira interogans serovar bataviae. dan kontrol positif 2 Leptospira borgpetersenii serovar ballum. Tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. ,5, 8,10,11. Sedangkan beberapa sampel mennjukkan adanya hanya 1 pita yang diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no.3,6, 9 yang menunjukkan adanya DNA saprofit leptospira.
29
Gambar 4.9 Gambar hasil elektroforesis ulangan produk PCR sampel air lingkungan pasar tradisional untuk mendeteksi adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) seperti yang tampak pada kontrol positif 1. Leptospira interogans serovar bataviae. dan kontrol positif 2 Leptospira borgpetersenii serovar ballum. Tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. 18, Sedangkan beberapa sampel mennjukkan adanya hanya 1 pita yang diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no.12, 13,14,15,17,19 yang menunjukkan adanya DNA saprofit leptospira
30
Gambar 4.10 Gambar hasil elektroforesis ulangan produk PCR sampel untuk memperjelas adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) pada sampel-sampel yang diduga memiliki 2 pita sejajar dengan kontrol positif 1. Leptospira interogans serovar bataviae. dan kontrol positif 2 Leptospira borgpetersenii serovar ballum. Tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. 5, 8,10,11,18
31
Pada semua gambar diatas menunjukkan hasil elektroforesis produk PCR pada kontrol positif
1 (K1) yang merupakan
interogans serovar bataviae. dan
bakteri kontrol Leptospira
Leptospira
kontrol positif 2 (K2) Leptospira borgpetersenii
serovar ballum. Setelah dilakukan beberapa kali pengulangan pemeriksaan PCR tampak adanya beberapa sampel yang menunjukkan hasil yang postif dimana adanya dua pita yang diharapkan yaitu di atas 400 bp (409 bp) dan diatas 500 bp (503 bp) yaitu sampel no. 5, 8,10,11,18. Kelima sampel yang mempunyai 2 pita yang sejajar dengan kontrol K1 dan K2 dapat diduga terdapat gen spesifik pada DNA dari bakteri leptospira patogen sehingga diasumsikan pada kelima sampel air lingkungan pasar tradisional terdapat bakteri leptospira patogen. Sampel no. 5, 8,10,11,18 mempunyai dua pita yang sejajar dengan kontrol K1 dan K2 dapat diduga terdapat gen spesifik pada DNA dari bakteri leptospira patogen sehingga diasumsikan pada kelima sampel air lingkungan pasar tradisional terdapat bakteri leptospira patogen. Kelima sampel tersebut adalah seperti tabel berikut :
Tabel 4.3 Kode sampel dan kolasi tempat pengambilan sampel yang diduga terdapat Leptospira patogen No.Sampel
Kode Sampel
Lokasi sampel
5
BD 3
Genangan air depan toko kelontong Pasar Badung
8
SNR 2
Selokan dekat tempat sampah Pasar Desa Sanur
10
KT 1
Genangan air komplek dagang timur Pasar Ketapian
11
KT 3
Genangan air dekat pintu keluar Pasar Ketapian
18
RN 2
Selokan kran air umum depan Pasar Renon
32
Sedangkan sampel no.3,6,9,13,14,15,17,19 menunjukkan adanya DNA saprofit leptospira. Tabel 4.4 Kode sampel dan kolasi tempat pengambilan sampel yang diduga terdapat Leptospira saprofit No.Sampel
Kode Sampel
Lokasi sampel
1
MD 3
Selokan samping Dagang Desa Yang Batu
3
MD 2
Selokan belakang Dagang Desa Yang Batu
6
KR 3
Selokan air kran untuk umum Pasar Kreneng
9
SR 2
Selokan kran air umum dekat toilet Pasar Surabi
13
BD 1
Selokan lorong penjual daging Pasar Badung
14
SNR 1
Selokan kran air umum belakang Pasar Desa Sanur
15
SR 1
Genangan air komplek dagang di luar Pasar Surabi
17
KT 2
Genangan air komplek dagang di dalam Pasar Ketapian
19
RN 1
Selokan kran air umum timur Pasar Renon
33
Tabel 4.5 Kode sampel dan kolasi tempat pengambilan sampel yang diduga tidak terdapat Leptospira patogen dan Saprofit No.Sampel
Kode Sampel
Lokasi sampel
2
MD 1
Selokan depan Dagang Desa Yang Batu
4
KR 1
Selokan dekat penjual daging Pasar Kreneng
7
KR 2
Selokan disamping dagang sate parkiran Pasar Kreneng
12
KM 1
Genangan air depan pintu masuk Pasar Desa Kesiman
16
BD 2
Sungai besar pasar badung
34
BAB V PEMBAHASAN
Diantara beberapa cara alternative untuk mendeteksi leptopsira, deteksi DNA merupakan cara yang cepat, lebih sensitif dan spesifik. Metode ini dapat dilakukan baik dengan konvensional PCR mupun real-time PCR (Karuniawati A,et al 2012) Pemeriksaan pada sampel dari lingkungan memerlukan evaluasi dan perhatian lebih. Leptospira non patogen atau disebut saprofit yang diwakili oleh .L. biflexa merupakan yang paling sering sebagai kontaminan lingkungan dan sering meragukan pada identifikasi strain patogen dari sampel lingkungan. Metode PCR merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk identifikasi (Smythe LD et al, 2002) Pita 503 bp dari hasil pcr ditemukan pada leptospira patogen serovar autumnalis, bataviae, canicola, djasiman, hebdomadis, icterohaemorrhagiae, pamona, pyrogenes dan sejroe. Hasil penelitian menunjukkan produk PCR pada 409 bp ditemukan dari sampel patogen. Ada atau tidaknya suatu hasil PCR dapat dengan mudahterjadi salah interpretasi sebagai negative palsu oleh karena itu salah satu cara yang dapat ditempuh dengan melakukan pemeriksaan PCR menggunakan kombinasi tiga primer Yaitu Lepto1(F), Lepto2(R) dsn Lepto3(F). Hasilnya menunjukkan dengan menggunakan 3 primer sekaligus dapat mengamplifikasi genom DNA dari 21 leptospira serovar patogen dan 4 serovar saprofit. Adanya 2 pita yaitu pada 503 bp dan 409 bp terdeteksi pada kelompok patogen, sedangkan yang hanya menunjukkan 1 pita pada 503 bp ditemukan pada spesies leptospira saprofit. (Uavechanichkul R, 2011) Bakteri leptospira sebagai penyebab penyakit leptospirosis merupakan penyakit zoonosis yang dapat menyebar luas.Bakteri ini mempunyai sumber penularan infeksi pada manusia melalui kontak secara langsung atau tidak langsung dengan urin hewan yang terinfeksi. Leptospira masuk ke dalarn tubuh melalui kulit yang terbuka atau membrane mukosa. Orang-orang yang berhubungan dengan perairan, lumpur dan hewan merupakan orang dengan resiko terinfeksi lebih besar (Levett PN, 2001). Leptospira dapat bertahan hidup di dalam air bersifat basa sampai 6 bulan. Penularan juga dapat terjadi jika kontak Iangsung dengan tanah basah yang terkontaminasi urin hewan penderita leptospirosis (Infectious Disease Information
35
Center, 2005). Leptospira biflexa merupakan safrofit yang hidup bebas di perairan dangkal dan jarang dihubungkan dengan infeksi pada manusia (Higgins R. 2004). Pasar tradisional sebagai tempat jual beli barang dan bahan makanan serta tersimpannya dagangan yang tentu saja banyak terdapat sarang hewan pengerat seperti tikus. Tikus dapat berkembang biak dengan pesat di pasar tradisional karena tersedianya makanan bagi mereka dan banyak sudut dan lingkungan pasar yang menjadi sarang mereka. Tikus tidak hanya sebagai hama yang merusak bahan makanan yang diperjual belikan akibat digerogoti juga tentu saja membawa penyakit bagi manusia yang salah satunya adalah penyakit Leptospirosis (Heath SE et al, 1994). Tikus sebagai pembawa bakteri Leptospira dalam tubuhnya dapat mencemari lingkungan pasar tradisional terutama air lingkungan disekitar pasar melalui air kencing yang dikeluarkannya yang dapat mengandung bakteri Leptospira (Soejoedono RR, 2000). Dengan timbulnya ada pita yang muncul pada pemeriksaan PCR dari sampel yaitu sampel yang menunjukkan adanya 2 pita yang sejajar seperti kontrol positif yaitu pada 503 bp dan 409 bp dimana diduga terdeteksi pada kelompok patogen, dan ada sampel yang menunjukkan 1 pita pada 503 bp dimana diduga ditemukan spesies leptospira saprofit serta ada sampel yang tidak menunjukkan kedua pita seperti kontrol dimana diduga tidak terdapat bakteri leptospira patogen dan saprofit. Pemeriksaan PCR pada penelitian ini yang menggunakan kombinasi tiga primer dapat membedakan adanya leptospira patogen, leptospira saprofit maupun yang tidak ada leptospira patogen dan saprofit dari sampel air lingkungan pasar tradisional. Pemeriksaan PCR menggunakan kombinasi tiga primer ini telah dikembangkan dan digunakan untuk mendeteksi dan membedakan antara spesies leptospira patogen dengan spesies saprofit pada gel agarose yang mana dapat diaplikasikan pada diagnosis rutin (Uavechanichkul R, 2011)
36
BAB VI KESIMPULAN
1. Sampel dari air lingkungan genangan air depan toko kelontong Pasar Badung, selokan dekat tempat sampah Pasar Desa Sanur, genangan air komplek dagang timur Pasar Ketapian, genangan air dekat pintu keluar Pasar Ketapian, selokan kran air umum depan Pasar Renon mempunyai dua pita yang sejajar dengan kontrol K1 dan K2 dapat diduga terdapat gen spesifik pada DNA dari bakteri leptospira patogen. 2. Sampel dari air lingkungan selokan samping Dagang Desa Yang Batu, selokan belakang Dagang Desa Yang Batu, selokan air kran untuk umum Pasar Kreneng, selokan kran air umum dekat toilet Pasar Surabi, selokan lorong penjual daging Pasar Badung, selokan kran air umum belakang Pasar Desa Sanur, genangan air komplek dagang di luar Pasar Surabi, genangan air komplek dagang di dalam Pasar Ketapian, selokan kran air umum timur Pasar Renon menunjukkan hasil PCR hanya 1 pita pada 503 bp dimana diduga ditemukan spesies leptospira saprofit 3. Sampel dari air lingkungan selokan depan Dagang Desa Yang Batu, selokan dekat penjual daging Pasar Kreneng, selokan disamping dagang sate parkiran Pasar Kreneng, genangan air depan pintu masuk Pasar Desa Kesiman, sungai besar pasar badung tidak menunjukkan kedua pita seperti kontrol dimana diduga tidak terdapat bakteri leptospira patogen dan saprofit 4. Pemeriksaan PCR pada penelitian ini yang menggunakan kombinasi tiga primer dapat membedakan adanya leptospira patogen, leptospira saprofit maupun yang tidak ada leptospira patogen dan saprofit dari sampel air lingkungan pasar tradisional.
37
DAFTAR PUSTAKA
Brooks GF, Butel JS, Morse SA. 2001. Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan, Penerbit Buku Kedokteran Jakarta.. Center for Diseases Control and Prevention (CDC).2005. Leptospirosis. Available at: http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/leptospirosis_g.htm Darodjat M, Ronohardjo P. 1989. Diagnosa Serologik Microscopic Agllutination Test (MAT) untuk leptospirosis pada serum manusia. Penyakit Hewan XXl(37) Semester 1 : 1-8 . Departemen kesehatan RI.2009.Awas, Gejala Leptospirosis menyupai Flu.Avilable at: http://www.depkes.go.id/index.php?option=articles&task Ebrahimi A, Nasr Z, Koiouri GHA. 2004. Scroinvestigation of bovine leptospirosis in Shahrekord district, central Iran . Iranian J . Vet .Res. University of Shiraz . 5(2) Ser. (10) . 1383 : 110-113 . Ellis WA, Obrien JJ, Nell SO, Bryson DG. 1986. Bovine leptospirosis: experimental serovar hardjo infection. Vet. Microbiol. 11 : 293-299. Faine S. 1982. Guidelines for the Control of Leptospirosis.WHO, Geneva. 171 p . Hartman EG, Van Den Ingh TSGAM, Rothutzen J. 1986 . Clinical, pathological and serological features of spontaneous canine leptospirosis. An evaluation of the IgM- and IgGspecific ELISA. Vet. Immunol . and Immunopathol.13:261-271. Heath SE, Johnson R. 1994. Leptospirosis. Javma 205(11) : 1518-1523 . Hickey PW, Deemeks D. 2003. Leptospirosis. Emedicine . pp .1-9 . Higgins, R. 2004. Emerging or re-emerging bacterial zoonotic diseases : bartonellosis, leptospirosis, Lyme borreliosis, plague.Rev.Sci.Tech. Off. Int . Epiz. 23(2):569-581 . Infectious Disease Information Center. 2005 . Leptospirosis-weil's disease-sewerman's fluswineherd's disease-Milker's disease . available in http .://www.Leptospirosisweil's disease.htm . Karuniawati A, Yasmon A, Ningsih I, 2012, Optimizing real-time PCR method to detect Leptospira spp. in human blood and urine specimens Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Universitas Indonesia, Jakarta, Indonesia Med J Indones Vol. 21, No. 1
38
Kocabiyik AL, Cetin C. 2003. Detection of antibodies to Leptospira interrogans serovar Hardjo by the Microscopic Agglutination Test and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in cattle sera . Indian Vet. J . 80:969-971. Kusmiyati, Noor SM, Supar. Leptospirosis pada hewan dan manusia di Indonesia. Balai Penelitian Veteriner Bogor. Indonesia.Wartazoa. 2005;15:213-20. Levett PN. 2001 . Leptospirosis. Clinical Microbiol. Review.14(2):296-326. Nazir H. 2005 . Diagnosis klinis dan penatalaksanaan leptospirosis . Disampaikan pada Workshop dan Training Penanggulangan Leptospirosis bagi Dokter Puskesmas di Propinsi DKI Jakarta, Bapelkes Depkes Cilandak, 29 Maret 2005. Office International Des Epizooties. 2000. Leptospirosis, in Manual of standards for diagnostic test and vaccines, 4th edition: 265-275. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perdagangan Dalam Negeri Departemen Perdagangan RI bekerja sama dengan PT Indef Eramadani (INDEF), 2007, Desember. “Kajian Dampak Ekonomi Keberadaan Hypermarket terhadap Pasar Tradisional”. Jakarta Ratnam S, Everard COR, Alex C. 1994. A pilot study on the prevalence of leptospirosis in Tamilmadu State . Indian Vet. J . 71 : 1059-1063 . Simanjuntak GM, Koesharjono C, Hardjoutomo S.1986 . Leptospirosis di daerah transmigrasi Kuala Cinaku propinsi Riau tahun 1981 . Penyakit Hewan XVI11(31) Semester I : 6-13 Scott-ORR, H, Darodjat M. 1978 . Leptospirosis : Kerja Pendahuluan di LP :PII . Bull . Lembaga Penelitian Penyakit Hewan (16) : 35-44. Scott-ORR, H, Darodjat M, Aciidijati J. 1980. Kejadian Leptospirosis dan Brucellosis pada ternak di Indonesia. Risalah (Proc.) Seminar Penyakit reproduksi dan unggas . Tugu, Bogor, 13 15 Maret 1980. LPP:II-Puslitbangnak, Deptan : 31-57. Smythe LD, Smith IL, Smith GA, Dohnt MF, Symonds ML, Barnett LJ, 2002, A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp, BMC Infectious Diseases 2002, 2:13http://www.biomedcentral.com/1471-2334/2/13
Soejoedono RR. 2000. Zoonosis. Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bogor. Uavechanichkul R, Sraphet S, Suwancharoen D, Triwitayakorn K, 2011. PCR-Based Technique for Detection and Differentiation of Pathogenic and Saprophytic Leptospira Species. Int.J.Microbiol.Res.,2(1):43-48
39
Wagenaar J, Zuener RL, David ALT, Bolin CA. 2000. Comparison of polymerase chain reaction assays with bacteriologic culture, immunoftiorescence, and nucleic acid hybridization for detection of Leptospira borgpetersenii serovar hardjo in urin of cattle . AJVR 61(3) : 316-320 . Widarso,Wilfried, Siti G. 2005. Penanggulangan Leptospirosis di Indonesia. Pusat Data Informasi-Perhimpunan Rumah Sakit Seluruh Indonesia. Jakarta. Woodward M J, Sullivan AG, Palmer NMA, Woolfy JC,Redstone JS. 1991 Development of a PCR test specific for Leptospira hardjo genotype bovis. Vet. Rec .128:282-283
40
LAMPIRAN Dokumentasi penelitian
41
42
43
44
45
CURICULUM VITAE BIOGRAFI / DAFTAR RIWAYAT HIDUP
1. Nama lengkap dan gelar
: dr. Made Agus Hendrayana,M.Ked
2. Tempat / tanggal lahir
: Denpasar, 17 Juli 1978
3. NIP
: 197807172006041004
4. Pangkat/Gol.
: Penata / III c
5. Bagian
: Mikrobiologi
6. Alamat Rumah
: Jl.Soka gg.VI no:50 B – Denpasar
7. HP / email
: 08123921590 /
[email protected]
8. Pendidikan (dari sarjana muda / yang sederajat ke atas ) UNIVERSITAS / INSTITUT DAN LOKASI
GELAR
TAHUN
BIDANG STUDI
1. Fakultas Kedokteran UNUD
Dokter
2003
Dokter Umum
2. Fakultas Kedokteran UNAIR
M.Ked
2010
Ilmu Kedokt. Tropis
Pendidikan non-gelar 1). Short couse and workshop Tropical infectious diseases, Unsyah, Banda Aceh, 2008 2). Summer school on Molecular Biology and Tropical Infectious Disease, University of Goettingen, German, 2009
9. Pengalaman kerja dalam penelitian dan pengalaman professional INSTITUSI
JABATAN
I. Pengalaman Kerja : 1. Dosen FK UNUD Asisten Ahli 2. Anngota SMF. Mikrobiologi Anggota Klinik, FK UNUD/RS.Sanglah 3. Peneliti Tropical Disease Center Anggota peneliti UNAIR.
46
PERIODE KERJA 2004 s/d sekarang 2005 s/d sekarang 2008 s/d sekarang
10. Penelitian yang pernah dilakukan Judul Penelitian
Kedudukan
Sumber dana Tahun
Identifikasi bakteri patogen sebagai penyebab wabah diare dari sumber mata air dan hapusan dubur penderita di Kecamatan Selat, Karangasem, Bali Pola distribusi genotipe VHB dan Subtipe VHC di Puskesmas Mengwi I
Ketua
Pengmas FK-
Peneliti
UNUD
Ketua
DP2M Dikti
2009
Analisis genotipe, subgenotipe dan subtipe VHB di Mengwi, Badung
Ketua
BPPS Dikti
2009
Identifikasi Gen ctx-A dengan Metode PCR dari Bakteri Vibrio Cholera serotype O1 pada Es Batu dan Air Es Pendingin Tempat Penyimpanan Hasil Laut Identifikasi Gen Shiga-like toxin SLT II atau VT2 dari Bakteri Escherichia coli O157 Pada Daging Babi di Kota Denpasar Identifikasi Gen ctx-A dari DNA Bakteri Vibrio Cholera serotype O1 dengan Metode PCR pada Air Laut di Pantai Wisata Seluruh Bali Analisis genotipe dan subgenotipe virus hepatitis B pada DNA gen regio s (surface) dari ibu hamil dengan HBsAg positif di wilayah Batubulan, Gianyar, Bali Karakterisasi Molekuler Molekul Adhesin Helicobacter pylori Menggunakan Kultur Sel Lambung Mencit (Mus musculus) dan Sel Caco-2(Studi Patogenesis Infeksi Helicobacter pylori pada Lambung Mencit)
Ketua
Litbang
2010
Peneliti
FK UNUD
Anggota
Litbang
Peneliti
FK UNUD
Anggota
Litbang
Peneliti
FK UNUD
Ketua
Litbang
Peneliti
FK UNUD
Ketua
RISBIN
Peneliti
IPTEKDOK
2008
Peneliti
Peneliti
2010
2011
2011
2012
( dr. Made Agus Hendrayana, M.Ked )
47
BIOGRAFI / DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Nama
: dr. I Wayan Surudarma, M.Si.
Tempat/tanggal lahir
: Gianyar, 14 Pebruari 1973
Unit Kerja
: Bagian Biokimia FK UNUD
Riwayat pendidikan
:
Jenjang
Bidang Ilmu
Universtas
Kota
Tahun lulus
S1
Kedokteran
UNUD
Denpasar
2000
S2
Bioteknologi
UGM
Jogjakarta
2006
pendidikan
Riwayat Pekerjaan -
:
Dosen Biokimia di FK UNUD sejak tahun 2003 sampai sekarang.
Pengalaman Penelitian -
Tahun 2006. Kloning Gen Penyandi Protein Rhoptry (ROP1) Takizoit Toxoplasma gondii Isolat Lokal
Karya Ilmiah -
Kloning Gen Penyandi Protein Rhoptry (ROP1) Takizoit Toxoplasma gondii Isolat Lokal. Journal of GMU Biotechnology. Vol III, Juli 2007, hal. 49-57.
48
