LAPORAN PENELITIAN HIBAH PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL TAHUN ANGGARAN 2009
PEMBUATAN BIOSENSOR KONDUKTOMETRI UNTUK MENDETEKSI KADAR ASAM URAT MENGGUNAKAN NATA DE COCO SEBAGAI MEDIA AMOBILISASI URIKASE
Dr. Ani Mulyasuryani, MS Arie Srihardyastutie, S.Si, M.Kes
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, melalui DIPA Universitas Brawijaya No : 0174.0/023-04.2/XV//2009 tanggal 31 Desember 2008, dan berdasarkan SK rector nomor : 160/SK/2009, tanggal 7 Mei 2009
UNIVERSITAS BRAWIJAYA NOPEMBER 2009
RINGKASAN Biosensor konduktometri asam urat dibuat dengan beberapa tahap, yaitu pembuatan nata de coco, isolasi urikase, pembuatan elektroda, amobilisasi urikase pada elektroda kerja dan pengujian biosensor. Untuk menghasilkan biosensor yang menghasilkan kepekaan dan ketepatan yang cukup baik maka dilakukan optimasi ketebalan membran serta pH larutan sampel pada saat pengukuran. Indikator yang digunakan sebagai ukuran kinerja biosensor konduktometri adalah kepekaan dan linieritas hubungan antara konsentrasi terhadap signal (daya hantar). Pembuatan nata de coco digunakan Acerobacter xylinum sebagai ragi, fermentasi dilakukan pada temperatur kamar dan dengan adanya sedikit cahaya sehingga nata de coco yang dihasilkan merupakan suatu membran yang tipis. Lama fermentasi berkisar antara 3 hingga 4 hari sehingga dihasilkan membran yang mempunyai ukuran seragam. Adapun urikase hasil isolasi dari candida utilis mempunyai kadar enzim bebas sebesar 16 mg/mL. Elektroda terbuat dari kawat platina yang dibentuk dengan ukuran 5 x 5 mm, kemudian dilapisi dengan membran nata de coco dan dikeringkan sekitar 30 menit dalam temperatut 50oC. Elektroda ini dibuat paling tidak 3 buah karena pada setiap kali pengukuran larutan asam urat dilakukan 2 kali, pertama dengan menggunakan sepasang elektroda tanpa mengandung enzim baik di katoda maupun di anoda. Ke dua dilakukan dengan sepasang elektroda dimana salah satu elektroda merupakan biosensor atau elektroda kerja yang mengandung urikase amobil. Amobilisasi dilakukan dengan menggunakan 2 mL urikase dilakukan dengan cara perendaman, yaitu elektroda yang sudah mengandung membran direndam dalam larutan urikase selama 24 jam. Sebelum digunakan dilakukan pengkondisian dengan mengukur blanko hingga dihasilkan daya hantar yang tetap. Untuk mengetahui apakah urikase sudah teramobilkan dalam membran nata de coco, maka dilakukan pengukuran spektrum IR terhadap membran nata de coco dengan urikase amobil dibandingkan dengan membran nata de coco tanpa urikase. Dari hasil spektrum IR terlihat ada perbedaan puncak pada daerah 3000 – 2000 cm-1 dan pada 1750 – 1200 cm-1 yang menunjukkan adanya ikatan NC, O-H dan N-S-C, ikatan-ikatan tersebut umumnya terdapat dalam suatu enzim. Optimasi ketebatan membran nata de coco dilakukan dengan cara melapisi kawat platina dengan membran nata de coco sebanyak 1, 2 dan 3 lapisan, sehingga menghasilkan ketebalan membran 5, 10 dan 15 µm. Adapun ketebalan membran merupakan ketebalan kering. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa jumlah enzim yang teramobilkan dipengaruhi oleh ketebalan membran. Jumalah urikase yang paling banyak teramobilkan adalah pada membran dengan ketebalan 10 µm, yaitu sebanyak 28,68 mg. Dari hasil pengujian larutan asam urat, maka ketebalan membran yang paling baik adalah 10 µm. Hal ini dapat dipahami, karena jumlah urikase yang teramobilkan paling banyak. Pada kondisi tersebut kepekaan pengukuran sebesar 1,2 nmho/ppm, dengan linieritas sebesar 0,96. Pengukuran daya hantar larutan dilakukan pada pH = 9, hal ini mengacu pada hasil penelitian sebelumnya pada pembuatan biosensor asam urat potensiometri menggunakan membran kitosan. Dengan menggunakan membran 10 µm dilakukan optimasi pH pengukuran pada kisaran 7,5 hingga 9,5 dengan perbedaan 0,5 satuan pH. Hal ini dilakukan dengan mempertimbangkan dua hal, pertama dari beberapa hasil penelitian, pH optimum aktivitas urikase amobil berkisar antara 8 – 9. Ke dua adalah pada penelitian ini, daya hantar yang dihasilkan didasarkan pada jumlah HCO3= yang merupakan hasil reaksi oksidasi asam urat yang dikatalisis urikase. Karena HCO3= merupakan hasil ionisasi H2CO3, maka jumlah HCO3= terbanyak (> 80%) pada kisaran pH 7,5 – 9,5. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada pH 8 hingga 9,5 , tidak ada perubahan selisih daya hantar yang berarti pada kisaran konsentrasi asam urat 1 hingga 10 ppm. Terjadi perubahan selisih daya hantar pada konsentrasi asam urat 1 hingga 3 ppm, pada pH = 7,5. Hal ini mengindikasikan bahwa pH optimum adalah 7,5. Hal ini
sangat berbeda dengan hasil penelitian-penelitian terdahulu, dimana pH optimum tercapai pada pH = 9 menggunakan membran kitosan. Pada tahapan ini ketebalan membran nata de coco yang digunakan hanya 5 µm, hal ini terjadi karena penelitian dilakukan paralel. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa media amobilisasi urikase mempengaruhi pH optimum aktivitas enzim tersebut. Pada tahapan selanjutnya perlu dilakukan karakterisasi biosensor menggunakan ketebalan 10 µm dan pH pengukuran 7,5. Konsentrasi asam urat yang digunakan 1 hingga 10 ppm. Untuk mengetahui karakter biosensor maka ditentukan beberapa parameter yaitu waktu respon, kisaran konsentrasi, dan efisiensi pemakaian. Waktu respon ditentukan dari berbagai konsentrasi yang diperkirakan masih mempunyai hubungan kuantitatif antara konsentrasi dengan signal. Pada penelitian ini digunakan konsentrasi asam urat 1 hingga 6 ppm. Dari hasil penelitian diketahui bahwa semakin besar konsentrasi asam urat, waktu respon semakin cepat tercapai dan sebaliknya. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang digunakan berada pada harga dibawah nilai KM, yaitu 22 ppm. Waktu respon yang memenuhi untuk semua konsentrasi adalah 180 detik atau 3 menit. Kisaran konsentrasi asam urat yang dapat ditentukan adalah 1 hingga 5,8 ppm. Hal ini ditentukan berdasarkan perpotongan antara dua garis yaitu garis yang mempunyai hubungan kuantitatif antara konsentrasi dengan signal dangaris yang tidak memberikan perubahan signal pada setiap perubahan konsentrasi. Sedangkan batas deteksi diasumsikan 1 ppm, hal ini dilakukan karena tibawah 1 ppm signal yang dihasilkan sudah sulit untuk dibaca. Efisiensi pemakaian biosensor bertahan hingga 3 hari dengan jumlah larutan yang diukur setiap hari sebanyak 12 larutan, setelah itu kirnerja biosensor mulai menurun. Untuk mengetahui kemampuan biosensor asam urat hasil penelitian ini, dilakukan pengukuran sampel yang diperkirakan mengandung asam urat. Digunakan 15 sampel yang berasal dari bagian tubuh mamalia (hati dan daging). Terhadap sampel yang sama dilakukan pula pengujian pembanding di salah satu laboratorium klinik di Malang. Hasil pengujian menunjukkan bahwa hasil pengukuran dengan biosensor relatif sama dengan kesalahan lebih kecil dari 10% jika dibandingkan dengan hasil dari laboratorium klinik. Akan tetapi jika konsentrasi asam urat dalam sampel labih besar dari 10 ppm kesalah tersebut semakin besar yaitu di atas 10 %. Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa biosensor asam urat konduktometri dapat dibuat dengan menggunakan membran nata de coco sebagai media amobilisasi urikase. Kinerja biosensor optimum dihasilkan pada pH = 7,5 dengan ketebalan membran nata de coco 10 µm. Biosensor yang dihasilkan mempunyai kisaran konsentrasi pengukuran 1 hingga 5,8 ppm dengan waktu respon 3 menit. Biosensor masih mempunyai kepekaan yang baik,yaitu antara 9 hingga 10 nmho/pp, untuk mengukur hingga 36 larutan. Linieritas masih baik jika digunakan untuk mengukur lebih dari 36 larutan tetapi kepekaan biosensor sudah mulai menurun. Biosensor yang dihasilkan dapat diaplikasikan terhadap sampel yang nyata dengan konsentrasi asam urat kurang dari 10 ppm. Untuk memperbaiki kinerja biosensor perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan mengubah cara amobilisasi selain itu biosensor dapat digunakan lebih lama. Agar pengukuran lebih efisien maka penelitian lanjutan diperlukan untuk mengembangkan disain biosensor dengan 4 elektroda, sehingga signal yang terbaca sudah merupakan perbedaan daya hantar antara elektroda kerja dengan pembanding.
SUMMARY The conductometric uric acid biosensor made by several stages. There is, make of nata de coco, the isolation of the uricase, make of electrodes, ammobilize of uricase on electrode, and characterization of biosensor. To produce a biosensor that generates sensitivity and accuracy is good enough then do the optimization thickness of the membrane and the pH of the sample solution during measurement. Indicators are used as a measure of performance conductometric biosensor are sensitivity and linearity of the relationship between the concentration of signal (conductivity). The nata de coco made from water of coconuts and used acerobacter xylinum as a yeast. Fermentation carried out at room temperature and with a bit of light so that nata de coco which produced a thin membrane. Fermentation duration ranges between 3 to 4 days so that the resulting membrane has a uniform size. The uricase resulted from iosolated candida utilis has free enzyme levels of 16 mg / mL. Electrodes made of platinum wire which is formed with a size of 5 x 5 mm, then coated with a membrane of nata de coco and dried about 30 minutes in temperatut 50oC. These electrodes are made at least 3 fruit because every time uric acid measurements performed 2 times, first with a pair of electrodes without enzyme contains both the cathode and the anode. To be done with a pair of two electrodes where one electrode is the working electrode biosensor or containing uricase amobil. Amobilisasi performed using 2 mL of uricase is done by soaking, the electrode that has a membrane soaked in a solution of uricase for 24 hours. Before used, the biosensor conditioned by measuring the blank to produce a permanent conductivity. To determine whether uricase membrane was teramobilkan in nata de coco, the IR spectrum is measured against the membrane of nata de coco with uricase membrane amobil compared with nata de coco without uricase. From the results of the IR spectrum there are differences in the peak seen in the region 3000 - 2000 cm-1 and the 1750 to 1200 cm-1 which shows the bond -N-C, -O-H, and –N-S-C, bonds are generally present in an enzyme. Membrane thickness optimization of nata de coco is done by means of platinum wire coated with a membrane of nata de coco as many as 1, 2 and 3 layers, resulting in a membrane thickness of 5, 10 and 15 µm. The thickness of the membrane is dry thickness. Based on the results of research known that the amount of enzyme that teramobilkan influenced by the thickness of the membrane. Number of uricase most teramobilkan is the membrane with a thickness of 10 µm, which is as much as 28.68 mg. From the results of uric acid test, the thickness of the best membrane was 10 µm. This is understandable, because the amount of uricase most teramobilkan. In these conditions the measurement sensitivity of 1.2 nmho / ppm, with a linearity of 0.96. Solution conductivity measurements performed at pH = 9, this refers to the results of previous studies on the manufacture of uric acid biosensor using potensiometri membrane kitosan. The performance optimization of biosensor used a 10 µm membrane in solution of uric acid with the pH range 7.5 to 9.5 and 0.5 ifference in pH. This is done by considering two things, first of several studies, the optimum pH of activity uricase immobilize at 8 to 9. The second is on this research, the resulting conductivity is based on the amount of HCO3= which is the result of oxidation reactions catalyzed uric acid uricase. Because HCO3= H2CO3 is a result of ionization, then the amount of HCO3= most (> 80%) in the range pH 7.5 to 9.5. The results showed that at pH 8 to 9.5, there is no difference in changes in conductivity which means that the uric acid concentration range of 1 to 10 ppm. Difference changes conductivity in uric acid concentration of 1 to 3 ppm, at pH = 7.5. This indicates that the optimum pH is 7.5. This is very different from the results of previous studies, where the pH optimum is reached at pH = 9 using a membrane kitosan. At this stage the membrane thickness of nata de coco is used only 5 µm, this occurs because the research is done in parallel. From the results of this study can be concluded that the media affects amobilisasi uricase optimum pH of enzyme activity. In the next stage characterization of biosensor used a 10 µm thickness and pH measurement of 7.5. Concentration of uric acid used from 1 to 10 ppm. To know the character of the biosensor some parameters are determined response time, the range of concentration, and efficiency. Response time is determined from the estimated concentration still has the quantitative relationship between the concentration of the signal. In this study used concentrations of uric acid 1 to 6 ppm. From the results of research known that the greater the concentration of uric acid, the faster the response time is reached and vice versa.
This shows that the concentrations used were at prices below the value of KM, namely 22 ppm. Meet the response time for all the concentration is 180 seconds or 3 minutes. The range of concentrations of uric acid which can be determined is 1 to 5.8 ppm. This is determined by the intersection of two lines are lines that have a quantitative relationship between the concentration of the signal that does not give dangaris signal changes at each change of concentration. While it is assumed detection limit 1 ppm, this is done because the signal is difficult to read. Biosensor efficiency lasted up to 3 days with a number of solutions which are measured every day as many as 12 solution, after which it the performance of biosensor began to decline. To determine the ability of uric acid biosensor results of this study, carried out sample measurements are estimated to contain uric acid. The samples derived from the mammalian body (liver and meat). Of the same sample also conducted a comparison test in one of the clinical laboratory in Malang. Test results showed that the relative error measurements of biosensor is less than 10% when compared with the results from clinical laboratories. However, if the concentration of uric acid in the sample is more than 10 ppm, the relative error is greater than10%. From the results of this study can be concluded that the conductometric uric acid biosensor can be made by using membrane nata de coco as a uricase immobilization media. Biosensor optimum performance is produced at pH = 7.5 with a membrane thickness of nata de coco 10 µm. The resulting biosensor has a concentration range of measurement of 1 to 5.8 ppm with a 3-minute response time. Biosensor still has a good sensitivity, ie between 9 and 10 nmho / pp, for measuring up to 36 solutions. Linearity is best when used to measure more than 36 solvents, but the sensitivity of biosensor was beginning to decline. The resulting biosensor can be applied to real samples with concentrations of uric acid is less than 10 ppm. To improve the biosensor performance further research needs to be done by changing the way besides amobilisasi biosensor can be used any longer. In order to measure more efficiently so further research is needed to develop a biosensor design with 4 electrodes, so that a readable signal is a difference in conductivity between the working electrode with the comparison.
