LAPORAN HIBAH PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL
Aspek: Penyakit Tropis
Deteksi dan Penentuan Virus Dengue dari Spsesimen Klinik di Rumah Sakit Kota Medan dengan Menggunakan Metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA TAHUN 2009
|1
BAB I. PENDAHULUAN Latar Belakang Infeksi oleh virus Dengue (DENV) adalah masalah kesehatan yang serius di banyak daerah tropis dan subtropis di dunia. Penyakit yang ditimbulkannya merupakan hiperendemis di Asia Tenggara, dengan bentuk yang paling berbahaya berupa Demam Berdarah Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD) yang biasanya bersifat fatal, terutama pada anak-anak (Rohani et al., 1997). Diperkirakan lebih kurang 100 juta kasus demam Dengue dan 500 ribu kasus DBD terjadi tiap tahunnya di seluruh dunia, 90% dari kasus-kasus tersebut menyerang anakanak di bawah 15 tahun (Malavie et al., 2004). Di Indonesia, demam Dengue (DD) mulai ditemukan pada tahun 1968, cenderung semakin menyebar luas sejalan dengan meningkatnya arus trasportasi dan kepadatan penduduk. Kasus DD dan DBD selalu berulang setiap tahun di banyak kawasan di Indonesia di mana berdasarkan profil Indonesia tahun 2001 Incidence rate 17,2 kasus per 100.000 penduduk tiap tahunnya (Depkes RI, 2002) Masalah terbesar pada kasus infeksi virus Dengue terkait dengan penatalaksanaan yang membutuhkan diagnosis segera terhadap infeksi dini. Dalam kasus infeksi Dengue, serotyping sangat penting karena infeksi sekunder oleh serotipe heterologus dapat menimbulkan demam berdarah Dengue (DBD) dan Dengue Shock Syndrome (DSS) (McBride
dan
Belefeldt-Ohmann,
2000).
Diagnosis
laboratorium
terutama
menggunakan isolasi virus dari serum pada infeksi fase akut, serodiagnosis, dan molecular assay terhadap RNA virus (Guzman dan Kouri, 1996). Seluruh serotipe virus Dengue terdapat di Indonesia. DEN-3 merupakan serotipe yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB di banyak daerah, diikuti DEN-2, DEN-1 dan DEN-4 pada tahun 1993-1994. Dari Hasil penelitian DEN-3 merupakan serotipe yang paling dominan berhubungan dengan tingkat keparahan penyakit, diikuti DEN-2 (Suroso, 1997).
|2
Tujuan Khusus Dalam usulan penelitian ini dilakukan deteksi dan penentuan serotype virus Dengue 1,2,3 dan 4 dari sampel serum penderita DD/DBD dengan menggunakan RT-PCR di Kota Medan untuk untuk melihat apakah serotipe virus Dengue yang telah dijumpai pada nyamuk Aedes aegypti sama dengan serotipe virus Dengue yang dijumpai pada serum penderita DD/DBD sehingga dari hasil penelitian ini didapatkan informasi penyebaran serotipe virus Dengue di kota Medan. Pada penelitian ini juga akan dilakukan analisis terhadap data demografi penderita untuk melihat adanya kecenderungan terjadinya pergeseran proporsi kasus penderita DD/DBD yang beresiko terinfeksi virus Dengue dari kelompok umur <15 tahun kepada kelompok umur ≥15 tahun.
|3
Urgensi (Keutamaan) Penelitian Pentingnya penanganan segera terhadap penyakit infeksi virus Dengue membutuhkan tersedianya metode diagnosis yang cepat dan akurat. RT-PCR merupakan salah satu metode diagnosis yang dapat mendeteksi keberadaan virus pada fase dini, dengan demikian penggunaannya menjadi sangat membantu terhadap penatalaksanaan kasus dan mencegah terjadinya Demam Dengue (DD) /Demam Berdarah Dengue (DBD). Data penelitian Litbangkes pada tahun 2007 menunjukkan bahwa serotipe virus Dengue (DEN) yang dijumpai di kota Medan pada tahun 2003-2005 adalah serotipe DEN2, DEN3, dan DEN4 namun tidak ditemukan adanya DEN-1. Dari hasil penelitian yang telah kami lakukan sebelumnya pada sampel nyamuk Aedes aegypti dengan metode RTPCR di kota Medan pada tahun 2008 dijumpai virus serotipe DEN-2 dan DEN-1. Dalam penelitian ini dilakukan deteksi dan penentuan serotipe virus Dengue 1,2,3 dan 4 dari sampel serum penderita DD/DBD di Rumah Sakit rujukan kasus DD/DBD di Kota Medan dengan menggunakan metode RT-PCR untuk melihat apakah tipe virus Dengue yang telah dijumpai pada
sampel nyamuk Aedes aegypti sama dengan tipe virus
Dengue yang dijumpai dari sampel serum penderita DD/DBD. Hasil penelitian ini akan memberikan informasi peta penyebaran dan perubahan serotipe virus Dengue yang dijumpai di kota Medan. Analisis data dari pasien juga
dilakukan untuk melihat adanya kecenderungan
terjadinya pergeseran proporsi kasus penderita DD/DBD dari kelompok umur <15 tahun kepada kelompok umur ≥15 tahun. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi penyebaran dan perubahan peta serotipe virus Dengue yang dijumpai di kota Medan dan untuk mengetahui adanya pergeseran proporsi kasus penderita DD/DBD dari anak-anak kepada dewasa untuk memperkuat Early Outbreak Recognition System (EWORS) dalam masalah penyakit DD/DBD.
|4
BAB II STUDI PUSTAKA
Di Indonesia, demam Dengue (DD) mulai ditemukan pada tahun 1968, cenderung semakin menyebar luas sejalan dengan meningkatnya arus trasportasi dan kepadatan penduduk. Kasus DD dan DBD selalu berulang setiap tahun di banyak kawasan di Indonesia di mana berdasarkan profil Indonesia tahun 2001 Incidence rate 17,2 kasus per 100.000 penduduk tiap tahunnya (Depkes RI, 2002) Masalah terbesar pada kasus infeksi virus Dengue terkait dengan penatalaksanaan yang membutuhkan diagnosis segera terhadap infeksi dini. Dalam kasus infeksi Dengue, serotyping sangat penting karena infeksi sekunder oleh serotipe heterologus dapat menimbulkan demam berdarah Dengue (DBD) dan Dengue Shock Syndrome (DSS) (McBride
dan
Belefeldt-Ohmann,
2000).
Diagnosis
laboratorium
terutama
menggunakan isolasi virus dari serum pada infeksi fase akut, serodiagnosis, dan molecular assay terhadap RNA virus (Guzman dan Kouri, 1996). Penegakan diagnosis untuk penyakit DD/DBD selama ini dilakukan berdasarkan Kriteria Klinis yang telah ditentukan oleh WHO yaitu dijumpainya demam tinggi dengan onset akut, manifestasi perdarahan, uji tourniquet positif, petechiae, echimosis atau purpura dan manifestasi laboratorium dari trombositopenia (≤ 100.000/mm3) serta meningkatnya hematokrit ≤ 20%, sedangkan Gold standar untuk diagnosis penyakit DD/DBD adalah dengan menemukan virus Dengue dalam darah. Pentingnya penanganan segera terhadap penyakit infeksi virus Dengue membutuhkan tersedianya metode diagnosis yang cepat dan akurat. RT-PCR merupakan yang dapat mendeteksi keberadaan virus pada fase dini. Dengan menggunakan aplikasi Teknologi Biomolekuler Single-Step RTPCR dapat dilakukan deteksi sekaligus penentuan serotype virus Dengue 1,2,3 dan 4 dari sampel serum penderita sehingga dengan demikian penegakan diagnosis penyakit DD/DBD akan dilakukan lebih cepat dan akurat dan dengan demikian penggunaannya
|5
menjadi sangat membantu terhadap penatalaksanaan kasus dan mencegah terjadinya DBD dan DSS. Dengan Teknik ini juga sekaligus akan dapat menjelaskan keberadaan serotype virus dengue secara epidemiologi. Penyebaran serotipe virus Dengue yang bersirkulasi di Bangkok, Thailand ternyata dijumpai berbeda untuk setiap kurun waktu yang berbeda. DEN-1 predominan pada tahun 1990-1992, DEN-2 pada tahun 1973 -1986 dan 1988-1989, DEN-3 pada 1987 dan 1995-1999, DEN-4 pada tahun 1993-1994 (Nisalak A, et al 2003). Thailand, Myanmar, Indonesia dan Vietnam tetap melaporkan banyak kasus di bawah 14 tahun, tetapi keadaan ini perlu diwaspadai sebab DD/DBD cenderung meningkat pada kelompok umur remaja dan dewasa. Pada tahun 1996-2000 proporsi kasus DD/DBD terbanyak adalah pada kelompok umur 4-5 tahun, namun setelah di atas tahun 2000 proporsi kasus pada kelompok umur 15-44 tahun meningkat. (Dinas Kesehatan Propinsi Jawa Timur, 2001). Data penelitian Litbangkes pada tahun 2007 menunjukkan bahwa serotipe virus Dengue yang dijumpai di kota Medan pada tahun 2003-2005 adalah DEN2, DEN3, dan DEN4 namun tidak menemukan adanya DEN-1. Dari hasil penelitian yang telah kami lakukan pada nyamuk Aedes aegypti dengan menggunakan RT-PCR di Kota Medan pada tahun 2008 dijumpai adanya virus DEN-2 dan DEN-1. Penelitian ini dilakukan untuk melanjutkan riset yang telah kami lakukan sebelumnya yaitu deteksi dan penentuan serotype virus Dengue tipe 1,2,3 dan 4 dari sampel nyamuk Aedes aegypti dengan menggunakan RT-PCR di Kota Medan pada tahun 2008. Dari hasil penelitian tersebut ternyata dari vektor nyamuk Aedes aegypti yang dikumpulkan dari sekitar rumah penderita dan mantan penderita DD/DBD sesuai dengan yang terdata pada Dinas Kesehatan Kota Medan, dijumpai adanya virus serotype DEN-2 dan DEN-1. Sedangkan data Litbangkes pada tahun 2007 menunjukkan bahwa peta serotipe yang dijumpai di kota Medan dari penelitian pada tahun 2003-2005 adalah DEN-2, DEN-3, serta DEN-4, dan tidak menemukan adanya serotype DEN-1. Hal ini memperlihatkan bahwa telah dijumpai serotipe baru (DEN-1) pada vektor berdasarkan dengan hasil penelitian yang telah kami lakukan pada sampel nyamuk, yang sangat memungkinkan akan dijumpai pula pada serum penderita DD/DBD di kota Medan. Analisis data dari
|6
pasien juga dilakukan untuk melihat adanya kecenderungan terjadinya pergeseran proporsi kasus penderita DD/DBD dari kelompok umur <15 tahun kepada kelompok umur ≥15 tahun. Dalam penelitian ini dilakukan deteksi dan penentuan serotype virus Dengue tipe 1,2,3 dan 4 pada sampel serum penderita yang dirawat di Rumah Sakit rujukan kasus DD/DBD di Kota Medan dengan metode Single Step RT-PCR untuk mengetahui informasi penyebaran dan perubahan peta serotipe virus Dengue yang dijumpai di kota Medan dan untuk mengetahui adanya pergeseran proporsi kasus penderita DD/DBD dari anak-anak kepada dewasa.
|7
BAB III. METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP H. Adam Malik Medan selama 10 bulan sejak bulan Maret sampai Desember 2009. Rancangan Penelitian ini dilakukan secara deskriptif dengan pendekatan analitik, untuk deteksi dan penentuan serotype virus Dengue tipe 1,2,3 dan 4 dari serum penderita DD/DBD dengan menggunakan RT-PCR di Kota Medan dan untuk melihat adanya pergeseran kelompok umur penderita DD/DBD. Pada penelitian ini akan digunakan sampel yang diambil dari serum penderita demam berdarah yang dirawat di tiga rumah sakit rujukan untuk penderita demam berdarah di kota Medan yaitu RSUP H. Adam Malik, RSUP Pirngadi dan RS Herna. Sampel serum diambil sebanyak 0,5 ml pada lima hari pertama demam dari penderita DD/DBD yang telah ditegakkan diagnosa klinis infeksi virus dengue dengan menggunakan kriteria WHO 1997 (Singh, K. et al, 2006). Kriteria WHO untuk menegakkan diagnosa klinis yaitu dijumpainya demam tinggi dengan onset akut, manifestasi perdarahan, uji tourniquet positif, petechiae, echimosis atau purpura dan manifestasi laboratorium dari trombositopenia (≤ 100.000/mm3) serta meningkatnya hematokrit ≤ 20%. Data dari setiap sampel dimasukkan ke dalam lembar chek list yang berisi informasi mengenai data demografi pasien seperti nama, umur, jenis kelamin, alamat, dan pekerjaan, serta hasil pemeriksaan laboratorium. Dalam penelitian ini digunakan sebanyak 85 sampel serum penderita, yang dihitung secara statistik berdasarkan proporsi penderita DD/DBD di kota Medan. n ≥ Z2 (0,5-α/2) p q d2
n ≥ (1,96)2 x 0,32 x 0,68 (10/100)2
n= jumlah sampel
e Z= nilai normal dari tabel Z yang besarnya tergantung dari nilai α yang ditentukan,
e
Untuk α = 0,05; Zc (0,5-α/2) = 1,96
|8
p= proporsi penderita DD/DBD di kota Medan yaitu 0,32 q= 1- p = 1-0,32 = 0,68 d = tingkat ketepatan yang diinginkan= 10% n ≥ 85
Berdasarkan proporsi penderita DD/DBD di kota Medan maka secara statistik jumlah minimal sampel yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah 85 sampel Penelitian ini dilakukan untuk melanjutkan riset sebelumnya yaitu deteksi dan penentuan serotype virus Dengue 1,2,3 dan 4 dari nyamuk Aedes aegypti dengan menggunakan RT-PCR di Kota Medan. Ekstraksi RNA Sampel serum yang telah dikumpulkan kemudian di simpan ke dalam freezer -70°C atau dapat langsung dilakukan ekstraksi RNA virus dengan menggunakan QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) RNA hasil ekstraksi kemudian dilakukan RT-PCR dengan metode Haris et al, dengan menggunakan SuperScriptTMII one step RT-PCR System dengan platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen, no katalog 12574-026). Master mix dibuat dengan mencampurkan 10µl RT-PCR buffer, 2µl dNTP Mix 10mM, 2µl RT-PCR Enzyme Mix, 1µl Primer Dengue Universal (D1: TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACCG), 1µl Primer DEN-1 (Ts1: CGT CTC AGT GAT CCG GGGG), 1µl Primer DEN-2 (Ts2: CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG), 1µl Primer DEN-3 (Ts3: TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAGC) dan 1µl Primer DEN-4 (D4: TGT TGT CTT AAA CAA GAG AGGTC). Produk RNA dipersiapkan dengan memanaskan tube pada 65ºC selama 5
menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama mempersiapkan master mix. 5 µl produk RNA ditambahkan ke dalam master mix, sebagai kontrol positif digunakan RNA DEN-1,DEN-2,DEN-3 dan DEN-4. Setiap reaksi menggunakan master mix, RNA sampel, kemudian ditambahkan RNase-free water hingga mencapai volume 50 µl.
|9
Step RT dilakukan pada 51ºC selama 45 menit untuk menghasilkan cDNA, kemudian amplifikasi dengan step PCR berikut: 92ºC selama 3 menit untuk initial denaturation, 92ºC selama 30 detik untuk denaturation, 53ºC selama 30 detik untuk annealing. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final extension 72ºC selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada 4ºC sebelum digunakan. Elektroforesis Gel dipersiapkan dengan menggunakan 50ml 1XTAE buffer, 2% agarose gel dan 5µl SYBER safe-TM gel staining. Sebanyak 1µl amplifikat hasil PCR yang telah dicampur dengan 4µl blue juice 2x.. Elektroforesis dijalankan dari kutub negatif ke positif dengan tegangan 80-100 V, selama 40 menit. Gel dilihat dengan iluminator UV (Vilber Lourmat), dan hasilnya difoto dengan kamera polaroid. Virus DEN-1 akan terbaca dengan adanya pita DNA berukuran 482 bp DEN-2 berukuran 119 bp, DEN-3 berukuran 290 bp dan DEN-4 berukuran 398 bp (Harris et al., 1998). Analisis Data Selain untuk melihat distribusi serotipe virus Dengue pada penderita DD/DBD di kota Medan, analisis dilakukan terhadap data demografi penderita. Analisis data ditujukan untuk mengetahui adanya pergeseran kelompok umur penderita.Data dikumpulkan untuk melihat perbedaan proporsi kasus penderita DD/DBD pada kelompok umur <15 tahun dengan kelompok umur ≥15 tahun. Kerangka Konsep Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya: Nyamuk Aedes aegypti dari 5 Kecamatan endemis di Kota Medan
Extraksi RNA virus RT-PCR
Tipe virus Dengue: DEN2 dan DEN-1
Elektroforesis Visualisasi
Penelitian yang dilakukan: Penderita DD/DBD (kriteria WHO)
Extraksi RNA virus
- 0,5 ml serum
RT-PCR
- Data demografi
Elektroforesis Visualisasi
Tipe virus Dengue
Analisis Data
| 10
BAB IV HASIL PENELITIAN 4.1 Hasil Penelitian Dalam penelitian ini telah dikumpulkan sebanyak seratus penderita akut DD/DBD yang sesuai kriteria klinis WHO dari 3 rumah sakit di kota Medan, 23 penderita RS Herna, 40 dari RS Adam Malik, 37 dari RS DR Pirngadi, dapat dilihat pada Tabel di bawah ini: Tabel 1. Seratus penderita akut DD/DBD yang diambil dari 3 rumah sakit di kota Medan. Rumah sakit
Jumlah
%
RS Herna
23
23,0
RS H Adam Malik
40
40,0
RS Dr Pirngadi
37
37,0
Total
100
100,0
Setiap responden yang dijadikan sampel diambil serum darahnya 0,5 ml dan karakteristiknya dicatat yaitu nama, alamat, umur, jenis kelamin. Satu persatu serum diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue, setelah itu dilakukan RT-PCR menggunakan Primer Dengue Universal, DEN-1, DEN-2, Primer DEN-3, DEN-4, kemudian dilakukan elektroforesis dan gel imaging (visualisasi). Dikatakan hasil virus Dengue positif jika terlihat pita DNA dengan ukuran hasil amplifikasi sebesar 482 bp
(dengue-1), 389 bp (dengue-4), 290 bp dengue-3, dan 119 bp (dengue-2). Sebagai pembanding digunakan Marker 100 bp DNA ladder.
| 11
Gambar di bawah ini menunjukkan hasil kontrol positif virus DEN-1, DEN-2, DEN3 dan DEN-4 sebagai berikut:
bp (Marker 100 bp) DNA ladder) 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp
100 bp
Gambar 1: Hasil RT-PCR kontrol (+)
Keterangan: 1. Lajur1 :kontrol (+) DEN-2 119 bp 2.Lajur 2: kontrol (+) DEN-3 290 bp 3. Lajur 3: kontrol (+) DEN-4 398 bp 4. Lajur 4: kontrol (+) DEN-1 482 bp 5. Lajur 5: Marker 100 bp DNA ladder
| 12
Gambar dibawah ini menunjukkan hasil RT-PCR penderita akut DD/DBD sebagai berikut:
Marker DNA
DEN-1 (482 bp)
DEN-2 (119 bp)
Gambar 2:Hasil RT-PCR virus Dengue sero tipe 1 dan 2 Keterangan: 1.
Lajur 1: Marker 100 bp DNA ladder
2.
Lajur 2:Kontrol negatif
3.
Lajur 3:Kontrol positif Den-1 (482 bp)
4.
Lajur 4: Kontrol positif Den-1(482 bp)
5.
Lajur 5:Sampel no 40, positif DEN-1 (482 bp)
6.
Lajur 6:Sampel no 79, positif DEN-1 (482 bp)
7.
Lajur 7:Kontrol positif DEN-2 (119 bp)
8.
Lajur 8 sampai 14: Sampel no 2,9,10,11,12,13,14 positif DEN-2 (119 bp)
Dari seratus sampel serum didapatkan adanya hasil positif virus Dengue serotype 2 dan Dengue serotype 1 yang ditandai dengan dijumpainya pita DNA dengan ukuran hasil amplifikasi sebesar 119 bp (dengue-2) dan 482 bp (dengue-1) sedangkan untuk virus Dengue serotype 3 dan 4 yang ditandai dengan pita DNA dengan ukuran hasil amplifikasi sebesar
290 bp (dengue-3) dan 389 bp (dengue-4), tidak ada
dijumpai dari hasil deteksi dengan teknik RT-PCR dalam penelitian ini.
| 13
Hasil RT-PCR virus DEN-1, DEN-2, DEN-3, dan DEN-4 dari seratus serum penderita akut DD/DBD dapat dilihat pada tabel berikut di bawah ini: Tabel 2. Hasil RT-PCR virus Dengue serotype 1, 2, 3 dan 4 dari sampel 1 sampai 100:
No
Sampel
Hasil DEN-2
1
Marker
Marker 100 bp DNA
2
Kontrol (-)
Negatif
3
Kontrol (+)
DEN-2
4
Sampel 1
Negatif
5
Sampel 2
DEN-2
6
Sampel 3
Negatif
7
Sampel 4
Negatif
8
Sampel 5
Negatif
9
Sampel 6
Negatif
10
Sampel 7
Negatif
11
Sampel 8
Negatif
12
Sampel 9
DEN-2
13
Sampel 10
DEN-2
14
Sampel11
DEN-2
15
Sampel12
DEN-2
16
Sampel13
DEN-2
17
Sampel14
DEN-2
18
Sampel15
DEN-2
19
Sampel16
DEN-2
20
Sampel17
DEN-2
21
Sampel18
DEN-2
22
Sampel19
DEN-2
23
Sampel20
DEN-2
24
Sampel21
DEN-2
25
Sampel22
DEN-2
26
Sampel23
DEN-2
27
Sampel24
DEN-2
| 14
28
Sampel25
DEN-2
29
Sampel26
DEN-2
30
Sampel27
DEN-2
31
Sampel28
DEN-2
32
Sampel29
DEN-2
33
Sampel30
DEN-2
34
Sampel31
DEN-2
35
Sampel32
DEN-2
36
Sampel33
DEN-2
37
Sampel34
DEN-2
38
Sampel35
DEN-2
39
Sampel36
DEN-2
40
Sampel37
DEN-2
41
Sampel38
DEN-2
42
Sampel39
DEN-2
43
Sampel40
DEN-1
44
Sampel41
Negatif
45
Sampel42
DEN-2
46
Sampel43
DEN-2
47
Sampel44
DEN-2
48
Sampel45
DEN-2
49
Sampel46
DEN-2
50
Sampel47
DEN-2
51
Sampel48
DEN-2
52
Sampel49
DEN-2
53
Sampel50
DEN-2
54
Sampel51
DEN-2
55
Sampel52
DEN-2
56
Sampel53
Negatif
57
Sampel54
Negatif
58
Sampel55
DEN-2
59
Sampel56
DEN-2
60
Sampel57
DEN-2
| 15
61
Sampel58
DEN-2
62
Sampel59
DEN-2
63
Sampel60
Negatif
64
Sampel61
DEN-2
65
Sampel62
DEN-2
66
Sampel63
DEN-2
67
Sampel64
DEN-2
68
Sampel65
DEN-2
69
Sampel66
DEN-2
70
Sampel67
Negatif
71
Sampel68
Negatif
72
Sampel69
Negatif
73
Sampel70
Negatif
74
Sampel71
DEN-2
75
Sampel72
DEN-2
76
Sampel73
DEN-2
77
Sampel74
DEN-2
78
Sampel75
DEN-2
79
Sampel76
DEN-2
80
Sampel77
DEN-2
81
Sampe78
DEN-2
82
Sampel79
DEN-1
83
Sampel80
DEN-2
84
Sampel81
DEN-2
85
Sampel82
DEN-2
86
Sampel83
DEN-2
87
Sampel84
DEN-2
88
Sampel85
DEN-2
89
Sampel86
DEN-2
90
Sampel87
Negatif
91
Sampel88
DEN-2
92
Sampel89
DEN-2
93
Sampel90
Negatif
| 16
94
Sampel91
Negatif
95
Sampel92
Negatif
96
Sampel93
DEN-2
97
Sampel94
DEN-2
98
Sampel95
DEN-2
99
Sampel96
DEN-2
100
Sampel97
DEN-2
101
Sampel98
DEN-2
102
Sampel99
DEN-2
103
Sampel100
Negatif
Hasil PCR dari 100 serum penderita akut DD/DBD yang telah dikumpulkan ternyata dijumpai adanya 76 serum penderita yang positif mengandung virus DEN yang terdiri dari 74 serum penderita yang mengandung virus DEN-2 dan 2 serum penderita mengandung virus DEN-1. Tabel 3 menunjukkan hasil RT-PCR dari serum 100 penderita akut DD/DBD dengan gejala klinis sesuai kriteria klinis WHO, setelah diperiksa maka yang disebabkan oleh DEN-2 sebanyak 74 orang (74,0%) dan yang disebabkan DEN-1 sebanyak 2 orang (2,0%) dan penderita yang tidak mengandung virus DEN atau negatif adalah sebanyak 24 orang (24%). Tabel 3. Distribusi serotype virus Dengue dari hasil RT-PCR serum 100 penderita akut DD/DBD.
Jumlah penderita virus Dengue Jumlah(orang)
%
DEN-1(+)
2
2%
DEN-2(+)
74
74%
DEN-3(+)
-
0%
DEN-4(+)
-
0%
DEN (-)
24
24%
100
100,0%
| 17
4.2. Distribusi hasil RT-PCR penderita akut DD/DBD berdasarkan karakteristik umur dan jenis kelamin. Tabel 4 di bawah menunjukkan hasil RT-PCR dari DEN-2 dan DEN-1 positif pada 76 serum penderita akut DD/DBD berdasarkan karakteristik umur. Sebanyak 74 serum penderita akut DD/DBD mengandung virus Dengue serotype 2 pada usia kurang dari 5 tahun sebanyak 3 orang (3,9 %), umur 5-9 tahun sebanyak 10 orang (13,2 %), umur 15-44 tahun sebanyak 48 orang (63,16 %) dan umur lebih dari 45 sebanyak 3 orang (3,9 %). Sebanyak 2 orang mengandung virus Dengue serotype-1, pada kelompok usia 5-9 tahun sebanyak 1 (1,32%) orang dan pada kelompok usia 15-44 tahun sebanyak 1 orang (1,32%).
Tabel 4. Distribusi hasil RT-PCR DEN-2 dan DEN-1 positif pada 76 serum penderita akut DD/DBD berdasarkan karakteristik umur.
Umur
DEN-2(+) (%)
DEN-1(+)
(%)
Total
(%)
3
(3,9)
< 5 tahun
3
(3,9)
-
(-)
5-9 tahun
10
(13,2)
1
(1,32)
11
(14,52)
10-14 tahun
10
(13,2)
-
(-)
10
(13,2)
15-44 tahun
48
(63,16)
1
(1,32)
49
(64,48)
>45 tahun
3
(3,9)
-
(-)
3
(3,9)
74
(97,36)
2
(2,64)
76
(100%)
Hasil RT-PCR DEN-2 dan DEN-1 positif pada 76 serum penderita akut DD/DBD berdasarkan karakteristik jenis kelamin ditemukan pada laki-laki sebanyak 36 orang (47,37 %) dan pada wanita sebanyak 40 orang (52,63%).
| 18
Tabel 5. Distribusi hasil RT-PCR DEN-2 dan DEN-1 positif pada 76 serum penderita akut DD/DBD berdasarkan karakteristik jenis kelamin.
Jenis Kelamin
DEN-2(+) (%)
DEN-1(+) (%)
Total
(%)
Laki-laki
34
(44,74)
2
(2,63)
36
(47,37)
Wanita
40
(52,63)
-
(-)
40
(52,63)
Jumlah
74
(97,37)
2
(2,63)
76
(100%)
| 19
BAB V PEMBAHASAN Pembahasan Penelitian Sampai saat ini penyakit DD/DBD masih menjadi masalah kesehatan masyarakat Indonesia dan dunia. Pada penelitian ini dikumpulkan serum dari seratus orang penderita akut DD/DBD yang memenuhi kriteria klinis WHO dari 3 rumah sakit di kota Medan, 23 penderita RS Herna, 40 dari RS Adam Malik, 37 dari RS DR Pirngadi. Ketiga rumah sakit ini merupakan rumah sakit rujukan terbanyak di kota Medan, sehingga ke 3 rumah sakit ini representing kondisi penderita akut DD/DBD di kota Medan. Setiap penderita diambil 0,5 ml serum darah, satu persatu serum diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue, setelah itu dilakukan RT-PCR (menggunakan Primer Dengue Universal, DEN-1, DEN-2, Primer DEN-3, dan DEN-4), kemudian dielektrophoresis dan gel imaging (visualisasi). Hasil virus Dengue serotype dikataka positif jika terlihat pita DNA dengan ukuran hasil amplifikasi sebesar 482 bp (Dengue-1),
389 bp (Dengue-4), 290 bp (Dengue-3), dan 119 bp (Dengue-2). Sebagai pembanding digunakan Marker 100 bp DNA ladder. Dalam penelitian ini telah dilakukan pemeriksaan terhadap 100 orang penderita akut DD/DBD yang memenuhi kriteria klinis WHO dengan pemeriksaan gold standard RT-PCR, didapatkan hasil 76 serum (76%) yang mengandung virus Dengue yang terdiri dari 74 (74%) serum positif virus DEN-2 dan 2 (2%) serum positif virus DEN1. Umur penderita akut DD/DBD yang disebabkan oleh virus Dengue serotype 2 dan serotype 1 yang terbanyak adalah antara 15-44 tahun yaitu 49 orang (64,48%). Penderita akut DD/DBD wanita lebih banyak positif mengandung virus Dengue serotype 2 dari pada laki-laki, yaitu sebanyak 40 orang (52,63%) pada wanita dibanding
34 orang (44,74%) pada laki-laki. Sedangkan penderita akut DD/DBD
akibat infeksi oleh virus Dengue 1 dijumpai 2 orang (2,63%) pada laki-laki dan tidak dijumpai pada wanita.Laporan WHO menyatakan bahwa seluruh wilayah tropis di dunia ini telah menjadi endemis dengan ke empat seroptipe virus secara bersama-sama di wilayah Amerika, Asia Psifik dan Africa.
| 20
Serotipe virus yang bersirkulasi di Bangkok Thailand ternyata berbeda-beda dalam kurun waktu yang berbeda. DEN-1 predominanpada tahun 1990-1992, DEN 2 pada Tahun 1973-1986 dan 1988-1989, DEN-3 pada 1987 dan 1995-1999, DEN-4 pada Tahun 1993-1994 (Nisalak, et al.,2003). Seluruh serotype virus Dengue terdapat di Indonesia, DEN-3 merupakan serotype yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB di banyak daerah, diikuti DEN-2 (Suroso, 1999). Dalam penelitian ini dapat dilihat bahwa hasil RT-PCR dari serum 100 penderita akut DD/DBD dengan gejala klinis sesuai kriteria klinis WHO, setelah diperiksa maka yang disebabkan oleh DEN-2 sebanyak 74 orang (74,0%) dan yang disebabkan DEN1 sebanyak 2 orang (2,0%) , sedangkan serum penderita yang tidak mengandung virus DEN atau negatif adalah sebanyak 24 orang (24%). Peta penyebaran serotype virus Dengue menurut laporan Departemen Kesehatan tahun 2007, dari hasil penelitiannya yang dilakukan oleh badan Litbang Jakarta dan TDC ( Tropical Disease Centre) Universitas Airlangga Surabaya yang bekerja sama dengan Namru II (US Navax) pada tahun 2003-2005, di Sumatera Utara ditemukan ketiga jenis virus Dengue yaitu DEN-2, DEN-3, DEN-4 dan yang paling banyak adalah DEN-2, dan dari hasil penelitian ini pun didapatkan bahwa sampai saat ini DEN-2 (74,0%) paling banyak menyebabkan DD/DBD di Sumatera Utara masih belum bergeser dan diikuti oleh DEN-1 (2,0%) namun tidak dijumpai adanya DEN-3 dan DEN-4. Hasil penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh peneliti terhadap sampel populasi nyamuk di kota Medan pada tahun 2008 juga menunjukkan bawa predominasi penyebaran serotype virus Dengue juga didominasi oleh DEN serotype 2 yang diikuti oleh DEN serotipe 1, dan tidak dijumpai infeksi virus DEN-serotipe 3 maupun DEN-serotipe 4 sama seperti dalam penelitian ini yang menggunakan sampel serum penderita akut DD/DBD. Kasus-kasus penderita akut DD/DBD di kota Medan tidak separah jika dibandingkan kasus-kasus di Jakarta yang penyebabnya lebih banyak adalah DEN-3 dan DEN-2. Ini
| 21
disebabkan karena infeksi oleh DEN-3 menunjukkan gejala Klinis yang lebih parah dibandingkan infeksi oleh virus DEN-2. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa infeksi virus Dengue serotype 2 yang paling banyak menyebabkan DD/DBD di kota Medan,yaitu 74% yang diikuti oleh adanya infeksi oleh virus tipe lain yaitu virus Dengue serotype 1 sebanyak 2%, maka kewaspadaan terhadap penyakit DD/DBD di kota Medan harus ditingkatkan di kemudian hari karena menurut teori Halstead tentang secondary infection yang menyatakan bahwa infeksi sekunder oleh virus Dengue serotype lain akan memperparah penyakit DD/DBD, dan dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Budhy Setya dari Universitas Airlangga menunjukkan bahwa kota-kota besar seperti Jakarta, Surabaya, Medan, Makasar dan Menado dimana mobilitas penduduk tinggi, lebih sering dijumpai adanya infeksi sekunder virus Dengue. Dengan kewaspadaan ini dapat memperkuat Early Warning Outbreak Recognition System (EWORS) dalam masalah DD/DBD. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kelompok umur yang paling banyak positif terinfeksi terinfeksi oleh virus DEN-2 dan DEN-1 adalah pada kelompok usia 15-44 tahun yaitu sebanyak 49 orang (64,48%) yang terdiri dari infeksi oleh DEN-2 sebanyak 48 orang (63,16%) dan infeksi oleh virus DEN-1 sebanyak 1 orang (1,32%). Hal ini menjadi acuan baru untuk kota Medan karena sejak awal, data epidemi pada setiap Negara untuk infeksi DD/DBD menunjukkan bahwa infeksi virus Dengue ini umumnya lebih banyak menyerang anak-anak dan 90% kasus dilaporkan berumur kurang dari 15 tahun, akan tetapi pada akhir-akhir ini beberapa Negara melaporka terjadinya kecenderungan adanya pergeseran infeksi mulai banyak terjadi peningkatan pada kasus-kasus dewasa selama kejadian luar biasa. Kelompok resiko tinggi penderita akut DD/DBD meliputi anak berumur 5-9 tahun, akan tetapi Filipina dan Malaysia baru-baru ini melaporkan banyak kasus berumur di atas 15 tahun. Walaupun Thailand, Myanmar, Indonesia, dan Vietnam tetap melaporkan banyak kasus di bawah 15 tahun. Kasus DBD yang berumur lebih dari 15 tahun banyak dijumpai di Amerika daripada di Asia (Kebijakan pemberantasan DBD, 1993).
| 22
Laporan Dinas Kesehatan Propinsi Jawa Timur, 2001: pada Tahun 1996-2000 proporsi kasus DD/DBD terbanyak adalah pada kelompok umur 4-5 tahun, namun setelah tahun 2000 proporsi kasus pada kelompok umur 15-44 tahun meningkat. Semakin maju transpotasi dan arus traveling yang tinggi merupakan salah satu factor penyebab terjadinga pergeseran umur penderita dari anak-anak ke dewasa muda, karena orang dewasa lebih banyak melakukan traveling dibandingkan pada anak-anak terutama perjalanan ke daerah endemis (Wider-Smith et. al., 2005). Kecenderungan bergesernya umur penderita DD/DBD dari umur anak-anak (59) tahun ke umur dewasa muda yaitu lebih dari 15 tahun, maka kewaspadaan menghadapi kasus-kasus DD/DBD dewasa harus ditingkatkan, karena penelitianpenelitian terhadap kasus dewasa secara klinis sampai saat ini masih sedikit, belum mempunyai cukup data-data yang mendalam tentang penyakit DD/DBD penderita dewasa. Derajat keparahan kasus DD/DBD juga tergantung pada daya imunitas penderita, sistim imunitas remaja muda dan orang dewasa lebih baik dari pada anakanak maka tingkat keparahan pada penderita DD/DBD dewasa akan lebih berat dibandingkan amak-anak. Sebagian dari penderita dewasa muda/dewasa pada daerah endemis sudah pernah menderita DD/DBD pada usia anak-anak sehingga kasus DD/DBD dewasa muda merupakan infeksi sekunder/tertier yang menurut teori Halstead penderita DD/DBD sekunder oleh serotype lain akan lebih berat dibandingkan kasus primer. Dari hasil penelitian ini terlihat bahwa infeksi virus Dengue yang positif lebih banyak terjadi pada penderita DD/DBD dengan jenis kelamin wanita dari pada laki-laki, yaitu sebanyak 40 orang (52,63%) pada wanita dibanding laki-laki 36 orang (47,37%). Menurut laporan Dinas Kesehatan Propinsi Jawa TImur, 2001: Penderita DD/DBD pernah ditemukan perbedaan yang nyata antara laki-laki dan wanita. Wanita lebih banyak tinggal di rumah disbanding laki-laki sehingga kesempatan untuk digigit nyamuk Aedes aegypti lebih besar dibandingkan dengan laki-laki.
| 23
BAB IV KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian didapatkan bahwa dari hasil RT-PCR dari serum 100 penderita akut DD/DBD dengan gejala klinis sesuai kriteria klinis WHO di 3 rumah sakit di kota Medan setelah diperiksa dengan RT-PCR, dijumpai infeksi oleh virus DEN-2 sebanyak 74 orang (74,0%) dan yang disebabkan DEN-1 sebanyak 2 orang (2,0%) dan penderita yang tidak mengandung virus DEN atau negatif adalah sebanyak 24 orang (24%). Dari segi umur didapatkan adanya kecenderungan pergeseran umur dari kelompok anak kepada kelompok umur dewasa muda/dewasa yaitu kelompok umur yang paling banyak positif terinfeksi terinfeksi oleh virus DEN-2 dan DEN-1 adalah pada kelompok usia 15-44 tahun yaitu sebanyak 49 orang (64,48%) yang terdiri dari infeksi oleh DEN-2 sebanyak 48 orang (63,16%) dan infeksi oleh virus DEN-1 sebanyak 1 orang (1,32%). Pada penelitian ini terlihat juga bahwa infeksi virus Dengue yang positif lebih banyak terjadi pada penderita DD/DBD dengan jenis kelamin wanita dari pada laki-laki, yaitu sebanyak 40 orang (52,63%) pada wanita dibanding laki-laki 36 orang (47,37%). SARAN Dengan dijumpainya infeksi virus Dengue yaitu serotype DEN-2 dan DEN-1 dari 100 serum penderita akut DD/DBD dengan gejala klinis sesuai kriteria klinis WHO di 3 rumah sakit di kota Medan maka diharapkan akan meningkatkan kewaspadaan terhadap penyakit DD/DBD dan dapat memperkuat Early Warning Outbreak Recognition System (EWORS) dalam masalah DD/DBD karena menurut teori Halstead tentang secondary infection yang menyatakan bahwa infeksi sekunder oleh virus Dengue serotype lain akan memperparah penyakit DD/DBD. Kecenderungan bergesernya umur penderita DD/DBD dari umur anak-anak (5-9) tahun ke umur dewasa muda yaitu lebih dari 15 tahun, maka kewaspadaan menghadapi kasus-kasus DD/DBD dewasa harus ditingkatkan, karena tingkat keparahan pada penderita DD/DBD dewasa lebih berat dibandingkan anak-anak.
| 24
DAFTAR PUSTAKA Depkes RI, (1995), Pokok-pokok kegiatan dan pengelolaan pemberantasan sarang nyamuk (PSN-DBD) Rohani, A., Zamree, I., Lee, H.L., Mustafakamal, I., et al. (2005): Detection of transovarian dengue virus for field caught Aedes aegypti and Aedes ablopictus mosquitoes using C6/36 cell line culture and RT-PCR, Tropical Biomedicine (in press) Guzman, M.G., Kouri, G., (1996): Advances in dengue diagnosis. Clin Diagn Lab Immunol, 3: 621-7 Malavige, G.N., Fernando, S., Fernando, and D.J., Senevirante, S.L. (2004): Dengue viral infection, Postgraduate Medical Journal 80: 588-601 McBride WJH, Belefeldt-Ohmann H (2000) Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology. Microbes and Infection, 2: 1041-50 Nisalak, A, Endy,T.P., Nimmannitya S., Vaughn D.W., (2003): Serotype-specific Dengue virus circulation and Dengue disease in Bangkok, Thailand from 1973 to 1999. Am J Trop Med Hyg, 68(2): 191-202. Suroso, T. (1997), Perkembangan Kebijaksanaan Upaya Pemebrantasan Penyakit DD/DBD di Indonesia. Workshop in Emerging Infectious Disease in Sawangan, East Java. Wider-Smith Annelies and Schwart Eli, Dengue in Travelers(2005), The New England Journal of Medicine, September 2005, (352): 924-932
| 25
LAMPIRAN Tabel data hasil penelitian RT PCR virus DEN-1, DEN-2, DEN-3 dan DEN-4 pada 100 sampel serum penderita akut DD/DBD No Sampel
Rumah sakit
Umur (tahun)
Jenis Kelamin
Serotipe virus Dengue
1
RS Pirngadi
6
LK
Negatif
2
RS Pirngadi
11
PR
DEN-2
3
RS Pirngadi
9
LK
Negatif
4
RS Pirngadi
8
PR
Negatif
5
RS Pirngadi
11
PR
Negatif
6
RS Pirngadi
18
LK
Negatif
7
RS H Adam Malik
58
LK
Negatif
8
RS H Adam Malik
18
LK
Negatif
9
RS Herna
14
LK
DEN-2
10
RS Herna
16
PR
DEN-2
11
RS H Adam Malik
17
LK
DEN-2
12
RS H Adam Malik
20
LK
DEN-2
13
RS H Adam Malik
20
PR
DEN-2
14
RS H Adam Malik
15
LK
DEN-2
15
RS H Adam Malik
12
LK
DEN-2
16
RS H Adam Malik
38
PR
DEN-2
17
RS H Adam Malik
1,5
LK
DEN-2
18
RS Pirngadi
24
PR
DEN-2
19
RS Pirngadi
29
PR
DEN-2
20
RS H Adam Malik
45
PR
DEN-2
21
RS H Adam Malik
11
LK
DEN-2
22
RS H Adam Malik
9
LK
DEN-2
23
RS H Adam Malik
13
PR
DEN-2
24
RS H Adam Malik
5
PR
DEN-2
25
RS Pirngadi
9
PR
DEN-2
26
RS Pirngadi
21
PR
DEN-2
27
RS Pirngadi
44
LK
DEN-2
28
RS Pirngadi
23
PR
DEN-2
29
RS Pirngadi
22
LK
DEN-2
30
RS Pirngadi
39
LK
DEN-2
31
RS Herna
17
PR
DEN-2
| 26
32
RS Herna
9
PR
DEN-2
33
RS Herna
18
PR
DEN-2
34
RS Herna
19
PR
DEN-2
35
RS Pirngadi
21
LK
DEN-2
36
RS Herna
25
LK
DEN-2
37
RS Pirngadi
28
LK
DEN-2
38
RS Pirngadi
32
LK
DEN-2
39
RS Pirngadi
25
LK
DEN-2
40
RS Pirngadi
19
LK
DEN-1
41
RS Pirngadi
29
LK
Negatif
42
RS Pirngadi
31
PR
DEN-2
43
RS Herna
41
PR
DEN-2
44
RS Herna
21
PR
DEN-2
45
RS Pirngadi
49
LK
DEN-2
46
RS Pirngadi
21
PR
DEN-2
47
RS Pirngadi
21
PR
DEN-2
48
RS Pirngadi
31
PR
DEN-2
49
RS Herna
41
LK
DEN-2
50
RS H Adam Malik
3
PR
DEN-2
51
RS H Adam Malik
14
LK
DEN-2
52
RS Pirngadi
15
PR
DEN-2
53
RS Herna
40
LK
Negatif
54
RS Herna
9
PR
Negatif
55
RS Pirngadi
16
PR
DEN-2
56
RS Pirngadi
19
LK
DEN-2
57
RS H Adam Malik
30
PR
DEN-2
58
RS H Adam Malik
9
PR
DEN-2
59
RS Pirngadi
30
LK
DEN-2
60
RS Pirngadi
41
LK
Negatif
61
RS Herna
9
PR
DEN-2
62
RS Herna
21
PR
DEN-2
63
RS Herna
21
PR
DEN-2
64
RS Pirngadi
22
PR
DEN-2
65
RS Pirngadi
11
LK
DEN-2
66
RS Pirngadi
44
PR
DEN-2
67
RS H Adam Malik
12
LK
Negatif
| 27
68
RS H Adam Malik
44
PR
Negatif
69
RS Herna
16
LK
Negatif
70
RS H Adam Malik
6
PR
Negatif
71
RS H Adam Malik
10
PR
DEN-2
72
RS H Adam Malik
8
LK
DEN-2
73
RS H Adam Malik
4
LK
DEN-2
74
RS H Adam Malik
6
PR
DEN-2
75
RS H Adam Malik
5
LK
DEN-2
76
RS H Adam Malik
43
LK
DEN-2
77
RS H Adam Malik
25
LK
DEN-2
78
RS Herna
18
LK
DEN-2
79
RS H Adam Malik
7
LK
DEN-1
80
RS H Adam Malik
8
LK
DEN-2
81
RS H Adam Malik
11
LK
DEN-2
82
RS H Adam Malik
6
PR
DEN-2
83
RS H Adam Malik
44
PR
DEN-2
84
RS Pirngadi
82
LK
DEN-2
85
RS Herna
29
PR
DEN-2
86
RS Herna
24
PR
DEN-2
87
RS Herna
44
LK
DEN-2
88
RS H Adam Malik
39
PR
DEN-2
89
RS H Adam Malik
10
LK
DEN-2
90
RS H Adam Malik
21
LK
Negatif
91
RS H Adam Malik
10
LK
Negatif
92
RS H Adam Malik
11
LK
Negatif
93
RS H Adam Malik
12
PR
DEN-2
94
RS H Adam Malik
16
PR
DEN-2
95
RS H Adam Malik
17
PR
DEN-2
96
RS H Adam Malik
20
LK
DEN-2
97
RS H Adam Malik
23
LK
DEN-2
98
RS H Adam Malik
17
LK
DEN-2
99
RS H Adam Malik
30
PR
DEN-2
100
RS H Adam Malik
11
LK
Negatif
| 28
