LAPORAN HASIL PENELITIAN HIBAH PENELITIAN DALAM PENINGKATAN PUBLIKASI ILMIAH INTERNASIONAL PROGRAM WORLD CLASS UNIVERSITY TAHUN 2010
POTENSI BIOAKTIF MIKROALGA LAUT Nanochloropsis oculata DALAM MENGINDUKSI IMUN SELULER UNTUK PENGEMBANGAN ANTIVIRAL (VIRAL NERVOUS NECROTIC) PADA KOMODITI IKAN KERAPU
Oleh: Rahmi Nurdiani, SPi., MApp.Sc Dr. Uun Yanuhar, SPi., MSi Asus Maizar SH., SPi., MP
Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional, melalui DIPA Universitas Brawijaya berdasarkan SK Rektor Nomor : 190/SK/2010, tanggal 17 Juni 2010.
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010
RINGKASAN Penelitian telah secara bertahap berjalan dengan melakukan kegiatan penelitian eksplorasi yakni diperolehnya bahan aktif berupa protein cell pigmen dari mikroalga laut N. oculata yang telah diuji mampu menghambat viral VNN. Penyebab kematian utama pada budidaya ikan kerapu tikus adalah proliferasi virus VNN yang terjadi pada ikan kerapu yakni mencapai hingga 100 %. Selain sebagai antiviral ternayata bahan tersebut juga mampu meghambat dan membunuh konsentrasi bakteri pada konsentrasi 40 ppm. Metode untuk mendapatkan pigmen cell protein adalah dengan isolasi enzimatis menggunakan protease inhibitor dan glass bead acid, kemudian dilakukan SDS Page, pemurnian protein, dan pengujian secara in vitro menggunakan sel line dan invivo langsung pada ikan kerapu. Sedangkan untuk mendapatkan inokulum virus dilakukan isolasi virus dengan menggunakan ultrahigh centrifugasi pada kecepatan 200.0000 rpm secara bertahap. Virus yang diperoleh dilakukan uji tantang untuk menentukan respon imun seluler dalammenghambat sinstesa dan proliferasi virus. Hasil pengujian bioaktif berupa protein cell pigmen tersebut pada ikan kerapu yang terinfeksi oleh VNN mampu menginduksi respon imun seluler yang terukur berupa berpengaruh terhadap daya hambat virus, selain itu secara seluler juga berpengaruh terhadap meningkatnya antioksidan MDA dan SOD (hasil penelitian sebelumnya telah dipublikasikan) sedangkan hasil uji awal terhadap infeksi VNN pada ikan kerapu diketahui mampu meningkatkan daya hidup ikan lebih lama. Pemetaan funsgi sel imun pada ikan kerapu yang telah dilakukan yakni pada infeksi VNN terjadi peningkatan ekspresi pada sel CD4 dan IL6, CD8 dan NK cell, dan juga MHC klas I dengan menggunakan pemeriksaan imunokimia yakni imunohistokimia dan imunositokimia. Hal ini diperkuat dengan pemeriksaan SEM menggunakan pelabelan antibodi menunjukkan bahwa secara seluler terdapat protektitifitas sel dengan pelabelan antibodi sekunder yang berpasangan dengan antibodi primer yang digunakan pada uiji ini. sebaran VNN terletak pada sel epitel dan juga sel makrofag, fungsi ini berkaitan dengan respon imun seluler yang teraktivasi oleh antigen, diperkuat pula dengan diketahuinya karakter Virus VNN baik proteinnya maupun genotipenya berupa RNA virus. Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa respon imun seluler dengan pemaparan bioaktif N. Oculata yang merupakan protein cell pigmen mampu berperan sebagai inducer respon imun seluler untuk ikan kerapu yang dapat diukur secara kualititif yakni melalui ekspresi sel imin CD4, CD8, IL6, NK cell dan I12. Respon imun pada ikan ini merupakan efek antiviral dan juga antibakteri yang di hasilkan melalui percobaan laboratorium secara in vitro dan in vivo.
SUMMARY Research has gradually walked by conducting exploratory research activity that is obtaining the active ingredient in the form of pigment cell protein from marine microalgae N. oculata which has been tested able to inhibit viral VNN. Leading cause of death in cultured mouse grouper is VNN virus proliferation that occurs in grouper reaching up to 100%. In addition to the antiviral ternayata material is also capable meghambat and kill the bacteria concentration at a concentration of 40 ppm. Method to get the pigment cells is to isolate enzymatic proteins using protease inhibitors and acid glass beads, was then performed SDS PAGE, protein purification, and testing in vitro using cell lines and in vivo directly on grouper. As for getting the virus inoculum virus was isolated by using ultrahigh centrifugasi at 200.0000 rpm speed gradually. The virus obtained carried challenge test to determine the cellular immune response dalammenghambat sinstesa and proliferation of the virus. The test results bioactive form of the pigment cell proteins in the infected grouper by VNN able to induce cellular immune responses measurable effect on inhibition of virus, but it is also affecting an increasing cellular antioxidant MDA and SOD (Results of previous studies have been published) while the initial test results of infection of VNN in groupers are known to increase the fish live longer. Mapping funsgi immune cells in the grouper that has been done either during the VNN infection increased expression on CD4 cells and IL6, CD8 and NK cells, and also MHC class I by using the immunohistochemical examination and imunositokimia imunokimia. This is confirmed by SEM examination using antibody labeling shows that there are cellular protektitifitas labeling cells with secondary antibody coupled with primary antibodies used in this uiji. VNN distribution lies in the epithelial cells and macrophage cells, this function is associated with cellular immune responses are activated by antigens, reinforced also by knowing the character of VNN virus genotype in the form of either protein or RNA viruses. In this research can be concluded that the cellular immune response by exposure of bioactive N. Oculata which is the pigment cell protein capable of acting as an inducer cellular immune response to the grouper that can be measured kualititif namely through imine cell expression of CD4, CD8, IL6, NK cell and I12. Immune response in these fish is also antibacterial and antiviral effects generated through laboratory experiments in vitro and in vivo.
DAFTAR PUSTAKA Ae Park, M., Sohn, sang-Gyu. 2000. Status of Desease of Seves Band Grouper Epinephelus septemfasciatus, in Korea RO. Pathology Devision. South Sea isheries research Institute. National Fisheries research and Development Institute. p. 35-37. Aldridge, P.D, Grai,N.A., Hirst, P.H, Anjam Khan, N. 2005. Ephithelial Bacterial athogen Interaction. Blackwell Synergy – Molecular Microbiology, Vol 55. Issue 3. p 655. Bloch, B., Gravningen, K. & Larsen, J. L. 1991. Encephalomyelitis among turbot ssociated with a piconodavirus-like agent. Diseases of Aquatic Organisms 10, 65-70. Breuil, G., Bonami, J. R., Pepin, J. F. & Pichot, Y. 1991. Viral infection (Picorna-like irus) associated with mass mortalities in hatchery-reared sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae and juveniles. Aquaculture 97, 109-116. Forum Inovasi Technic Aquacullture (FITA) . 2009. Kumpulan Laporan dan Komunikasi Hasil Penelitian Seminar Nasional. Hotel Majapait Surabaya. Glazebrook, J. S., Heasman, M. P. & De Beer, S. W. (1990). Picornalike viral particles associated with mass mortalities in larval barramundi, Lates calcarifer (Bloch). Journal of Fish Diseases 13, 245-249 Gunawan, I dan U. Yanuhar, 2009. Ekspresi Protein Imunogenik Viral Nervous Necrotic (VNN) Isolat Lokal Yang Menginfeksi Grouper Cromileptes altivelis. Seminar Nasional MAI 2009. Hotel Sheraton Jogjakarta Irawan, B dan U. Yanuhar. 2009. Pemanfaatan Mikroalga laut N. oculata sebagai umber Bioaktif Terpenoid Untuk Antibaktteri. Laporan Tugas Akhir. FPIK UB Jawetzs., Melnick & Adelberg’s. 2006. Medical Microbiology. twenty –third edition. Mc raw Hill. p. 536-571. Kopp, E., Medzhitov, R. 2003. Recognition of Microbial Infection by Toll-like receptor. Elsevier. Curent Opinion in Immunology. 15:396-401. Kothary, M.H., Delston, R.B., Curtis, S.K., Mc. Cardell, B.A. Tall, B.D. 2001. Purification and Characterization of a Vulnificolysin-like Cytolysin Produced by Vibrio tubiashii. Applied and Environmental Microbiology, August Vol. 68, No. 8, p.3707-3711 Maeno, Y., Leobert D. De La Pena and Erlinda R. Cruz-Lacierda. 2007. Susceptibility of Fish Species Cultured in Mangrove Brackish Area to Piscine Nodavirus. JARQ 41 (1), p : 95 – 99 Masitoh, M.M &U. Yanuhar, 2009. Pemanfaatan Ekstrak Mikroalga Laut N. oculata sebagai Sumber Antioksidant Superoxide Dismutase dan Malanoldehaldehide
pada Otak Ikan Kerapu Tikus yang Terinfeksi Vibrio alginolyticus . Laporan Tugas Akhir, Juni. FPIK UB Masitoh, M.M., Irawan, B., Rahmawaty, A., Yanuhar, U. 2009. Potensi Ekstrak Mikroalga Laut N. oculata Sebagai Sumber Antioksidant dan Antibakteri. Laporan Pekan Kreatifitas Mahasiswa. Ditjen Dikti. Universitas Brawijaya. Mori, K., Nakai, T., Muroga, K., Arimoto, M., Mushiake, K. & Furusawa, I. 1991. Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found inlarval striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis. Virology 187, 368-371. Munday, B. L., Langdon, J. S., Hyatt, A. & Humphrey, J. D. 1992. Mass mortality associated with a viral-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundi, Lates calcarifer Bloch. Aquaculture 103, 197211 Nagasawa, K. dan Cruz-Lacierda, T.R. 2004. Diseases of Cultured Grouper. South East Asean Fisheries Development Center Aquaculture Department. Government of Japan Trust Fund. Nguyen, H. D. 1997. Tissue distribution of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in adul striped jack. Diseases Of Aquatic Organism 28. 82-91. Nurjana, 2010. Komunikasi Dalam Rangka Ujian Terbuka Program Pascasarjana Pertanian, Program Doktor, 1 April 2009. Rahmawaty, A., Nurdiani, R. dan Yanuhar, 2009. Pemanfaatan Ekstrak Mikroalga Laut N. oculata sebagai Sumber Antioksidant Superoxide Dismutase dan Malanoldehaldehide pada Organ Ginjal Ikan Kerapu Tikus yang Terinfeksi Vibrio alginolyticus . Laporan Tugas Akhir, Agustusi. FPIK UB Ramboarina, S., Fernandes P., Danielll, S., Islam, S., Simpson, P., Frankel, G., Booy, F. Donnenberg, M.S., Mattews, S. 2005. Structure of Bundle Forming Pilus From Entheropathogenic E.coli. J.Biol.Chem. December 2, Vol 280, p.4025240260 SEAFDEC, 2001. Husbandry and Health Management of Grouper. SEAFDEC Aquaculture Department, Tigbauan 5021, Iloilo, Philippines. 94 page Setiawan, A.. Yanuhar, U., Sukoso. 2009. Ekspresi Interleukin 6 (IL-6), CD4 dan CD8 Pada Organ Spesifik Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) Terhadap Infeksi Vibrio spp. dan VNN (Viral Nervous Necrosis). Tesis Pascasarjana FPIK. Shahidi , F. 2007. Nutraceuthicals and Heatlhful Products from Aquatic Resources. Health and Nutrition from The Sea. The Journal Ocean of Technology. Paper and Review. Departmment of Biochemistry, Memoryal University of Newfoundland , St. John’s , NL Canada, A1B, 3X9.p. 36-48.
Subiyakto. 2010. Efektifitas Transfeksi, Mikroinjeksi dan Elektrophorasi Untuk Transfer Gen Hormon Pertumbuhan GH Pada Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis). Ringkasan Disertasi Pascasarjana Universitas Brawijaya Malang. Sugama, I.K. 2007. Kebijakan Pembangunan Perikanan dan Kelautan pada Prospek Terkini. Makalah Utama Seminar Nasional Hasil-Hasil Perikanan dan Kelautan. Universitas Brawijaya Malang. Thiery, R., Coizien, J., Cabon, J., Lamour, F., Baud, M., Schneemann, A. 2006. Induction of a Protective Immune Response against Viral nervous Necrosis in the European Sea Bass Dicentrarchus labrax by Using Betanodavirus - Like Particles. Journal of Virulogy. Oct, p. 10201-10207. Thye, C.T. 2001. Survey of Grouper Desease in Malaysia. National Fish Healt Research Center, Fisheries research Institute. p.38-40 Yanuhar, U. 2006. Identifikasi Protein Reseptor Membran Sel Epitel Usus Ikan Kerapu Tikus Cromileptes altivelis pada Kultur In Vitro. Jurnal Agritek . Terakreditasi Nasional. Yanuhar, U. 2004. Laporan Hasil Penelitian Program Riiset Unggulan Terpadu XI. Karakterisasi Molekuler Protein Adhesin Vibrio alginolyticus dan Reseptornya dengan Antibodi Monoklonal. KMNRT-DRN. Yanuhar, U. 2008. Laporan Hasil Penelitian Program L’Oreal Life Science In Woman Unesco “ Ekspresi peptida-peptida reseptor yang Mengenali Antigen untuk pengembangan bahan antiviral. Yanuhar, U., Sumarno., Sukoso, 2008. Pengembangan Vaksin Berbasis Peptida yang Terekspresi pada Reseptor Ikan Kerapu Untuk penyiapanTransgenik Antibodi. Laporan Penelitian Program Insentif Riset Dasar. KMNRT. Tidak Dipublikasikan Yanuhar, 2009. Identifikasi Protein Haemaglutinin Viral Nervous Necrotic (VNN) Sebagai Protein Adhesin Pada Ikan Kerapu Tikus Cromileptes altivelis. Makalah disampaikan pada Forum Inovatif teknologi Aquaculture. Surabaya Yanuhar, U., Sumarno., Sukoso. 2009. Pengembangan Vaksin Berbasis Peptida yang Terekspresi pada Reseptor Ikan Kerapu Untuk penyiapanTransgenik Antibodi. Laporan Penelitian Program Insentif Riset Dasar. KMNRT. Tidak Dipublikasikan Yanuhar, U. 2009. Regulasi Reseptor Organ Spesifik Ikan Kerapu Tikus Cromileptees altivelis pada Infeksi Antigen yang Disebabkan oleh Protein Imunogenik Vibrio alginolyticus. Jurnal Aquacultura Inonesia pada Volume 10 (2) Agustus 2009. Terakreditasi Nasional. Yanuhar, U & R. Nurdiani, 2009. Eksplorasi Viral Nervous Necrotic Pada Beberapa Organ Ikan Kerapu Tikus. Seminar Nasional, Machung University.
Yoshikoshi, K. & Inoue, K. 1990. Viral nervous necrosis in hatchery reared larvae and juveniles of Japanese parrot®sh, Oplegnathus fasciatus (Temminck & Schlegel). Journal of Fish Diseases 13, 69-77 Yuasa, K., Des Roza, I. Koesharyani, F. Johnny and K. Mahardika, 2000. General Remarks On Fish Disease Diagnosis. Pp. 5-18. Textbook for the Training Course on Fish Disease Diagnosis. Lolitkanta-JICA Booklet No. 12. Zhou, Li.,Fang Gui,Liang, 2008. Molecular Mechanism Underlying Sex Change in Hermaphroditic Groupers. Fish Physiol Biochem Journal, Springerlink, 13 page Zhou, Y.C., Hui H., Jun W., Ben Z., dan Yong Q. S. 2002. Vaccination of The Grouper, Epinephelus awoara, againts Vibriosis Using The Ultrasonic Technique. Aquaculture 203: 229-238.
