LAMPIRAN. Lampiran 1. Daftar Singkatan

LAMPIRAN Lampiran 1. Daftar Singkatan cAMP

: Cyclic Adenosine Mono Phosphate

COX

: Cyclooxygenase

DAB

: 3,3'-diaminobenzidine

EGF

: Epidermal Growth Factor

GM

: Glandular Mucosa

HE

: Hematoxylin Eosin

HK ATPHydrogen Kalium: Hydrogen Kalium Adenosine Tri Phosphate HP

: Histopatologi

HS

: Human Stomach

IHK

: Imunohistokimia

IL 1β

: Interleukin 1beta

K

: Kontrol

LR

: Limiting Ridge

M

: Mucosa

MS

: Mouse Stomach

NM

: Non Glandular Mucosa

NO

: Nitric Oxyde

NOS

: Nitric Oxyde Sinthase

OAINS

: Obat Anti Inflamasi Non Steroid

PA

: Patologi Anatomi

PAS

: Periodic Acid Schiff

PG

: Prostaglandin

PG

: Pepsinogen

PG1

: Pepsinogen 1

PG2

: Pepsinogen 2

PgE2

: Prostaglandin E2

PgI2

: Prostaglandin I2

PLN

: Perlakuan Lesi Negatif

PLP

: Perlakuan Lesi Positif

S

: Serosa

SM

: Sub Mukosa

TGF α

: Transforming Growth Factor alpha

VIP

: Vasoactive Intestinal Peptide

Lampiran 2. Komposisi pakan tikus No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bahan Jagung Bungkil Dedak Kapur Tepung tulang Minyak Methionin Lisin Garam Vitamin + mineral mix

Persentase 73,943 14,505 6,8 1,5 1,263 1,0 0,362 0,31 0,213 0,106

Lampiran 3. Data Pakan Tikus Per- Hari

Lampiran 4. Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff : 1. Perendaman gelas objek dalam xylol I selama 2 menit (deparafinasi). 2. Perendaman dalam xylol II selama 2 menit (deparafinasi). 3. Pembilasan dengan air mengalir. 4. Pembilasan dengan aquades. 5. Perendaman dengan larutan asam asetat glacial (CH3COOH) 3% selama 35menit. 6. Perendaman dalam pewarna 1% Alcian Blue 8 GX dalam 3% CH3COOH (pH 2,5) selama 15-30 menit. 7. Pembilasan dengan larutan asam asetat glacial (CH3COOH) 3% selama 15 menit. 8. Pembilasan dengan air mengalir. 9. Pembilasan dengan aquades. 10. Pembilasan dengan air mengalir. 11. Perendaman dalam asam asetat 1% selama 5 menit. 12. Pembilasan dengan aquades. 13. Tahap oksidasi kedalam Periodic Acid 1% selama 5-10menit. 14. Pencucian dengan aquades sebanyak 3 kali, dalam waktu 5 menit untuk satu kali pembilasan. 15. Masukkan kedalam Schiff reagen. 16. Pembilasan dengan air sulfite sebanyak 3 kali dengan campuran larutan: a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO3) sebanyak 10ml. b. 1 N HCl sebanyak 10ml. c. Aquadestilata sebanyak 200 ml. ATAU a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO3) sebanyak 18ml.

b. 1 N HCl sebanyak 15ml. c. Aquadestilata sebanyak 300 ml. d. Hematoxyllin Mayer 30 detik. 17. Pembilasan dengan air mengalir selama 10-15 menit. 18. Pembilasan dengan aquades. 19. Perendaman dalam alkohol 95% selama 10 detik. 20. Perendaman dalam alkohol absolut I selama 1 menit. 21. Pencelupan dalam alkohol absolut II selama 2 menit. 22. Pencelupan dalam xylol I selama 1 menit. 23. Pencelupan dalam xylol II selama 2 menit. 24. Setelah proses pewarnaan selesai, kemudian preparat ditutup dengan cover glass dan diberi label. 25. Hasil: Ab (+) berwarna biru, PAS(+) berwarna merah magenta. Pewarnaan ini bertujuan untuk melihat struktur organ/sampel, sel mukus dan jenis-jenis sel radang yang hanya jelas terlihat dengan pewarnaan AB-PAS.

Lampiran 5. Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin WAKTU 2’ 1. Xylol I 2. Xylol II

2’

3. Alkohol Absolut

2’

4. Alkohol 95%

2’

5. Alkohol 80%

1’

6. Cuci dalam air keran

1’

7. Mayer’s Hematoksilin

8’


30’’

9. Lithin Karbonat

15’’-30’’


2’

11. Eosin

2’-3’

12. Cuci dalam air ketan

2’

13. Alkohol 95%

10x celupan

14. Alkohol absolut I

10x celupan

15. Alkohol absolute II

2’

16. Xylol I

1’

17. Xylol II

2’

TAHAPAN Deparafinisasi

Rehidrasi

Dehidrasi

18. Tutup dengan cover glass

Clearing

Lampiran 6. Metode pewarnaan imunohistokimia isoenzim COX-1 dan COX-2 Prosedur pembuatan pulasan immunohistokimia 1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan pada gelas objek yang telah di coating 3. Panaskan pada hotplate,lalu simpan didalam incubator bersuhu 38-40c semalam 4. Deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3kali masing-masing 5 menit 5. Celupkan kedalam ethanol sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit 6. Celupkan dalam alcohol 90%,80% dan70% masing-masing 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir 8. Masukkan kedalam H2O2 dalam methanol dingin 15 menit 9. Cuci dengan aquadest selama 5 menit 10. Rendam dalam cairan buffer citrate,lalu panaskan didalam microwave 2 kali 5 menit 11. Dinginkan pada suhu ruangan selama 20-30 menit 12. Cuci dengan aquadest 13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengnan Pap pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit 15. Teteskan blocking serum lalu incubasi selama 5-10 menit 16. Cuci dengan PBS(baca protocol pabrikan) 17. Buang sisa pencuci,teteskan primary antibody lalu incubasi selama 60 menit 18. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 19. Teteskan secondary antibody, incubasi selama 10-20 menit 20. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 21. Teteskan HRP-streptavidin biotin,incubasi selama 10-20 menit 22. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit 23. Teteskan larutan kromogen DAB,incubasi 5-10 menit 24. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit 25. Counterstain dengan mayer haematoxylin ,incubasi selama 2 menit 26. Cuci dengan air mengalir selama 5-15 menit 27. Dehiddrasi dengan alcohol 70% sampai dengan xylol masing-masing 5 menit 28. Teteskan entelan lalu tutup dengan cover glass.

Mayers Hamatoxylin Hamatoxylin………………………… 0,1 gr Tawas …………………………………. 5 gr Natriumjodat ………………………….. 0,01 gr Aquadest ……………………………… 100 ml Campurkan sampai larut,diamkan semalam. Keesokan harinya tambahkan Chloral hydrat ………………………… 5 gr Citric acid …………………………….. 0,1 gr Campurkan kembali sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit.

Eosin phloxin 1% Eosin 1% Eosin ………………………………….. 1gr Aquadest ……………………………… 20 ml Alkohol 96% …………………………. 80 ml Phloxin 1% Phloxin ……………………………….. 1 gr Aquadest ……………………………... 20 ml Alkohol ………………………………. 80 ml Eosin 1%............................................... 90 ml Phloxin 1%............................................ 9ml Ethanol ……………………………….. 715ml Asam acetat …………………………. 3,5ml

Prosedur pembuatan preparat Histopatologi 1. Sediaan dipotong dengan microtom setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan potongan pada objekglas, lalu panaskan pada hotplat 3. Deparafinisasi dengan Xylol 1…………………………………………………………. 3 menit Xilol 2.. ………………………………………………………... 3 menit 4. Cuci dengan ethanol, alkohol 90,80%,70% ,masing-masing 20 celup 5. Cuci dengan air mengalir

6. Rendam dalam hamatoxylin ………………………………….. 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir ……………………………………... 3 menit 8. Rendam dalam lithium carbonat 0,5% ………………………. 4 celup 9. Cuci dengan air mengalir 10. Rendam dalam alcohol 70% ……………………………….. 20 celup 11. Rendam dalam Eosin Phloxin 1% ………………………….. 1 menit 12. Cuci dengan air mengalir …………………………………… 30 celup 13. Rendam dalam alcohol 70%,80%,96% ……………………... 10-20 celup 14. Rendam dalam Carboxylol 2X ……………………………… 10-20 celup 15. Rendam dalam Xylol 2X …………………………………… 10-20 celup 16. Teteskan Entelan, lalu tutup dengan coverglas

Formula for acid decalcifying agent Concentrated Hy drochloric acid …………………………. 15 ml Sodium chloride …………………………………………... 75 gr Distilled water ……………………………………………. 1000 ml Hydrochloric acid ………………………………………… 80 ml Formic acid ………………………………………………. 100 ml Distiled water ……………………………………………. 1000 ml

Lithiumcarbonate 0.5% Lithiumcarbonate ……………………………………… 0,5 gr Aquadest ……………………………………………….. 100 ml

Mayer hamatoxylin (Jim Millios) Hamatoxylin …………………………………………… 5 gr Alumuniumamonium sulfate/Tawas ………………….. . 50 gr Sodium iodat …………………………………………… 1gr Aquadest ……………………………………………….. 700 ml Glicerol ………………………………………………… 300 ml Glacial acetic acid ……………………………………… 10 ml

Prosedur pemeriksaan immunohistokimia 1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron -Blok paraffin sebaiknya disesuaikan dengan microtome yang kita pakai -Blok paraffin dicari yang ada lesi mukosa -Blok paraffin harus yang baik dan benar dalam prosesnya 2. Lekatkan pada objekglas yang telah di coating -Harap diperhatikan penomoran preparat dan nama antiboby -Lama waktu saat dalam waterbath -Suhu waterbath 3. Keringkan dan panaskan diatas hot plate -Sebaiknya dalam keadaan kering saat diatas hotplate -Simpan dalam incubatos 38 s/d 40c semalam agar lebih kuat melekat 4. Deparafinisasi dengan xylol 5. Masukkan dalam ethanol 6 .Masukkan dalam alcohol 90%,80% dan 70% 7. Cuci dengan air mengalir 8. Masukkan dalam H2O2 dalam methanol dingin 9. Cuci dengan aquadest 10. Rendam dalam larutan citrate buffer,panaskan dalam microwave 2x 5 menit 11. Dinginkan dalam suhu ruangan 20 s/d 30 menit 12. Cuci dengan aquadest 13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengan PAP pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit 15. Teteskan bloking reagen, incubasi 10 s/d 20 menit -Lihat intruksi manual dari perusahaan -Harus dicuci PBS tidak ? 16. Teteskan Primary antibody, incubasi 60 menit -Lihat intruksi manual -Berapa pengenceran yang disarankan -Berapa lama incubasi yang disarankan 17. Cuci dengan PBS 2x 5menit 18. Teteskan secondary antibody(Link),incubasi 10s/d 20 menit

19. Cuci dengan PBS 2x 5menit 20. Teteskan streptavidin biotin, incubasi 10 s/d 20 menit 21. Cuci dengan PBS 2x 5menit 22. Teteskan DAB incubasi 5 s/d 10 menit 23 .Cuci dengan air mengalir 5 menit 24.Counterstain dengan mayers haematoxilin 2 s/d 3 menit 25.Cuci dengan air mengalir 26.Dehydrasi dengan alcohol 70% s/d xylol 27.Mounting

Citrat buffer (10 mM citric acid pH 6.0 ) Citric acid (anhydrous)……………...1.92 g Aquadest ………………………..…1000 ml

Sodium citrate buffer ( 10mM sodium citrate pH6.0 ) Tri-sodium citrate (dihydrat ) …………….2.94 g Aquadest …………………………………1000 ml

Phosphate Bufferd Saline (PBS) Na2HPO4 ………………………………….1,92 gr NaH2PO4…………………………………..0,92 gr NaCL ………………………………………5,90 gr Aquadest …………………………………..1000 ml

Mayers Hamatoxylin Hamatoxylin …………………………..…..1 gr Natrium jodat ……………………………...0,2 gr Tawas ……………………………………...50 gr Aquadest …………………………………..1000 ml Campurkan dan aduk sampai larut,lalu biarkan semalam. Keesokan harinya tambahkan : Chloral hydrat ………………………………50 gr

Asam citrate …………………………………1 gr Diaduk sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit Sebelum dipakai harus disaring

Proses jaringan dengan alat Tissue Processor 

Alkohol 70% …………………………………………… 1jam



Alkohol 80% …………………………………………… 1 jam



Alkohol 95% …………………………………………… 1 jan



Alkohol 95% …………………………………………… 1 jam



Ethanon ………………………………………………… 1 jam



Ethanol …………………………………………………. 1,5 jam



Ethanol+Xylol …………………………………………. 1 jam



Xilol 1 …………………………………………………. 1 jam



Xilol 2 …………………………………………………...1 jam



Parafin 1 ……………………………………………….. 1,5 jam



Parafin 2 sisa waktu

Lampiran 7. Analisa Statistik Hasil Penelitian Perhitungan statistik sel radang Antrum/Pilorus. Anova untuk sel radang (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel radang

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 44152.997 17933.950 62086.947

df 2 16 18

Mean Square 22076.499 1120.872

F 19.696

Sig. .000

Uji Duncan untuk sel radang (Antrum/Pilorus) Sel radang a,b

Duncan

Lesi mukosa Kontrol Negatif Positif Sig.

N 10 5 4

Subset f or alpha = .05 1 2 3 45.4000 118.2000 161.2500 1.000 1.000 1.000

Means f or groups in homogeneous subsets are display ed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.455. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed.

Perhitungan statistik sel mukus regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel mukus (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel goblet


Sum of Squares 108877.9 71402.083 180280.0

df 2 12 14

Mean Square 54438.958 5950.174

Uji Duncan untuk sel mukus (Antrum/Pilorus)

F 9.149

Sig. .004

Sel goblet Duncan

a,b


N 6 5 4

Subset f or alpha = .05 1 2 11.6667 163.0000 206.2500 1.000 .399

Means f or groups in homogeneous subset s are display ed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.865. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed.

Perhitungan statistik sel parietal regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel parietal (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel parietal


Sum of Squares 31.121 345.300 376.421

df 2 16 18

Mean Square 15.561 21.581

Uji Duncan untuk sel parietal (Antrum/Pilorus) Sel pari etal Duncan

a,b

Lesi mukosa Positif Negatif Kontrol Sig.

N 4 5 10

Subset f or alpha = .05 1 5.0000 7.4000 8.3000 .283


F .721

Sig. .501

Perhitungan statistik sel chief regio Antrum/Pilorus Anova untuk sel chief (Antrum/Pilorus) ANOVA Sel chief


Sum of Squares 106.437 87360.300 87466.737

df 2 16 18

Mean Square 53.218 5460.019

F .010

Sig. .990

Uji Duncan untuk sel chief (Antrum/Pilorus) Sel chief Duncan

a,b


N 10 5 4

Subset f or alpha = .05 1 316.5000 319.2000 322.5000 .901


Data Summary

Lesi mukosa

Kontrol

Negatif

Positif

Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel

radang goblet parietal chief kelenjar aktif radang goblet parietal chief kelenjar aktif radang goblet parietal chief kelenjar aktif

Mean 45.40 11.67 8.30 316.50 7.33 118.20 163.00 7.40 319.20 78.00 161.25 206.25 5.00 322.50 102.00

St d Dev iat ion 29.33 3.50 5.85 81.93 1.86 27.96 120.29 1.67 26.95 19.67 48.53 67.00 2.94 89.53 39.30

St andard Error of Mean 9.27 1.43 1.85 25.91 .76 12.50 53.79 .75 12.05 8.80 24.27 33.50 1.47 44.77 19.65

Perhitungan statistik diameter lambung regio Fundus/Korpus Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus ANOVA

Diamet er sagital (cm)

Diamet er transf ersal (cm)

Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 4.082 26.030 30.112 .396 7.264 7.660

df 2 17 19 2 17 19


F 1.333

Sig. .290

.198 .427

.463

.637

Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranversal pada fundus/korpus Diameter sagital (cm) Duncan

a,b

Fundus/korpus lesi negatif Kontrol lesi positif Sig.

N 2 10 8

Subset f or alpha = .05 1 8.7000 9.8700 10.2875 .097


Diameter transfersal (cm) Duncan

a,b

Fundus/korpus lesi negatif Kontrol lesi positif Sig.

N 2 10 8

Subset f or alpha = .05 1 4.3000 4.5400 4.7500 .362


Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus ANOVA




Sum of Squares .171 29.941 30.112 .241 7.419 7.660

df 2 17 19 2 17 19

Mean Square .086 1.761 .121 .436

F .049

Sig. .953

.276

.762

Uji Duncan untuk diameter sagital dan transversal pada fundus/korpus Diameter sagital (cm) Duncan

a,b

Fundus/korpus lesi positif Kontrol lesi negatif Sig.

N 2 10 8

Subset f or alpha = .05 1 9.7500 9.8700 10.0250 .782



a,b

Fundus/korpus lesi positif Kontrol lesi negatif Sig.

N 2 10 8

Subset f or alpha = .05 1 4.4000 4.5400 4.7250 .512


Perhitungan statistik diameter lambung regio Antrum/Pilorus Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada Antrum/Pilorus ANOVA




Sum of Squares 5.379 24.733 30.112 1.516 6.144 7.660

df 2 17 19 2 17 19


F 1.849

Sig. .188

.758 .361

2.097

.153

Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranfersal pada Antrum/Pilorus Diameter sagital (cm) Duncan

a,b

Antrum/pilorus lesi negatif Kontrol lesi positif Sig.

N 5 10 5

Subset f or alpha = .05 1 9.2400 9.8700 10.7000 .062



a,b

Antrum/pilorus lesi negatif Kontrol lesi positif Sig.

N 5 10 5

Subset f or alpha = .05 1 4.2800 4.5400 5.0400 .052


Perhitungan statistik sel radang regio Fundus/Korpus Anova untuk sel radang (Fundus/korpus) ANOVA Sel radang


Sum of Squares 55521.543 17132.457 72654.000

df 2 17 19

Mean Square 27760.771 1007.792

F 27.546

Sig. .000

Uji Duncan untuk sel radang (Fundus/korpus) Sel radang a,b

Duncan

Lesi mukosa Kontrol Positif Negatif Sig.

N 10 7 3

Subset f or alpha = .05 1 2 3 33.2000 121.8571 165.0000 1.000 1.000 1.000

Means f or groups in homogeneous subsets are display ed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.207. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed.

Perhitungan statistik sel mukus regio Fundus/Korpus Anova untuk sel mukus (Fundus/korpus) ANOVA Sel goblet


Sum of Squares 136643.6 87476.929 224120.5

df 2 15 17

Mean Square 68321.786 5831.795

F 11.715

Sig. .001

Uji Duncan untuk sel mukus regio Fundus/Korpus Sel goblet Duncan

a,b

Lesi mukosa Kontrol Positif Negatif Sig.

N 8 7 3

Subset f or alpha = .05 1 2 12.2500 173.7143 213.0000 1.000 .429


Perhitungan statistik sel Parietal regio Fundus/Korpus Anova untuk sel parietal (Fundus/korpus) ANOVA Sel parietal


Sum of Squares 17245.026 49335.524 66580.550

df 2 17 19

Mean Square 8622.513 2902.090

Uji Duncan untuk sel parietal (Fundus/Korpus) Sel pari etal Duncan

a,b

Lesi mukosa Negatif Positif Kontrol Sig.

N 3 7 10

Subset f or alpha = .05 1 197.3333 200.1429 258.0000 .102


F 2.971

Sig. .078

Perhitungan statistik sel Chief regio Fundus/Korpus Anova untuk sel chief (Fundus/korpus)

ANOVA Sel chief


Sum of Squares 2701.576 118635.6 121337.2

df 2 17 19

Mean Square 1350.788 6978.566

Uji Duncan untuk sel chief (Fundus/Korpus)

Sel chief Duncan

a,b

Lesi mukosa Negatif Positif Kontrol Sig.

N 3 7 10

Subset f or alpha = .05 1 250.6667 255.8571 277.3000 .633


F .194

Sig. .826

Ringkasan Data

Lesi mukosa

Kontrol

Negatif

Positif

Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel Sel

radang goblet parietal chief kelenjar aktif radang goblet parietal chief kelenjar aktif radang goblet parietal chief kelenjar aktif

Mean 33.20 12.25 258.00 277.30 10.50 165.00 213.00 197.33 250.67 187.00 121.86 173.71 200.14 255.86 166.14

St d Dev iat ion 15.79 6.73 61.37 98.19 2.88 40.85 82.71 21.50 41.68 91.28 43.88 110.66 49.18 68.79 76.02

St andard Error of Mean 4.99 2.38 19.41 31.05 1.02 23.59 47.75 12.41 24.06 52.70 16.58 41.83 18.59 26.00 28.73

LAMPIRAN. Lampiran 1. Daftar Singkatan

Recommend Documents