LAMPIRAN 1. Standar zona hambat antibiotik menurut CLSI
Jenis antibiotik
Konsentrasi cakram antibiotik
Kloramfenikol
30 µg
Diameter zona hambat (mm) Sensitif intermediate Resisten ≥ 18 13 s/d 17 ≤ 12
Sumber: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS) Providing NCCLS standards and guidelines ISO/TC 212 standards, and ISO/TC 76 standards. LAMPIRAN 2. Analisis keragaman pengaruh pelarut, konsentrasi, dan isolat terhadap zona hambat pada mikroba uji E. coli Post Hoc Test pelarut untuk mikroba uji E. coli Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:ZonaHambat Source
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
265.154a
44
Intercept
302.791
1
4.650
2
2.325
7.764
.001
Konsentrasi
24.387
4
6.097
20.358
.000
Isolat
47.375
2
23.688
79.097
.000
3.515
8
.439
1.467
.180
129.423
4
32.356 108.042
.000
Konsentrasi * Isolat
16.318
8
2.040
6.811
.000
Pelarut * Konsentrasi * Isolat
39.486
16
2.468
8.241
.000
Error
26.953
90
.299
Total
594.897
135
Corrected Total
292.106
134
Pelarut
Pelarut * Konsentrasi Pelarut * Isolat
6.026
20.123
.000
302.791 1.011E3
.000
a. R Squared = .908 (Adjusted R Squared = .863)
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 3. Post Hoc Test pelarut untuk mikroba uji E. coli Duncan Pelarut
N
n-heksana metanol Etil asetat Sig.
45 45 45
Zona Hambat Subset 1 2 1.2358 1.6129 1.6442 1.000 .787
LAMPIRAN 4. Post Hoc Test konsentrasi untuk mikroba uji E. coli Duncan Konsentrasi
Zona Hambat Subset 2
N 1
0 40 80 60 100 Sig.
27 27 27 27 27
3
.7100 1.4796 1.6293 1.6967 1.000
1.6967 1.9726 .067
.173
LAMPIRAN 5. Post Hoc Test isolat untuk mikroba uji E. coli Duncan Isolat
Zona Hambat Subset 2
N 1
S2T16-1 S3T32-3 S3T33-3 Sig.
45 45 45
3
.7100 1.6442 1.000
1.000
2.1387 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 6. Analisis keragaman pengaruh pelarut, konsentrasi, dan isolat terhadap zona hambat pada mikroba uji S. aureus Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:ZonaHambat Type III Sum of Squares
Source
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
90.656a
44
2.060 1.740E3
.000
Intercept
125.802
1
125.802 1.062E5
.000
17.603
2
8.801 7.431E3
.000
2.249
4
.562 474.795
.000
17.603
2
8.801 7.431E3
.000
4.499
8
.562 474.795
.000
35.205
4
8.801 7.431E3
.000
Konsentrasi * Isolat
4.499
8
.562 474.795
.000
Pelarut * Konsentrasi * Isolat
8.998
16
.562 474.795
.000
Error
.107
90
.001
Total
216.565
135
90.763
134
Pelarut Konsentrasi Isolat Pelarut * Konsentrasi Pelarut * Isolat
Corrected Total
a. R Squared = .999 (Adjusted R Squared = .998)
LAMPIRAN 7. Post Hoc Test Pelarut untuk mikroba uji S. aureus Duncan Pelarut n-heksana Etil asetat Metanol Sig.
N 45 45 45
Zona hambat Subset 1 2 .7100 .7100 1.4760 1.000 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 8. Post Hoc Test Konsentrasi untuk mikroba uji S. aureus Duncan Konsentrasi
N
0 60 40 80 100 Sig.
27 27 27 27 27
Zona hambat Subset 1 2 .7100 1.0148 1.0156 1.0204 1.000
.581
3
1.0659 1.000
LAMPIRAN 9. Post Hoc Test Isolat untuk mikroba uji S. aureus Duncan Isolat S2T16-1 S3T32-3 S3T33-3
N 45 45 45
Zona Hambat Subset 1 2 .7100 .7100 1.4760
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 10. Analisis keragaman pengaruh pelarut, konsentrasi, dan isolat terhadap zona hambat pada mikroba uji C. albicans Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:ZonaHambat Source
Type III Sum of Squares
Df
Mean Square
Corrected Model
254.597a
44
Intercept
305.733
Pelarut
Sig.
60.624
.000
1
305.733 3.203E3
.000
170.599
2
85.300 893.702
.000
21.849
4
5.462
57.229
.000
4.590
2
2.295
24.046
.000
43.698
8
5.462
57.229
.000
Pelarut * Isolat
9.180
4
2.295
24.046
.000
Konsentrasi * Isolat
1.560
8
.195
2.043
.050
Pelarut * Konsentrasi * Isolat
3.120
16
.195
2.043
.018
Error
8.590
90
.095
Total
568.920
135
Corrected Total
263.187
134
Konsentrasi Isolat Pelarut * Konsentrasi
5.786
F
a. R Squared = .967 (Adjusted R Squared = .951) LAMPIRAN 11. Post Hoc Test Pelarut untuk mikroba uji C. albicans Duncan Zona hambat Pelarut N Subset 1 2 n-heksana 45 .7100 Etil asetat 45 .7100 Metanol 45 3.0947 Sig. 1.000 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 12. Post Hoc Test Konsentrasi untuk mikroba uji C. albicans Duncan Zona Hambat Konsentrasi N Subset 1 2 0 27 .7100 40 27 1.6044 80 27 1.6804 1.6804 60 27 1.7370 1.7370 100 27 1.7926 Sig. 1.000 .140 .213
LAMPIRAN 13. Post Hoc Isolat untuk mikroba uji C. albicans Duncan Zona Hambat Konsentrasi N Subset 1 2 S2T16-1 45 1.2504 S3T32-3 45 1.5827 S3T33-3 45 1.6816 Sig. 1.000 .132
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 14. Analisis keragaman pengaruh pelarut, konsentrasi, dan isolat terhadap zona hambat pada mikroba uji F. oxysporum
Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:ZonaHambat Source
Type III Sum of Squares
Df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
10.622a
44
Intercept
111.339
1
Pelarut
3.668
2
1.834
46.562
.000
Konsentrasi
2.249
4
.562
14.275
.000
.757
2
.379
9.614
.000
Pelarut * Konsentrasi
1.087
8
.136
3.449
.002
Pelarut * Isolat
1.063
4
.266
6.749
.000
.571
8
.071
1.812
.085
Pelarut * Konsentrasi * Isolat
1.226
16
.077
1.945
.026
Error
3.545
90
.039
Total
125.506
135
14.167
134
Isolat
Konsentrasi * Isolat
Corrected Total
.241
6.129
.000
111.339 2.827E3
.000
a. R Squared = .750 (Adjusted R Squared = .627) LAMPIRAN 15. Post Hoc Test Pelarut untuk mikroba uji F. oxysporum Duncan Konsentrasi Etil asetat n-heksana Metanol Sig.
N 45 45 45
Zona Hambat Subset 1 2 .7596 .8269 1.1380 .111 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 16. Post Hoc Test Konsentrasi untuk mikroba uji F. oxysporum Duncan Konsentrasi
N
0 60 40 80 100 Sig.
27 27 27 27 27
Zona hambat Subset 1 2 .7100
3 .8730 .8981 .9489
1.000
.189
1.1107 1.000
LAMPIRAN 17. Post Hoc Test isolat untuk mikroba uji F. oxysporum Duncan Konsentrasi S2T16-1 S3T32-3 S3T33-3 Sig.
N 45 45 45
Zona Hambat Subset 1 2 .8373 .8753 1.0118 .366 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 18. Analisis keragaman pengaruh pelarut, konsentrasi, dan isolat terhadap zona hambat pada mikroba uji G. boninense Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:ZonaHambat Source
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
110.856a
44
Intercept
570.992
1
8.190
2
4.095
10.371
.000
Konsentrasi
64.555
4
16.139
40.875
.000
Isolat
12.064
2
6.032
15.277
.000
2.813
8
.352
.891
.528
12.265
4
3.066
7.766
.000
Konsentrasi * Isolat
3.603
8
.450
1.141
.344
Pelarut * Konsentrasi * Isolat
7.367
16
.460
1.166
.310
Error
35.535
90
.395
Total
717.384
135
Corrected Total
146.391
134
Pelarut
Pelarut * Konsentrasi Pelarut * Isolat
2.519
6.381
.000
570.992 1.446E3
.000
a. R Squared = .757 (Adjusted R Squared = .639)
LAMPIRAN 19. Post Hoc Test Pelarut untuk mikroba uji G. boninense Duncan Konsentrasi Etil asetat n-heksana Metanol Sig.
N 45 45 45
Zona Hambat Subset 1 2 1.7733 2.0227 2.3738 .063 1.000
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 20. Post Hoc Test Konsentrasi untuk mikroba uji G. boninense Duncan Konsentrasi 0 60 40 80 100 Sig.
N 27 27 27 27 27
Zona hambat Subset 1 2 .7100 2.2419 2.2433 2.4144 1.000
.347
3
2.4144 2.6733 .134
LAMPIRAN 21. Post Hoc Test isolat untuk mikroba uji G. boninense Duncan Zona Hambat Konsentrasi N Subset 1 2 S2T16-1 45 1.6593 S3T32-3 45 2.1300 S3T33-3 45 2.3804 Sig. 1.000 .062
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 22. Hasil uji antagonis ekstrak isolat terhadap mikroba uji dalam bentuk zona hambat pertumbuhan (mm)
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 0 40 60 80 100 0 40 60 80 100
10,00 0 0,83 0,69 0,79 1,53 0 6,90 7,73 7,90 9,40
19,20 0 1,08 1,58 1,42 2,22 0 7,23 6,47 9,40 10,97
17,13 0 1,23 0,04 0,99 1,55 0 5,18 9,05 7,68 7,18
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S3T33-3
0 13,03 15,46 17,26 19,73 0 11,46 11,43 11,80 14,83 0 13,20 14,53 16,58
S3T32-3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 16,63 19,20 18,90
S2T16-1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,33 8,93 6,07
S3T32-3
0 40 60 80 100 0 40 60 80 100 0 40 60 80
Etil Asetat S3T33-3
G. boninense
S2T16-1
F. oxysporum
S3T33-3
C. albicans
S3T32-3
S. aureus
S2T16-1
E. coli
Konsentrasi ekstrak (%)
Mikroba uji
Ekstrak n-heksana
Metanol
0 0 0 6,70 0 13,50 0 9,70 0 18,83 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 15,30 15,56 18,63 21,93 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 2,24 2,38 4,84 6,77
0 0 0,33 0,67 0,75 2,08 0 7,41 8,01 8,61 8,71
0 0 0 0 0 0 0 5,60 4,00 3,46 6,07
0 0 0 0 0 0 0 7,16 6,96 6,79 6,26
0 0 0 0 0,50 1,00 0 6,32 4,87 5,75 7,85
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 23. Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Antimikroba dari Sampel Tanah
Sampel Tanah -
Ditimbang sebanyak 1 g Ditambah aquadest steril hingga 10 ml Dihomogenkan.
Suspensi Tanah -
Diambil sebanyak 1 ml Disebarkan pada permukaan media NA Diinkubasi dapa suhu 30±2○C selama 24-48 jam
Kultur campuran bakteri - Diamati koloni yang menunjukkan daerah bening di sekitarnya - Disubkultur pada media NA
Kultur murni bakteri potensial antimikroba
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 24. Alur Kerja Ekstraksi Isolat Bakteri Potensial Antimikroba Menggunakan Pelarut Metanol, n-heksana dan Etil Asetat Isolat Bakteri Potensial Antimikroba
- Dibuat suspense dengan kekeruhan sesuai Standar McFarland (1x108 CFU/ml) - Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media NA - Dibuat beberapa petri - Diinkubasi selama 5-6 hari pada suhu ruang (ditutupi dengan aluminium foil)
Kultur Bakteri -
Dipotong kecil-kecil Dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 500 ml Ditambahkan ± 150 ml pelarut metanol Dimaserasi selama 3 hari Disaring dan disimpan dalam tabung Erlenmeyer lain - Dimaserasi kembali dengan volume yang sama
Maserat - Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit
Supernatan - Dipekatkan dengan menggunakan rotary Evaporator pada suhu tidak lebih dari 50±2°C - Hal yang sama dilakukan terhadap jenis pelarut n-heksana dan etil asetat
Ekstrak Bakteri
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 23. Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Antimikroba dari Sampel Tanah
Sampel Tanah -
Ditimbang sebanyak 1 g Ditambah aquadest steril hingga 10 ml Dihomogenkan.
Suspensi Tanah -
Diambil sebanyak 1 ml Disebarkan pada permukaan media NA Diinkubasi dapa suhu 30±2○C selama 24-48 jam
Kultur campuran bakteri - Diamati koloni yang menunjukkan daerah bening di sekitarnya - Disubkultur pada media NA
Kultur murni bakteri potensial antimikroba
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 24. Alur Kerja Ekstraksi Isolat Bakteri Potensial Antimikroba Menggunakan Pelarut Metanol, n-heksana dan Etil Asetat Isolat Bakteri Potensial Antimikroba
- Dibuat suspense dengan kekeruhan sesuai Standar McFarland (1x108 CFU/ml) - Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media NA - Dibuat beberapa petri - Diinkubasi selama 5-6 hari pada suhu ruang (ditutupi dengan aluminium foil)
Kultur Bakteri -
Dipotong kecil-kecil Dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 500 ml Ditambahkan ± 150 ml pelarut metanol Dimaserasi selama 3 hari Disaring dan disimpan dalam tabung Erlenmeyer lain - Dimaserasi kembali dengan volume yang sama
Maserat - Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit
Supernatan - Dipekatkan dengan menggunakan rotary Evaporator pada suhu tidak lebih dari 50±2°C - Hal yang sama dilakukan terhadap jenis pelarut n-heksana dan etil asetat
Ekstrak Bakteri
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 25 . Alur Kerja Pembuatan Larutan Standar McFarland 108 CFU/ml (http://www.quelab.com)
0,048 M BaCl2
0,18 M H2SO4 -
-
Diambil sebanyak 0,5 ml
-
Diambil sebanyak 99,5 ml
Dihomogenkan kedua larutan
Hasil - Diukur densitas suspensi dengan menggunakan spektrofotometer ( nilai O.D. 625nm ± 0,13)
Larutan standar 0,5 McFarland 1x 108 CFU/ml
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 26. Alur Kerja Uji Daya Hambat Isolat Potensial Terhadap Mikroba Patogen Isolat bakteri penghasil antimikroba
Bakteri Patogen
- Masing-masing disubkultur selama ± 24 jam pada media NA - Diambil dengan jarum ose - Masing-masing dilarutkan dalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) - Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhannya dengan standar 0.5 McFarland (1x108 CFU/ml)
Suspensi bakteri patogen
-
Suspensi bakteri penghasil antimikroba
Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media MHA Diletakkan cakram kertas yang sudah berisi suspensi bakteri antimikroba
- Ditetesi sebanyak 10µl pada cakram kertas steril
Hasil - Diinkubasi pada T: 30±2○C selama 24-48 jam - Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong
Diameter zona hambat
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 27. Alur Kerja Uji Daya Hambat Ekstrak Isolat Potensial Terhadap Bakteri Patogen Ekstrak Metabolit Sekunder
Bakteri Patogen -
Disubkultur selama ± 24 jam pada media NA Diambil dengan jarum ose Dilarutkan dalam larutan fisiologis (NaCl 0.9%) Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhannya dengan standar 0,5 McFarland (1x108 CFU/ml)
Suspensi Bakteri Patogen
- Diencerkan dengan DMSO sesuai konsentrasi yaitu 40,60,80, dan 100% - Ditetesi sebanyak 10µl pada cakram kertas steril - Kontrol (-) digunakan cakram kertas yang berisi 10µl DMSO - Kontrol (+) digunakan cakram kertas yang berisi kloramfenikol 30 µg
- Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media MHA - Diletakkan cakram kertas yang sudah berisi ekstrak meatbolit sekunder isolat potensial
Hasil - Diinkubasi pada T: 30±2○C selama 24-48 jam - Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong
Diameter zona hambat
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 28. Alur Kerja Uji Daya Hambat Ekstrak Isolat Potensial Terhadap Jamur Patogen Ekstrak Metabolit Sekunder
Jamur Patogen - Disubkultur selama 72-96 jam pada media PDA khusus untuk C. albicans ± 24 jam
Jamur patogen usia 3-4 hari
- Diencerkan dengan DMSO sesuai konsetrasi yaitu 40,60,80, dan 100% - Ditetesi sebanyak 10µl pada cakram kertas kosong steril - Kontrol (-) digunakan cakram kertas yang berisi 10µl DMSO - Kontrol (+) digunakan cakram kertas yang berisi ketokonazol 20µg
- Diletakkan cakram kertas yang sudah berisi ekstrakmetabolit sekunder isolat potensial di ke empat sisinya sesuai konsentrasi
Hasil - Diinkubasi pada T: 27-29 ○C selama 24-48 jam - Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong
Diameter zona hambat
Universitas Sumatera Utara
