Lampiran 1 Rancangan penelitian

18

LAMPIRAN

19

Lampiran 1 Rancangan penelitian

Cacing tanah E. foetida dewasa Kering oven vakum (Setiawan)

Tepung cacing kering Ekstraksi buffer dan sentrifugasi

Ekstrak kasar protease Salting-out dengan amonium sulfat

· Pengukuran bobot molekul (SDS-PAGE metode Laemmli 1970) · Konsentrasi protein (Bradford 1976)

Presipitat

Dialisis

Dialisat

Kromatografi kolom

Eluat

· Aktivitas enzim dengan pengaruh suhu, pH, waktu inkubasi (Jackson 1988) · Spesifisitas substrat secara spektrofotometri

20

Lampiran 2 Daftar faktor pembekuan darah Faktor Pembekuan Faktor I Faktor II Faktor III Faktor IV Faktor V Faktor VI Faktor VII

Keterangan

Fibrinogen Protrombin Tromoboplastin jaringan (faktor jaringan) Ion kalsium (Ca2+) Faktor labil (proaccelerin) Belum didefinisikan* Faktor stabil (serum prothrombin conversion accelerator (SPCA) proconvertin) Faktor VIII Faktor antipembekuan darah, faktor VIII:C (protein pembekuan darah) Faktor IX Faktor Christmas (plasma thromboplastin component (PTC), faktor B antihemofilia) Faktor X Faktor Stuart-Prower Faktor XI Plasma thromboplastin antecedent (PTA) Faktor XII Faktor Hageman (faktor kontak) Faktor XIII Fibrin-stabilizing factor (FSF) Faktor Fitzgerald High-molecular-weight kininogen (HMWK) Faktor Fletcher Prekallikrein * Penamaan faktor VI dibatalkan karena senyawa yang dahulu dianggap sebagai faktor pembekuan darah sebenarnya adalah prekursor dari faktor V, dan untuk menghindari kekeliruan, faktor VI belum didefinisikan hingga saat ini.

21

Lampiran 3 Pembuatan bufer-bufer 1. Bufer fosfat pH 7 Sebanyak 8.9 g NaH2PO4 ditambahkan dengan 2 g NaOH lalu dilarutkan dalam 525 mL akuades. 2. Bufer 50 mM Tris-HCl pH 7.5 Sebanyak 1.63 g Tris dilarutkan dalam 200 mL akuades, lalu pH diukur. Larutan kemudian dititrasi menggunakan HCl hingga pH menjadi 7.5. Volum ditera menggunakan akuades hingga 250 mL. 3. Bufer 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 Sebanyak 18.15 g Tris dilarutkan dalam 60 mL akuabides, kemudian dititrasi menggunakan NaCl hingga pH mencapai 8.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 mL. Simpan bufer pada suhu 4°C. 4. Bufer 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Sebanyak 6 g Tris dilarutkan dalam 60 mL akuabides lalu dititrasi menggunakan NaCl hingga pH 6.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 mL. Simpan bufer pada suhu 4°C. 5. Bufer sampel elektroforesis Bufer 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 sebanyak 0.3 mL ditambahkan 2.5 mL gliserol, 1 mL SDS 10% ( v), 0.25 mL 2-merkaptoetanol, 0.5 mL bromofenol biru 1% ( v), lalu dilarutkan dalam 0.45 mL akuades. Simpan dalam lemari pembeku 6. Bufer running Sebanyak 1.803 g Tris ditambahkan 8.648 g glisina, dan 0.6 g SDS, kemudian dilarutkan dalam 500 mL akuades. Larutan dititrasi menggunakan 1 M HCl hingga pH menjadi 8.3. Tera dengan akuades hingga volum 600 mL. Simpan pada suhu 4°C. 7. Bufer 0.1 M glisina-NaOH pH 8 Ditimbang 0.375 g glisina dilarutkan dalam 50 mL akuades, kemudian pH ditera menggunakan NaOH hingga mencapai pH 8.

22

Lampiran 4 Prosedur regenerasi kolom DEAE-Selulosa Sigma D6418 Langkah-langkah regenerasi berikut sebaiknya dilakukan di dalam corong Buchner. Regenerasi yang dilakukan di dalam kolom dapat mengakibatkan penyumbatan yang tak kasatmata. 1. Resin disuspensikan di dalam akuades sebanyak 5 kali volum resin dan didiamkan selama 30-45 menit. 2. Volum resin diukur. Volum yang didapat dicatat sebagai Volum Kolom (VK) yang akan digunakan untuk mengukur volum larutan pencuci kolom. Lanjutkan ke langkah 3. Untuk resin dalam keadaan tersuspensi (baru atau bekas) 3. Suspensi kolom disaring. 4. Resin yang telah disaring disuspensikan ke dalam 2 VK 0.1 M NaOH yang mengandung 0.5 M NaCl selama 10 menit, maksimum selama 30 menit, kemudian dituang ke dalam corong Buchner dan pompa cairan secara PERLAHAN (laju alir 1 VK bufer/ 5 menit). Resin dicuci kembali menggunakan larutan yang sama sebanyak 2 VK. 5. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.5 M NaCl (tanpa 0.1 M NaOH). Jika resin dalam keadaan sangat kotor, ditambahkan 0.5 M NaCl sebanyak 3-5 VK setelah pencucian menggunakan asam dan/atau basa dan corong dibiarkan terbuka agar larutan dapat mengalir tanpa hambatan. 6. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.1 M HCl yang mengandung 0.5 M NaCl. 7. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan akuades. 8. Pencucian dilanjutkan menggunakan akuades sebanyak 5-10 VK atau hingga pH efluen lebih besar dari 5. 9. Resin disuspensikan di dalam 2 VK 1 M NaCl dan dititrasi menggunakan NaOH hingga pH suspensi berkisar antara 7-8. Simpan (Langkah 10) atau gunakan (Langkah 11). 10. Menyimpan resin: kemasan diberi label dan disimpan pada 0-5°C (Lanjutkan pada langkah 11 untuk menggunakan resin. Jika diperkirakan terjadi kontaminasi bakteri, mulailah pada Langkah 4). 11. Menggunakan resin: resin disaring kemudian dicuci menggunakan 5 VK akuades. Resin diresuspensi menggunakan 10x bufer (sesuai yang akan digunakan) sebanyak 2 VK lalu disaring. Resuspensi resin di dalam 1x bufer yang sama sebanyak 2 VK lalu pH filtrat diukur. Jika pH filtrat berkisar 0.15 dari pH 1x bufer, resin siap digunakan. Jika tidak, ulangi Langkah 11. 12. Resin dikemas ke dalam kolom. Biarkan kolom terkemas secara alami. Pemompaan dapat menyebabkan penyumbatan. 13. Sampel dimasukkan ke dalam kolom, dicuci, lalu dielusi. 14. Regenerasi kolom seperti pada Langkah 3-8.

23

Lampiran 5 Data aktivitas protease Suhu 25°C, pH 6 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.220 0.303 0.238 0.265 0.239 0.307

Ul 2 0.227 0.298 0.238 0.266 0.255 0.310

Ul 3 0.228 0.266 0.238 0.270 0.247 0.311

Absorban Rerata 0.225±0.004 0.289±0.020 0.238±0.000 0.267±0.003 0.247±0.008 0.309±0.002

Ul 3 0.326 0.323 0.338 0.326 0.326 0.333

Absorban Rerata 0.329±0.003 0.330±0.012 0.353±0.014 0.311±0.015 0.324±0.003 0.335±0.002

Ul 3 0.283 0.313 0.334 0.345 0.327 0.346

Absorban Rerata 0.283±0.008 0.331±0.015 0.327±0.007 0.355±0.010 0.331±0.008 0.357±0.013

Ul 3 0.211 0.213 0.219 0.185 0.238 0.262

Absorban Rerata 0.221±0.009 0.217±0.004 0.214±0.007 0.208±0.020 0.217±0.019 0.257±0.010

Blanko 0.233 0.330 0.239 0.282 0.217 0.273

Standar 0.510 0.523 0.523 0.534 0.556 0.517

Aktivitas (U m ) 0.000 -0.425 -0.060 -0.060 0.022 0.074

Standar 0.495 0.484 0.538 0.534 0.536 0.540

Aktivitas (U m ) 0.000 -0.040 0.075 -0.077 -0.015 -0.003

Suhu 37°C, pH 6 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.329 0.344 0.356 0.309 0.326 0.337

Ul 2 0.332 0.324 0.365 0.297 0.320 0.335

Blanko 0.356 0.333 0.338 0.340 0.336 0.339


Ul 1 0.291 0.341 0.321 0.355 0.341 0.354

Ul 2 0.276 0.338 0.325 0.364 0.326 0.372

Blanko 0.311 0.323 0.320 0.328 0.323 0.326

Standar 0.507 0.514 0.517 0.569 0.594 0.596

Aktivitas (U m ) 0.000 0.084 0.036 0.056 0.007 0.019

Suhu 25°C, pH 7.4 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.224 0.219 0.206 0.221 0.210 0.264

Ul 2 0.227 0.220 0.217 0.218 0.202 0.246

Blanko 0.175 0.195 0.217 0.201 0.215 0.255

Standar 0.415 0.393 0.377 0.358 0.383 0.435

Aktivitas (U m ) 0.000 0.222 -0.019 0.022 0.003 0.002

24

Lanjutan lampiran 5 Suhu 37°C, pH 7.4 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.223 0.254 0.237 0.242 0.245 0.241

Ul 2 0.239 0.250 0.230 0.238 0.244 0.244

Ul 3 0.221 0.250 0.240 0.254 0.236 0.257

Absorban Rerata 0.228±0.010 0.251±0.002 0.236±0.005 0.245±0.008 0.242±0.005 0.247±0.009

Ul 3 0.259 0.288 0.273 0.297 0.358 0.372

Absorban Rerata 0.258±0.002 0.290±0.003 0.277±0.005 0.302±0.004 0.364±0.008 0.391±0.017

Ul 3 0.260 0.282 0.259 0.260 0.277 0.280

Absorban Rerata 0.267±0.008 0.282±0.001 0.264±0.004 0.261±0.006 0.273±0.004 0.269±0.009

Ul 3 0.222 0.224 0.238 0.252 0.230 0.238

Absorban Rerata 0.224±0.004 0.226±0.004 0.239±0.005 0.236±0.014 0.237±0.007 0.239±0.001

Blanko 0.228 0.242 0.245 0.243 0.252 0.240

Standar 0.393 0.423 0.417 0.454 0.438 0.429

Aktivitas (U m ) 0.000 0.099 -0.054 0.005 -0.013 0.006

Standar 0.493 0.555 0.560 0.581 0.609 0.629

Aktivitas (U m ) 0.000 0.185 0.031 0.054 0.070 0.057

Suhu 60°C, pH 7.4 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.256 0.289 0.283 0.303 0.373 0.402

Ul 2 0.259 0.294 0.276 0.305 0.362 0.400

Blanko 0.251 0.263 0.268 0.268 0.269 0.267


Ul 1 0.275 0.281 0.265 0.267 0.272 0.265

Ul 2 0.266 0.283 0.267 0.256 0.269 0.263

Blanko 0.267 0.269 0.261 0.272 0.268 0.276

Standar 0.457 0.451 0.467 0.474 0.465 0.474

Aktivitas (U m ) 0.000 0.143 0.015 -0.027 0.006 0.006


Ul 1 0.229 0.224 0.244 0.226 0.244 0.240

Ul 2 0.222 0.231 0.235 0.231 0.237 0.240

Blanko 0.191 0.203 0.203 0.214 0.220 0.224

Standar 0.371 0.422 0.450 0.458 0.470 0.519

Aktivitas (U m ) 0.000 0.210 0.146 0.045 0.017 0.008

25

Lanjutan lampiran 5 Suhu 60°C, pH 8 Waktu (menit) 0 5 10 20 40 60

Ul 1 0.246 0.265 0.324 0.324 0.325 0.358

Ul 2 0.238 0.270 0.319 0.319 0.321 0.354

Ul 3 0.248 0.264 0.314 0.323 0.365 0.361

Absorban Rerata 0.244±0.005 0.266±0.003 0.319±0.005 0.322±0.003 0.337±0.024 0.358±0.004

Contoh perhitungan: Misal, suhu 25°C, pH 6, menit ke-5 Rerata Rerata

Ulan an .

Ulan an

.

Ulan an

.

Rerata = 0.289 ktivitas U m

sampel -

lanko

standar -

lanko

ktivitas U m

.

- .

.

- .

ktivitas U m

- .

ktivitas

- .

.

U

m

aktor pen enceran Waktu inku asi

Blanko 0.250 0.261 0.262 0.275 0.291 0.296

Standar 0.473 0.507 0.500 0.498 0.525 0.535

Aktivitas (U m ) 0.000 0.041 0.239 0.105 0.049 0.043

26

Lampiran 6 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas enzim metode Jackson Suhu 25°C, pH 6 Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.323 0.334 0.360 0.390 0.446 0.496 0.514 0.520 0.550 0.553

Panjang gelombang (nm) 462.0 471.0 478.0 494.0 513.0 533.0 544.0 550.0 567.0 575.0

0.6 Absorban

Puncak

0.5 0.4

0.3 0.2 400

450

500

550

600

550

600

550

600

λ (nm)

Puncak

Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.318 0.320 0.322 0.394 0.410 0.431 0.470 0.500 0.530 0.531


Absorban

Suhu 37°C, pH 6 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 400

450

500 λ (nm)

Puncak

Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.294 0.309 0.323 0.353 0.372 0.401 0.462 0.469 0.491 0.493


Absorban

Suhu 60°C, pH 6 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 400

450

500 λ (nm)

27

Lanjutan lampiran 6

Puncak

Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.308 0.324 0.369 0.374 0.386 0.399 0.419 0.419 0.433 0.460


Absorban

Suhu 25°C, pH 7.4 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 400

450

500

550

600

λ (nm)

Suhu 37°C, pH 7.4 Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.194 0.209 0.215 0.227 0.257 0.278 0.305 0.335 0.358 0.369


0.4 0.35

Absorban

Puncak

0.3 0.25 0.2

0.15 400

450

500

550

600

λ (nm)

Suhu 60°C, pH 7.4 Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.341 0.345 0.372 0.460 0.474 0.488 0.504 0.519 0.529 0.563


0.6

Absorban

Puncak

0.5 0.4 0.3 0.2 400

450

500 λ (nm)

550

600

28

Lanjutan lampiran 6

Puncak

Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.276 0.274 0.296 0.323 0.352 0.363 0.390 0.497 0.507 0.518


Absorban

Suhu 25°C, pH 8 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 400

450

500

550

600

λ (nm)

Puncak

Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.357 0.384 0.409 0.407 0.429 0.467 0.485 0.509 0.508 0.532


Absorban

Suhu 37°C, pH 8 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 400

450

500

550

600

550

600

λ (nm)

Suhu 60°C, pH 8 Absorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.276 0.290 0.306 0.331 0.418 0.472 0.491 0.500 0.542 0.557


0.6 Absorban

Puncak

0.5 0.4 0.3 0.2 400

450

500 λ (nm)

29

Lampiran 7 Contoh hasil pengukuran aktivitas enzim

Lampiran 8 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas fibrinolitik Puncak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorban 0.160 0.172 0.207 0.228 0.266 0.360 0.365 0.343 0.323 0.289


Absorban

0.4 0.3 0.2 0.1 0 400

420

440

460

480 λ (nm)

500

520

540

560

30

Absorban

Lampiran 9 Kurva standar pewarna karmoisin y = 0.0022x + 0.0207 R² = 0.9948

1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0

50

100

150

200

250

Konsentrasi pewarna (ppm)

Lampiran 10 Hasil pengukuran aktivitas fibrinolitik

S

S

Keterangan: B= blanko S= sampel

S

B

300

350

400

31

Lampiran 11 Pengukuran bobot molekul dengan PhotoCaptMW

Lampiran 12 Prosedur pembuatan reagen Bradford Reagen Bradford (Bradford 1976): 1. 50 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dilarutkan dalam 25 ml etanol 95%. 2. Ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% ( v). 3. Ditera menggunakan akuades hingga volum 0.5 liter ketika pewarna telah larut sempurna. 4. Larutan disaring menggunakan kertas Whatman no. 1 ketika akan digunakan. 5. Jika sampel tidak larut, tambahkan 1 M NaOH sebanyak 1x volume sampel. Jika sampel ditambahkan NaOH, standar juga harus diberi perlakuan yang sama.

32

Lampiran 13 Penentuan kurva standar protein metode Bradford Hari ke-1 Konsentrasi (mg/mL) 0.0000 0.0125 0.0250 0.0500 0.1000 0.2500 0.5000 0.7500 1.0000

Ulangan 1 0.000 0.108 0.133 0.202 0.315 0.386 0.812 0.965 0.944

1.2

Rerata 0.000 0.107 0.136 0.210 0.317 0.425 0.824 0.941 0.987

y = -1.0465x2 + 1.9578x + 0.0735 R² = 0.9852

1 Absorban

Absorban Ulangan 2 Ulangan 3 0.000 0.000 0.126 0.087 0.149 0.125 0.210 0.219 0.324 0.311 0.443 0.447 0.824 0.835 0.940 0.917 0.995 1.023

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Konsentrasi BSA (mg/mL)

Berdasarkan daerah linier kurva di atas, [BSA] yang dipilih setelah disesuaikan dengan [sampel] adalah antara 0.025-0.2 mg/mL.

Hari ke-2 Konsentrasi (mg/mL) 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200

Ulangan 1 0.152 0.204 0.225 0.242 0.255 0.280 0.326 0.349

Absorban Ulangan 2 Ulangan 3 0.148 0.207 0.225 0.241 0.256 0.285 0.318 0.349

0.157 0.200 0.223 0.238 0.261 0.283 0.325 0.333

Rerata 0.065 0.152 0.204 0.224 0.240 0.257 0.283 0.323 0.344

Terkoreksi 0.000 0.087 0.139 0.159 0.175 0.192 0.218 0.258 0.279

33

Lanjutan lampiran 13 0.35 y = 1.2118x + 0.0463 R² = 0.9314

0.3

Absorban

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0

0.05

0.1 0.15 Konsentrasi BSA (mg/mL)

0.2

0.25

Hari ke-3 Konsentrasi (mg/mL) 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200

Ulangan 1

Ulangan 2

0.132 0.164 0.205 0.222 0.255 0.280 0.326 0.349

0.128 0.177 0.205 0.221 0.256 0.275 0.318 0.349

Absorban Ulangan 3 0.137 0.160 0.193 0.218 0.241 0.273 0.325 0.333

Rerata 0.065 0.132 0.167 0.201 0.220 0.251 0.276 0.323 0.344

Terkoreksi 0.000 0.067 0.102 0.136 0.155 0.186 0.211 0.258 0.279

34

Lanjutan lampiran 13 0.3 y = 1.3029x + 0.0246 R² = 0.9815

Absorban

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250


Hari ke-4 Konsentrasi

Absorban

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200

Ulangan 1 0.000 0.039 0.102 0.153 0.201 0.240 0.272 0.309 0.342

Absorban Ulangan 2 Ulangan 3 0.000 0.000 0.033 0.045 0.088 0.104 0.154 0.156 0.199 0.182 0.230 0.242 0.273 0.261 0.313 0.311 0.348 0.352

0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.000

Rerata 0.000 0.039 0.098 0.154 0.194 0.237 0.269 0.311 0.347

y = 1.7647x + 0.0073 R² = 0.9938

0.050

0.100

0.150


0.200

0.250

35

Lampiran 14 Penentuan konsentrasi protein No . 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Absorban

Sampel Ekstrak kasar Presipitat Dialisat Dialisat kering beku

Ekstrak kolom 9 Ekstrak kolom 17 Ekstrak kolom 18 Ekstrak kolom 37 Ekstrak kolom 38

Ulangan 1

Ulangan 2

Ulangan 3

0.174 0.218 0.285 0.335 0.040 0.267 0.280 0.206 0.157

0.196 0.216 0.332 0.330 0.033 0.240 0.295 0.252 0.173

0.186 0.252 0.328 0.270 0.028 0.249 0.303 0.280 0.239

Rerata 0.185±0.011 0.229±0.020 0.315±0.026 0.312±0.036 0.034±0.006 0.252±0.014 0.293±0.012 0.246±0.037 0.190±0.043

Catatan: perhitungan konsentrasi protein menggunakan kurva standar hari ke-4

Contoh perhitungan: Rerata

Ulan an

kstrak kasar kstrak kasar

Ulan an .

Ulan an

.

.

. sor an . . . .

onsentrasi protein ekstrak kasar onsentrasi protein ekstrak kasar onsentrasi protein ekstrak kasar

.

onsentrasi protein ekstrak kasar

m

.

m m

.

m

Konsentrasi protein (mg/ mL)

1.009 1.259 1.746 1.729 0.015 0.139 0.162 0.135 0.104

Lampiran 1 Rancangan penelitian

Recommend Documents