Lampiran 1. Penyiapan media bakteri Aeromonas hydrophila a. Media TSA (Trypticase Soy Agar) Untuk membuat media TSA, dilarutkan 4 gram TSA dalam 100 ml akuades yang ditempatkan dalam erlenmeyer dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen. Kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 121 atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, lalu disimpan di dalam lemari es dengan menggunakan plastik steril. b. PBS (Phospat Buffer Saline) Untuk membuat 1 liter PBS diperlukan : - 8,0 gram NaCl - 0,2 gram KH2PO4 - 1,5 gram NaH2PO4 - 0,2 gram KCl Dilarutkan dalam 1 liter akuades yang ditempatkan dalam erlenmeyer, dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1 atm selama 15 menit. c. Media LB (Lauryl Broth) Untuk membuat 25 ml LB diperlukan : - Yeast ekstrak 0,125 gram - Triptone 0,250 gram - NaCl 0,750 gram Dilarutkan dalam 25 ml akuades yang ditempatkan dalam erlenmeyer, dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga homogen, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1 atm selama 15 menit.
Lampiran 2. Metode uji fasase 4 ekor ikan lele dumbo (Clarias sp) Masing-masing ikan diinjeksi bakteri A. hydrophila
Ikan yang mati dalam waktu 24 jam diisolasi Ikan dibedah
Ginjal ikan digores menggunakan ose Hasil goresan ditumbuhkan pada media TSA dan diinkubasi di inkubator
Koloni tunggal yang terbentuk ditumbuhkan pada media agar miring kemudian diinkubasi
Dilakukan uji biokimia pada bakteri yang tumbuh, yaitu uji oksidatif/fermentative, uji motilitas, uji oksidase, uji katalase, dan pewarnaan gram
Bila positif A. hydrophila maka bakteri ditumbuhkan kembali dalam TSA agar miring dan diinkubasi 18 – 24 jam
Bakteri siap digunakan dalam perlakuan
Lampiran 3. Karakterisasi sifat biokimia bakteri 1. Uji Oksidatif/Fermentatif Untuk mengetahui kemampuan memecah karbohidrat (glukosa) dalam suasana aerobik (oksidatif) atau anaerobik (fermentatif). Media O/F terdiri dari : Bacto trypton 2,00 gram K2HPO4 0,30 gram Natrium Chloride (NaCl) 5,00 gram Bacto agar 2,00 gram Bromtymol blue 0,08 gram Media disiapkan dengan melarutkan 9,4 gram bahan dalam 1 liter air, ditambah 10 gram glukosa, dipanaskan di penangas hingga larut sempurna. Didistribusikan ke tabung reaksi sebanyak 5 ml, disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm. Cara melakukan uji, koloni bakteri diambil dengan jarum ose, diinokulasikan vertikal pada 1 set O/F medium, salah satu tabung diberi paraffin cair 1 ml, diinkubasi selama 24 jam, sedangkan yang satu lagi tidak diberi paraffin. Kemudian diinkubasi 24 jam. Hasil pengujian, reaksi oksidatif bila pada tabung yang tidak diberi paraffin berubah menjadi kuning; sedangkan reaksi fermentatif bila tabung yang diberi paraffin berubah warna menjadi kuning atau kedua tabung berubah warna menjadi kuning. 2. Uji Motilitas Menggunakan media SIM (Sulfida Indol Motility) yang merupakan salah satu media semi solid yang digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yakni untuk mengetahui kemampuan membentuk indol (produk hasil degradasi protein), ikatan sulfida dan motilitas atau pergerakan bakteri. Media SIM terdiri dari : Trypton 20,0 gram Ferrous ammonium sulfat 0,2 gram Sodium thiosulfat 0,2 gram Pepton 6,1 gram Bacto agar 3,5 gram Penyiapan media, dilakukan dengan melarutkan 30 gram bahan dalam 1 liter, dipanaskan di penangas hingga larut sempurna, didistribusikan dalam kemasan tabung reaksi sebanyak 5 ml, disterilkan dengan autoklaf 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm. Cara melakukan uji, koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum inokulum, diinokulasikan secara vertikal, diinkubasi selama 24 jam. Hasil uji, motilitas bakteri diperlihatkan dengan adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan tidak hanya pada bekas pada tusukan, bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan. 3. Uji Oksidase Cara melakukan uji, p-aminodimethylaniline-oxalat 1% diteteskan pada kertas saring. Kemudian satu ose penuh biakan dari media padat diulaskan diatas
tetesan p-aminodimethylaniline-oxalat. Bila koloni berubah warna menjadi merah, berarti tes positif, dan bila berwarna ungu berarti tes negatif. 4. Uji Katalase Uji ini dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim katalase. Enzim tersebut merupakan katalisator dalam penguraian hydrogen-peroksida (H2O2) untuk menghasilkan oksigen dan air. Cara melakukan uji, sebagian koloni bakteri dari agar miring diambil dan diletakkan pada gelas objek, kemudian diberikan larutan hydrogen-peroksida pada koloni tersebut. Adanya gelembung-gelembung menunjukkan reaksi positif. Lampiran 4. Pewarnaan Gram 1
2
3
6
5
4
7
8
9
Keterangan : 1. Preparat olesan bakteri. 2. Larutan kristal violet diteteskan sebanyak 2 – 3 tetes pada olesan bakteri, dibiarkan selama 1 menit. 3. Pencucian menggunakan air mengalir dan pengeringan dengan kertas isap secara hati-hati. 4. Larutan kalium iodida diteteskan dan dibiarkan selama 1 menit. 5. Dicuci dengan air dan dikeringkan. 6. Larutan alkohol diteteskan dan dibiarkan selama 30 detik. 7. Dicuci dengan air dan dikeringkan. 8. Larutan safranin diteteskan dan didiamkan selama 30 detik. 9. Dicuci dengan air dan dikeringkan menggunakan kertas isap, kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
Lampiran 5. Hasil dan perhitungan Uji Lethal Dosis 50% Konsentrasi Bakteri
Ikan Mati
Ikan Hidup
Rasio kematian
108 107 106 105 104
4 4 3 3 1
0 0 1 1 3
4/4 4/4 3/4 3/4 1/4
Ikan Mati 15 11 7 4 1
∑ Akumulasi Ikan Rasio Hidup Kematian 0 15/15 0 11/11 1 7/8 2 4/6 5 1/6
% 100 100 88 67 17
Perhitungan : A − 50 A− B 67 − 50 = 67 − 17 17 = 50 = 0.34
Selang Proporsi =
Log negatif LD50 = Log negatif konsentrasi di atas 50% + Selang Proporsi = (-5) + 0.34 = -4.7 = 104.7 ≈ 105 cfu/ml LD50
Lampiran 6. Metode pembuatan bubuk daun pepaya (a) dan metode ekstrak daun
pepaya (b) (a)
(b)
Daun pepaya (Carica papaya L.) segar
Bubuk daun papaya ditimbang sebanyak 5 gram
Dicuci menggunakan air mengalir Dijemur dan ditutup kain putih selama 1 minggu
Pisahkan jari daun dan daun diblender hingga halus kemudian diayak
Bubuk halus menjadi stock bubuk daun pepaya
Dilarutkan dalam 100 ml akuades steril Ditempatkan di Erlenmeyer 200 ml yang ditutup alumunium foil Direbus pada suhu 50oC ± 30 menit Kemudian disaring menggunakan kain blacu dan kertas saring
Hasil saringan diencerkan menjadi 10, 20, 30, dan 40 mg/ml
Lampiran 7. Metode kertas cakram
1. Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri Aeromonas hydrophila diambil, diteteskan pada media TSA dan kemudian disebar merata menggunakan batang penyebar. 2. Pinset dibakar sebentar di atas nyala api, kertas saring diambil menggunakan pinset satu persatu. Kertas saring dicelupkan ke dalam larutan PBS di letakkan di atas permukaan media TSA yang telah disebari 1 biakan bakteri Aeromonas hydrophila. Kertas saring selanjutnya dicelupkan ke dalam larutan ekstrak daun pepaya dosis 10 mg/ml dan diletakkan pada cawan petri yang sama dengan jarak tetentu. Hal tersebut dilakukan hingga hingga dosis ekstrak daun pepaya 50 mg/ml. 3. Diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. 4. Diamati pertumbuhan yang terjadi dan diameter daerah bening yang timbul diukur.
50
40
20 30
10
PBS
Susunan kertas cakaram Lampiran 8. Gambar zona hambat yang terbentuk
Lampiran 9. Diameter rata-rata (mm) zona hambat pada uji in vitro
Ulangan 1 2 3 Rata-rata
10 8.0 8.0 7.5 7.83
20 9.5 8.0 8.0 8.5
Perlakuan Dosis (mg/ml) 30 40 50 7.5 8.0 7.0 7.0 8.0 7.0 7.5 8.5 7.0 7.33 8.17 7.00
PBS 0 0 0 0
Lampiran 10. Analisis statistik RAL (a) dan Uji lanjut Duncan (b) diameter rata-rata zona hambat yang terbentuk pada uji in vitro
a. Analisis statistik RAL diameter rata-rata zona hambat pada uji in vitro Oneway Anova Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
155.236
5
31.047
2.000
12
.167
157.236
17
F
Sig.
186.283
.000
b. Uji lanjut Duncan diameter rata-rata zona hambat pada uji in vitro Duncan Perlakuan
N
Subset alpha = 0.05 1
2
3
4
PBS
3
Dosis 50
3
7.0000
Dosis 30
3
7.3333
Dosis 10
3
Dosis 40
3
8.1667
Dosis 20
3
8.5000
Sig.
.0000 7.3333 7.8333
1.000
.337
.159
7.8333
.081
Lampiran 11. Persentase mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi
a. Mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi Mortalitas Harian Ikan Lele Dumbo (%) Pasca Infeksi Hari Kontrol Positif Pencegahan Pengobatan ke- Kontrol Negatif UI UII UIII UI UII UIII UI UII UIII UI UII UIII 1 0 0 0 20 20 40 0 0 0 20 0 20 2 0 0 0 20 20 40 0 0 0 20 20 20 3 0 0 0 20 20 40 0 20 0 20 20 20 4 0 0 0 20 20 40 0 20 0 20 20 20 5 0 0 0 20 20 60 0 20 0 20 20 20 6 0 0 0 20 20 60 0 20 0 20 20 20 7 0 0 0 20 20 60 0 20 0 20 20 20 b. Rata-rata mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi Rata-rata Mortalitas Harian Ikan Lele Dumbo (%) Pasca Infeksi Hari keKontrol Negatif Kontrol Positif Pencegahan Pengobatan 1 0 26.67 0 13.33 2 0 26.67 0 20 3 0 26.67 6.67 20 4 0 26.67 6.67 20 5 0 33.33 6.67 20 6 0 33.33 6.67 20 7 0 33.33 6.67 20
Lampiran 12. Analisis statistik RAL (a) dan Uji lanjut Duncan (b) akumulasi mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi
a. Analisis statistik RAL akumulasi mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi Oneway Anova Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1966.667
3
655.556
Within Groups
1333.333
8
166.667
Total
3300.000
11
F
Sig.
3.933
b. Uji lanjut Duncan akumulasi mortalitas harian ikan lele dumbo (%) pasca infeksi
.054
Duncan Perlakuan
N
Subset alpha = 0.05 1
Kontrol Negatif
3
.0000
Pencegahan
3
6.6667
Pengobatan
3
20.0000
Kontrol Positif
3
Sig.
2
20.0000 33.3333
.106
.242
Lampiran 13. Skor gejala klinis harian pasca infeksi
a. Kelainan klinis dan diameter kelainan klinis ikan lele dumbo kontrol positif setelah diinfeksi Aeromonas hydrophila Hari ke1 2 3 4 5 6 7
1 1 1.1 1.1 1.1 1.1 1 0.9
2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.45 0.4 0.4
3 1.4 1.4 1.4 1.3 1.2 1.1 1
4 0.7 0.6 0.6 0.6 0.55 0.5 0.5
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke5 6 7 8 9 10 11 0.9 0.8 0.7 0.6 0.9 1.1 1.4 0.9 0.8 0.7 1.4 0.7 1.4 1.4 0.9 0.8 0.7 1.4 0.7 1.4 1.4 0.9 0.8 0.6 1.4 0.7 1.4 1.4 0.9 0.8 0.6 1.4 0.6 1.3 1.4 0.9 0.8 0.5 1.3 0.5 1.2 1.4 0.9 0.8 0.5 1.2 0.5 1.1 1.4
12 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.6 0.5
13 1.5 1.5 1.5 1.5 1.4 1.3 1.2
14 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
15 2 2 1.8 3 3 3 3
b. Kelainan klinis dan diameter kelainan klinis ikan lele dumbo perlakuan pengobatan setelah diinfeksi Aeromonas hydrophila Hari ke1 2 3 4 5 6 7
1 1.3 1.3 1.2 1.1 0.95 0.9 0.85
2 0.9 1.3 1.2 1 0.9 0.8 0.7
3 1.2 1.3 1.2 1.2 1 1 0.9
4 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke5 6 7 8 9 10 11 1.1 1.3 1.5 0.8 0.2 1.8 1.3 1 1.2 1.5 0.7 0.2 2.6 1.6 0.8 1 1.3 0.6 SN 2.6 1.5 0.7 0.8 1.2 0.5 SN 2.6 1.4 0.6 0.65 1.1 0.4 SN 2.6 1.3 0.55 0.6 1 0.4 SN 2.6 1.1 0.4 0.5 0.9 0.3 SN 2.6 1
12 1.2 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8
13 0.9 0.9 0.6 0.5 0.35 0.3 0.3
c. Kelainan klinis dan diameter kelainan klinis ikan lele dumbo perlakuan pencegahan setelah diinfeksi Aeromonas hydrophila
14 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
15 1 1.1 1 0.8 0.7 0.6 0.5
Hari ke1 2 3 4 5 6 7
1 0.6 0.7 0.5 0.4 0.4 0.3 0.2
2 0.5 0.5 SN SN SN SN SN
3 0.4 0.4 0.2 0.15 0.1 0.1 SN
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke5 6 7 8 9 10 11 0.3 1 0.5 1.7 N 1.2 0.6 0.1 1 0.4 1.5 N 1.2 0.6 0.1 0.9 0.4 1.8 N 1.1 0.5 SN 0.7 0.3 1.8 N 1 0.45 SN 0.6 0.2 1.8 N 1 0.4 SN 0.6 0.2 1.8 N 0.9 0.4 SN 0.5 0.2 1.8 N 0.6 0.3
4 1 1 0.9 0.7 0.6 0.55 0.5
12 1.4 1.5 1.3 1.2 1.15 1.1 0.95
13 1 0.8 0.8 0.4 SN SN SN
14 0.5 0.5 0.3 0.2 0.2 0.1 SN
15 N 0.3 SN SN SN SN SN
Keterangan : SN
= Sembuh
N
= Normal
H
= Hemoragi
R
= Radang
T
= Tukak
M
= Mati
Diameter klinis dibagi menjadi 4 kelompok : - Bila diameter kelainan klinis berada diantara (0,1 – 0,7 cm) diberi angka 1 - Bila diameter kelainan klinis berada diantara (0,8 – 1,4 cm) diberi angka 2 - Bila diameter kelainan klinis berada diantara (1,5 – 2,1 cm) diberi angka 3 - Bila diameter kelainan klinis berada diantara (2,2 – 3 cm) diberi angka 4 Taging diberikan pada ikan lele dumbo tiap perlakuan dan ulangan untuk membedakan antara ikan 1,2,3,4, dan 5 d. Skor rata-rata diameter kelainan klinis ikan lele dumbo kontrol positif Perlakuan
Hari ke-
Kontrol Positif
1 2 3 4 5 6 7
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke1 2 4 6 6 6 6 6
2 2 3 3 3 3 3 3
3 4 6 6 6 6 6 6
4 2 3 3 3 3 3 3
5 8 8 8 8 8 8 8
6 8 8 8 8 8 8 8
7 1 2 2 3 3 3 3
8 1 4 6 6 6 6 6
9 2 2 3 3 3 3 3
10 2 4 6 6 6 6 6
11 8 8 8 8 8 8 8
12 1 1 2 3 3 3 3
13 6 9 9 9 6 6 6
14 8 8 8 8 8 8 8
15 3 6 9 12 16 16 16
Skor Ratarata 3.87 5.07 5.80 6.13 6.20 6.20 6.20
e. Skor rata-rata diameter kelainan klinis ikan lele dumbo perlakuan pengobatan Perlakuan
Hari
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke-
Skor
ke-
Pengobatan
1 2 3 4 5 6 7
1 2 4 6 6 6 6 6
2 4 6 6 6 6 6 3
3 4 6 6 6 6 6 6
4 8 8 8 8 8 8 8
5 4 6 6 3 3 3 3
6 4 6 6 6 3 3 3
7 6 9 6 6 6 6 6
8 2 3 3 3 3 3 3
9 1 1 0 0 0 0 0
10 6 16 16 16 16 16 16
11 2 6 9 6 6 6 6
12 2 4 6 6 6 6 6
13 4 6 3 3 3 3 3
14 8 8 8 8 8 8 8
15 4 6 6 6 3 3 3
Ratarata 4.07 6.33 6.33 5.93 5.53 5.53 5.33
f. Skor rata-rata diameter kelainan klinis ikan lele dumbo perlakuan pencegahan Perlakuan
Hari ke-
Pencegahan
1 2 3 4 5 6 7
Diameter kelainan klinis (cm) ikan ke1 1 2 3 3 3 3 3
2 1 1 0 0 0 0 0
3 1 2 3 3 3 3 0
4 2 4 6 3 3 3 3
5 1 2 3 0 0 0 0
6 4 6 6 3 3 3 3
7 2 3 3 3 3 3 3
8 3 6 12 12 12 12 12
9 0 0 0 0 0 0 0
10 4 6 6 6 6 6 3
11 2 3 3 3 3 3 3
12 4 9 6 6 6 6 6
13 2 2 2 1 0 0 0
14 1 2 3 3 3 3 0
15 0 1 0 0 0 0 0
Contoh perhitungan skor : Bila diameter kelainan klinis radang berada diantara (0,1 – 0,7 cm) diberi angka 1, maka nilai skornya 1 x 1 = 1, kemudian nilai skor dirata-ratakan, demikian seterusnya. Lampiran 14. Analisis statistik RAL (a) dan Uji lanjut Duncan (b) skor rata-rata gejala klinis harian pasca infeksi
a. Analisis statistik RAL skor rata-rata gejala klinis harian pasca infeksi Oneway Anova Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
64.507
3
21.502
7.979
8
.997
72.486
11
F 21.559
b. Uji lanjut Duncan skor rata-rata gejala klinis harian pasca infeksi
Sig. .000
Skor Ratarata 1.87 3.27 3.73 3.07 3.00 3.00 2.40
Duncan Perlakuan
N
Subset alpha = 0.05 1
2
3
Kontrol Negatif
3
Pencegahan
3
Pengobatan
3
5.5810
Kontrol Positif
3
5.6381
Sig.
.0000 2.9048
1.000
1.000
.946
Lampiran 15. Persentase pertambahan bobot rata-rata ikan lele dumbo selama perlakuan
a. Rata-rata bobot awal dan akhir (gram) ikan lele dumbo Bobot awal dalam Perlakuan Ulangan gram (ekor ikan hidup) 1 28.4 (5) Kontrol Negatif 2 23.8 (5) 3 26.5 (5) 1 34.4 (5) Kontrol Positif 2 26.6 (5) 3 24.5 (5) 1 34.5 (5) Pencegahan 2 29.4 (5) 3 26.7 (5) 1 25.1 (5) Pengobatan 2 34.3 (5) 3 34.2 (5) b. Pertambahan bobot (%) ikan lele dumbo tiap perlakuan Bobot Rata-rata Bobot Rata-rata Perlakuan Hari H-7 (g) Hari H+7 (g) Kontrol Negatif 5.25 10.09 Kontrol Positif 5.70 7.90 Pencegahan 6.04 9.37 Pengobatan 6.24 9.47
Bobot akhir dalam gram (ekor ikan hidup) 48.68 (5) 51.92 (5) 50.75 (5) 36.11 (4) 28.85 (4) 14.02 (2) 50.69 (5) 40.11 (4) 40.41 (5) 29.71 (4) 44.74 (4) 39.20 (4)
Pertambahan Bobot (%) 92.31 38.56 55.17 51.78
Lampiran 16. Analisis statistik RAL (a) dan Uji lanjut Duncan (b) persentase
pertambahan bobot rata-rata ikan lele dumbo a. Analisis statistik RAL persentase pertambahan bobot rata-rata ikan lele dumbo Oneway Anova Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
5305.037
3
1768.346
Within Groups
1700.012
8
212.502
Total
7005.049
11
F
Sig.
8.322
.008
b. Uji lanjut Duncan persentase pertambahan bobot rata-rata ikan lele dumbo Duncan Perlakuan
N
Subset alpha = 0.05 1
Kontrol Positif
3
36.6133
Pengobatan
3
51.4267
Pencegahan
3
56.2733
Kontrol Negatif
3
Sig.
2
93.6900 .152
1.000
