Lampiran 1. Pembuatan Ekstrak Daun Nangka
(a)
(b)
(d)
(c)
(e)
Keterangan : (a) Daun nangka segar dicuci kemudian dikeringkan (kering udara). (b) Daun nangka kering dihaluskan dengan cara diblender. (c) Daun nangka halus direndam dengan etanol selama 24 jam. Perendaman dilakukan 3 kali. (d) Supernatan diambil, kemudian dievaporasi dengan vakum rotavapour pada suhu ± 600C dengan kecepatan 120 rpm. (e) Ekstrak daun nangka siap pakai.
39
Lampiran 2. Uji Fitokimia Daun Nangka
No. 1.
Zat yang Diuji Alkaloid
Hasil Positif Terbentuk endapan putih
2.
Flavonoid
Terbentuk warna kuning kemerahan sampai merah
3.
Saponin
Terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 1 -10 cm, tidak hilang pada penambahan satu tetes HCl 2N
4.
Tanin
Terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman
Sumber : Bachtiar dkk 2010
40
Gambar
Lampiran 3. Pembuataan Konsentrasi Ektrak Daun Nangka
Pembuatan konsetrasi ektrak daun nangka untuk uji zona hambat :
0,1 ml larutan stok
0,1 ml larutan stok
0,1 ml larutan stok
0,9 ml akuades
0,9 ml akuades
0,9 ml akuades
0,1 ml larutan stok
9
100.000 ppm 10.000 ppm (0,1 g ektrak + 0,9 ml akuades)
1000 ppm
0,9 ml akuades
100 ppm
Pembuatan konsetrasi ektrak daun nangka untuk uji zona LC 50 : A = 600 ppm = 600 mg/L = 9 g/15 L B = 300 ppm = 300 mg/L = 4,5 g/15 L C = 100 ppm = 100 mg/L = 0,15 g/15 L D = 50 ppm = 50 mg/L = 0,75 g/15 L
Pembuatan konsentrasi ekstrak daun nangka untuk penelitian utama B = 20 ppm = 20 mg/L = 0,3 g/15 L C = 30 ppm = 30 mg/L = 0,45 g/15 L D = 40 ppm = 40 mg/L = 0,6 g/15 L E = 50 ppm = 50 mg/L = 0,75 g/15 L
41
10 ppm
Lampiran 4. Pembuatan Media Nutrien Agar (NA)
Bahan
NA (28 g/L) = 1,05 g
Aquades
= 37,5 ml
Cara Pembuatan Media NA:
Memasukan NA dan aquades kedalam labu Erlenmeyer
Memasukan magnetik stirer agar NA dan akuades homogen kemudian ditutup dengan alumunium foil.
Memanaskan larutan pada hotplates sampai mendidih.
Memasukan media kedalam autoclave pada suhu 1210C pada tekanan 1 atm selama 15 menit.
42
Lampiran 5. Pembuatan larutan bakteri kepadatan 108 cfu/mL dengan Spektrofotometer Langkah-langkah pembuatan larutan bakteri kepadatan 108 cfu/mL dengan menggunakan spektrofotometer adalah sebagai berikut : 1. Isolasi Aeromonas hydrophila dari media NA dari tabung reaksi. Penumbuhannya di cawan petri yang sudah berisi media NA. 2. Inkubasi dalam inkubator pada suhu 270C selama 24 jam. 3. Pemanenan bakteri secara aseptik kedalam Falcon Centrifuge Tube yang telah berisi larutan NaCl fisiologis. 4. Penghitungan kepadatan dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm dan absorban (OD) 0,235 5. Apabilah belum diperoleh nilai OD tersebut, penambahan larutan NaCl fisiologis atau stok bakteri harus dilakukan hingga diperoleh absorban 0,235. 6. Dari pengukuran dapat diasumsikan bahwa OD 0,235 setara dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL
43
Lampiran 6. Gambar Uji Zona Hambat
Hasil Uji Zona Hambat
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Keterangan : (a) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 100.000 ppm (b) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 10.000 ppm (c) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 1000 ppm (d) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 100 ppm (e) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 10 ppm (f) Zona bening pada konsentrasi 10.000 ppm 1000 ppm, 100 ppm (ampisilin/kontrol)
44
Lampiran 7. Uji LC50 Perendaman Ekstrak Daun Nangka a. Prosedur Rancangan percobaan untuk ekstrak herbal daun nangka pada benih ikan mas masing-masing 15 ekor menggunakan 4 perlakuan dengan 2 ulangan, lama waktu pemeliharaan selama 2 hari, dengan prosedur kerja:
Benih ikan mas direndam menggunakan ekstrak daun nangka dengan konsentrasi yang berbeda, diamati kematian ikan setiap jam untuk perhitungan menentukan LC50
b. Hasil Analisis Probit Analisis nilai toksisitas (LC50) dengan menggunakan Software Epa Probhit Analysis Version 1,5 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 LC50 daun nangka ProportionObserved Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc.
Exposed
50.0000 100.0000 300.0000 600.0000
30 30 30 30
Resp. Responding
Controls
Responding
0 20 28 30
0.0000 0.6667 0.9333 1.0000
0.0889 0.4857 0.9795 0.9996
0.0000 0.6667 0.9333 1.0000
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu = 2.008218 Sigma = 0.229437
=
10.058
=
5.991
Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits -------------------------------------------------------------------Intercept -3.752818 3.349210 (-18.164467,10.658831) Slope 4.358500 1.689636 (-2.912002, 11.629004) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
45
46
Lampiran 7. (lanjutan) LC50 daun nangka Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point LC/EC 1.00 LC/EC 5.00 LC/EC 10.00 LC/EC 15.00 LC/EC 50.00 LC/EC 85.00 LC/EC 90.00 LC/EC 95.00 LC/EC 99.00
Exposure Concentration 29.818 42.738 51.781 58.943 101.910 176.200 200.569 243.007 348.302
Analisis nilai toksisitas (LC50) dengan menggunakan Software Epa Probhit Analysis Version 1,5 untuk perendaman ekstrak daun nangka terhadap benih ikan mas adalah 101.910 ppm.
Lampiran 8. Tata Letak Perlakuan
E1
C1
Keterangan
A1
D2
A2
D1
A3
B2
D3
: A, B, C, D, dan E = Perlakuan 1, 2, 3
= Ulangan
47
E2
E3
B1
C2
B3
C3
Lampiran 9. Kelangsungan Hidup Benih Ikan Mas Setelah Pengobatan
Perlakuan
A
B
C
D
E
Ulangan 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
1 3 3 2 3 2 2 1 3 3 3 2 1 2 3 2
2 4 2 3 2 1 2 2 1 3 2 2 2 1 2 2
Jumlah Benih yang Mati Pada Pengamatan Hari ke3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 0 0 0 0 0 2 3 1 1 0 0 0 0 0 0 2 3 2 1 0 0 0 0 0 0 3 2 2 2 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
48
13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Total (Ekor) 14 13 14 9 5 5 5 6 7 6 5 3 5 8 7
Lampiran 10. Analisis Data Kelangsungan Hidup Benih Ikan Mas Data Hasil Pengamatan Selama Pemeliharaan Perlakuan
Jumlah ikan awal
Konsentrasi (ppm)
A B C D E
U1
0 20 30 40 50
U2
15 15 15 15 15
Jumlah ikan akhir
U3
15 15 15 15 15
U1
15 15 15 15 15
1 6 10 9 10
U2 2 5 9 10 7
U3 1 5 8 12 8
Jumlah
Jumlah Ikan Hidup
Selisih Mortalitas/ Perlakuan
4 16 27 31 25 103
41 29 18 14 20 122
Data Hasil Persentase Perlakuan
Kelangsungan Hidup (%)
Konsentrasi (ppm)
A B C D E
Total
0 20 30 40 50
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
6,67 40,00 66,67 60,00 66,67
13,33 33,33 60,00 66,67 46,67
6,67 33,33 53,33 80,00 53,33
Jumlah
26,67 106,67 180,00 206,67 166,67 686,67
Ratarata 8,89 35,56 60,00 68,89 55,56
Hasil Transformasi arcsin Perlakuan
Konsentrasi (ppm)
A B C D E
0 20 30 40 50
Kelangsungan Hidup (%) Ulangan 1 3,82 23,58 41,81 36,87 41,81
Ulangan 2 7,66 19,47 36,87 41,81 27,82
Jumlah
49
Ulangan 3 3,82 19,47 32,23 53,13 32,23
Total 15,31 62,52 110,91 131,81 101,86 422,41
Ratarata 5,10 20,84 36,97 43,94 33,95
50
Penghitungan Analisis Ragam 1. Faktor koreksi = = = 11895,28 2. Jumlah Kuadrat Total = ∑ = ((3,82)2 + (7,66)2 + (3,82)2 + ... + (32,23)2) − 11895,28 = 3144,25 ∑
− FK
3. Jumlah Kuadrat Perlakuan = =
(
)
11895,28
= 2835,96 4. Jumlah Kuadrat Galat = JK Total – JK Perlakuan = 3144,25 − 2835,96 = 308,29 Tabel Analisi Ragam SK Perlakuan Galat Total
DB 4 10 14
JK
2835,96 308,29 3144,25
KT 708,99 30,83
Fhit 23,00
F 0,05 3,48
Keterangan : *) Fhitung > Ftabel maka H0 ditolak, artinya dengan taraf 0,05 terdapat perbedaan pengaruh yang signifikan diantara perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak daun nangka dalam pengobatan penyakit Aeromonas hydrophila terhadap persentase kelangsungan hidup benih ikan mas.
51
Uji Jarak Berganda Duncan Sx = √
LSR = SSR 5% x Sx =√
= 3,21
SSR 5% = Tabel lampiran 10 (Gasperz 1995) dengan db Galat (error df) = 10 untuk taraf nyata 0,05
SSR 5% LSR
2 3,15 10,10
3 3,3 10,58
4 3,37 10,81
5 3,43 11,00
Tabel Perbandingan Antar Perlakuan Konsentrasi (ppm) A B E C D
0 20 50 30 40
Rata-rata Perlakuan 8,89 35,56 55,56 60,00 68,89
A 26,67 46,67 51,11 60,00
Hasil Perbandingan B E
20,00 24,44 33,33
4,44 33,33
C
28,89
LSR
10,10 10,58 10,81 11,00
Notasi a b c c d
Keterangan : *)Tiap rata-rata perlakuan yang diikuti huruf yang sama memberikan pengaruh tidak berbeda nyata menurut uji Duncan pada taraf kepercayaan 95 %.
52 Lampiran 11. Data Kualitas Air Selama Penelitian
Perlakuan Ulangan 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
A
B
C
D
E Optimal
Suhu (0C) 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 23-25*
Awal Pengamatan pH DO (mg/L) 7,28 4,6 7,51 4,6 7,50 4,5 7,27 4,2 7,14 4,1 7,26 4,8 7,42 4,3 7,41 4,8 7,40 4,6 7,32 4,5 7,28 4,4 7,10 4,7 7,32 4,5 7,17 4,6 7,16 4,7 6,5-8,5* 3,0-5,0*
Keterangan : * Tim Lentera (2002) ** Boyd (1982)
Amonia Suhu (mg/L) (0C) 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 0 24 < 1** 23-25*
Akhir pengamatan pH DO (mg/L) 7,56 4,7 7,74 4,5 7,72 4,3 7,7 4,5 7,64 4,4 7,55 4,8 7,65 4,8 7,72 4,7 7,7 4,4 7,59 4,3 7,63 4,7 7,74 4,5 7,67 4,1 7,71 4,7 7,58 4,3 6,5-8,5* 3,0-5,0*
Amonia (mg/L) 0,50 0,25 0,25 0,25 0,25 0,50 0,25 0,50 0,50 0,25 0,25 0,50 0,50 0,25 0,50 < 1**
