Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy a dalších

Laboratorní diagnostika g klíšťové encefalitidy a dalších flavivirových neuroinfekcí Hana Zelená Jan Raszka Jiří Januška Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě Centrum klinických laboratoří Vi l i ké oddělení Virologické dděl í NRL ČR pro arboviry

Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a p poddruhů,, 10 genoskupin g p • skupina savčích virů přenášených klíšťaty – v. klíšťové klíšť é encefalitidy f litid ((podtypy: dt evropský, ký sibiřský ibiř ký a dálněvýchodní) – v. Louping-ill – v. Omské O ké hemoragické h i ké h horečky čk

• skupina v. dengue – vv. dengue g 1-4

• skupina v. japonské encefalitidy – v. japonské encefalitidy – v. v West Nile – v. Usutu

• skupina v. žluté zimnice – v. žluté zimnice

Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a p poddruhů,, 10 genoskupin g p • skupina savčích virů přenášených klíšťaty – v. klíšťové klíšť é encefalitidy f litid (podtypy: ( dt evropský, ký sibiřský ibiř ký a dálněvýchodní) – v. Louping-ill – v. Omské O ké hemoragické h i ké h horečky čk




Čeleď Flaviviridae,, Rod Flavivirus ICTV taxonomie ~ 80 druhů a p poddruhů,, 10 genoskupin g p • skupina savčích virů přenášených klíšťaty – v. klíšťové klíšť é encefalitidy f litid (podtypy: ( dt evropský, ký sibiřský ibiř ký a dálněvýchodní) – v. Louping-ill – v. Omské O ké hemoragické h i ké h horečky čk




Laboratorní vyšetřovací metody • Přímá diagnostika – průkaz ůk viru i nebo b jeho j h části

• Nepřímá diagnostika – průkaz ůk protilátek tilát k

– pozitivní v časné fázi infekce f ((během ě virémie) é ) – u flavivirových neuroinfekcí omezený význam – – – –

kultivace virů (izolační pokus) elektronová mikroskopie průkaz antigenu molekulárně genetické metody (PCR)

– – – – –

komplementfixační p reakce ((KFR)) virusneutralizační test (VNT) ELISA nepřímá imunofluorescence (NIF) imunoblot

– – – – –

celkové Ig IgG IgM avidita IgG intrathekální protilátky

Kultivace virů (izolační pokus) • neselektivní metoda

• trvání pokusu 1-2 týdny (alespoň 2 pasáže) • nezbytný b t ý správný á ý odběr dbě a rychlý hlý ttransportt vzorku k d do llaboratoře b t ř

• buněčné kultury

• pokus na zvířeti

• •

•

buněčné linie CV-1, PS cytopatický efekt (CPE)

• •

buňky CV-1 - částečný CPE

buňky CV-1 - totální CPE

intracerebrální inokulace sajících myší pro arboviry nejcitlivější onemocnění a úhyn zvířat

Průkaz antigenu • KFR nebo b VNT pro identifikaci id tifik i iizolovaného l éh viru i • komerční kity pro detekci cirkulujících antigenů v krvi – vv. dengue: NS-1 antigen – metoda ELISA

Molekulárně genetické metody • rychlá diagnostika • vysoká citlivost • pro flaviviry většinou „home home made“ • druhově nebo rodově specifické Metody: • RT-PCR v reálném čase • nested-PCR t d PCR • sekvenace

Komplementfixační reakce (KFR) • • • • • • •

pro průkaz akutní infekce nutné vyšetření párových sér zkřížené reakce s jinými flaviviry, možnost záchytu infekce jiným flavivirem princip: vyvazování komplementu z reakční směsi specifickými k komplexy l A Ag-Ab Ab → zábrana áb hemolýzy h lý senzibilizovaných ibili ý h ovčích čí h erytrocytů kvantifikace stanovením KF titru KF titr: tit převrácená ř á áh hodnota d t nejvyššího j ššíh řředění dě í séra é (likvoru), (lik ) kt která á za přítomnosti antigenu ještě váže komplement komplement nejlépe vážou protilátky IgM, proto nejvyšší KF titry jsou v akutní fázi infekce interpretace výsledků: – negativita: – séropozitivita: – akutní infekce:

KF titr = 0 KF titr ≥ 4 sérokonverze nebo minim. 4-násobný vzestup titru v párových sérech KF titr ≥ 128 v jjediném vzorku – vysoce y suspektní

kontrolní antigen

ředění séra

4

č. vzorku u

KFR 4

8

4

pozitivní antigen

8

16 32 64 128

Virusneutralizační test • • • • • •

nejspecifičtější sérologická metoda pro průkaz ůk akutní k t í infekce i f k nutné t é vyšetření š tř í párových á ý h vzorků ků sér é princip: specifické protilátky neutralizují infekčnosti viru → ochrana buněk před cytopatickým efektem viru použití žití vitálního itál íh barviva b i (neutrální ( t ál í červeň) č ň) – zabarví b í se pouze živé ži é nepoškozené buňky → možnost makroskopického odečtení výsledku výsledky: VN titr = převrácená hodnota nejvyššího ředění séra, séra které je ještě schopno neutralizovat cytopatický efekt viru u více než 50% buněk interpretace výsledků: – negativita: – séropozitivita: – akutní infekce:

VN titr = 0 VN titr ≥ 4 sérokonverze nebo minim. 4-násobný 4 násobný vzestup titru v párových sérech KF titr ≥ 128 v jediném vzorku – vysoce suspektní

Virusneutralizační test (VNT) ( )

Využití VNT • zlatý standard v sérologické diagnostice flavivirů • konfirmační vyšetření – – – –

např. atypická protilátková odpověď subklinický nebo netypický průběh infekce nespecifické a zkřížené reakce přítomnost protilátek proti jiným flavivirům (jap. enc., žl. zimnice, dengue, West Nile)

• stanovení úrovně ochrany po očkování • diagnostika „selhání očkování“ – dynamika v párových sérech é h • Nevýhody: – trvání 5-7 dní – nerozliší třídy protilátek – práce s živým virem a s buněčnými kulturami – vyhrazeno pro specializované laboratoře

ELISA • využívá vazby antigenu s protilátkou vázané na pevné fázi, enzymem značená protilátka (konjugát), vznik barevných produktů • rychlá, rychlá jednoduchá metoda metoda, komerčně dostupné kity • rozliší třídy protilátek • různé varianty uspořádání reakce – nepřímá metoda (sandwich) – IgM, IgG, avidita IgG – capture IgM – vyšší citlivost i specificita – kompetitivní ELISA – pro průkaz celkových specifických Ig, lze detekovat protilátky u různých živočišných druhů

• semikvantitativní stanovení v relativních číslech (index pozitivity = IP) - porovnáním hodnoty absorbance vzorku s referenční hodnotou

Avidita IgG g protilátek p • Avidita vyjadřuje pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou úroveň rezistence vazby Ag protilátkou, Ag-Ab Ab vůči denaturujícím látkám. – Na začátku imunitní odpovědi (primární infekce, očkování) → nejprve j produkce d k IIgG G protilátek tilát k s nízkou í k aviditou. idit – S vyzráváním imunitní odpovědi → postupné zvyšování podílu protilátek s vysokou aviditou. – Při reinfekci nebo reaktivaci → paměťové B-buňky → ihned tvorba protilátek s vysokou aviditou.

• Vyšetření avidity IgG = stanovení pevnosti vazby AgAb po přidání denaturačního činidla (urey) do reakční směsi. ě i – Protilátky s nízkou aviditou jsou působením urey z vazby y a odstraněnyy promytím. p y uvolněny – Protilátky s vysokou aviditou urea neuvolní.

Vyšetření avidity IgG metodou ELISA • Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách – v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. • Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v % %.

Ag Ag Ag Ag

Ag Ag Ag Ag

Vyšetření avidity IgG metodou ELISA • Séra pacientů se testují paralelně ve 2 jamkách – v 1 z nich se nechá působit urea, 2. jamka ponechána bez urey. • Na konci testu porovnáme naměřenou optickou denzitu v jamce s ureou a bez urey, podíl vyjadřujeme v % %. IgG

Ag Ag Ag Ag

IgG

Ag Ag Ag Ag


IgG

U

Ag Ag Ag Ag

U

U

U

Ag Ag Ag Ag


Ag Ag Ag Ag

Ag Ag Ag Ag

ELISA – avidita IgG

ELISA – avidita IgG

IgG s vysokou aviditou

IgG s nízkou aviditou

Nepřímá imunofluorescence • IgG, I G IgM, I M IgA I A • rychlá metoda, komerční soupravy • princip: – antigen = buňky infikované virem na sklíčku → vazba specifických p ý p protilátek ve vzorku → sekundární protilátka značená fluorescenčním barvivem → odečet ve fluorescenčním mikroskopu

• nevýhody: ýh d – nespecifcké a zkřížené reakce – subjektivita j – nehodí se pro vyšetření velkého množství vzorků

Nepřímá p imunofluorescence Toscana IgG 1:40

Toscana IgM 1:80

Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy f litid • dvoufázový průběh • 1. fáze (febrilie): PCR, izolace viru z krve • 2. fáze (neurologická): průkaz protilátek (PCR negativní v krvi k i i v lik likvoru)) • IgM i IgG v séru zpravidla hned v úvodu neurologickié fáze • Je-li v 1. vzorku pozit. jen IgM (a IgG je negativní), nutno vyšetřit y 2. vzorek s odstupem p cca 1 týdne. ý • nízká avidita IgG (<40%) při akutním onemocnění • IgM mohou přetrvávat i několik měsíců (až rok), IgG celoživotně → význam avidity IgG pro stanovení recentní infekce.

Dynamika diagnostických markerů u klíšťové encefalitidy y



Vyšetření likvoru u klíšťové encefalitidy Přímý průkaz (PCR, (PCR izolace viru): • Téměř vždy negativní, ale v případě úmrtí bývá pozit. záchyt v mozku. Sérologie: Sé l i • Likvor obsahuje cca 500x méně protilátek než sérum → nižší % pozitivity, záleží na citlivosti metody. – – – –

•

nepřímé ří é metody t d IgG, I G IgM I M – likvor lik cca v 50 50-70% 70% pozitivní, iti í později ději než ž v séru é capture IgM – likvor téměř ve 100% pozitivní KFR zpravidla negativní VNT bývá slabě pozitivní nebo negativní

Intrathekální produkce protilátek – porovnání hladiny protilátek v séru a v likvoru, výpočet dle Reibera – v průběhu klíšťové encefalitidy dochází k intrathekální produkci protilátek – velký význam u případů KE u očkovaných

Diagnostika klíšťové encefalitidy u očkovaných • vždy žd vyšetření š tř í párových á ý h vzorků ků s odstupem d t minimálně i i ál ě 1 týdne, případně 3. vzorek za další týden • vždy konfirmace metodou VNT • průkaz akutní infekce u očkovaných: minimálně 4násobnýý vzestup p titru ve VNT (p (případně p KFR)) • IgM je pozitivní nebo negativní, nebo IgM se objeví později (za 7-10 dní) • avidita idi IgG I G je j u očkovaných čk ý h vysoká ká i při ři vysokých ký h hodnotách IgM • vyšetření pouze ELISA testy je nedostatečné – kvantifikace je nespolehlivá, a to i u tzv. kvantitativních ELISA souprav • stanovení intrathekální produkce protilátek

Selhání očkování – 1. kazuistika anti/TBEV IgM (IP) (IP)* souprava A

anti/TBEV IgM (IP)* souprava B

anti/TBEV IgM capture (IP)* souprava C

anti/TBEV IgG (AU/ml)** souprava A

anti/TBEV IgG (RU/ml)** souprava B

anti/TBEV total Ig (IP) (IP)* souprava C

anti/TBEV KFR anti/TBEV VNT

26.8. 1 65 1,65 2,08 3,50 173 125 3 63 3,63 16 128

31.8. 4 28 4,28 7,68 13,65 160 166 4 32 4,32 ≥128 ≥1024

31.10. 1 15 1,15 6,78 13,63 205 229 4 56 4,56 ≥128 1024

* IP = index i d pozitivity iti it (semikvantitativní ( ik tit ti í výsledky) ý l dk ) ** Arbitrární jednotky – „kvantitativní“ výsledky

pozitivní hodnoty

>1,1 >1 1 ≥1,1 >1,5 > 22 ≥ 20 >1,5 15 ≥4 ≥4

Selhání očkování – 2. kazuistika anti/TBEV IgM (IP) (IP)* souprava A

anti/TBEV IgM capture (IP)* souprava C

anti/TBEV IgG (AU/ml)** souprava A

anti/TBEV total Ig (IP)* souprava C

anti/TBEV KFR anti/TBEV VNT

29.6. neg neg. neg. 62 5,48 16 16

7.7. 1 30 1,30 3,03 110 7,09 64 32

30.7. 2 80 2,80 7,80 98 8,57 ≥128 128

* IP = index pozitivity (semikvantitativní výsledky) ** Arbitrární jednotky – „kvantitativní“ výsledky

pozitivní hodnoty

>1,1 >1 1 >1,5 > 22 >1,5 1,5 ≥4 ≥4

Diagnostika sibiřského a dálněvýchodního typu VKE • stejné diagnostické metody jako u evropského typu • možné rozlišení pouze na základě VNT provedeného paralelně s různými subtypy virů – porovnání VN titrů prakticky a t c y rozlišení o še na a základě á adě anamnestických a a est c ýc • p údajů

West Nile virus • • • •

Čeleď: Flaviviridae, Flaviviridae skupina virů japonské encefalitidy Rezervoár: ptáci Vektor: komár rodu Culex Výskyt: – do r. 1998 – Evropa, Asie, Afrika – 1999 virus zavlečen do USA -1500-12000 případů ročně – typ 1 – do r. 2008: Izrael, Rusko, Rumunsko, Francie, Itálie, Španělsko, Portugalsko sev. Portugalsko, sev Afrika – typ 1 – 2009 – Maďarsko, Rakousko – typ 2 – 2010 – Řecko – typ 2 – ČR: 1997 a 1999 izolace typu yp 3 „Rabensburg“ g na J. Moravě – 1997 – 5 suspektních případů na J.Moravě – ČR import: 2002 – 1 z USA, 2007 pravděp. z Kypru

• •

Inkubační doba: 2-14 2 14 dní Klinika: – bezpříznakový průběh (~80%) – západonilská horečka (~20%) ( 20%) – infekce CNS (<1%) • smrtnost ~10%

Laboratorní parametry infekce WNV

West Nile v. laboratorní diagnostika • přímý ří ý průkaz ůk (PCR (PCR, iizolace) l ) – málo výtěžné, virémie končí s nástupem klinických příznaků – záchyt viru v likvoru velmi průkazný, avšak málokdy úspěšný

• sérologie – průkaz specifických protilátek – průkaz IgM, IgG v krvi a v likvoru (komerční sety ELISA, NIF) – nízká specificita – časté zkřížené reakce s jinými flaviviry, u nás zejména s VKE (až 75% v IgG a 12% v IgM) – vždy nutná konfirmace VNT! – minimálně 4-násobný vzestup nebo sérokonverze v párových sérech pro průkaz akutní infekce

Japonská encefalitida • • • •

Čeleď: Č l ď Flaviviridae, Fl i i id skupina k i virů i ů jjaponské ké encefalitidy f litid Rezervoár: koně, prasata Vektor: komár rodu Culex Výskyt: JV Asie – 50 000 prokázaných případů ročně – 10 000 úmrtí ročně

• Inkubační doba: 5-15 dní • Klinika: – bezpříznakový nebo subklinický průběh ~ 99% – meningoencefalitida < 1% • smrtnost 30%, trvalé následky 50%

Japonská encefalitida

Japonská encefalitida laboratorní diagnostika • Pří Přímý ý průkaz ůk (PCR, (PCR průkaz ůk antigenu) ti ) z kkrve nebo b likvoru: – jen v prvních dnech infekce – izolace viru se běžně neprovádí – vysoce rizikové agens! (nutná laboratoř BSL4)

• Sérologie: – – – – – –

IgM a IgG komerční soupravy p y NIF KFR časté zkřížené reakce s jinými flaviviry konfirmace VNT vždy nutno vyšetřit paralelně i na jiné běžnější flaviviry – klíšťovou encefalitidu, dengue

Virus Usutu • Čeleď: Flaviviridae, skupina virů japonské encefalitidy • 1959: izolace z komárů v J. J Africe ve Svazisjku; známý výskyt jen v subsaharské Africe • 2001: masivní úhyn ptáků v Rakousku v okolí Vídně (kos, puštík, vlaštovka) – izolován virus Usutu • 2003: detekce protilátek proti u migrujících ptáků ve Velké Británii • 2005-2006: izolace viru Usutu z uhynulých kosů v Maďarsku aďa s u v regionu eg o u Budapešti udapeš – testováno 332 ptáků, z toho 33 kosů, z nich 9 pozitivních na virus Usutu

• 2006: izolace viru Usutu ve Španělsku z komárů Culex pipiens • 2009: 2 případy fatální neuroinfekce u imunosuprimovaných osob v Itálii

Úskalí v diagnostice g flavivirových ý infekcí • • • •

Vzácné infekce → absence komerčních souprav. V Vysoce riziková i ik á agens → vyhrazeno h pouze pro laboratoře l b t ř BSL-3 BSL 3 a 4 4. Krátká doba virémie u flavivirových neuroinfekcí, pozdní odběr vzorku → přímá diagnostika málokdy úspěšná. Sé l i – velmi Sérologie l i časté č té zkřížené kříž é a nespecifické ifi ké reakce, k i t interpretace t obtížná, někdy nemožná (pacient je pozitivní na všechny flaviviry): – zásadní je detailní anamnéza (cestování, očkování, prodělané nemoce) – paralelní vyšetření na různé flaviviry – konfirmace VNT

•

Obezřetnost v interpretaci výsledků sérologie flavivirů, zejména: – u očkovaných – u osob po prodělané flavivirové infekci – u osob opakovaně cestujících do rizikových oblastí

Přehled vyšeteřní dostupných v NRL ČR pro arboviry (ZÚ Ostrava)

V indikovaných případech lze zajistit diagnostiku dalších arbovirů v zahraničí.

Děkuji Vám za pozornost...

Laboratorní diagnostika klíšťové encefalitidy a dalších

Recommend Documents