Laboratorní cvičení č. 6 Transformace rostlinného materiálu pomocí mikroprojektilového přenosu DNA a následná vizualizace chimerního proteinu Teoretický úvod Metody transgenoze umožňují vnesení jednoho nebo skupiny dvou až tří genů do rostlinného genomu a následné sledování funkčních změn vyvolaných jednotlivými proteiny v hostitelské rostlině či buňce. Do rostliny je nejprve transformován gen pro studovaný protein v patřičném binárním vektoru pod vhodným promotorem [1]. Uvnitř rostlinných buněk dojde k inkorporaci vnesené DNA do vlastního genomu a k následné expresi rekombinantních proteinů. Během výzkumu transgenoze rostlin bylo vyvinuto několik typů transformačních metod, více či méně úspěšných. Těmito metodami lze navodit buď transientní (dočasnou) nebo stabilní expresi transgenu. Agrobacterium je jedním z nejpoužívanějších systémů umožňující transgenozi vnímavých rostlin. Jedná se o přirozeně patogenní bakterii většiny dvouděložných rostlin. Jednoděložné rostliny nepatří k typickým přirozeným hostitelům této bakterie a transformace je proto z těchto důvodů obtížná. Jednou ze základních metod transformace rostlin Agrobacteriem je metoda „floral-dip“; kdy je rostlina transformována infekcí květů pomocí Agrobacterium thumefaciens. Další metodou transformace na principu infekce je transformace pomocí bakterií Agrobacterium rhizogenes. Tato bakterie indukuje v infikovaném pletivu růst transgenních kořínků tzv. „hairy-roots“. Nevýhodou obou transformačních metod je zdlouhavá a náročná doba přípravy rostlinného materiálu určeného k transformaci (řádově měsíce) a rozdílná vnímavost jednotlivých druhů rostlin k agrobakteriální infekci. U metody transformace květů bakterií A. thumefaciens jsou v první generaci selektováni heterozygoti s transgenem inkorporovaným na různých místech v genomu hostitelské rostliny, přičemž transgenní rostlina s aktivní formou vneseného transgenu musí být mezi ostatními transformanty nejprve selektována [2]. Není-li účelem transformace získání stabilní transgenní rostlinné linie, pak je žádoucí rychlejší metoda přípravy transgenního rostlinného materiálu. Rychlou a efektivní metodu transformace rostlin představuje metoda transformace pomocí mikroprojektilového přenosu DNA (particle bombardment), kdy je DNA vstřelována do rostlinného pletiva na nosičích v podobě mikročástiček zlata nebo wolframu za přetlaku helia [3]. Neocenitelnou výhodou této metody je možnost transformace téměř libovolného rostlinného materiálu [4]. Proto se transformace mikroprojektilovým přenosem DNA používá u rostlinných druhů, které je obtížné nebo nemožné transformovat jiným způsobem. K takovým rostlinným druhům patří pšenice, kukuřice, ječmen, rýže a jiné jednoděložné rostliny. První expresi rekombinantního proteinu v transgenním pletivu je možné pozorovat v řádu několika dnů. Nevýhodou této metody je poměrně nízká efektivita a dále také fakt, že mohou vznikat buňky s inzercí více kopií transgenu, přičemž může docházet k umlčení transgenu nebo případně k jinému ovlivňování aktivity exprimovaného transgenu [5]. Detekce takovýchto multi-inzercí je pak náročná. Pro studium subcelulární lokalizace chimerních proteinů v transgenním pletivu je však tato metoda pro svou rychlost a jednoduchost úspěšně využívaná u většiny druhů rostlin [6]. 1
Vizualizace rekombinantních proteinů na úrovni buňky umožňuje například značení protilátkou. Nevýhodou tohoto způsobu je však náročnost přípravy protilátky a případná nespecifita u podobných genů [7]. Další možností značení proteinů je fúze transgenu s reportérovým genem, např. pro β-glukuronidasu (GUS), případně pro zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty, nebo s genem pro červený fluorescenční protein (DsRed) apod. Transgen sfúzovaný s reportérovým genem je inkorporován do binárního vektoru pod patřičným promotorem a transformován do rostlinného pletiva. Následuje selekce a screening transgenních pletiv pod fluorescenčním nebo konfokálním mikroskopem. Je-li žádoucí pozorovat rekombinantní protein na úrovni buněčných kompartmentů, pak je konfokální mikroskopie fúzních proteinů s fluorescenčním reportérem vhodným řešením. V tomto cvičení se seznámíte s metodou transformace rostlinného pletiva mikroprojektilovým přenosem DNA. Tato metoda vyžaduje sterilní přípravu rostlinného materiálu, veškerá práce tedy probíhá ve sterilním prostředí laminárního boxu určeném pro manipulaci s rostlinami. Jako rostlinné pletivo pro transformaci poslouží kořeny kukuřice, do kterých bude vnášen reportérový gen pro β-glukuronidasu (GUS) v binárním vektoru pAHC25. Úspěšnost transformace bude ověřena na základě histochemické reakce, pozorování aktivity exprimované β-glukuronidasy, která po reakci se substrátem poskytuje snadno detekovatelné modré zbarvení. Jelikož gen pro β-glukuronidasu bude exprimován do cytosolu jednotlivých buněk, budou tyto modře zbarvené buňky pozorovány pod mikroskopem pod patřičným zvětšením.
Materiál a chemikálie •
MS-médium tuhé (0,43% Murrashige and Skoogh Basal Salt Mix, 1% sacharosa, 1 mM MES, 0,4 % agar na rostliny, pH 6,1)
•
Petriho misky
•
Sterilní voda
•
70% sterilní ethanol
•
7% Sodium hypochlorid
•
Míchačka s elektromagnetickým míchadlem
•
Osmotické MS-médium s manitolem (58,3 g·l-1 manitolu, 1% agar na rostliny)
•
Semena kukuřice Zea mays, cv. Cellux 225
•
Sterilní pinzety, nůžky a skalpely
•
Sterilní zkumavky 25 ml
•
Laminární box (flowbox)
•
Kultivační box pro pěstování explantátů (klimakomora)
•
Sterilní Erlenmayerova baňka 500 ml, 100 ml, 1000 ml kádinka
•
LB-médium s ampicilinem tekuté (1% pepton, 0,5% kvasnicový extrakt, 1% NaCl, 100 mg·l-1 ampicilin) a tuhé (1,5% agar)
•
Inkubovaná třepačka 37°C, laboratorní chlazená mikrocentrifuga
•
Kultura E. coli nesoucí plasmid pAHC25
•
Plasmid Mini Kit pro isolaci plasmidové DNA 2
•
Restrikční endonukleasy EcoRI, XbaI, KpnI s pufry
•
Termoblok
•
TE pufr (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)
•
1% agarosa v 1x TAE pufru (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0)
•
Nanášecí pufr (50% glycerol, 50 mM EDTA, 0,125% bromfenolová modř, 0,125% xylenová violeť, pH 8,0)
•
10% ethidium bromid
•
GeneRuler 1 kb DNA marker
•
Elektroforéza, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj
•
AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů
•
UV-spektrofotometr, křemenná kyveta
•
Mikrozkumavky 1,5 ml
•
Mikropipety a špičky
•
Zařízení pro mikroprojektilový přenos DNA Biolistic BioRad PDS – 1000/He
•
Materiál pro mikroprojektilový přenos DNA: Rupture Disks 1100 PSI, Macrocarriers, Thungsten M 17 Microcarriers, Stopping Screens
•
96% ethanol, isopropanol
•
Roztoky pro přípravu microcarrierů a směsi microcarrierů s DNA: 2,5 M CaCl2, 0,1 M spermidin, absolutní ethanol
•
Roztok pro barvení na GUS (0,1 M fosfátový pufr pH 7,2 s 10 mM EDTA, 0,5 mM K3Fe(CN)6, 0,5 mM K4Fe(CN)6, 0,1% Triton), substrát pro β-glukuronidasu (1 mM XGlcA – 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glukuronid, 100 mg rozpustit v 0,5 ml dimethylformamidu)
•
Petriho misky malé
•
Parafilm
•
70% ethanol pro promytí explantátů
•
Mikroskop Nikon SMZ 700
•
Materiál pro přípravu mikroskopických preparátů: podložní a krycí sklíčka, skalpel, kapátko, voda
•
PC vybavené softwarem pro zpracování digitálního obrazu pořízeného kamerou mikroskopu
3
Experimentální postupy Veškerá manipulace s rostlinným materiálem probíhá po celou dobu ve sterilním prostředí laminárního boxu. Je třeba pracovat v rukavicích, používat desinfekce k udržování čistoty práce a prostředí a vyvarovat se případným kontaminacím. 1. DEN (provede vedoucí cvičení) a) Sterilizace semen kukuřice Semena kukuřice Zea mays cv. Cellux 225 nejprve promyjeme v 1000 ml kádince dostatečným množstvím vody tak, aby bylo odstraněno veškeré mořidlo. Poté k semenům přilijeme 500 ml 70% ethanolu a na míchačce promícháváme 10 min. Následuje samotná sterilizace semen chlornanem (7% sodium hypochlorid) 30 min za stálého míchání. Slijeme chlornan, 2x promyjeme sterilní vodou, přesypeme semena do 500 ml Erlenmayerovy baňky a ve flowboxu ještě 3x promyjeme sterilní vodou, každé promystí po dobu 3 min. Přebytečnou vodu slijeme a semena ponecháme bobtnat do dalšího dne. b) Napěstování bakteriální kultury nesoucí plasmid Do sterilní 100 ml baňky odměříme 20 ml LB media s ampicilinem a inokulujeme 5 µl zásobní kultury bakterií E. coli nesoucí plasmid pAHC25. Kulturu necháme inkubovat přes noc při 37°C na třepačce. 2. DEN (provede vedoucí cvičení) c) Vysazení sterilizovaných semen kukuřice do zkumavek s MS-médiem Pracujeme ve flowboxu. Do 25 ml sterilních zkumavek s tuhým MS-médiem opatrně pinzetou přenášíme jednotlivá zrna kukuřice, do každé zkumavky vysadíme dvě zrna. Takto připravené zkumavky necháme kultivovat v klimakomoře (den - 16 h plné osvětlení, 28°C, noc – 8 h tma, 24°C) po dobu 14 dní. d) Mikroizolace plasmidové DNA Postupujeme dle návodu laboratorního cvičení č.1 (2.den). Změříme koncentraci vyizolované DNA a koncentraci upravíme na 1 µg·ml-1. Plasmidovou DNA zamrazíme na 20°C. 16. DEN e) Příprava explantátů pro transformaci Ve flowboxu otevřeme zkumavky s narostenými semenáčky kukuřice, rostlinky opatrně vyjmeme sterilní pinzetou a serilním skalpelem z nich odřízneme kořínky, které pokládáme na připravené Petriho misky s osmotickým MS-médiem. Na jednu misku skládáme dle velikosti 5 - 10 kořínků těsně vedle sebe, na střed misky. Pro jednu transformaci připravíme vždy dvě misky. f) Příprava přístroje firmy BioRad PDS-1000/He pro transformaci Před samotnou transformací je třeba vysterilizovat ve flowboxu všechy potřebné součásti přístroje (nosiče, šroubení) v 96% ethanolu po dobu 30 min. Obě desky vyjmeme z přístroje, řádně navlhčíme 96% ethanolem a vše necháme volně na sterilních Petriho miskách 4
oschnout. Přístroj včetně dvířek několikrát vystříkame 96% ethanolem a necháme vyschnout při otevřených dvířkách. Podle počtu střel si připravíme Macrocarriers, Stopping Screens a podle požadovaného tlaku Rupture Disks (1100 psi). Vše samostatně vysterilizujeme – Macrocarriers a Stopping Screens v 96% ethanolu po dobu 15 min. Rupture Disky v isopropanolu po dobu 5 min. Vše necháme volně vyschnout na sterilních Petriho miskách ve flowboxu. g) Příprava zlatých částic pro mikroprojektilový přenos DNA (provede vedoucí cvičení) Do mikrozkumavky navážíme 60 mg 1,0 µm částic zlata, nebo wolframu (Bio-Rad) a přidáme 1 ml 100% čistého ethanolu, vortexujeme 1 - 2 min, centrifugujeme 1 min 13 000 rpm. Vzniklý supernatant odebereme pipetou a celý proces opakujeme ještě 2x. Přidáme 1 ml sterilní vody a obsah důkladně promícháme pomocí vortexu a centrifugujeme 2 minuty, opakujeme ještě jednou. Připravený roztok rozdělíme po 50 μl do 20 mikrozkumavek. Takto připravená zásobní suspenze zlata je uchovávána při −20°C. h) Příprava směsi zlatých částic s DNA 1. Do mikrozkumavky s 50 µl zlatých částic přidáme 5 µl plazmidové DNA o koncentraci 1µg.µl-1, přičemž DNA napipetujeme na stěnu mikrozkumavky. 2. Suspenzi zlata a DNA velmi krátce promícháme s plazmidovou DNA vortexováním. 3. Na stěnu mikrozkumavky napipetujeme 50 µl 2,5 M CaCl2 (sráží DNA) a na opačnou stranu 20 µl 0,1 M roztoku spermidinu (chrání DNA před degradací a změnou její struktury). Mikrozkumavku uzavřeme a obsah promícháme pomocí vortexu. 4. Obsah inkubujeme 1 minutu na ledu, centrifugujeme při 5 000 rpm 30 – 60 s. 5. Opatrně odstraníme supernatant. 6. K peletu přidáme 250 µl absolutního ethanolu, opatrně promícháme pipetou, pak pomocí vortexu. 7. Centrifugujeme po dobu 30 sekund při 5 000 rpm. 8. Opatrně odstraníme supernatant. 9. Ke zlatému peletu přidáme 60 µl absolutního ethanolu (je lépe přidat 65 µl, rychle se odpařuje) a obsah velmi opatrně promícháme pipetou. 10. Na sterilní macrocarrier, který je umístěn v kovovém nosiči rovnoměrně do jeho střední části napipetujeme 3,5 µl připravené suspenze (vystačí celkem na 12 střel). 11. Po zaschnutí suspenze (přibližně 10 min) je DNA zachycená na částicích připravena k transformaci. i) Vlastní transformace 1. Otevřeme přívodní ventil na bombě s heliem, nastavíme požadovaný tlak otáčením šroubení tak, aby odpovídal vybranému Rupture Disku (1100 psi). 2. Zapneme přistroj pro mikroprojektilový přenos DNA (indikace červenou kontrolkou). 3. Zavřeme dvířka, zapneme vývěvu centrálně a na přístroji, vypneme přibližně při tlaku 20 psi a několikrát naprázdno vyprázdníme komoru. 4. Vložíme všechny potřebné části do přístroje (ve správném pořadí a směru). 5. Petriho misku s rostlinným pletivem umístíme do komůrky ve výšce 6 cm od Rupture Disku a zavřeme dvířka. 6. Zapneme vývěvu, vypneme při tlaku 25 psi a stiskneme tlačítko “Shot“. 7. Po vystřelení vyrovnáme tlak v komoře, otevřeme dvířka a vyjmeme natransformovaný materiál . 8. Vyměníme potřebné terčíky, nezapomeňte pokaždé vyměnit Rupture Disk!
5
9. Po skončení zavřeme přívod helia, zapneme vývěvu, při tlaku 20 psi vypneme a několikrát stiskneme “Shot“ a tak vyprázdníme zbytek helia z přístroje, povolíme šroubení a pokud oba ukazatele nejsou na nule, postup zopakujeme. 10. Vypneme vývěvu na přístroji i centrálně, vypneme přístroj. 20. DEN j) Barvení explantátů na GUS Transformované kořínky z každé transformace přemístíme do jedné malé Petriho misky a připipetujeme k nim roztok pro barvení na GUS, obsahující substrát pro βglukuronidasu. Misky s kořínky umístíme do exikátoru, který připojíme k vývěvě. Vakuum necháme působit 2 min a poté ponecháme misky s kořínky v roztoku inkubovat při 37°C přes noc. 21. DEN k) Pozorování chimerního proteinu v transformovaném rostlinném pletivu Kořínky zbavíme roztoku pro barvení na GUS a promyjeme je 70% ethanolem. Kořínky pozorujeme nejprve ve vodě přímo na Petriho miskách. Vybereme ty kořínky, které exprimují GUS (modré tečky) a z nich připravíme pomocí skalpelu preparáty. Na podložním sklíčku překrytém krycím pozorujeme jednotlivé buňky kořínků kukuřice, které exprimují chimerní protein. Pomocí kamery připojené k mikroskopu pořídíme snímky pozorování. Vyhodnocení výsledků 1) Vyhodnoťte výsledek transformace (počet úspěšně transformovaných kořenů, popište polohu a množství buněk exprimujících β-glukuronidasu v kořeni). 2) Proč se rostlinný materiál po transformaci kultivuje na osmotickém médiu? 3) Jakým způsobem byste zesílili míru exprese transgenu v pletivu? 4) V případě, že byste vyzkoušenou metodou chtěli získat celou transgenní rostlinu, jak byste postupovali? 5) Popište princip GUS jako reportérového genu. Jak funguje barvení na GUS? Literatura 1) Horsch R., Fry J., Hoffmann N., Wallroth M., Eichholtz D., Rogers S., and Fraley R. (1985), Science 227, 1229-1231. 2) Bechtold N., Ellis J., and Pelletier G. (1993), C. R. Acad. Sci. Paris 316,1194-1199. 3) Qui P., Ziegelhoffer P., Sun J., Yang N.S. (1996), Gene Therapy 3, 262-268. 4) Sanford J. C., Smith F.D. and Russel J.A. (1993), Meth. Enzymol. 217, 483-509. 5) Klein T.M., Arentzen R., Lewis P.A. and Fitzpatrick-McElligott S. (1992), Bio/Technology 10, 286-291. 6) Yansong M. and Liwen J. (2007), Nature protocol 2, 2348 - 2353. 7) Galuszka P., Frébortová J., Luhová L., Bilyeu K.D., English J.T., Frébort I. (2005), Plant Cell Physiol. 46, 716-728.
6
Obrázek 1. Přístroj pro mikroprojektilový přenos DNA BioRad PDS 1000/He
Obrázek 2. Průběh procesu mikroprojektilového přenosu DNA
7
