MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta
Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk
Diplomová práce
Brno 2007
Lenka Činčárová
Ráda bych tímto poděkovala svojí školitelce Mgr. Marii Brázdové, Ph.D. za cenné rady, odborné vedení, pomoc a připomínky při tvorbě této diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Veronice Kudláčkové a celému kolektivu LBCHMO za vytvoření příjemné pracovní atmosféry a inspirativního prostředí. Dekuji také své rodině za podporu během studia.
Tato práce byla vypracována na Biofyzikálním ústavu Akademie Věd ČR v Brně v Laboratoři biofyzikální chemie a molekulární onkologie.
SEZNAM ZKRATEK
aminokyselinové zbytky
aa Amp r
ampicilin
Amp
rezistence k ampicilinu
bp
páry bazí
BSA
hovězí sérový albumin
DBSS
strukturně selektivní vazba na DNA (DNA structure-selective binding)
DEPC
diethylpyrokarbonát, inhibitor RNAázy
dsDNA
dvouřetězcová DNA (double stranded DNA)
DTT
1,4-dithio-1-treitol
EDTA
ethylendiamintetraoctová kyselina
flp53
lidský protein „o celé délce“ (full lenght)
FPLC
rychlá proteinová kapalinová chromatografie
HEPES
N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N´-2-ethansulfonová kyselina
IPTG
izopropyl-β-thiogalaktosid
lin DNA
lineární forma DNA
MOPS
4-morfolinpropansulfonová kyselina
mutp53
mutantní forma proteinu p53
mutp53BS
mutp53binding sites
NK
nukleová kyselina
ocDNA, oc
otevřená kružnicová DNA
p53C
C-koncová DNA vazebná doména (aa 320-393)
p53CD
centrální doména p53 (aa 94-312)
p53CON
konvenční sekvence specifické vazby p53 (consensus sequence) 5´PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy3´
p53For
primer pro sekvenci p53, forward
p53Rev
primer pro sekvenci p53, revers – v opačném směru
Pu
purinová báze
Py
pyrimidinová báze
RE
responsivní element, místo vazby mutp53
scDNA, sc
superhelikální, nadšroubovicová DNA
SCS
selektivní vazba na scDNA (supercoiled selective binding)
SDS
dodecyl síran sodný
SDS-PAGE
polyakrilamidová elektroforéza s SDS
siRNA
malé interferující molekuly RNA (small interfering RNA)
ssDNA
jednořetězcová DNA
ssRNA
jednořetězcová RNA
TEMED
N,N,N´,N´-tetramethylethylendiamin
Tris
tris(hydroxymethyl)-aminomethan
wtp53
standardní forma proteinu p53
OBSAH 1. ÚVOD ....................................................................................................................................1 1.1 Nádorový supresorový protein p53 ............................................................................2 1.2 Struktura genu TP53 ...................................................................................................2 1.3 Mutace proteinu p53 ....................................................................................................3 1.4 Struktura proteinu p53 ............................................................................................... 4 1.5 Polymorfismus kodonu 72 v genu TP53......................................................................5 1.6 Konformace proteinu wtp53 a mutp53 ..................................................................... 6 1.7 Funkce a regulace standardního typu proteuinu p53 (wtp53) ................................ 7 1.8 Biologické konsekvence mutace proteinu p53 ...........................................................8 1.8.1 Heterogenita způsobů inaktivace wtp53 v lidských nádorech.............................. 9 1.8.2 Mutantní p53 jako onkogen ................................................................................10 1.8.2.1 Dominantně negativní efekt .......................................................................10 1.8.2.2 Mechanismy získaných vlastností mutp53 („gain-of-function“)................10 1.8.2.3 Zvýšení poločasu rozpadu mutp53, narušená dráha degradace proteinem MDM2..........................................................10 1.8.2.4 Protein-protein interakce ...........................................................................11 1.8.2.5 Transaktivace genů mutantními proteiny p53 ............................................11 1.9 Vazba p53 na DNA .....................................................................................................13 1.9.1 Sekvenčně specifická vazba na p53CON (konsensní sekvence p53) .................13 1.10 Vazba mutp53 na DNA ............................................................................................13 1.10.1 Sekvenčně specifická vazba mutp53 .................................................................13 1.10.2 Strukturně selektivní vazba mutp53 ..................................................................14 1.10.2.1 Vazba mutp53 k MAR/SAR elementům in vivo .........................................15 1.10.2.2 Vazba mutp53 k repetetivním sekvencím in vivo ......................................16 1.11 Gliomy .......................................................................................................................17 1.11.1 Astrocytomy ......................................................................................................17 1.11.2 Molekulární změny astrocytomů ......................................................................17 1.11.3 Role p53 v nádorech mozku ..............................................................................18 1.11.4 p53 terapie mozkových nádorů ........................................................................ 19 2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE ...........................................................................................20 3. MATERIÁL A METODY .................................................................................................21 3.1 Materiál…... ................................................................................................................22 3.1.1 Bakteriální kmeny (Escherichia coli) .................................................................22 3.1.2 Buněčné linie .......................................................................................................21 3.1.3 Plasmidová DNA ................................................................................................21 3.1.3.1 Mapy plasmidů určených pro studium vazby p53.......................................22 3.1.3.2 Mapy plasmidů určených pro studium exprese p53 ...................................22 3.1.3.3 Mapa plasmidu pSUPER (Brummelkamp, 2002).......................................22 3.1.3.4 Příprava plasmidové DNA pro studium vazby p53 ...................................23 3.2 Metody .........................................................................................................................23 3.2.1 Techniky pro práci s DNA ..................................................................................23 3.2.1.1 Transformace buněk E.coli ........................................................................23 3.2.1.2 Izolace plasmidové DNA kolonou GIAGEN-tip 2500 ................................24
3.2.1.3 Izolace plasmidové DNA kitem NucleoSpin Plasmid (Macherey- Nagel) .................................................................................... 25 3.2.1.4 Stanovení koncentrace nukleových kyselin.................................................25 3.2.1.5 Příprava lineárních fragmentů pro vazbu p53 ..........................................26 3.2.1.6 Metodika klonování.....................................................................................26 3.2.1.6.1 Štěpení plasmidové DNA restrikční endonukleázou Van91I ...................26 3.2.1.6.2 Izolace DNA z agarózového gelu kitem NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel) ...................................................................................27 3.2.1.6.3 Defosforylace vektorové DNA alkalickou fosfatázou ..............................28 3.2.1.6.4 Purifikace DNA pomocí fenol/chloroform/isoamylakoholové extrakce ...................................................................................................28 3.2.1.6.5 Ligace T4 DNA ligasou (Invitrogen) izolovaných fragmentů mutp53 a bakteriálního expresního vektoru pT7-7..................................28 3.2.1.6.6 PCR .........................................................................................................28 3.2.2 Techniky práce s proteiny ...................................................................................29 3.2.2.1 Izolace rekombinantních proteinů mutp53.................................................29 3.2.2.2 Separace proteinů na SDS polyakrylamidových gelech ............................29 3.2.2.3Barvení SDS PAGE gelu Coomasie blue (Eckershorn aj., 1988)................29 3.2.2.4 Stanovení koncentrace proteinů podle obarveného SDS-PAGE Coomasie Blue ...........................................................................................30 3.2.2.5 Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové...................................30 3.2.2.6 Přenos proteinů z polyakrylamidových gelů, elektorblot............................30 3.2.3 Vazba proteinů na lineární DNA ........................................................................30 3.2.3.1 Inkubace p53 s DNA ..................................................................................30 3.2.3.2 Agarózová elektroforéza.............................................................................30 3.2.3.3 Detekce DNA...............................................................................................31 3.2.3.4 Přenos z agarózového gelu, vakuový blot...................................................31 3.2.3.5 Imunodetekce proteinů na membránách ....................................................31 3.2.4 Práce s buněčnými kulturami...............................................................................32 3.2.4.1 Kultivace gliomových linií..........................................................................32 3.2.4.2 Izolace DNA z gliomových buněk................................................................32 3.2.4.3 Příprava proteinových lyzátů z gliomových buněk ....................................32 3.2.4.4 Izolace celkové RNA z gliomových buněk...................................................32 3.2.4.5 Syntéza cDNA metodou TermoScriptTM RT-PCR......................................33 3.2.4.6 Štěpení BstUI ..............................................................................................33 3.2.4.7 Transientní transfekce buněk gliomu ........................................................33 3.2.4.8 Přečištění RNA pomocí DNA-freeTM kitu (Ambion) ................................34 3.2.4.9 Detekce exprese genů pomocí PCR ...........................................................34 3.2.5 Přístroje .............................................................................................................. 35 4. VÝSLEDKY........................................................................................................................36 4.1 Charakterizace gliomových linií s mutp53...............................................................36 4.1.1 Detekce mutace v p53 .........................................................................................36 4.1.2 Detekce exprese mutp53 v buňkách gliomových linií ........................................37 4.1.3 Polymorfismus kodonu 72 v genu TP53 gliomových linií U251, Onda10 a Onda11 ................................................................................................37 4.1.4 Morfologie buněk linií Onda10, Onda11 ............................................................39 4.2 Příprava mutp53 proteinu v E.coli............................................................................41 4.2.1 Příprava expresního vektoru pro produkci mutp53 v E.coli BL21 (DE3) ..........41 4.3 Vazba p53 na lineární DNA.......................................................................................44
4.3.1 Vazba proteinů p53 na lineární DNA fragmenty pBluescript, pPGM1, pPGM2..................................................................................................44 4.3.1.1 Vazba wtp53 proteinu ................................................................................44 4.3.1.2 Vazba mutp53 proteinů ..............................................................................46 4.3.2 Vazba mutp53 na lineární fragmenty genomové DNA.......................................48 4.3.2.1 Charakterizace genomové DNA určené pro vazbu mutp53 .......................48 4.3.2.2 Vazba mutantních proteinů R273C a R273H na genomovou DNA ........................................................................................50 4.4 Regulace exprese kandidátních genů proteinem mutp53 v gliomových liniích ...................................................................................................53 4.4.1 Příprava cDNA ....................................................................................................53 4.4.2 Test exprese metodou PCR .................................................................................54 5. DISKUSE ............................................................................................................................56 5.1 Charakterizace gliomových linií s mutantní p53 ....................................................56 5.2 Charakterizace vazebných schopností mutantních proteinů p53 .........................57 5.3 Regulace genové exprese ...........................................................................................60 6. ZÁVĚR ................................................................................................................................63 7. SUMMARY ........................................................................................................................64 8. LITERATURA ...................................................................................................................65
