Interakce různých forem proteinu p53 s p73 izoformami

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta katedra biochemie

Interakce různých forem proteinu p53 s p73 izoformami

Diplomová práce

Brno 2006

Martin Klepárník

„Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci zpracoval samostatně a pouze s využitím pramenů v práci uvedených.“ Martin Klepárník

2

Chtěl bych poděkovat především Mgr. Pavle Češkové, PhD.

za odborné

vedení, poskytnutí potřebných materiálů, pomoc a trpělivost při zpracování této práce.

Děkuji RNDr. Bořivoji Vojtěškovi, DrSc. za možnost pracovat v jeho skupině na

oddělení Základna experimentální onkologie Masarykova onkologického ústavu v Brně a všem členům pracovní skupiny za pomoc a rady. Rodině a svým blízkým za podporu.

Děkuji 3

OBSAH:

str.

Seznam použitých zkratek

7

I. Úvod

8

II. Teoretická část

1. Historie a funkce p53-genové rodiny 2. Protein p53

2.1. Struktura proteinu p53

9

9

11

11

2.1.1. N-terminální oblast

2.1.2. Centrální DNA vazebná oblast 2.1.3. C-terminální oblast

12

12

13

2.2. Regulace stability a degradace proteinu p53

14

2.4. Mutace proteinu p53

18

2.3. Funkce proteinu p53 3. Protein p73

3.1. Struktura genu pro protein p73 3.2. Struktura proteinu p73

3.2.1. Transaktivační doména (TAD)

16

20

20

21

22

3.2.2. DNA vazebná doména (DBD)

22

3.2.4. C-terminální SAM (Sterile Alpha Motif) doména

23

3.2.3. Oligomerizační doména (OD) 3.2.5. Poly-prolinová oblast (PY)

3.3. Regulace stability a degradace proteinu p73 3.3.1. Interakce s proteinem MDM2 3.3.2. Acetylace proteinu p73

3.3.3. Sumoylace proteinu p73

3.3.4. Ubikvitin-dependentní degradace proteinu p73 3.3.5. Další možnosti degradace proteinu p73

3.4. Funkce proteinu p73

3.4.1. Funkce proteinu p73 v apoptóze

3.4.2. Funkce proteinu p73 ve vývoji a diferenciaci tkání 3.4.3. Funkce proteinu p73 v karcinogenezi

4. Interakce mezi mutantními formami p53 a isoformami p73

4

22

24

24

24

25

25

26

26

27

27

28

29

30

III. Cíle diplomové práce

31

IV. Materiál a metody

32

1. Mutageneze

2. Příprava a izolace plazmidové DNA 2.1. Příprava kompetentních buněk 2.2. Transformace buněk

35

36

36

36

2.3. Izolace plazmidu

37

3.1. Kultivace buněčných linií MCF 7, RD, SW 837 a H1299-p53β

37

3.3. Izolace cytosolických a jaderných proteinů

38

3. Příprava jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií

3.2. Kultivace buněčné linie MCF 7 s indukovanou hladinou p53

4. Příprava IVTT proteinů

5. SDS-PAGE + Western bloting

37

38

38

39

5.1. SDS-PAGE

39

5.2. Western bloting

6. Imunodetekce proteinů na membráně 7. EMSA (electromobility shift assay) 7.1. Značení oligonukleotidu 32P

7.2. Specifická vazba proteinu na DNA 7.3. Elektroforéza

8. Kultivace a transientní transfekce buněčné linie H1299-RGC-2 8.1. β-galaktosidasová assay

9. Kultivace a transientní transfekce buněčné linie H1299 pro detekci aktivace transkripce proteinů MDM2 a p21

V. Výsledky a diskuse

1. Příprava expresních vektorů pro proteiny p53 s polymorfismem 72 R/P

2. Studium DNA vazebných schopností in vitro 2.1. Příprava IVTT proteinů

2.2. Izolace jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií

2.3. Studium DNA vazebných schopností wtp53 a mutantních p53

39

40

40

41

41

41

42

42 43

44

44

45

46

46

připravených in vitro transkripcí/translací

47

formami proteinu p53

48

2.4. Studium DNA vazebných schopností isoforem p73 s různými

5

2.5. Studium DNA vazebných schopností isoforem p73 (IVTT)

s jadernými a cytosolickými lyzáty buněčných linií nesoucích wtp53 nebo mutantní p53

3. Studium DNA vazebných schopností v podmínkách ex vivo

3.1. Vyhodnocení schopnosti transaktivace p73β v kombinaci s různými formami proteinu p53

4. Studium DNA vazebných schopností in vivo

VI. Závěr

VII. Abstract

50

52

52

55

59

60

Seznam použité literatury

62

6

Seznam použitých zkratek

AK

aminokyselina/aminokyseliny

CDKs

cyklin dependentní kinasy

D-MEM

Dulbeco's modified Eagle's medium

bp

CSB

base pair

complete sample buffer (nanášecí barva pro SDS-PAGE)

DTT

dithiotreitol

HPV

Human papilomavirus (lidský papilomavirus)

IVTT

in vitro transkripce/translace

LSH motiv

loop-sheet-helix motiv

EMSA IPTG

electromobility shift assay

isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid

LB médium Luria-Bertani médium ONPG PMSF

o-nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid phenylmethylsulfonylfluorid

SDS-PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu sodného Sf9

wt p53

Spodoptera frugiperda

wild-type p53 (divoký, nemutovaný typ)

7

I. Úvod Protein p53 je známý antionkogen, ztráta jeho funkčnosti způsobená mutací je

prokázána asi u 55 % lidských nádorů rozdílného histologického původu. Mutace p53

indikuje horší prognózu léčby a přežití pacienta. Protein p73 vykazuje vysoký stupeň

homologie s proteinem p53 na úrovni genu i proteinu. Přestože p73 není klasickým tumor supresorovým genem a mutace v genu TP73 byly nalezeny u méně než 0,6%

lidských nádorů, tak je schopen stejně jako protein p53, transkripčně aktivovat geny, jejichž produkty se uplatňují při zástavě buněčného růstu a apoptóze.

Už dřívější experimenty dokázaly, že fyzikální interakce mezi proteiny wt p53 a

p73 za fyziologických podmínek jsou velmi slabé. Změna struktury proteinu p53

mutací nebo delecí však může výrazně ovlivnit jeho schopnost fyzikálně a funkčně inetragovat s proteinem p73 a významně tak ovlivňovat jeho DNA vazebné

schopnosti i protein-protein interakční potenciál. To může ve výsledku vést ke

změněné schopnosti proteinu p73 indukovat transkripci jako odpověď na různé genotoxické vlivy.

Studium jakým způsobem mutantní protein p53 interaguje s isoformami p73 je

důležité pro nalezení možnosti rozpojení těchto inhibičních interakcí a uvolnění funkce proteinu p73, který by pak mohl stejně jako wt p53 působit proti rozvoji nádoru zástavou buněčného cyklu nebo indukcí apoptózy

8

II. Teoretická část 1. Historie a funkce Při výzkumu opičího Simian viru 40 (SV 40; polyomavirus, jehož přirozeným

hostitelem je Makak rhesus), byla v roce 1979 s jedním z jeho proteinů (tzv. velký T antigen) koprecipitována molekula o hmotnosti 53 kDa (1) (později charakterizován

jako nový protein pojmenovaný p53) (2). Následně bylo zjištěno, že polyomaviry vyvolávají nádory u experimentálních zvířat, v nichž je onkogenetické působení

zprostředkováno právě tzv. velkým T (= transformačním) antigenem, který se váže na nádorový supresor p53 a inaktivuje jej.

Původně se předpokládalo, že se jedná o nový onkogen (nález proteinu p53

v několika typech nádorů u zvířat) (3). Tuto myšlenku podpořil fakt, že při zastavení

buněčného cyklu je hladina p53 v buňce velmi nízká, zatímco při indukci růstu se zvyšuje (a maximální je před iniciací replikace DNA) (4).

Srovnání cDNA klonů p53 (používaných při studiu a objevu konzervativních

domén) ukázalo, že většina používaných klonů je v mutované formě. Následné studie využívající wt p53 ukázaly, že původní funkce p53 je opačná, tedy inhibice

transformace (5,6). Od konce 80. let je přijímán názor, že protein p53 se podílí na regulaci buněčného cyklu a diferenciaci a je tumor supresorovým genem. Protein

p73

společně

s proteinem

p63

patří

do p53-genové rodiny

transkripčních faktorů. Protein p73 byl objeven až v roce 1997 (7). Následným

podrobným screeningem byly objeveny isoformy p73α a p73β, lišící se na svém Ckonci. V roce 1998 pak byl popsán další homolog proteinu p53, protein p63 (8).

Na základě jejich strukturní homologie s proteinem p53, se předpokládalo, že

budou mít podobné funkce jako protein p53. Všechny tři proteiny mají podobnou

strukturu zahrnující N-terminální transaktivační (TA) doménu, centrální DNA

vazebnou doménu (DBD) a C-terminální oligomerizační doménu (OD). Stupeň identity v sekvenci aminokyselin u centrální DNA vazebnou domény je přibližně

65 %. U obratlovců se předpokládá, že proteiny p63 a p73 jsou evolučními předky proteinu p53 a patrně se vyvinu z nějakého p63/p73 archetypu. V současné době je již známo, že jejich funkce je v některých oblastech odlišná (např. růst a vývoj tkání).

9

Protein p73 může aktivovat řadu p53-regulovaných genů a tím potlačovat

buněčný růst nebo indukovat apoptózu. Proteiny p53 a p73 jsou aktivovány

poškozením DNA. Proteiny p63 a p73 jsou důležité pro normální vývoj některých typů

tkání, mají dlouhou C-terminální oblast, která je alternativně sestřihována a vytváří různé C-koncové isoformy. Geny p63 a p73 jsou velmi zřídka mutované u lidských

nádorů, na rozdíl od genu p53.

obr. 1: Znázornění p53-rodiny transkripčních faktorů a jejich překrývajících se i odlišných biologických

funkcí. Proteiny p53, p63 a p73 se v některých funkcích překrývají a některé mají rozdílné; p53

reguluje stresovou odpověď vedoucí k potlačení vzniku nádoru; p63 je nezbytný pro diferenciaci ektodermu; p73 pravděpodobně reguluje stresovou odpověď a je zapojen do diferenciace některých

typů tkání. Protože proteiny p53 a p73 jsou spojeny s rozdílnými signálními dráhami, může být tato rodina transkripčních faktorů regulována běžnou skupinou genů exprimovanou jako odpověď na různé extracelulární signály a vývojové podněty (9).

.

10

2. Protein p53 2. 1. Struktura proteinu p53 Gen pro lidský protein p53 (TP53) byl lokalizován na krátkém raménku

chromozomu 17 (10), je dlouhý 20 kb a obsahuje 11 exonů (z nichž první se ve formě RNA podílí na autoregulaci rychlosti syntézy, ale není translatován) a 10 intronů (11).

V současnosti nové studie ukazují, že podobně jako u proteinů p63 a p73, tak

může docházet k alternativnímu splicingu genu TP53 a mohou tak vznikat různé Nkoncové a C-koncové isoformy proteinu p53. N-koncové isoformy mohou vznikat prostřednictvím alternativního promotoru uvnitř intronu 4. C-terminální oblast může

být alternativně sestřižena (v oblasti intronu 9) a mohou vznikat tři různé isoformy – p53 (plně dlouhý protein), p53β a p53γ (postrádají oligomerizační doménu).

Alternativní promotor umožňuje expresi N-terminálně zkráceného proteinu p53 (∆133p53), který se začíná přepisovat na kodonu 133. Gen TP53 tak může teoreticky kódovat nejméně 9 různých isoforem proteinu p53 – p53, p53β, p53γ, ∆133p53,

∆133p53β a ∆133p53γ pomocí alternativního sestřihu intronu 9 a alternativního promotoru uvnitř intronu 4, ale také ∆40p53 pomocí alternativního sestřihu intronu 2 a alternativní iniciace translace. (93,94,95)

obr. 2: Schéma různých isoforem proteinu p53, které mohou být kódovány genem TP53. (92)

11

Lidský protein se skládá z 393 aminokyselin a lze na něm rozlišit tři strukturně

a funkčně odlišné oblasti: N-terminální (AK 1-100), centrální (AK 101-299) a Cterminální (AK 300-393).

2. 1. 1. N-terminální oblast N-terminální oblast je zodpovědná svou oblastí (AK 1-42) za transkripčně

aktivační schopnosti. Obsahuje první konzervativní doménu (AK 13-23) (12). Touto oblastí se protein p53 váže na komplex bazálních transkripčních faktorů - TBP (TATA box binding protein), TAF (TBP-associated factors) části TFIID (13,14).

Dalším proteinem, který se váže do této oblasti, je E3 ubikvitin ligasa MDM2

regulující stabilitu proteinu p53. MDM2 se váže na oblast AK 17-27 a negativně

ovlivňuje množství proteinu p53 jeho ubikvitinací. Dále pak se mohou do této oblasti vázat virové proteiny (např. adenovirový protein E1B-55 kDa, X protein viru hepatitidy

B, HPV E6 protein lidského papilomaviru) a inhibovat tak transaktivační funkci proteinu p53.

N-terminální oblast je velmi bohatá na prolin. Pravidelný motiv pěti repetic

PXXP (P – prolin, X – libovolná AK) v oblasti AK 63-97 tvoří ve struktuře levotočivý

helix podobný SH3 vazebné doméně (konzervovaná struktura meziproteinových

interakcí), který umožňuje zapojení p53 do signálních transdukčních drah. Tato oblast je postradatelná pro transaktivační funkci proteinu p53, ale je nezbytná pro vyvolání p53-dependentní apoptózy a zástavu buněčného cyklu. Tento motiv je

ovlivněn polymorfismem v kodonu 72 Pro/Arg, kde v případě argininu dochází

k narušení struktury jednoho z pěti PXXP motivů a zvýšené náchylnosti k HPV E6-

indukované degradaci p53 (15). Klinické studie pak potvrzují vyšší výskyt nádorů u populace s lidským papilomavirem v kombinaci s homozygotním Arg 72 (16). 2. 1. 2. Centrální DNA-vazebná oblast Obsahuje

AK

102-292

tvořící

strukturu

zodpovědnou

za

sekvenčně

specifickou vazbu na DNA. Nacházejí se zde 4 konzervativní domény - II: AK 117-

142, III: AK 171-181, IV: AK 234-250 a V: AK 270-286 (12). V této oblasti se nachází asi 95% všech bodových mutací proteinu p53.

12

Centrální DNA-vazebná doména obsahuje 2 α-helixy (H1 a H2) a 11 β-řetězců

(označované S1, S2, S2´ a S3-S10) spojených smyčkami (z nichž jsou strukturně

důležité L1-L3). Dva antiparalelní β-listy složené ze čtyř (S1, S3, S5 a S8) a pěti (S4,

S6, S7, S9 a S10) řetězců tvoří β-sendvič, který je lešením pro LSH motiv (loop-

sheet-helix; L1, S2, S2´, S10 a H2) a dvě velké smyčky (L2 přerušená krátkým helixem H1 a L3).

L1 z LSH interaguje s DNA ve velkém žlábku, dlouhá smyčka L3 v malém

žlábku. Smyčky L2 a L3 se stabilizují vzájemnou interakcí postranních řetězců

aminokyselin a zejména koordinací atomu zinku Cys176 a His 179 (L2) a Cys238 a Cys242 (L3) (17).

2. 1. 3. C-terminální oblast C-terminální oblast proteinu p53 obsahuje několik funkčně i strukturně

odlišných částí: flexibilní linker (AK 300-318) spojující DNA vazebnou doménu s C-

terminálním koncem; tetramerizační doménu (AK 323-356); tři sekvence NLS (nuclear localisation signal) a C-terminální doménu (AK 363-393).

Tvorba tetrameru proteinu p53 je velmi dobře prokázána (18). Tetramer lze

nejlépe popsat jako dimer dimeru, kdy je dvojice proteinů spojena antiparalelně probíhajícími β-řetězci a dva dimery jsou spojeny hydrofóbními a elektrostatickými interakcemi α-helixů, tvořících svazek (tzv. „four helix bundle“). Tetramerizace je

nezbytná pro plnou funkci proteinu p53, ačkoli monomery proteinu p53 s delecí v tetramerizační doméně vykazují určité transaktivační schopnosti (19).

Tři sekvence NLS1, NLS2 a NLS3 nalezené na C-konci proteinu p53 se

podílejí na jeho lokalizaci v jádře. Sekvence NLS1 (AK 316-325) je nejdůležitější a

pokud chybí nebo je pozměněna, je protein lokalizován pouze v cytoplazmě. Při změnách v sekvencích NLS2 a NLS3, je pak exprimovaný protein p53 lokalizován jak v cytoplazmě, tak z části i v jádře (20).

C-terminální doména zahrnuje oblast AK 363-393, která je zodpovědná za

sekvenčně nespecifickou vazbu na DNA (21). C-terminální doména je také místem

interakce s několika buněčnými i virovými proteiny (např. X protein hepatitidy B (22), podjednotkami XPD a XPB komplexu TFIIH). Tyto interakce jsou

ovlivněny

fosforylací na Ser315 (kinasami CDK1, CDK2) (23), Ser378 protein kinasou C (24)

13

a Ser392 kasein kinasou II a nachází se zde i několik míst acetylovaných acetylasou p300 (např. Lys320 a Lys382) (25).

obr. 3: Struktura proteinu p53 a znázornění jeho funkčních oblastí, evolučně konzervovaných domén a struktury centrální DNA-vazebné domény. Podle Pierre a Evelyne May (26).

2. 2. Regulace stability a degradace proteinu p53 Protein p53 se za normálních podmínek vyskytuje v buňce ve velmi nízké

koncentraci (poločas života

p53 v buňce je asi 5-10 minut). Existuje totiž

zpětnovazebná regulační smyčka proteinu p53 s E3 ubikvitim ligasou MDM2, při které dochází k p53-dependentní transkripci proteinu MDM2 zprostředkovávající degradaci p53 (27). Protein p53 se navíc vyskytuje v latentní formě, jejíž DNAvazebná aktivita je velmi nízká. Ke stabilizaci a aktivaci proteinu p53 dojde po vystavení buňky různým druhům stresu zpravidla vedoucím k poškození DNA.

V současnosti jsou známy tři odlišné cesty stabilizace p53 v buňce. Všechny

vedou ke zrušení interakce p53-MDM2. MDM2 není schopen ubikvitinovat p53, čímž dojde k inhibici degradace p53.

14

První cesta je vyvolána přímo poškozením DNA (např. ionizujícím zářením).

Dochází k aktivaci dvou protein kinas - kinasa ATM (ataxia telangiectasia-mutated),

ta je stimulována dvouřetězcovými zlomy DNA a následně aktivuje další kinasu Chk2

(Checkpoint kinase 2). Obě tyto kinasy fosforylují protein p53 na Ser15 a Ser20 a

znemožňují tím vazbu MDM2 (28).

Druhá cesta stabilizace p53 v buňce je spuštěna abnormálními růstovými

signály (zejména nadměrnou expresí onkogenů, např. Ras, Myc), které vyvolají stabilizaci a akumulaci proteinu p14/ARF(29), který je lokalizován v jadérku, kam také vychytává protein MDM2, čímž se zabrání degradaci p53.

Třetí cesta stabilizace p53 v buňce zahrnuje kinasy ATR a CK II (kasein

kinasa II) a je spouštěna širokým spektrem chemoterapeutik, UV-zářením nebo inhibitory protein kinas. Vede opět k fosforylaci p53 na Ser15 a Ser20.

obr. 4: Regulace a funkce proteinu p53. Aktivace p53 působením stresových faktorů na buňku je

spojena s rozpojením p53-MDM2 zpětnovazebné smyčky. Funkcí proteinu p53 je pak především aktivovat skupiny genů, jejichž produkty vedou k různým biologickým funkcím. (30)

15

2. 3. Funkce proteinu p53 Protein p53 se svou funkcí účastní při regulaci buněčného cyklu, apoptóze,

opravě DNA, udržení stability genomu a angiogenezi.

Jednou z nejdůležitějších funkcí proteinu p53 je jeho schopnost vázat se na

určité promotorové sekvence DNA a aktivovat transkripci příslušných genů. Geny pod přímou kontrolou p53 lze rozdělit do 4 skupin: A) geny vyvolávající zástavu buněčného cyklu; B) geny udržující stabilitu genomu - reparace DNA; C) geny indukující apoptózu a D) geny inhibující angiogenesi vznikajícího nádoru.

Po působení stresového faktoru je jednou z prvních reakcí buněk zástava

buněčného cyklu. Protein p53 indukuje expresi inhibitoru cyklin-dependentních kinas

p21/WAF1/CIP1. Protein p21 pak způsobuje zástavu buněčného cyklu v G1 fázi inhibicí několika cyklin-dependentních kinas (CDKs) cyklin D-CDK4/6, cyklin E-CDK2

a cyklin A-CDK2 (31), které regulují průchod z G1 do S fáze cyklu. Následkem

inhibice CDKs nedojde k fosforylaci retinoblastoma proteinu (RB). Ten je v průběhu G1 fáze hypofosforylován v tomto stavu se váže na E2F transkripční faktor nezbytný pro vstup buňky do S fáze. Pokud nedojde k uvolnění E2F transkripčního faktoru z RB proteinu, zastaví se buněčný cyklus před vstupem do S fáze a to umožní opravu poškozené DNA.

Druhým možným místem zástavy buněčného cyklu je průchod z G2 fáze do

mitózy, kde je hlavním regulátorem komplex cyklinu B1 s CDK1 kinasou. Na epiteliálních buňkách bylo prokázáno, že po aktivaci proteinu p53 v buňce dojde

k transkripci genu pro protein 14-3-3σ, který se svou vazbou na komplex cyklinu B1

s CDK1 kinasou izoluje mimo jádro buňky a napomáhá tím zástavě buněčného cyklu v G2 fázi. (32)

V závislosti na buněčném typu, povaze a intenzitě působení stresového

faktoru a rozsahu následného poškození DNA, je protein p53 schopen vyvolat apoptózu. Mechanismus spuštění apoptotických dějů je velmi komplexní.

Protein p53 se váže na p53-responzivní promotorové sekvence pro-

apoptických genů a

stimuluje jejich expresi. Stimulací exprese pro-apoptických

proteinů Bax, PUMA, NOXA a p53AIP1 a jejich následnou lokalizací do mitochondrií dochází ke ztrátě potenciálu na mitochondriální membráně a uvolňování cytochromu c. Uvolněný cytochrom c společně s dalším p53-indukovaným proteinem APAF-1 (apoptosis protease-activating factor-1) a kaspasou 9 vytváří apoptozomový 16

komplex, který dále aktivuje kaskádu cysteinových apoptických proteas – kaspas. Další možností je stimulace transkripce receptorů pro-apoptických molekul

(Fas/CD95, death receptor 4 - DR4, death receptor 5 - DR5) (33,34,35), které po vazbě ligandu aktivují kaspasu 8 a zvyšují tak schopnost buňky reagovat na apoptické signály z okolního prostředí. Protein

p53

může

také

podporovat

rozvoj

apoptózy

prostřednictvím

transkripčně nezávislého mechanismu. Tímto mechanismem může být přímá

interakce s anti-apoptickými mitochondriálními proteiny Bcl-2 a Bcl-XL a jejich

inatkivace, vedoucí opět k uvolnění cytochromu c z mitochodrií a následné apoptóze (36).

Obr. 5: Znázornění p53-dependentní apoptosy. Popis v textu. (37)

K nádorové transformaci buňky přispívá také inaktivace genů udržujících

stálost genomu. Tyto geny přímo neovlivňují dělení a zánik buněk, ale v případě jejich inaktivace nebo změny funkce dochází k hromadění chyb ve všech genech -

tedy i těch, které regulují proliferaci a diferenciaci. Z genů podílejících se na reparaci DNA byla identifikována skupina pod přímou kontrolou p53 (např. GADD45). (38)

17

2. 4. Mutace proteinu p53 Mutace genu TP53 jsou nejčastější se vyskytující somatickou mutací nalezenou ve

zhoubných nádorech člověka. Mutace se vyskytuje ve více než 50% všech nádorů. Do oblasti DNA-vazebné domény náleží asi 95% těchto mutací, přičemž u 75% z nich se jedná o jednobodové mutace v centrální DNA-vazebné doméně (39).

Mutace lze rozdělit do dvou tříd. První třída obsahuje mutace v místě kontaktu

s DNA, tzv. DNA-kontaktní mutace - R248 (L3) a R273 (S10 v LSH). Druhá pak obsahuje mutace v oblasti stabilizující okolní strukturu tzv. strukturní mutace – R175 (L2), G245 (L3), R249 (L3) a R282 (H2 v LSH).

obr. 6: Frekvence somatických mutací v jednotlivých kodonech genu TP53 nalezených u lidských

nádorů. Vyznačeny jsou tzv. hot-spot mutace (v kodonech 175, 245, 248, 249, 273 a 282), které tvoří více než 40% z celkového počtu 18144 nalezených mutací. Většina mutací se nachází v centrální DNA vazebné doméně (oblast kodonů 102-292). (39)

Oba dva tyto typy mutací mohou být rozlišeny pomocí polyklonálních protilátek. DNA-

kontaktní mutace specificky vážou protilátku PAb1620, která rozpoznává nativní konformaci proteinu p53. Zatímco strukturní mutace specificky vážou protilátku PAb240, která rozpoznává pouze nesprávný folding proteinu p53 a nebo denaturovaný p53 (40).

18

Lze tedy říci, že některé mutace v oblasti centrální DNA-vazebné domény

znemožňují vazbu na specifické oblasti DNA změnou z nativní konformace na denaturovanou zatímco jiné mutací přímo v místě kontaktu s DNA.

O tom, zda mutace ovlivňuje vazbu na DNA změnou foldingu nebo mutací

v místě kontaktu rozhoduje také termodynamická stabilita centrální DNA-vazebné domény. Při teplotách nad 42°C se wild-type p53 agreguje do velkých komplexů a

mění svou nativní strukturu (váže se na PAb240) (41). Stabilita wild-type p53

centrální DNA-vazebné domény byla stanovena pomocí reverzibilní denaturace močovinou na 7,5 kcal.mol-1 při 25°C (je to hodnota, která udává ∆G potřebnou na

přechod z denaturované do nativní formy). Mutantní formy p53 tuto hodnotu mají při 37°C rozdílnou a lze je tedy rozdělit do tří různých fenotypů: DNA-kontaktní mutace

(bez efektu na folding), mutace narušující lokální strukturu (∆G menší než 2 kcal.mol-1) a mutace způsobující denaturaci (∆G větší než 3 kcal/mol, více než 50%

proteinu p53 je denaturováno) (42). Pro některé mutantní formy bude tedy

termodynamicky výhodnější mít jiný než nativní folding.

19

3. Protein p73 3. 1. Struktura genu pro protein p73 Gen pro protein p73 (TP73) se nachází v chromozomové oblasti 1p36.2-3, což

je předpokládaný tumor supressorový genový lokus (43). Na rozdíl od genu TP53,

který má pouze jeden promotor, gen TP73 může být transkribován ze dvou různých

promotorových sekvencí. Promotor P1 se nachází v 5’-netranslatatované oblasti nekódujícího exonu 1, zatímco promotor P2 se nachází uvnitř 23 kb oblasti intronu 3.

Transkripce genu TP73 z promotoru P1 pak vede ke vzniku proteinu TA-p73, který obsahuje transaktivační doménu (TA), transkripce z promotoru P2 vede ke vzniku proteinu ∆N-p73, který TA doménu postrádá.

obr. 7: Schématické znázornění 5' konce genu TP73. Bílé oblasti reprezentují exony, šrafované oblasti

5' netranslatované oblasti. Šedé oblasti znázorňují promotory: P1 (pro TAp73) and P2 (pro ∆Np73) .

Gen TP73 obsahuje 14 exonů a různým sestřihem mRNA a následnou

translací pak dochází ke vzniku různých isoforem proteinu p73, odlišných na Nterminální nebo C-terminální části. Kromě isoformy α , která obsahuje všech 14

exonů jsou v současnosti známy formy zkrácené na C-terminální části: isoforma β (neobsahuje exon 13), isoforma γ (neobsahuje exon 11), isoforma δ (neobsahuje

exony 11, 12 a 13), isoforma ε (neobsahuje exony 11 a 13), isoforma ζ (neobsahuje exony 11 a 12) a isoforma η dále také formy zkrácené na N-terminální části: ∆N-p73,

p73∆exon2/3 a p73∆exon2 (7,44,45,46) (obr.1). Strukturně se nejvíce podobá

proteinu p53 isoforma p73γ, která má jen o něco málo delší C-terminální oblast než je 30 AK dlouhá C-terminální oblast p53.

20

obr. 8: V horní části jsou zobrazeny různé isoformy isoformy proteinu p73, vznikající přepisem do mRNA z promotoru P1 a nebo P2 a alternativním sestřihem 14 exonů genu TP73. Ve spodní části

jsou pak porovnány struktury proteinů p53, p63α a strukturními a funkčními oblastmi. (47)

p73α se znázorněnými nejdůležitějšími

3. 2. Struktura proteinu p73 Protein p73 vykazuje vysoký stupeň homologie s proteinem p53 i na úrovni

aminokyselinové sekvence. Protein p73 obsahuje tři strukturně a funkčně odlišné oblasti: N-terminální transaktivační doménu (TAD), centrální DNA-vazebnou doménu (DBD) a C-terminální oligomerizační doménu (OD). Na rozdíl od proteinu p53 má p73

delší C-terminální oblast obsahující další strukturní motivy (u p73α je to např. SAM

doména). Nejvyšší stupeň homologie s proteinem p53 (63%) je u centrální DNAvazebné domény.

21

3. 2. 1. Transaktivační doména (TAD) Strukturní homologie mezi transaktivačními doménami proteinů p53 a p73 je

29%. Gen TP73 kóduje dvě varianty proteinu p73 s rozdílnou N-terminální oblast a

odlišnou transaktivační schopností - TAp73 a ∆Np73.

TAp73 formy proteinu p73 jsou funkční formy proteinu p73, zatímco ∆Np73

formy působí jako dominantně negativní inhibitory ostatních isoforem p73 i ostatních členů p53-genové rodiny in vivo u myší i u transfekovaných lidských buněčných linií

(48,49).

Tyto inhibiční funkce mohou být způsobeny schopností vytvářet inaktivní

tetramery proteinu p73, kde inaktivace je způsobena přítomností jedním nebo více

monomery ∆Np73 a nebo tím, že ∆Np73 může kompetitovat (a tím inhibovat transaktivaci) na některých stejných cílových sekvencích jako má protein p53. (50) 3. 2. 2. DNA vazebná doména (DBD) Mnoho nezávislých experimentů dokázalo, že protein p73 se svou DNA-

vazebnou doménou váže na různé p53-respozivní promotory a aktivuje transkripci různých p53-responzivních genů (včetně p21Waf1/Cip1, bax, mdm2, cyclin-G, GADD45,

IGFBP3) (7,8,45,51,52,53,54), ale některé cílové geny odpovídají rozdílně na aktivaci

p53 nebo p73.

3. 2. 3. Oligomerizační doména (OD) Oligomerizační doména proteinu p53 je protein-protein interakční doménou

umožňující

oligomerizaci monomerů p53 do aktivních homotetramerů. Vzhledem

k vysokému stupni homologie oligomerizačních domén proteinů p53 a p73 (38%) se předpokládalo, že budou schopny vytvářet heteroteramery.

Pro stanovení zda oligomerizační domény navzájem interagují byly použity

protein-protein interakční assaye s poly-histidinem značenými oligomerizačními doménami proteinů p53, p63 a p73. Bylo prokázáno, na úrovni exprimovaných

samostatných OD protein p73 vytváří aktivní homotetramery (55). I přes značnou homologii nebyla pozorována tvorba funkčních heterotetramerů mezi wt p53 a p73 a

pouze velmi slabá interakce mezi oligomerizačními doménami proteinů p63 a p73 22

(56). Pouze pokud je 15krát vyšší koncentrace proteinu p53 než proteinu p73, tak se mohou in vitro vytvářet heterotetramery mezi monomerními proteiny p53 a p73 (55).

obr. 9: Dvourozměrné schéma interakce oligomerizačních domén produktů p53-genové rodiny. Vysoká homologie v

sekvenci AK (asi 58%) a tím i v terciální struktuře mezi oligomerizačními

doménami p63 a p73 umožňuje slabé interakce mezi monomery proteinů p63 a p73 (56).

3. 2. 4. C-terminální SAM (Sterile Alpha Motif) doména Tato doména se vyskytuje v C-terminální oblasti proteinů p73α, p63α a u

olihního p53, ale nikoliv u lidského p53. Přibližně 70 AK dlouhá SAM doména byla

poprvé popsána v roce 1995 jako doména zapojující se do sexuální diferenciace u kvasinek a jako součást polyhomeotických proteinů (produkty genů kódujících chromatinové proteiny) u Drosophyly u kterých se předpokládá, že jsou zapojeny v počátečních fázích embryogeneze (57).

SAM doména je protein-protein interakční doménou, která je schopna vazby

na ostatní SAM domény. Konzervované tyrosiny jiné SAM domény (nalezené u Eph-

receptoru protein tyrosinových kinas) jsou také schopny protein-protein interakcí vazbou na SH2 domény (58). Identita mezi SAM doménou nalezenou u proteinu p73 a ostatními SAM doménami je sice celkem nízká (15 – 17%), ovšem terciální uspořádání α-helixů a smyček interakci s ostatními SAM doménami umožňuje. Zatím

nebylo prokázáno, že by SAM domény proteinů p63 a p73 vytvářely homooligomery

ani heterooligomery. Důležité ovšem je, že aby se SAM doména proteinu p73 nebo

p63 mohla zapojit do protein-proteinových interakcí, musí být její vazební partneři stejně strukturně vzdálení od ostatních SAM domén. Další možností je pak interakce s proteiny neobsahujícími SAM doménu (59).

23

3. 2. 5. Poly-prolinová oblast (PY) V blízkosti SAM domény proteinu p73 se nachází oblast bohatá na prolin (PY).

Tato oblast je specifická pro isoformy p73α a p73β a může interagovat s SH3 a WW doménami. Interakce byla prokázána pro poly-prolinovou (PY) oblast proteinu p73α a SH3 domény non-receptorové tyrosin kinasy c-Abl (aktivuje se při poškození DNA)

(60). Byla také popsána interakce mezi isoformou p73β (oblastí AK 321 – 376) a SH3 doménou proteinu amphiphysin IIb-1 (ten inaktivuje apoptickou funkci p73β a je pravděpodobně zapojen do clathrinem-mediated endocytózy) (61).

Interakce mezi PY oblastí p73α a doménou WW byla prokázána u YAP

proteinu (Yes-associated protein). YAP je fosfoprotein interagující svou SH3

doménou s protoonkogenním proteinem c-Yes, což je non-receptorová kináza, náležící do Src-rodiny (62).

3. 3. Regulace stability a degradace proteinu p73 3. 3. 1. Interakce s proteinem MDM2 E3

ubikvitin

ligasa

MDM2

udržuje

nízkou

hladinu

proteinu

p53

zpětnovazebnou smyčkou, při které je indukována proteinem p53 a zároveň způsobuje jeho ubikvitinaci a degradaci. Protein p73 je homologní s proteinem p53 v

N-terminální oblasti zodpovědné za vazbu na MDM2. Předpokládalo se, že MDM2 se

bude stejným způsobem jako u p53 podílet na regulaci a degradaci proteinu p73. Vazba isoforem p73α a p73β na MDM2 prostřednictvím N-terminální oblasti byla

prokázána (62,63). Vazba proteinu MDM2 na p53 způsobuje degradaci proteinu p53, ovšem vazba na protein p73 nezpůsobuje degradaci, ale naopak stabilizaci proteinu

p73. Jedno z možných vysvětlení je takové, že C-terminální oblast proteinu p53, která je nezbytná pro úspěšnou MDM2-degradaci není zachována u proteinu p73 a

243 AK dlouhá C-terminální oblast proteinu p73α tak patrně inhibuje proteozomální degradaci. Inhibice degradace v proteazomech vede ke zvýšení hladiny proteinu p73α a je nezbytné ji regulovat jiným proteinem s podobnou funkcí, jakou má MDM2.

24

Na transkripční úrovni existuje určitá zpětnovazebná smyčka mezi MDM2 a

proteinem p73 – p73 aktivuje transkripci genu pro MDM2, zatímco MDM2 svou

vazbou inhibuje transkripci zprostředkovanou proteinem p73. Interakce mezi

isoformou p73α a MDM2 tedy sice inhibuje transkripční schopnost proteinu p73α, ale v menší míře, než je tomu u proteinu p53. Jedním z možných vysvětlení je to, že

interakce mezi MDM2 a p73α může zabraňovat degradaci p53 titrací MDM2 proteinu. Vysoká hladina p73α pak může vést ke stabilizaci p53 (62). 3. 3. 2. Acetylace proteinu p73 Bylo zjištěno, že při koncentraci způsobující apoptózu DNA-poškozujícího

léčiva doxorubicinu jsou konzervované lysiny proteinu p73α na pozicích 321, 327

a 331 acetylovány acetyltransferázou p300. Mutantní p73α, který nelze acetylovat,

byl exprimován v p53-null buňkách a prokázalo se, že není schopen indukce apoptózy, naproti tomu ale je schopen indukovat p21 ve stejné míře jako p73α (64).

Acetylace proteinu p73 indukovaná poškozením DNA vede ke zvýšení schopnosti

proteinu p73 aktivovat transkripci proapoptických genů a tedy aktivovat p73dependentní apoptózu.

3. 3. 3. Sumoylace proteinu p73 C-terminální lysin v poloze 627 je hlavním místem vazby SUMO-1 (molekula

podobná ubikvitinu), kovalentně se vázajícího na isoformu p73α. Experimentálně bylo zjištěno, že isoforma p73α s kovalentně navázaným SUMO-1 jsou rychleji degradovány v proteazomech než samotná p73α. SUMO-1 modifikace není in vivo

nezbytná pro degradaci proteinu p73, ale pouze zvyšuje proteozomální degradaci p73α. Vazba SUMO-1 také nezvyšuje transkripční aktivitu isoformy p73α, ale může upravovat subcelulární lokalizaci isoformy p73α nebo měnit interakce p73α s ostatními proteiny, které se SUMO-1 interagují (65).

25

3. 3. 4. Ubikvitin-dependentní degradace proteinu p73 V současnosti byl objeven protein Itch, patřící do rodiny HETC – E3 ubiqitin

ligas , který vysoce specificky váže a ubikvitinuje protein p73. Protein p73 se na WW domény proteinu Itch váže svou PY doménou. Regulace stability a degradace

prostřednictvím Itch je tedy závislá na přítomnosti oblasti bohaté na prolin (PY) a selektivní pouze pro isoformy p73 obsahující PY doménu (66). Itch tedy nemá žádný efekt na C-terminálně zkrácené isoformy p73 ani na protein p53. Exogenní

koexprese proteinu p73 a Itch vedla k rychlé degradaci proteinu p73, zatímco Itchdeficientní

buňky

prokazovaly

zvýšenou

hladinu

proteinu

p73.

Itch

tedy

pravděpodobně udržuje stálou nízkou hladinu proteinu p73, podobně jako je tomu u

MDM2-p53 regulace. Při poškození DNA se protein Itch ztrácí prostřednictvím zatím

neznámého mechanismu a umožňuje tak akumulovat protein p73 a tím spouštět jeho proapoptický efekt.

3. 3. 5. Další možnosti degradace proteinu p73 Existuje také alternativní cesta regulace stability proteinu p73. Tato cesta

specificky ovlivňuje stabilitu isoformy p73α a je zprostředkována 20S proteazomem a

regulována NAD(P)H chinon oxidoreduktasou 1 (NQO1), na rozdíl od ubikvitin-26S dependentní

regulace

(degradace

v proteazomech

26S).

Ve

skutečnosti

NADH.dependentní vazba NQO1 na protein p73 zabraňuje jeho degradaci ve 20S proteazomech a zprostředkovává akumulaci proteinu p73 jako odpověď na působení γ-záření (67).

obr. 10:

Přehled oblastí proteinu p73, které se zůčastňují protein-proteinových interakcí a nebo

podléhají posttranslačním modifikacím. (47)

26

3. 4. Funkce proteinu p73 3. 4. 1. Funkce proteinu p73 v apoptóze Apoptická funkce proteinu p73 může být zprostředkována třemi typy signálů:

onkogeny, poškozením DNA a hyperaktivací receptoru T-buněk.

Bylo prokázáno, že buněčné a virové onkogeny E2F1, c-Myc a E1A mohou

indukovat a aktivovat proteiny TAp73α a TAp73β k transaktivaci cílových genů a

zastavení růstu v p53-deficientních lidských buněčných liniích (68,69). E2F1 se váže přímo na E2F1-responzivní sekvenci uvnitř promotoru P1 genu TP73 (69).

Uvolňování proteinů E2F1 a c-Myc je jednou z nejčastěji se vyskytujících genetických poškození, které se mohou vyskytnout v lidských nádorech. To může být jednou z příčin zvýšené exprese TAp73 proteinu v nádorech.

Je známo, že poškození DNA vede k aktivaci proteinu p53. Různé induktory

poškození DNA pravděpodobně regulují také protein p73. Byly popsány dva typy

regulace – A) tyrosinová fosforylace Tyr99 (zvyšuje aktivitu proteinu p73) a B)

akumulace proteinu p73 (podmíněná fosforylací). Oba dva tyto typy regulace jsou závislé na způsobu aktivace jaderné tyrosin kinasy c-Abl (70,71).

Fosforylace proteinu p73 na Tyr99 prostřednictvím c-Abl tyrosin kinasy bylo

pozorováno in vitro nebo při transientní koexpresi (72). Při působení ionizujícího

záření (IR) byla pozorována fosforylace proteinu p73 asi po 30 minutách a ukázalo se, že pro fosforylaci proteinu p73 c-Abl tyrosin kinasou je nezbytná funkční ATM kinasa (71,73).

Cisplatina, způsobující cross-linking DNA (74), a taxol, látka stabilizující

mikrotubuly a zabraňující dokončení mitózy, indukují akumulaci proteinu p73 a

zvyšují jeho poločas rozpadu. Na lidských buňkách izolovaných z karcinomu tlustého střeva a myších embryonálních fibroblastech (MEF) bylo prokázáno, že tyrosin kinasa c-Abl a protein MLH1 (zapojený v mismatch-repair mechanismu) jsou

nezbytné pro to, aby cisplatina mohla indukovat p73, zatímco u taxolu postačovala pouze tyrosin kinasa c-Abl (9).

Ionizující záření tedy aktivuje c-Abl tyrosin kinasu rychle (asi 30 minut od

působení IR), což vede ke stimulaci tyrosinové fosforylace proteinu p73 bez ovlivnění jeho hladiny v buňce. Aktivace c-Abl prostřednictvím cisplatiny nebo taxolu

27

je pomalejší – přibližně po 6 až 18 hodinách a vede k akumulaci (podmíněné tyrosinovou fosforylací) proteinu p73 (74,75).

Po působení UV záření, actinomycinu D a methylmethan sulfonátu u různých

buněčných linií nebylo pozorováno zvýšení hladiny ani aktivace proteinu p73 (7,74).

Buňky tedy rozlišují mezi různými induktory poškození DNA. Aktivace nebo

akumulace proteinu p73 je odpovědí pouze na některé z nich a jsou řízeny různým

způsobem aktivace tyrosin kinasy c-Abl a dalšími posttranslačními modifikacemi proteinu p73.

Protein

p73

je

indukován

také

při

antigenem-indukované

apoptóze

cirkulujících periferních T-buněk po aktivaci jejich TCR receptoru a také při TNF-α

indukované apoptóze thymocytů (nedovivinuté T-buňky) (76). Naopak pro přežití

antigenem stimulovaných T-buněk je potřeba inhibice exprese p73 zprostředkovaná jaderným faktorem κB (77). Protein p73, tak pravděpodobně slouží při receptorempřenášeném apoptickém podnětu.

3. 4. 2. Funkce proteinu p73 ve vývoji a diferenciaci tkání I když homologie mezi členy p53-genové rodiny naznačuje, že by měly být

podobné funkce jako transkripční faktory, tak biologické funkce jsou pravděpodobně velmi rozdílné.

U p73-/- myší byly prokázány různé vývojové vady CNS (48). Prokazatelně u

p73-/- myší dochází ke vrozenému hydrocefalu (patologicky zvýšené množství mozkomíšního

moku

v CNS),

hippokampální

dysgenezi

(porucha

vývoje

obloučkovitého závitu ve spodní části mozku), vede ke zmizení Cajal-Retziusových neuronů (nezbytné pro vláknitou organizaci kortikálních neuronů) a k defektům

v detekci feromonů u myších samiček. Dále se u p73-/- myší projevují záněty celého trávícího

ústrojí,

doprovázeného mikrobiologickými

infekcemi,

které

je

charakteristické masivním pronikáním neutrofilů k místu zánětu. Patogeneze zatím

není známa, ale předpokládá se, že tyto záněty a infekce souvisí s poruchou

epiteliální bariérové funkce (podobně jako u cistické fibrózy). U p73-/- myší nebyla prokázána spontánní tvorba nádorů (při 2-letém pozorování) (48).

Při ektopické expresi proteinu p73 v nediferenciovaných neuronálních

buňkách (neuroblastomy) se indukuje růst neuritů a exprese neuronálních

28

diferenciačních markerů. Indukce diferenciace prostřednictvím retinoidů (deriváty vitamínu A, nezbytné pro správný rozvoj CNS) u stejných buněk byla doprovázena akumulací proteinu p73 (78). Protein p73 transaktivuje NCAM a p21 promotory, čímž

zvyšuje stálou hladinu NCAM (neural cell adhesion molecule; molekula podobná

imunoglobulinům na povrchu neuronů podílející se na růstu neuritů), p21 a neurofilamentů (79).

3. 4. 3. Funkce proteinu p73 v karcinogenezi Gen

TP73

náleží

do

předpokládaného tumor

supresorového lokusu

chromozomu 1p36.33, který často podléhá heterozygosity u nádorů plic a tlustého střeva, neuroblastomech, oligodendrogliomech a melanomech. Tento fakt společně s funkční podobností s proteinem p53 vedl původně k domnění, že TP73 je tumor supresorový gen (7). Genetická data z většiny typů nádorů (kromě leukémií a

lymfomů) nicméně vylučují p73 jako klasický Knudsonův tumor supresor (podle definice je tumor supresorový gen takový, u kterého ztráta funkce nebo exprese vede

k rozvoji nádoru). V současnosti z více než 1100 primárních nádorů má mutaci v p73 pouze asi 0,6%. Bylo objeveno zatím pouze 5 typů těchto mutantů. Dvě mutace

(P405R a P425L) byly nalezeny u neuroblastomu (79), jedna mutace (R269Q) byla nalezena u rakoviny prsu (80), jedna (P405R) byla nalezena u rakoviny plic (81) a jedna mutace (N204S) byla nalezena u nádorů CNS (82).

Studie na hematologických malignanciích ukázaly souvislost mezi velmi

nízkou expresí genu TP73 a hypermetylací 5´-netranslatované oblasti p73 mRNA

(83). Hypermethylace je považována za příčinu inaktivace TP73 genu u T- a Bbuňkami způsobených akutních lymfatických leukémiích (84), Burkittova lymfomu

(85), lymfomu NK buněk, a patrně je zapojena do rozvoje oligodendrogliálních

nádorů (86).

Při studiu hladiny proteinu p73 u různých typů primárních nádorů se ukázalo,

že mnohem častější změnou není ztráta schopnosti exprimovat protein p73, ale nádorově-specifická nadměrná exprese různých isoforem proteinu p73 (87).

U nadměrné exprese ∆Np73 se předpokládá klinický význam u nejméně

několika typů nádorů. ∆Np73 lze také použít jako prognostický faktor snížení progrese a celkového přežívání u pacientů s neuroblastomem (88).

29

4. Interakce mezi mutantními formami p53 a isoformami p73 V několika studiích bylo prokázáno, že některé mutace v DNA-vazebné

doméně proteinu p53 umožňují těmto mutantům interagovat fyzikálně i funkčně s isoformami proteinu p73 a snižovat tak schopnost některých isoforem p73 indukovat transkripci a apoptózu (89,90).

Možným vysvětlením schopnosti vazby mutantních proteinů p53 na p73, může

být změněná konformace DNA-vazebné domény u mutantních proteinů p53. Některé bodové mutace DNA-vazebné domény proteinu p53 způsobují konformační změny

v DNA-vazebné doméně a umožňují tak vazbu monoklonální protilátky PAb240. Tato protilátka rozpoznává jiný než nativní folding DNA-vazebné domény p53 (16) a tím

neschopnost vazby mutantních proteinů p53 na DNA. Pravděpodobně je tedy právě

DNA-vazebná doména proteinu p53 nezbytná pro fyzikální interakci s proteinem p73

(90). Které domény na proteinu p73 se účastní interakcí s mutantními p53 není

dosud objasněno.

Delece na C- nebo N-konci proteinu p53 neumožňují vazbu na DNA stejně

jako je tomu u mutací v DNA-vazebné doméně proteinu p53. To naznačuje, že konformační změny, podobné jako u bodových mutací uvnitř DNA vazebné domény, mohou být přenášeny i z oblastí mimo DNA-vazebnou doménu (90).

V současné době se ukazuje, že v rámci lidské populace běžně se vyskytující

polymorfismus Arg/Pro (R/P) kodonu 72 , může ovlivňovat stabilitu tvorby komplexů

mezi mutantními proteiny p53 a isoformami proteinu p73. Při studiu několika různých mutantů proteinu p53 se ukázalo, že R isoformy byly schopny interagovat a i tím i snižovat aktivitu proteinu p73 ve stejné nebo větší míře než tomu bylo u P isoforem (91).

obr. 11: Tabulka interakcí mezi wild-type p53 nebo mutovanými p53 a proteinem p73.

( - , nedetekovatelné nebo méně než 1%; +, mírná interakce (mezi 1 až 5%); +++, účinná interakce

(nad 5%)). (P) a (R) označují R/P polymorfismus kodonu 72 u daného typu mutace (pokud je znám) (90).

30

III. Cíle diplomové práce

Cílem diplomové práce bylo:

1. Příprava expresních vektorů pro proteiny p53 s polymorfismem 72 R/P 2. Sledování vlivu mutace, polymorfismu a různé C-koncové struktury proteinu p53 na jeho DNA vazebné schopnosti

3. Sledování transaktivační schopnosti různých forem proteinu p53 a funkční spolupráce s jednotlivými p73 isoformami

4. Schopnost různých forem proteinu p53 indukovat proteiny buněčného cyklu samostatně a ve spolupráci s jednotlivými p73 isoformami

31

IV. Materiál a metody Seznam přístrojů Autokláv: Systec 3150 EL, Chirana (PS20A) Blottovací aparatura: BioRad Trans-Blot SD

Centrifugy: Heraeus Instruments (Biofuge fresco, Biofuge primo R), Eppendorf (5402), Mechanika Prezyzyjna (MPW 300, MPW 360)

Detektor radioaktivního záření: Uehlinger-Pfiffner AG (series 900)

Elektroforetická aparatura: BioRad (Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis system)

Kultivační termostat (pro E.Coli): Laboratorní přístroje Praha (Biological termostat

BT120)

Kultivační termostat (pro buněčné linie): Heraeus instruments (HERA Cell)

Laminární box: Heraeus instruments (HERA Safe HS12) Míchačka: IKA (Werke RCT basic)

pH elektroda: Beckman (Φ200 pH meter) PCR cycler: Omnigene (Hybaid)

Spektrofotometr: Pharmacia LKB (Ultrospec III)

Sušička gelů: LKB Bromma (2003 slab gel dryer), Savant (SGD 2000 + GP 110) Termoblok: Biometra (TB 1)

Třepačka: New Brunswick Scientific (C76 water bath shaker), Biometra (WT 16) Ultrazvuk: Vibra Cell (VC 40)

Zdroj UV záření: Stratagene (UV Stratalinker 1800) Váhy: Precisa (XB320M), Sartorius (A200S)

Zdroje napětí: BioRad (3000 Xi, Power PAC 300, Power PAC 200), OmniBio (model P1)

Seznam chemikálií Ampicilin (Pliva)

APS (Ammonium persulfát, Fluka)

Akrylamid (N,N'-Methylenbisacrylamid, Fluka) 32

bacto-trypton (BD)

bacto-yeast extrakt (Difco)

Coomassie Briliant Blue R-250 (BioRad) DNAse I (Roche)

DTT (dithiotreitol, Sigma) D-MEM (Gibco)

ECL – detection reagent (Amersham) γ-32P-ATP (Lacomed)

Glutamin (Sevapharma) Glycin (Merck)

HEPES (Sigma)

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, Sigma) LB agar (Difco), NP40 (Fluka)

ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, Sigma)

PenStrep (Penicilin-Streptomycin, Gibco) Phosphatase inhibitor cocktail (Sigma)

PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid, Sigma) Prothease inhiditor cocktail (Sigma)

Protein Assay (pro stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové, BioRad)

Roscovitin(6-benzylamino-2(R)-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropylpurin, Cyclacell)

SDS (Sigma)

T4-polynukleotid kinasa (ICN Biomedicals)

TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin, Fluka) TRIS (Trizma-base, Sigma) Triton X-100 (Sigma) Tween 20 (Sigma)

Pro přípravu veškerých roztoků byla použita redestilovaná voda. Složení roztoků LB medium (1% bacto-trypton; 0,5% bacto-yeast extrakt, 1% NaCl, pH 7) 1x TBE pufr (89 mM Tris-borát, 2 mM EDTA, pH 7,6) 33

1x TE pufr (10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA)

1x CSB (10% glycerol, 0,06 M TRIS pH 6,8, 0,004% bromfenol blue, 2% SDS, 5% merkaptoetanol)

1x PBS (0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 6,5 mM Na2HPO4)

Seznam použitých protilátek Monoklonální protilátky 2A9 (MDM2), Bp53-10.1 (p53, proti AK oblasti 369 –

378) DO-1 (p53, proti AK oblasti 20 – 25), PC-10 (PCNA), 118 (p21) byly izolovány a charakterizovány na Základně experimentální onkologie Masarykova onkologického

ústavu v Brně. Protilátka anti-HA, je komerčně vyráběnou monoklonální protilátkou (Invitrogen).

Seznam použitých buněčných linií MCF 7 je buněčná linie původem z karcinomu prsu nesoucí wt p53.

SW837 je buněčná linie původem z karcinomu konečníku nesoucí mutaci 248W p53. RD je buněčná linie původem z karcinomu močového měchýře nesoucí mutaci 248W p53.

H1299 je buněčná linie původem z malobuněčného karcinomu plic a je p53 deficientní.

H1299-RGC-2 je p53 deficientní buněčná linie z malobuněčného karcinomu plic

stabilně transfekovaná reportérovým genem pro β-galaktosidasu pod kontrolou p53responzivního RGC promotoru.

34

1. Mutageneze Příprava R/P polymorfismu v kodonu 72 proteinu p53 pomocí QuikChange®

Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) byla provedena dle návodu. Výchozím

vektorem byl expresní vektor pcDNA3.1 nesoucí wt p53. Plazmid nese gen

rezistence na ampicilin. Mutagenezní sondy byly navrženy pomocí softwaru Oligo 6.6 a syntetizovány firmou East Port. Pořadí kodonu

Původní sekvence wt p53:

68

69 70

71 72(R) 73

74

75

76

gag gct gct ccc CGC gtg gcc cct gca

Primery:

72-P-sens : 5´-GAG GCT GCT CCC CCA GTG GCC CCT GCA-3´

72-P-antisens: 5´-TGC AGG GGC CAC TGG GGG AGC AGC CTC-3´

Tm = 75,6°C (melting temperature; teplota denaturace resp. renaturace

dvouřetězcové struktury)

PCR reakce byla provedena podle návodu. Pro optimalizaci PCR reakce byla

volena rozdílná koncentrace templátu (plazmid pcDNA3.1 wt p53) při ponechání

konstantní koncentrace primerů Na optimalizaci PCR reakce o objemu 50µl bylo použito 125 ng primeru 72-P-sens, 125 ng primeru 72-P-antisens a různá množství templátu v hodnotách 5, 10, 20 a 50 ng. Dalším optimalizačním parametrem byla

teplota annealingu (teplota připojení primerů k templátu, krok 2 ve druhém bloku), kterou jsme volili vyšší než výrobcem udávaných 55°C vzhledem k vysoké Tm našich

primerů (optimální teplota annealingu je přibližně Tm - 5°C). Ostatní teploty a počet cyklů byly předepsány výrobcem a v posledním kroku 2. bloku se volil čas podle délky plazmidu (v našem případě 6,5kb) 1min/kb délky plazmidu.

1. blok 2. blok

Počet cyklů 1 16

35

Teplota 98°C 95°C 68°C 72°C

čas 30 sek. 30 sek. 1 min. 6:30 min.

K výslednému produktu se přidával 1µl Dpn I restriktázy (pro odštěpení

původního DNA templátu) a nechal se inkubovat na ledu 30 minut. Výsledný produkt

jsme ověřovali transformací do kompetentních buněk DH5α nesoucích gen pro rezistenci k ampicilinu a vysetím na aragarové misky obsahující ampicilin.

Kontrolní mutageneze se provádí pomocí kontrolnícho plazmidu pWhitescript

a kontrolních sens a antisens primerů (dodávaných výrobcem). Po provedení PCR

reakce pro kontrolní mutagenezi dle návodu a naštěpení Dpn I restriktázou, se pro ověření úspěšnosti mutageneze vzniklý produkt transformoval do XL1-Blue

kompetentních buněk. Buňky po transformaci byly vysety na agarové misky

obsahující IPTG a X-gal. Po 24 hodinové inkubaci při 37°C se pak pozoruje tvorba

modrých kolonií. Ty vznikají přeměnou substrátu X-gal pomocí funkční βgalaktosidasy

pWhitescript).

(vzniklé

mutagenezí

pomocí

Plazmidy pcDNA3.1 175H(R)p53

a

kontrolních

primerů

pcDNA3.1 175H(P)p53

a

plazmidu

nesoucí R/P

polymorfismus kodonu 72 byly na našem pracovišti k disopozici a daly se proto použít pro následné experimenty.

2. Příprava a izolace plazmidové DNA 2. 1. Příprava kompetentních buněk Kultura E.Coli DH5α (kultivovaná v LB mediu bez přídavku ampicilinu) při A600

≅ 0,4 byla centrifugována (6000g/10 minut/4°C) a pelet resuspendován v ledovém

CAP-pufru (60 mM CaCl2, 15% glycerol, 10 mM PIPES), následně byly buňky

inkubovány cca 60 minut na ledu a dále skladovány a uchovávány při -20°C. 2. 2. Transformace buněk

Zahuštěné buňky v CAP-pufru transformujeme tepelným šokem. Plazmid

s kompetentními buňkami (1 µg plazmidu na 50 µl komeptentních buněk) inkubujeme

30 minut na ledu, směs přemístíme na 45s do 42 °C a následně opět ochladíme na ledu na 1 minutu. Natransformované buňky necháme 2 hodiny třepat při 37 °C v LB

36

médiu a následně vyséváme na misky s LB agarem obsahujícím ampicilin (100µg/ml).

2. 3. Izolace plazmidu Vybrané kolonie byly po kultivaci použity pro izolaci plazmidů pomocí Qiagen®

Plasmid Maxi Kit dle návodu. Získaná DNA byla vysrážena isopropanolem, promyta

70 % etanolem a po vysušení na vzduchu rozpuštěna v PCR vodě (speciálně redestilovaná, deionizovaná voda neobsahující endonukleásy, používaná pro PCR reakce).

Koncentrace plazmidové DNA byla zjištěna na spektrofotometru při vlnové

délce 260 nm. Platí, že A260 = 1 odpovídá c(DNA) = 50 µg/ml. Kontrola kvality

vyizolovaného plazmidu byla provedena v 1 % agarózovém gelu v 1 x TBE pufru při

napětí 80 V a vizualizace byla provedena barvením etidiumbromidem a vizualizací

pomocí UV záření. Purifikované plazmidy byly použity pro transientní transfekci do buněčných linií (H1299, H1299-RGC-2).

3. Příprava jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií Byly vybrány buněčné linie obsahující mutaci v jedné aminokyselině DNA-

vazebné domény proteinu p53 – RD (248W), SW 837 (248W) a buněčná linie MCF-7 obsahující wt p53.

3. 1. Kultivace buněčných linií MCF 7, RD, SW 387 a H1299-p53β Buňky buněčných linií MCF 7, RD, SW 387 a H1299-p53β byly pěstovány

v médiu D-MEM (Dulbeco's modified Eagle's medium; s 10 % hovězím fetálním sérem, 1 % PenStrep a 300 mg glutaminu/l

média) při 37 °C s 5 % CO2. Při

maximální konfluenci byly všechny buňky za sterilních podmínek sklizeny

seškrábáním do média a uloženy na ledu. Následnou centrifugací (1300 g/10 minut/4°C) byly získány pelety buněk, které byly zamraženy v tekutém dusíku a uchovány při -80°C.

37

3. 2. Kultivace buněčné linie MCF 7 s indukovanou hladinou p53 Buňky buněčné linie MCF 7 byly pěstovány v médiu D-MEM (Dulbeco's

modified Eagle's medium; s 10 % hovězím fetálním sérem, 1 % PenStrep (směs

antibiotik penicilinu a streptomycinu) a 300 mg glutaminu/l média) při 37 °C s 5 % CO2. Při 80 % konfluenci byly buňky po odsátí média ozářeny 40 J.m-2 UV zářením a

do čerstvého média byl přidán roscovitin do výsledné koncentrace 20 mM. 24 hodin po ozáření byly všechny buňky za sterilních podmínek sklizeny seškrábáním do

média a uloženy na ledu. Následnou centrifugací (1300 g/10 minut/4°C) byly získány pelety buněk, které byly zamraženy v tekutém dusíku a uchovány při -80°C. 3. 3. Izolace cytosolických a jaderných proteinů Získané pelety byly promyty PBS a rozsuspendovány v 100 µl pufru (40 mM

HEPES pH 7,6, 40 % glycerol, 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,4 mM EDTA, 0,1 %

NP40, 1 mM DTT, 0,5 mM). Po centrifugaci (1300 g/5 minut/4°C) byl odebrán supernatant (obsahující cytosolické proteiny) a pelet byl rozsuspendován ve 100 µl

téhož pufru s doplněním koncentrace NaCl na 0,5 M pro solubilizaci jaderných

proteinů. Po centrifugaci (14 000 g/15 minut/4 °C) byl odebrán supernatant (obsahující jaderné proteiny). Takto připravené frakce byly uchovávány pří -80 °C.

Ve všech získaných frakcích byla změřena koncentrace proteinu metodou dle Bradfordové

a

všechny

frakce

byly

analyzovány

SDS-PAGE

s imunodetekcí p53, pro potvrzení přítomnosti proteinu p53 ve frakcích.

v kombinaci

4. Příprava IVTT proteinů Pro přípravu proteinů metodou in vitro transkripce a translace byl použit

systém

TNT®

Quick

Coupled

Transcription/Translation

systems

(Promega)

využívající jako základ lyzát králičích retikulocytů. Jako templáty byly použity plazmidy pcDNA3.1 pro eukaryontní expresi nesoucí wt p53, mutované p53. Pro isoformy p73 byly použity plazmidy pcDNA3.1 obsahující geny pro isoformy p73

značené HA-tagem (ten je rozpoznáván Anti-HA protilátkou). Reakční směs i pracovní postup dle návodu.

38

Po reakci byla směs proteinů rozdělena SDS-PAGE, proteiny přeneseny na

membránu pomocí western blotingu a následně ověřena přítomnost proteinu detekcí monoklonální protilátkou.

5. SDS-PAGE + Western bloting 5. 1. SDS-PAGE Pro denaturační gelovou elektroforézu v polyakrylamidovém gelu byla použita

aparatura firmy BioRad. K izoelektrické fokusaci slouží 5 % polyakrylamidový gel (5%

N,N'-Methylenbisacrylamid, 0,125 M TRIS-HCl pH 6,8, 0,4% SDS) a k následné separaci 10 % polyakrylamidový gel (10% N,N'-Methylenbisacrylamid, 0,37 M TRISHCl pH 8,8, 0,4% SDS). Pro zpolymerování byl použit 10% APS a TEMED.

Elektroforetický pufr obsahuje 25 mM TRIS, 0,2 M glycin, 0,1 % SDS. Vzorky proteinů se před nanesením na gel smíchají v poměru 1:1 s 2x CSB (20% glycerol, 0,12 M TRIS pH 6,8, 0,008% bromfenol blue, 4% SDS, 10% merkaptoetanol) a 3 minuty povaří ve vodní lázni. Proteiny se fokusují při konstantním napětí 80 V a separují při konstantím napětí 120 V při laboratorní teplotě. 5. 2. Western bloting Po SDS-PAGE se proteiny převedly na membránu pomocí blottovací

aparatury BioRad Trans-Blot (semi-dry bloting). Gel s rozseparovanými proteiny se

nechá 10 min. ekvilibrovat v blotovacím pufru (39 mM glycin, 48 mM Tris, 0,04%

SDS, 10% methanol) vychlazeném na 4 - 8°C. Na spodní část aparatury (anoda) se vloží 3 vrstvy filtračního papíru (Whatman) (ekvilibrovaného 10 min v blotovacím

pufru vychlazeném na 4 - 8°C), na ně polyvinyldifluoridová membrána (ekvilibrovaná 10 min v blotovacím pufru vychlazeném na 4 - 8°C), na ně polyakrylamidový gel s

proteiny a opět 3 vrstvy filtračního papíru (Whatman) a přiloží se svrchní část aparatura (katoda). Semi-dry bloting probíhá při konstantním proudu (0,1A na 1

membránu o velikosti 5x9 cm) 80 minut.

39

6. Imunodetekce proteinů na membráně Po přenesení proteinu na membránu se membrána nechala 1 hodinu blokovat

v 5% roztoku sušeného odtučněného mléka v PBS s 0,1% Tween 20. Poté se

zablokovaná membrána promyla v PBS a byla na ni nanesena primární protilátka (koncentrace 1µg protilátky/1ml 5% roztoku sušeného mléka) a nechala se inkubovat při 4°C přes noc. Po inkubaci se membrána promyla nejdříve 2x v PBS, 1x v PBS

s 0,1% Tween 20 a nakonec 1x v PBS a na membránu byla nanesena sekundární protilátka (značená peroxidázou; koncentrace 1µg protilátky/1ml 5% roztoku

sušeného mléka) a nechala se inkubovat 1h při laboratorní teplotě. Po inkubaci se sekundární protilátkou se membrána promyla stejným způsobem jako po inkubaci s primární protilátkou. Značené proteiny byly vizualizovány metodou ECL (Amersham Biosciences). Vyvolaná chemiluminiscence byla exponována na Hyperfilm MP (Amersham Biosciences)

7. EMSA (electromobility shift assay) Ke zjištění schopnosti proteinů vázat se na DNA v in vitro podmínkách byla

využita electromobility shift assay. Pro všechny DNA vazebně experimenty byly použity sens a anti-sens oligonukleotidy a obsahovaly tyto sekvence: bax: TCACAAGTTAGAGACAAGCCTGGGCGTGGGCTATATT gadd45: GAACATGTCTAAGCATGCTG mdm2: GGTCAAGTTGGGACACGTCC CON: AGACATGCCTAGACATGCCT p21: GAACATGTCCCAACATGTTG

Jako kompetitorová DNA k zabránění nespecifické vazby na DNA byl použit

plazmid pBluescript štěpený endonukleasou SmaI (plazmid obsahuje jedno cílové místo pro tuto restrikční endonukleasu).

40

7. 1. Značení oligonukleotidu 32P Pro značení oligonukleotidu byla použita T4-polynukleotid kinasa. Reakční

směs obsahovala v celkovém objemu 10 µl: 1 µl 10x T4-polynukleotid kinasy (odpovídá 10 U), 1 µl 10x pufru pro tuto kinasu, 100-500 ng DNA (2 ng na jednu

reakční směs pro EMSA) a 3 µl [γ-32P]ATP. Po 1 hodině inkubace při 37 °C byla reakce zastavena 25 µl vymražené srážecí směsi (obsahující 100 % etanolu a 4 M octan amonný v poměru 24:1) a následně inkubována 30 minut při -20 °C nebo přes noc.

Vysrážená DNA byla následně centrifugována (14 000 g/20 minut), po

odstranění supernatantu promyta ve 25 µl 80 % etanolu a po centrifugaci (14 000 g/20 minut) 15 minut vysušena volně na vzduchu. Následně byla rozpuštěna

v redestilované vodě na výslednou koncentraci 2 ng/µl a po 30 minutové rekonstituci

uchovávána při -20 °C v bezpečnostní patroně. Při manipulaci s

[γ-32P]ATP se

pracovalo v digestoři a byl používán plexisklový štít pro ochranu před radioaktivním zářením.

7. 2. Specifická vazba proteinu na DNA Vazba proteinů na DNA probíhá v reakční směsi o objemu 20 µl, obsahuje 10

µl 2x vazebného pufru (1x vazebný pufr: 20 % glycerol, 1 mg/ml BSA, 5 mM DTT, 50

mM KCl a 0,1 % Triton X-100) s požadovaným množstvím proteinu a případně s 200 ng purifikované monoklonální protilátky. Po přidání 2 ng značené DNA a 20 ng kompetitorové DNA (plazmid pBluescript štěpený SmaI) se směs doplní na objem 20

µl, inkubuje 30 minut při požadované teplotě (0 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C). Po přídavku

4 µl 6x LB (nanášecí pufr: 40 % sacharosa, 0,2 % bromfenolová modř a 0,2 %

xylencyanolová oranž) je vzorek připraven k elektroforéze. 7. 3. Elektroforéza

Elektroforéza probíhá v 4 % polyakrylamidovém gelu (v 0,5x TBE) v kombinaci

s 16 % polakrylamidovým gelem (v 0,5x TBE) sloužícímu k zachycení oligonukleotidu bez navázaného proteinu. Elektroforéza (aparatura BioRad) v 0,33x TBE probíhá ve

4 °C při konstantním napětí 200 V dvě hodiny. Poté jsou gely převedeny na filtrační 41

papír (Wattman) a po usušení založeny do kazety s filmem (Hyperfilm, Amersham

Biosciences) k expozici podle potřeby.

8. Kultivace a transientní transfekce buněčné linie H1299-RGC-2 pro β-galaktosidasovou assay

Buňky buněčné linie H1299-RGC-2 byly pěstovány v médiu D-MEM

(Dulbeco's modified Eagle's medium; s 10 % hovězím fetálním sérem, 1 % PenStrep

a 300 mg glutaminu/l média) při 37 °C s 5 % CO2. Při 80 % konfluenci byla byla

provedena transientní transfekce za použití Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Na misku o průměru 5 cm bylo do objemu 2 ml bezsérového D-MEM média přidáno 400 µl transfekční směsi obsahující 8 µl Lipofectaminu a 3,5 µg plazmidové DNA. Kontrolní buňky byly transfekovány prázdným plazmidem pBlue, stejným způsobem

jako jako u transfekovaných buněk. 6 hodin po transfekci bylo buňkám vyměněno

médium za kompletní D-MEM (i s fetálním sérem). 24 hodin po transfekci byly buňky

seškrabány do média, promyty PBS a pelety po centrifugaci (1300 g/10 minut) použity na β-galaktosidasovou assay. 8. 1. β-galaktosidasová assay Pelet buněk z jedné 5 cm misky byl rozsuspendován ve 100 µl 0,25 M TRIS-

HCl pH 7,5 a sonikován dvěma 2s pulzy pomocí utrazvuku. Po centrifugaci (14000

g/30 minut/4°C) byl supernatant odebrán a byla změřena koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové.

Reakční směs pro zjištění transkripční aktivity proteinu p53, proteinu p73 a

kombinací p53 s p73 obsahovala v celkovém objemu 300 µl: 150 µl 0,2 M fosfátový

pufr pH 7,5 (výsledná koncentrace 0,1 M), 66 µl 1x ONPG (4 mg/ml v 0,1 M

fosfátovém pufru), 3 µl 100 x Mg (0,1 M MgCl2, 4,5 M merkaptoetanol) a 81 µl supernatantu (roztok proteinů). Reakce byla inkubována 3 hodiny při 37 °C a

následně zastavena přídavkem 0,5 ml 1M Na2CO3. Výsledek reakce byl

kvantifikován měřením absorbance při 420 nm a výsledná absorbance přepočtena na 100 µg proteinu. Každý vzorek byl měřen nezávisle ve třech paralelkách a byl vyhodnocen průměr.

42

9. Kultivace a transientní transfekce buněčné linie H1299 pro detekci aktivace transkripce proteinů MDM2 a p21

Buňky buněčné linie H1299 byly pěstovány v médiu D-MEM (Dulbeco's

modified Eagle's medium; s 10 % hovězím fetálním sérem, 1 % PenStrep a 300 mg

glutaminu/l média) při 37 °C s 5 % CO2. Při 80 % konfluenci byly transfekovány za

použití Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Na jamku ve 24 jamkové desce bylo do objemu 0,5 ml bezsérového D-MEM média přidáno 100 µl transfekční směsi obsahující 2 µl Lipofectaminu a 0,88 µg plazmidové DNA. 6 hodin po transfekci bylo

buňkám vyměněno médium za kompletní D-MEM (i s fetálním sérem). Kontrolní buňky nebyly transfekovány, bylo jim pouze vyměněno médium stejným způsobem jako transfekovaným buňkám.

24 hodin po transfekci byly mrtvé buňky plovoucí v médiu sklizeny centrifugací

(1300 g/10 minut) a pelet po promytí PBS rozsuspendován v 10 µl horkého 1xCSB.

Buňky adherované na povrchu jamky byly omyty PBS a zlyzovány 50 µl horkého

1xCSB. Lyzáty buněk z média a povrchu jamky byly spojeny a uchovány při -20°C pro následnou analýzu.

43

V. Výsledky a diskuse 1. Příprava expresních vektorů pro proteiny p53 s polymorfismem 72 R/P V současné době se ukazuje, že v rámci lidské populace běžně se vyskytující

polymorfismus Arg/Pro (R/P) kodonu 72 , může ovlivňovat stabilitu tvorby komplexů mezi mutantními proteiny p53 a isoformami proteinu p73. Proto pro studium této

problematiky bylo nezbytné připravit připravit plazmidy pcDNA3.1 kódující různé formy proteinu p53 obsahující v oblasti kodonu 72 Arg (R) nebo Pro (P).

Při mutagenezi a následné transformaci produktu mutageneze se nám na

pozorovaných miskách po 24 hodinové inkubaci při 37°C neobjevila žádná kolonie natransformovaných buněk, což značilo negativní výsledek.

Proto jsme provedli kontrolní mutagenezi (dodávanou výrobcem) pomocí

kontrolního plazmidu pWhitescript a kontrolních sens a antisens primerů, kterou se nám podařilo provést s pozitivním výsledkem (tvorba modrých kolonií po transformaci a vysetí na agarové misky obsahující X-gal).

Můžeme se domnívat, že negativní výsledek mutageneze, pro přípravu

plazmidů pcDNA3.1 kódujících různé formy proteinu p53 obsahující v oblasti kodonu 72 Arg (R) nebo Pro (P), mohl být způsoben: přítomností velkého množství G a C

nukleotidů v navržených oligonukleotidových primerech (74,1%), které zvyšují teplotu Tm a znesnadňují nasednutí navržených oligonukleotidových primerů 72-P-sens a 72-P-antisens na teplát DNA a tím pádem i náslenou amplifikaci pomocí PCR; nebo

tím že nebyla správným způsobem zoptimalizovaná PCR, kterou možná s danými

probami zoptimalizovat nelze, přičemž navrhnout jiné proby není vzhledem k dané oblasti jednoduché; přes pozitivní výsledek kontrolní mutageneze nelze také úplně vyloučit chybu v provedení.

44

2. Studium DNA vazebných schopností in vitro Pro studium schopnosti vazby na sekvenci DNA v in vitro podmínkách byla

využita electromobility shift assay za použití

32

P-značených oligonukleotidů, in vitro

transkribovaných/translatovaných proteinů (p73β, p73δ, wtp53, mutantní p53,

isoforma p53β) a buněčných lyzátů (cytosolických a jaderných frakcí) buněčných linií

nesoucích wtp53, mutantní p53 nebo transientně transfekovaných isoformou p53β.

Výsledky získané s použitím IVTT proteinů mohou být zkresleny nepřítomností

posttranslačních modifikací, protein/proteinových interakcí a dalších vlivů, které

in vivo významně ovlivňují aktivitu a funkčnost proteinů. Proto jsme přistoupili

k přípravě jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií obsahující wtp53, mutantní p53 nebo isoformu p53β. Takovéto proteiny jsou již ovlivněny komplexním pozadím buněčného lyzátu nádorové buňky.

Na zakládě výsledku předchozích experimentů prováděných na našem

pracovišti Mgr. Pavlou Češkovou PhD. byly pro následující EMSA experimenty

vybrány pouze in vitro transkribované/translatované isoformy p73β a p73δ, protože jsou schopny vazby na DNA v in vitro podmínkách.

obr. 12: Sekvenčně specifická vazba IVTT isoforem p73 na DNA. Jako pozitivní kontrola byl použit

purifikovaný hmyzí Sf9p53 protein (eukaryotický translační aparát Sf9 buněk poskytuje posttranslační modifikace typické pro eukaryotické buňky a nezbytné pro vazbu wtp53 na DNA).

45

2. 1. Příprava IVTT proteinů Pomocí in vitro transkribce/translace byly připraveny proteiny p73β, p73δ,

wtp53, 285K, p53β, 175H(R) a 175H(P). Získané proteinové vzorky byly testovány na přítomnost proteinu p53 nebo proteinu p73.

obr. 13: Imunodetekce proteinů p53 a p73 připravených in vitro transkribcí/translací. 1 µl IVTT reakční směsi byl analyzován pomocí SDS-PAGE a western blotingu. Byly použity specifické protilátky DO-1 (p53) a anti-HA (p73).

2. 2. Izolace jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií Byly připraveny buněčné lyzáty (cytosolické a jaderné frakce) linií obsahující

mutaci proteinu p53 – 248W (buněčné linie RD, SW 837) a v případě proteinu p53β byla

použita

linie

H1299

s požadovaným genem.

(p53-/-)

tranzientně

transfekována

plazmidem

Buňky linie MCF7 nesoucí wt p53 mají přirozeně velmi nízkou hladinu wtp53,

z důvodu krátkého poločasu života tohoto proteinu. Proto pokud chceme zvýšit jeho

hladinu, je nutné působit na buňky MCF7 stresovými faktory (UV, roscovitin), které vyvolají stabilizaci a akumulaci wtp53 proteinu. Působení UV záření na buňky linie

MCF7 nesoucí wt p53 vyvolává translokaci proteinu p53 z cytoplazmy do jádra, kde působí jako transkripční faktor. Proto je jeho hladina v jaderné frakci vyšší než v cytosolické.

46

Buněčné linie nesoucí mutovaný protein p53 vykazují vyšší hladiny proteinu i

bez stabilizace působením stresových faktorů z důvodu absence zpětnovazebné

regulační smyčky (nefunkční protein p53 není schopen aktivovat transkripci proteinu

MDM2, který ho značí k degradaci). Dochází tak k pomalejší degradaci mutovaných proteinů p53 a v buňce dochází k jejich hromadění.

obr. 14: Potvrzení exprese wt p53 a mutantních forem p53 v cytosolických (A) a jaderných (B) frakcích

buněčných liní. 5 µl proteinového lyzátu z jaderné a cytosolické bylo analyzováno pomocí SDS-PAGE

a p53 specifické protilátky DO-1.

2. 3. Studium DNA vazebných schopností wt p53 a mutantních p53 připravených in vitro transkripcí/translací

Výsledky experimentu ukazují, že wt p53, mutantní formy p53 ani isoforma

p53β připravené in vitro transkripcí/translací nejsou schopny vazby na DNA bez předchozí aktivace. Protilátka Bp53.10 svou vazbou na C-terminální oblast aktivuje

wt p53 k vazbě na DNA. Aktivace k vazbě na DNA neproběhla v případě mutovaných

forem p53. Protilátka Bp53.10 není schopna vazby a tedy ani aktivace proteinu p53β, protože delece v C-terminální oblasti p53β zahrnují i oblast vazby Bp53.10.

47

obr. 15: Sekvenčně specifická vazba IVTT proteinů p53 na DNA. Sekvečně specifické vazby je schopen pouze wtp53 po aktivaci protilátkou Bp53.10. Jako pozitivní kontrola byl použit purifikovaný hmyzí Sf9p53 protein.

2. 4. Studium DNA vazebných schopností isoforem p73 s různými formami proteinu p53

Metodou in vitro transkripce/translace připravené isoformy p73β a p73δ byly

kombinovány s různými formami proteinu p53 připravenými také

in vitro

transkripcí/translací. Předpokladem experimentu byl vznik komplexu mezi mutantními p53 a isoformami p73.

Výsledky experimentů s IVTT proteiny ukazují, že samostatné isoformy p73β a

p73δ jsou schopny vazby na DNA. Supershift s anti-HA protilátkou potvrdil specifitu

vazby isoforem p73β a p73δ. V přítomnosti protilátky Bp53.10 nedošlo ke tvorbě

nového bandu u samostatných isoforem p73β a p73δ ani u kombinací isoforem p73β

a p73δ s mutantními 285K, 175H(P), 175H(R) ani u kombinace isoforem p73β a p73δ s isoformou p53β. Přítomné bandy mají stejný shift jako bandy samostatných isoforem p73β a p73δ a pravděpodobně tedy náleží těmto samostatným isoformám

p73β a p73δ. Můžeme tedy usuzovat, že mutantní formy 285K, 175H(P), 175H(R)

ani isoforma p53β netvoří s isoformami p73β a p73δ komplex schopný vazby na DNA.

Kombinace isoforem p73β nebo p73δ s wt p53 v přítomnosti protilátky

Bp53.10 vedla ke vzniku bandu s jiným shiftem než mají samostané isoformy p73.

48

V předchozích experimentech jsme prokázali, že protilátka Bp53.10 aktivuje

IVTT protein wt p53 k vazbě na DNA. Tento komplex (wt p53 + Bp53.10) se v přítomnosti isoformy p73β pravděpodobně váže na značené oligonukleotidy obsahující p53-responzivní elementy a vytváří samostatný band. Vazba samostatné

isoformy p73β je v tomto případě obtížně pozorovatelná. Můžeme tedy usuzovat, že nově vzniklý band náleží wt p53 aktivovanému protilátkou Bp53.10. U isoformy p73δ

v kombinaci s wt p53 za přítomnosti protilátky Bp53.10 jsou pozorovatelné dva bandy - spodní band náleží samostatné isoformě p73δ a horní band pravděpodobně náleží wt p53 aktivovanému protilátkou Bp53.10.

obr. 16: Sekvenčně specifická vazba samostatného proteinu p73β a kombinací p73β s různými

formami proteinu p53. Specifita vazby p73β byla potvrzena anti-HA protilátkou. Červená šipka

označuje komplex wtp53 + Bp53.10, ve kterém je IVTT wtp53 protein aktivován protilátkou Bp53.10 k vazbě na DNA.

obr. 17: Sekvenčně specifická vazba samostatného proteinu p73δ a kombinací p73δ s různými formami proteinu p53. Specifita vazby p73δ byla potvrzena anti-HA protilátkou. Červená šipka

označuje komplex wtp53 + Bp53.10, ve kterém je IVTT wtp53 protein aktivován protilátkou Bp53.10 k vazbě na DNA.

49

Výsledky získané s použitím IVTT proteinů nám neprokázaly tvorbu komplexů mezi isoformami p73 a mutantními proteiny p53.

2. 5. Studium DNA vazebných schopností isoforem p73 (IVTT) s jadernými a cytosolickými lyzáty buněčných linií nesoucích wtp53 nebo mutantní p53

Přistoupili jsme k přípravě jaderných a cytosolických frakcí buněčných linií

obsahující wt p53, mutantní p53 nebo isoformu p53β, u kterých jsme sledovali schopnost sekvenčně specifické vazby samostatně a v kombinaci s in vitro transkribovanou/translatovanou isoformou p73δ

Při tomto experimentu jsme použili kombinaci IVTT proteinu (p73δ)

s cytosolickými a jadernými extrakty buněčných linií nesoucích různé formy proteinu p53 (wt p53, 248Wp53) a buněčnou linii H1299 (p53-/-) transientně transfekovanou isformou p53β.

Použití cytosolického nebo jaderného proteinového ektraktu znesnadňuje

vyhodnocení experimentu v důsledku množství nespecifických vlivů a je možno

pracovat pouze s izoformou p73δ, která při porovnání s p73β putuje při elektroforéze v polyakryamidovém gelu rychleji a její band je identifikovatelný i přes silné pozadí. Sekvenčně specifická vazba isoformy p73δ byla prokázána supershiftem protilátkou anti-HA u kombinací isoformy p73δ s jadernými a cytosolickými frakcemi všech

použitých buněčných linií. Sekvenčně specifická vazba samostatné isoformy p73δ

(bez přítomnosti anti-HA protilátky) není pozorovatelná pouze v případě přítomnosti cytosolického nebo jaderného lyzátu buněčné linie SW 837 (na rozdíl od linie RD nesoucí

stejnou

mutaci 248W),

což

může

být

způsobeno

specfickým

či

nespecifickým vyvázáním proteinu p73δ na další proteiny v cytosolické či jaderné

frakci buněčné linie SW 837 a tím inhibici její DNA vazebné schopnosti. Tato inhibice

se ale neprojeví v přítomnosti anti-HA protilátky, interpretace těchto pozorování nicméně vyžaduje další experimenty.

Kvůli velkému nespecifickému pozadí, které znesnadňuje vyhodnocení bylo

upuštěno od dalších experimentů.

50

obr. 18: DNA vazebná schopnost p73 δ (IVTT) a cytosolických extraktů buněčných linií.

obr. 19: DNA vazebná schopnost p73 δ (IVTT) a jaderných extraktů buněčných linií

51

3. Studium DNA vazebných schopností v podmínkách ex vivo Ke studiu transkripčně aktivačních schopností isoforem proteinu p73

v přítomnosti mutantních proteinů p53 ex vivo bylo využito reportérového genu pro β-galaktosidasu

pod

kontrolou

p53-responzivního

transfekovaného do p53 deficientních buněk H1299.

RGC

promotoru

stabilně

Na základě předchozích experimentů, prováděných na našem pracovišti Mgr.

Pavlou Češkovou, PhD., byla pro sledováni interakce s mutantními formami proteinu p53 vybrána transaktivačně nejsilnější isoforma p73β.

3. 1. Vyhodnocení schopnosti transaktivace p73β v kombinaci s různými formami proteinu p53

Ø A420 (na 100µg prot.) 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040

p73β + p53β

p73β + wtp53

p73β + 285K

p73β + 175H(P)

p73β + 175H(R)

p73β + 273H

p73β + 249S

p73β + 248W

p53β

wt p53

285K

175H(P)

175H(R)

273H

249S

248W

0,000

p73β

0,020

obr. 20: Průměrné hodnoty absorbance získané ze tří nezávislých měření, od kterých byly odečteny hodnoty kontroly (buňky transfekované prázdným plazmidem pBlue). Znázorněna je směrodatná odchylka

β-galaktosidasová assay sleduje snadno měřitelnou aktivitu enzymu, jehož

transkripce je aktivována prostřednictvím p53-responzivního RGC promotoru přímo v buňce.

Experiment ex vivo potvrdil, že mutantní formy proteinu p53 nejsou

samostatně schopny transaktivace. Protein p53β vykazuje v tomto experimentu 52

stejné vlastnosti jako v DNA-vazebné oblasti mutované proteiny p53, což může být způsobeno delecí v C-koncové doméně. Ta může způsobovat změnu v konformaci DNA-vazebné domény vedoucí k neschopnosti transaktivovat RGC promotor.

Při porovnámí schopnosti transaktivace proteinu wt p53 a isoformy p73β je

zřejmé, že isoforma p73β je schopna transaktivace ve větší míře než je tomu u

proteinu wt p53. V případě koexprese isoformy p73β s proteinem wt p53 je ale intenzita transaktivace srovnatelná s intenzitou indukovanou pouze proteinem wt

p53. Vzhledem k v literatuře udávanému faktu, že nedochází k interakci mezi

proteinem wt p53 a isoformou p73β, můžeme spekulovat, že protein wt p53 se na RGC promotor váže specifičtěji než isoforma p73β, nicméně je schopen transaktivace v menší míře.

Při koexpresi isoformy p73β s mutovanými proteiny p53 je výsledná intenzita

transaktivace přibližně 70%-ní ve srovnání se samostatnou isoformou p73β, výrazné snížení

hladiny

transaktivace

s mutantem 248W a 273H.

proteinu

p73β

bylo

pozorováno

v kombinaci

Vzhledem k literaturou udávanému faktu, že mutant 248W fyzikálně interaguje

s proteinem p73 (90), můžeme usuzovat, že výrazné snížení hladiny transaktivace isoformy p73β může být způsobeno i přímou interakcí s mutantem 248W. Jejím

výsledkem pak může být snížení schopnosti isoformy p73β transaktivovat cílové geny a podílet se tak na indukci apoptózy a zástavě buněčného cyklu.

Mutant 273H podle dostupných literárních zdrojů při ektopické koexpresi

s proteinem p73 pravděpodobně neinteraguje

(90). To je zajímavé při porovnání

s našimi výsledky, kde se ukázalo statisticky významné snížení transaktivace při

koexpresi s isoformou p73β, které by mohlo být způsobeno i přímou interakcí s mutantem 273H. Tyto rozdíly mezi výsledky našeho experimentu a výsledky ostatních pracovních skupin mohou být způsobeny použitým experimentálním

systémem s RGC promotorem a pro potvrzení námi získaných výsledků by bylo třeba použít jiný experimentální systém s jiným p53-responzivním promotorem (např. p21, bax).

U některých typů mutantů p53 se navíc předpokládá vliv R/P polymorfismu

kodonu 72 na schopnost interagovat s proteinem p73 (91). V literatuře je popisována schopnost mutanta 175H(R) interagovat s proteinem p73 při ektopické koexpresi,

zatímco schopnost interakce proteinu p73 s mutantem 175H(P) v dostupné literatuře nebyla popsána. V našem ex vivo experimentu se ukázalo, že intenzita transaktivace 53

při koexpresi mutantů 175H(R) nebo 175H(P) s p73β byla srovnatelná a na základě tohoto výsledku můžeme spekulovat, že přirozeně se vyskytující R/P

polymorfismus kodonu 72 u mutace 175H nemá vliv na schopnost inhibice transaktivačního potenciálu p73β, nicméně pro potvrzení této domněnky by bylo třeba ještě dalších experimentů. .

Experiment ex vivo potvrdil, že všechny použité typy mutací proteinu p53 i

delece v C-terminální oblasti u proteinu p53β způsobují neschopnost proteinu p53 transaktivovat p53-responzivní RGC promotor. Můžeme se tedy domnívat, že

k inhibici transaktivace p73β v kombinaci s mutanty 249S, 175H(R), 175H(P), 285K i s isoformou p53β dochází nějakým nespecifickým způsobem (např. zbytkovou vazebnou aktivitou mutovaných proteinů). Pozorované výrazné snížení hladiny

transaktivace isoformy p73β v přítomnosti mutantů 248W a 273H je zajímavé také

z hlediska toho, že oba tito mutanti patří mezi DNA-kontaktní mutanty a mají nativní konformaci DNA vazebné domény. Přičemž byla ukázána korelace mezi schopností

mutatních p53 fyzikálně interagovat s proteinem p73 a vázat se na protilátku PAb240 (rozpoznávající změněnou konformaci DNA vazebné domény). (90)

Studium DNA vazebných schopností in vitro (EMSA) s IVTT proteiny je

vhodné pro posouzení schopnosti fyzikální interakce mezi proteiny (a zároveň transkripčními faktory) p53 a p73, ale je obtížně interpretovatelné vzhledem k

nepřítomností buněčného pozadí a faktorů, které jsou in vivo nezbytné pro

sekvenčně specifickou vazbu na DNA. Tento problém se dá částečně vyřešit

použitím buněčných lyzátů, které ale značným způsobem znesnadňují interpretaci výsledků. Experimenty ex vivo jsou pak výhodným experimentálním modelem pro studium schopnosti proteinů p53 a p73 (samostatně i v kombinaci) vázat se na DNA a svou vazbou umožňovat transaktivaci cílových genů.

Při porovnání ex vivo experimentů s EMSA experimenty, kde se prokázalo, že

in vitro transkribcí/translací připravené mutantní proteiny 285K, 175H(R), 175H(P) ani isoforma p53β netvoří komplex s p73β, můžeme konstatovat, že ani v jednom

z těchto experimentů se nepodařilo prokázat interakci mutantních proteinů 285K, 175H(R), 175H(P) ani isoformy p53β s isoformou p73β.

Pro ověření předchozích pozorování v in vitro a ex vivo experimentech jsme

přistoupili ke studiu aktivace transripce cílových genů in vivo, což je nejpřirozenější experimentální systém.

54

4. Studium DNA vazebných schopností in vivo Protein p53 působí v buňce jako transkripční faktor mnoha cílových genů

včetně proteinů MDM2 a p21. Zároveň oba dva tyto proteiny jsou indukovány i

proteinem p73. Detekce jejich hladiny pomocí monoklonálních protilátek v lyzátech

buněčné linie H1299 (p53-/-) transfekované kombinacemi mutantních p53 s isoformami p73 je proto vhodná na posouzení zda kotransfekce mutantního proteinu p53 (neschopného aktivace transkripce) s isoformami p73 nějakým způsobem ovlivňuje transaktivační potenciál těchto isoforem p73.

Uvedené výsledky získané z in vivo experimentu pochází pouze z jednoho

experimentu a pro jejich potvrzení by bylo třeba dalších opakování experimentu.

obr. 21: Imunodetekce proteinů z lyzátů H1299 po transientní transfekci různých forem proteinu p53.

20 ul buněčného lyzátu bylo analyzováno pomocí SDS-PAGE a western blotingu. Byly použity specifické protilátky DO-1 (p53), PC-10 (PCNA), 2A9 (MDM2) a 118 (p21).

Ve vzorcích, ve kterých není možné změřit celkovou koncentraci proteinu se

používá k ověření vyrovnaného množství proteinu PCNA (proliferating cell nuclear antigen), což je 36 kDa protein konstitutivně syntetizovaný v G1 a S fázi.

55

Protein p53 byl prokázán ve všech lyzátech buněk buněčné linie H1299

transfekovaných plazmidem nesoucím gen pro wt p53, mutantní p53 a isoformu p53β

(ta má přibližně 46kDa, je tedy kratší než wt p53 a migruje tedy pod hladinou

markeru o velikosti 50kDa). Buňky buněčné linie H1299 (p53-/-), které nebyly transfekovány (kontrola) ani transfekované prázdným plazmidem (pBluescript) neprodukují žádný protein p53.

obr. 21: Imunodetekce proteinů z lyzátů H1299 po kotransfekci isoformy p73β s různými formami

proteinu p53. 20 ul buněčného lyzátu bylo analyzováno pomocí SDS-PAGE a western blotingu. Byly použity specifické protilátky DO-1 (p53), anti-HA (p73), PC-10 (PCNA), 2A9 (MDM2) a 118 (p21).

Protein p73β byl prokázán ve všech lyzátech buněk transfekovaných

samotným plazmidem nesoucím gen pro p73β a dále při kontransfekcích s wt p53, mutantními p53 nebo isoformou p53β.

Protein p21 je 21 kDa inhibitor cyklin dependentních kinas pod kontrolou p53

responzivního promotoru. Pokud je v buňce produkován funkční protein p53 nebo

protein p73, dochází k vazbě proteinu p53 resp. p73 na promotor p21 a k aktivaci

56

transkripce. Pokud je protein p53 mutovaný (a tedy nefunkční), nedochází k transkripci proteinu p21.

U buněk transfekovaných plazmidem nesoucím gen pro wt p53 byl detekován

protein p21, zatímco u buněk transfekovaných geny pro mutantní proteiny p53 nebo isoformu p53β protein p21 detekován nebyl, stejně jako u kontrolních buněk a buněk transfekovaných plazmidem pBlue. Samostatná isoforma p53β nedokáže in vivo

transaktivovat cílové geny stejně jako mutantní p53, čímž potvrzuje výsledek předchozího ex vivo experimentu i teroretické předpoklady.

Buňky transfekované plazmidem nesoucím gen pro p73β indukují protein p21

přibližně ve stejné míře jako při kotransfekci p73β s wt p53. Kotransfekce proteinu

p73β s mutanty 248W, 249S a 273H vedla ke snížení indukce proteinu p21

v porovnání se samostatnou p73β. Kotransfekce p73β s mutanty 285K, 175H(P),

175H(R) ani s isoformou p53β nevedla ke snížení schopnosti indukovat protein p21 v porovnání s isoformou p73β.

U proteinu MDM2 dochází v přítomnosti aktivního p53 nejen k aktivaci jeho

transkripce, ale také ke stabilizaci vazbou na protein p53. Exprese proteinu MDM2

byla výrazně vyšší u samostatného wt p53 v porovnání s mutantními p53 a isoformou

p53β. Samostatná isoforma p73β je schopna indukovat protein MDM2 přibližně ve stejné míře jako při kontransfekci s wt p53. Při posuzování indukce proteinu MDM2

při kontransfekcích p73β s mutantními proteiny p53 lze konstatovat, že snížení indukce MDM2 ve srovnání se samostatnou isoformou p73β lze pozorovat pouze při kotransafekci s mutantem 248W.

došlo

Studiem transaktivačních schopností ex vivo se nám podařilo prokázat, že k výraznému

snížení

transativace

p53-responzivního

promotoru

při

kotransfekci isoformy p73β a mutantů 248W a 273H, což může být způsobeno i přímou interakcí těchto proteinů s isoformou p73β.

V následném in vivo experimentu se ukázalo, že kotransfekce proteinu p73β

s mutantem 248W vedla ke snížení indukce proteinu p21 i proteinu MDM2, což potvrzuje výsledky předchozího ex vivo experimentu. Na základě našich experimentů

i dostupné literatury se lze domnívat, že příčinou snížené schopnosti transaktivovat cílové geny při kotransfekci mutanta 248W s isoformou p73β může být jejich vzájemná interakce.

57

Snížení indukce proteinu p21 se projevilo i u kotransfekce mutantů 249S a

273H, ale u indukce proteinu MDM2 nelze z dostupných výsledků snížení prokázat. Můžeme tedy spekulovat, že v in vivo podmínkách lze lépe pozorovat indukci

proteinu p21 než proteinu MDM2. Indukce proteinu MDM2 je v porovnání s indukcí

proteinu p21 komplexnější vícestupňový proces zahrnující nejen indukci exprese MDM2 ale také inhibici degradace prostřednictvím zpětnovazebné regulační smyčky s proteinem p53.

V našem experimentu se v

in vivo podmínkách neprojevil vliv R/P

polymorfismu kodonu 72 u mutanta 175H na indukci p21 ani MDM2 při kotransfekci s p73β, což podporuje výsledky z předchozího ex vivo experimentu.

58

VI. Závěr 1. Přípravu expresních vektorů s polymorfismem 72R/P se pomocí místně cílené mutageneze nepodařilo provést s pozitivním výsledkem. Možnými důvody mohou být – vysoká Tm primerů, nesprávně optimalizovaná PCR a nelze úplně vyloučit i možnost chyby v provedení.

2. Interakce mutantních proteinů p53 s isoformami p73 nebyla in vitro prokázána

-

mutantní formy p53 ani isoforma p53β připravené in vitro transkribcí/translací

nejsou schopny vazby na DNA

-

mutantní formy p53 ani isoforma p53β neinteragují za in vitro podmínek

-

použití jaderných a cytosolických lyzátů buněčných linií obsahujících mutantní

s isoformami p73

formy p53 nebo isoformu p53β v kombinaci s in vitro

transkribovanou/translatovanou isoformou p73δ neposkytuje příliš silnému nespecifickému pozadí jednoznačně interpretovatelné výsledky

3. V podmínkách ex vivo bylo prokázáno statisticky významné snížení schopnosti transaktivace isoformy p73β v kombinaci se všemi použitými mutantními formami p53, isoformou p53β i s wt p53

- ke snížení schopnosti transaktivace p73β v kombinaci s wt p53 dochází pravděpodobně z důvodu specifičtější vazby wt p53 na RGC promotor, přičemž wt p53 je schopen transaktivace v menší míře než p73β

- ke snížení schopnosti transaktivace p73β v kombinaci s mutanty 249S, 175H(R), 175H(P), 285K i s isoformou p53β dochází patrně nějakým

nespecifickým způsobem (např. zbytkovou vazebnou aktivitou mutovaných proteinů)

- výrazné snížení transaktivace pozorované při kontransfekci isoformy p73β s 248Wp53 nebo 273Hp53 může být způsobeno přímou interakcí mutantního proteinu p53 s isoformou p73β.

4. Výsledky detekce proteinů p21 a MDM2 pod kontrolou p53 responzivního promotoru in vivo podporují závěry získané z ex vivo experimentu.

59

. VII.

Abstract The p53 tumour suppresor protein is critical in the control of cell growth and

the maintenance of genomic stability. These activities are due, at least in part, to its ability to form homooligomers that bind to specific DNA sequences and activate

transcription . The p53 homologues, p73 (encoded by TP73) and p63 (encoded by TP63), was recently indetified.

Mutation in tumour suppressor p53 gene (TP53) occurs in approximately 55 %

of human tumours and 95 % of these lie in the core DNA-binding domain. Some of

the mutations, which markedly alter the ability of DNA binding, appear more

frequently in tumours and hence they are so-called hot spot mutations. Mutated

positions are involved in direct interaction with DNA or are responsible for the

formation of the shape of DNA binding site. The p73 is not classical tumor supressor

gene, because TP73 gene, in contrast to TP53, is rarely mutated in human cancers. The p53 and p73 proteins have a high degree of structural identity especially in DNA

binding domain, TP73 gene can be translated to many p73 isoforms with different transactivation and DNA binding ability and protein-protein interaction activity. It was

shown that the interaction between the tumour supressor protein p53 and the p73 protein is very weak under physiological conditions but mutated p53 proteins gain the

ability to interact with p73. The reduced activity of p73 isoforms, due to interaction with mutated p53 proteins, can affect the ability of p73 to induce apoptosis in response to genotoxic agents.

Our work has been focused on the study of the physical and functional

interactions between mutant p53 proteins and p73 isoforms.

We analysed the specificity and affinity of binding of particular mutated p53

proteins (285K p53, p53β, 175H(P) p53 and 175(R)H p53), p73β and p73δ isoforms and assumed complexes of mut p53/p73 to p53 responsive elements using EMSA

(electromobility shift-assay). Proteins were in the form of transfected cells lysates or IVTT (in vitro transcribed/translated) proteins. It seems, that in conditions of in vitro

EMSA experiments, there are not any physical interactions between chosen p53 mutated proteins and p73β or p73δ isoforms – we did not observed any complex formation.

60

We showed, using stably transfected p53 null cell line H1299-RGC by reporter

gene for β-galactosidase under control of p53 responsive element, the significant

reduced level of transcriptional activity in coexpression of mutated p53 proteins (248Wp53 and 273Hp53) with p73β isoform, which should be caused by direct interation between these two proteins.

These results were confirmed in experiment in vivo by detection the level of

proteins under p53 control (MDM2 and p21) expressed in transfected H1299 cell line.

Our results indicate that the mutant 248W p53 should interact with p73β isoform and

decreased transcriptional ability of p73β isoform in coexpression experiments.

61

Seznam použité literatury 1. Lane, D. P., Crawford, L.V.: T antigen is bound to a host protein in SV40transformed cells. Nature 1979. 278, 261-263.

2. Kress M. et al.: Simian virus 40-transformed cells express new species of proteins precipitable by anti-simian virus 40 tumor serum. J Virol. 1979. 31, 472-483.

3. Rotter V. et al.: Abelson murine leukemia virus-induced tumors elicit antibodies against a host cell protein, P50; J Virol. 1980. 36, 547-555.

4. Reich, N.C., Levine, A.J.: Growth regulation of a cellular tumour antigen, p53, in nontransformed cells. Nature 1984. 308, 199-201.

5. Soussi T. et al.: Cloning and characterization of a cDNA from Xenopus laevis

coding for a protein homologous to human and murine p53. Oncogene 1987. 1, 71-78.

6. Vogelstein, B. et al.: Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med. 1988. 319, 525-532.

7. Kaghad, M. et al.: Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36 a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 1997. 90,

809-819

8. Yang, A. et al.: p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with

transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol. Cell 1998. 2, 305-316.

9. Levrero, M. et al.: The p53/p63/p73 family of transcription factors: overlapping and distinct functions. J. Cell Sci. 2000. 113, 1661-1670.

10. Miller C. et al.: Human p53 gene localized to short arm of chromosome 17. Nature. 1986. 319, 783-784.

11. Mosner J. et al.: Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. EMBO J. 1995. 14, 4442-4449.

12. Soussi, T., May, P.; Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution: a second look; J Mol Biol. 1996. 260, 623-637.

13. Lu, H. , Levine, A.J.: Human TAFII31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein; Proc Natl Acad Sci U S A 1995. 92, 5154-5158.

14. Thut C.J. et al.: p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60. Science 1995. 267, 100-104.

62

15. Walker, K.K., Levine, A.J.: Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression; Proc Natl Acad Sci U S A 1996. 93,

15335-15340.

16. Storey, A.et al.: Role of a p53 polymorphism in the development of human papillomavirus-associated cancor. Nature 1998. 393, 229-234.

17. Cho, Y. et al.: Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science 1994. 265, 346–355.

18. Kraiss, S. et al.: Oligomerization of oncoprotein p53; J Virol. 1988. 62, 4737-4744.

19. Shaulian, E. et al.: Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53. Oncogene 1995. 10, 671-680.

20. Shaulsky, G. et al.: Nuclear accumulation of p53 protein is mediated by several

nuclear localization signals and plays a role in tumorigenesis. Mol Cell Biol. 1990. 10, 6565-6577.

21. Wang, Y. et al.: p53 domains: identification and characterization of two autonomous DNA-binding regions; Genes Dev. 1993. 7, 2575-2586.

22. Wang, X.W. et al.: Hepatitis B virus X protein inhibits p53 sequence-specific DNA binding, transcriptional activity, and association with transcription factor ERCC3; Proc Natl Acad Sci U S A 1994. 91, 2230-2234.

23. Blaydes, J.P. et al.: Stoichiometric phosphorylation of human p53 at Ser315

stimulates p53-dependent transcription. J Biol Chem. 2001. 276, 4699-4708.

24. Baudier, J. et al.: Characterization of the tumor suppressor protein p53 as a

protein kinase C substrate and a S100b-binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A 1992. 89, 11627-11631.

25. Sakaguchi, K. et al.: DNA damage activates p53 through a phosphorylationacetylation cascade. Genes Dev. 1998. 12, 2831-2841.

26. Soussi, T., May, P.; Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution: a second look; J Mol Biol. 1996. 260, 623-637.

27. Reich, NC. et al.: Two distinct mechanisms regulate the levels of a cellular tumor antigen, p53. Mol Cell Biol. 1983. 3, 2143-2150.

28. Erster S. et al.: In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation. Mol Cell Biol. 2004. 24, 6728-6741.

29. Mummenbrauer T. et al.: p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease aktivity. Cell. 1996. 28, 1089-1099.

63

30. Vogelstein, B., Lane, D.P., Levine, A.J.: Surfing the p53 network. Nature 2000. 408, 307-310.

31. el-Deiry W.S. et al.: WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993. 75, 817-825.

32. Chan, T. A. et al.: 14-3-3sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. Nature 1999. 401, 616–620.

33. Muller M. et al.: p53 activates the CD95 (APO-1/Fas) gene in response to DNA damage by anticancer drugs. J Exp Med. 1998. 188, 2033-2045.

34. Guan B. et al.: Evidence that the death receptor DR4 is a DNA damage-inducible, p53-regulated gene. J Cell Physiol. 2001. 188, 98-105

35. Wu GS. et al.: KILLER/DR5, a novel DNA-damage inducible death receptor gene, links the p53-tumor suppressor to caspase activation and apoptotic death. Adv Exp Med Biol. 2000. 465, 143-151.

36. Mihara, M. et al.: p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. Mol. Cell 2003. 11, 577–590

37. Hofseth, LJ. et al.: p53: 25 years after its discovery. Trends Pharmacol Sci. 2004. 25, 177-181.

38. Zhan, Q. et al.: Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth arrest. Mol Cell Biol. 1993. 13, 4242-4250.

39. http://www-p53.iarc.fr/index.html

40. Milner, J.: Flexibility: the key to p53 function? Trends Biochem. Sci. 1995. 20, 49–51

41. Hansen, S., Hupp, T. R., Lane, D.P.: Allosteric regulation of the thermostability and DNA binding activity of human p53 by specific interacting proteins. J. Biol. Chem.1996. 271, 3917–3924.

42. Bullock, A. N., Henckel, J., Fersht, A. R.: Quantitative analysis of residual folding and DNA binding in mutant p53 core domain: definition of mutant states for rescue in cancer therapy. Oncogene 2000. 19, 1245–1256.

43. Schwab, M. et al.: Genomic instability in 1p and human malignancies. Genes Chromosomes Cancer 1998. 16, 211-229.

44. Ishimoto, O. et al.: Possible oncogenic potential of DeltaNp73: a newly identified isoform of human p73. Cancer Res 2002. 62, 636-641.

45. De Laurenzi, V. et al.: Two new p73 splice variants, gamma and delta, with different transcriptional activity. J. Exp. Med. 1998. 188, 1763-1768. 64

46. De Laurenzi, V. et al.: Additional complexity in p73: induction by mitogens in

lymphoid cells and identification of two new splicing variants epsilon and zeta. Cell Death Differ 1999. 6,389-390.

47. Ceskova, P., Valik, D., Vojtesek, B.: What We Currently Know about the Structure and Function of the p53 Homologue p73 Protein: Facts, Hypotheses and Expectations. Folia Biologica 2003. 49, 1-8.

48. Yang, A. et al.: p73-deficient mice have neurological, pheromonal and

inflammatory defects but lack spontaneous tumors. Nature 2000. 404, 99-103.

49. Pozniak, C.D. et al.: An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science 2000. 289, 304-6.

50. Grob, T. J. et al.: Human delta Np73 regulates a dominant negative feedback loop for TAp73 and p53. Cell Death Differ. 2001. 8, 1213-1223.

51. Jost, C. A., Marin, M. C., Kaelin, W. G., Jr.: p73 is a simian [correction of human] p53-related protein that can induce apoptosis. Nature 1997. 389, 191-194.

52. Lee, C. W., La Thangue, N. B.: Promoter specificity and stability control of the p53-related protein p73. Oncogene 1999. 18, 4171-4181.

53. Takada, N. et al.: Identification of a transactivation activity in the COOH-terminal

region of p73 which is impaired in the naturally occurring mutants found in human neuroblastomas. Cancer Res. 1999. 59, 2810-2814.

54. Zeng, X. et al.: MDM2 suppresses p73 function without promoting p73 degradation. Mol. Cell Biol. 1999. 19, 3257-3266.

55. Davison, T.S. et al.: p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interactions with each other but not with p53. J. Biol. Chem.1999. 274, 1870918714.

56. Kojima, T. et al.: Analysis of molecular interactions of the p53-family p51(p63) gene products in a yeast two-hybrid system: homotypic and heterotypic

interactions and association with p53-regulatory factors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 281, 1170-1175.

57. Ponting, C. P.: SAM: a novel motif in yeast sterile and Drosophila polyhomeotic proteins. Protein Sci. 1995. 4, 1928-1930.

58. Schultz, J. et al.: SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation. Protein Sci.1997. 6, 249-253.

65

59. Chi, S. W., Ayed, A., Arrowsmith, C. H.: Solution structure of a conserved

C-terminal domain of p73 withstructural homology to the SAM domain. EMBO J. 1999. 18, 4438-4445.

60. Agami, R. et al.: Interaction of c-Abl and p73 alpha and their collaboration to induce apoptosis. Nature 1999. 399, 809-813.

61. Kim, K. C. et al.: Amphiphysin IIb-1, a novel splicing variant of amphiphysin II,

regulates p73beta function through protein-protein interactions. Oncogene 2001. 20, 6689-6699.

62. Balint, E., Bates, S., Vousden, K. H.: Mdm2 binds p73 alpha without targeting degradation. Oncogene 1999. 18, 3923-3929.

63. Zeng, X et al.: MDM2 suppresses p73 function without promoting p73 degradation. Mol. Cell Biol.1999. 19, 3257-3266.

64. Lissy, N.A. et al.: A common E2F-1 and p73 pathway mediates cell death induced by TCR activation. Nature 2000. 407, 642-645.

65. Minty, A. et al.: Covalent modification of p73alpha by SUMO-1. Twohybrid

screening with p73 identifies novel SUMO-1-interacting proteins and a SUMO-1 interaction motif. J. Biol. Chem. 2000. 275, 36316-36323.

66. Rossi, M. et al.: The ubiquitin–protein ligase Itch regulates p73 stability. EMBO J. 2005. 24, 836-848.

67. Asher, G. et al.: A mechanism of ubiquitin-independent proteasomal degradation of the tumor suppressors p53 and p73. Genes Dev. 2005. 19, 316–321.

68. Zaika A, Irwin M, Sansome C, Moll UM.: Oncogenes induce and activate endogenous p73 protein. J Biol Chem 2001. 276, 11310-11316.

69. Stiewe T, Putzer B.M.: Role of the p53-homologue p73 in E2F1-induced apoptosis. Nat Genet 2000. 26, 464-469.

70. Levrero, M. et al.: Structure, function and regulation of p63 and p73. Cell Death Differ. 1999. 6, 1146-1153.

71. Shaul, Y.: c-Abl: activation and nuclear targets. Cell Death Differ. 2000. 7, 10-16. 72. Agami, R. et al.: Interaction of c-Abl and p73 and their collaboration to induce apoptosis. Nature 1999. 399, 809-813.

73. Yuan, Z. M. et al.: p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature 1999. 399, 814-817.

74. Gong, J. G. et al.: The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. Nature 1999. 399, 806-809. 66

75. Baskaran, R et al.: Ataxia telangiectasia mutant protein activates c-Abl tyrosine kinase in response to ionizing radiation. Nature 1997. 387, 516-519.

76. Lissy, N.A. et al.: A common E2F-1 and p73 pathway mediates cell death induced by TCR activation. Nature 2000. 407, 642-645.

77. Wan YY, DeGregori J.: The survival of antigen-stimulated T cells requires NFnBmediated inhibition of p73 expression. Immunity 2003. 18, 331-342.

78. De Laurenzi, V. et al.: Induction of neuronal differentiation by p73, in a neuroblastoma cell line. J. Biol. Chem. 2000. 275, 15226-15231.

79. Ichimiya, S. et al.: p73 at chromosome 1p36.3 is lost in advanced stage

neuroblastoma but its mutation is infrequent. Oncogene 1999. 18, 1061-1066.

80. Han, S. et al.: Infrequent somatic mutations of the p73 gene in various human cancers. Eur. J. Surg. Oncol. 1999. 25, 194-198

81. Ikawa, S., Nakagawara, A., Ikawa, Y.: p53 family genes: structural comparison, expression and mutation. Cell Death Differ. 1999. 6, 1154-1161.

82. Lomas, J. et al.: Analysis of p73 gene in meningiomas with deletion at 1p. Cancer Genet. Cytogenet. 2001. 129, 88-91.

83. Kawano, S et al.: Loss of p73 gene expression in leukemias/lymphomas due to hypermethylation. Blood 1999. 94, 1113-1120.

84. Liu, M. et al.: Loss of p73 gene expression in lymphoid leukemia cell lines is associated with hypermethylation. Leuk. Res. 2001. 25, 441-447.

85. Corn, P. G. et al.: Transcriptional silencing of the p73 gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkittís lymphoma is associated with 5´CpG island methylation. Cancer Res.1999. 59, 3352-3356.

86. Dong, S. M. et al.: Concurrent hypermethylation of multiple genes is associated with grade of oligodendroglial tumors. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2001. 60,

808-816.

87. Moll, U.M., Slade, N.: p63 and p73: Roles in Development and Tumor Formation. Mol Cancer Res. 2004. 2, 371-386.

88. Casciano, I., Mazzocco, K., Boni, L. et al.: Expression of DNp73 is a molecular

marker for adverse outcome in neuroblastoma patients. Cell Death Differ 2002. 9, 246-251.

89. Strano, S. et al.: Physical and functional interaction between p53 mutants and different isoforms of p73. J. Biol. Chem. 2000. 275, 29503–29512.

67

90. Gaiddon, C. et al.: A Subset of Tumor-Derived Mutant Forms of p53 Down-

Regulate p63 and p73 through a Direct Interaction with the p53 Core Domain. Mol

Cell Biol. 2001. 21, 1874-1887.

91. Marin, M. C. et al.: A common polymorphism acts as an intragenic modifier of mutant p53 behaviour. Nat. Genet. 2000. 25, 47–54.

92. Bourdon J.C. et al.: p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 2005. 19, 2122-2137.

93. Courtois, S. et al.: deltaN-p53, a natural isoform of p53 lacking the first

transactivation domain, counteracts growth suppression by wild-type p53. Oncogene 2002. 21, 6722–6728.

94. Ghosh, A., Stewart, D., Matlashewski, G.: Regulation of human p53 activity and cell localization by alternative splicing. Mol. Cell. Biol 2004. 24, 7987–7997.

95. Yin, Y. et al.: p53 Stability and activity is regulated by Mdm2-mediated induction of alternative p53 translation products. Nat. Cell Biol. 2002. 4, 462–467.

68