Laboratorium techniek NIPT Merryn Macville, laboratorium specialist klinische genetica 27 februari 2014
Invasieve prenatale diagnostiek
1966 Karyotypering amnioncellen
1970
1980
Karyotypering chorion villi
1990
2010
2000
FISH
MLPA
2014
GW-array QF-PCR
NIPT
Niet invasieve prenatale screening Risicoschattende test gebaseerd op fenotypische factoren
/Echoscopie
Niet invasieve prenatale test Risicoschattende test gebaseerd op DNA
Celvrij foetaal DNA
Afkomstig van apoptotische cytotrophoblast cellen Afkomstig van overgebleven foetale cellen van vorige zwangerschap (1 cel op 109) Gefragmenteerd DNA (~150 bp) Aanwezig vanaf week 5 van zwangerschap Totale hoeveelheid celvrij DNA in het maternale plasma is ~2-10 ng per ml plasma In week 10: 5-15% van het celvrij DNA in het maternale plasma is van foetale origine Halfwaardetijd in vivo 20 min MINIEME hoeveelheden Verdwijnt 2 uur na bevalling
Lo YMD, Chiu RWK. Nat Rev Genet, 2007;8:71-77.
Trisomie 21 sample
% foetaal DNA
Di- -> Trisomie 21 (% toename)
Di- -> Trisomie 21 (x factor)
vlok
100%
50%
1.5
maternale plasma
~10%
5%
1.05
maternale plasma
4%
2%
1.02
een krachtige techniek om subtiele verschillen aan te tonen en/of een slimme techniek om de regio van interesse te verrijken
Next Generation Sequencing (NGS) Miljoenen tot miljarden baseparen sequencen in 1 keer. Door gebruik te maken van patient-specifieke barcodes is het mogelijk om tientallen patiënten simultaan parallel te sequencen in 1 keer.
Massively Parallel Sequencing (MPS)
A
G
T
C
DNA sequentie …ACGTGACTGAGGACCGTG CGACTGAGACTGACTGGGT CTAGCTAGACTACGTTTTA TATATATATACGTCGTCGT ACTGATGACTAGATTACAG ACTGATTTAGATACCTGAC TGATTTTAAAAAAATATT…
2013
2014 TRIDENT
NIPT methode
Lab handwerk: DNA extractie uit plasma. Library prep = Uniformeren fragmenten, koppelen van patient barcode (indexeren). MPS apparaat: Output sequencing reads
Chiu et al., PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63
Targeted approach Whole genome approach
Computers: De-indexeren Alignen op referentiegenoom Filteren van data Tellen van sequencing reads per chromosoom Statistiek Z-score
Library preparatie
Miljoenen kleine DNA fragmenten per monster Repareren van uiteinden Koppelen van poly-A staart Koppelen van PCR-primer en van de unieke index, opdat meerdere monsters tegelijkertijd gesequenced kunnen worden. • Library bestaat uit uniforme fragmenten, klaar om ‘gelezen’ te worden • Poolen van libraries van verschillende patienten en laden in de ‘flow cell’ • • • •
Clustervorming
• Elk fragment bindt aan de flow cell en wordt vermenigvuldigd tot een cluster. • Alle clusters (700K – 900K/mm2) worden simultaan gesequenced.
Massively Parallel Sequencing
• Eén voor één worden fluorescerend-gelabelde nucleotiden ingebouwd complementair aan de basevolgorde van het cluster fragment • Het fluor-label wordt geëxciteerd door een laserscanner en het emissielicht wordt gedetecteerd door een camera. Elke base (A,T,G,C) heeft een eigen kleur. • Het fluor-label wordt weggewassen en de volgende nucleotide ingebouwd. • 50 cycli worden vastgelegd. Eén cyclus duurt 90 min. Eén MPS-run duurt 75 uur. • De computer slaat de sequentie per cluster op = 1 read
Align & Count Aligning (Mapping)
referentiegenoom
• 1 read = een fragment met een nucleotide sequentie • De chromosomale oorsprong van elke read wordt bepaald aan de hand van het referentiegenoom (Human Genome Project 1990-nu) • Per chromosoom wordt het aantal reads geteld.
Statistiek
• Hoe meer reads in totaal = hoe meer reads per chromosoom en individuele base = hoe nauwkeuriger test: kleine verschillen detecteren. • Bepalen of van één chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is, ten opzichte van een referentieset van normale individuen. • Z-score (Chiu et al., 2008), Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011)’, student’s t -test-based (Jiang et al., 2012), Stouffer Z-score WISECONDOR (Straver et al., 2013)
Z-score analysis
• Het genoom wordt verdeeld in ‘bins’ van 1 Mb. Bins met onvoldoende reads worden niet gebruikt. • Het aantal reads van elke bin wordt binnen het sample vergeleken met ander bins. • Als het aantal reads 3x StDev verschilt van de mediane waarde dan is de z-score +/-3. • Z-score van naburige bins versterken het effect = Stouffer z-score
Uitslag = Normaal
13
18
21
Uitslag = T21
13
18
21
Uitslag = T18
13
18
21
Uitslag = T13
13
18
21
Lab flow Week 1,2 ma+di:
Binnenkomst EDTA bloed
Centrifugeren plasma scheiden duplo naar Nijmegen Week 1,2 woe:
DNA isolatie
Week 1,2 woe+do:
Library prep
Week 1,2 vrij: Week 3 ma t/m do: Week 3 do+vrij: Week 4 ma:
Doormeten, verdunnen, poolen Runnen MPS machine Data analyse en interpretatie Uitslag
3 wkn
TRIDENT: TRIal by Dutch laboratories for Evaluation of Noninvasive Testing Proefimplementatie NIPT Eerste/Tweede lijn Counseling prenatale screening, combinatietest Benoemen van 4 opties vervolgonderzoek: - geen onderzoek - vlokken biopsie - vruchtwaterpunctie - NIPT ihkv TRIDENT studie Combinatietest Verhoogd risico >1:200
Verwijzing naar centrum voor prenatale diagnostiek voor high-risk counseling
Centrum PND
Bij het maken van de afspraak pte schriftelijke informatie over TRIDENT toesturen: - informatiebrief - informatiefolder - toestemmingsformulier - formulier verloop zwangerschap en bevalling - verwijzing website proefpersonen onderzoek - verwijzing website meerovernipt.nl
TRIDENT: TRIal by Dutch laboratories for Evaluation of Noninvasive Testing Proefimplementatie NIPT Centrum PND
Mondelinge counseling 4 opties vervolgonderzoek - geen onderzoek - vlokken biopsie - vruchtwaterpunctie - NIPT ihkv TRIDENT studie TRIDENT Informed consent - toestemmingsformulier tekenen en meesturen met bloed - Astraia TRIDENT registratie invullen - vragenlijst Q1 NIPT onderzoek aanvragen NIPT aanvraagformulier helemaal invullen - Naam, tel, centrum aanvrager - CT resultaten: risico T21, T18, T13 - GPA, aantal jongens/meisjes - eerder kind T21/18/13 - gewicht (wegen!), lengte (zelf rapportage) - uitsluiten meerling, vanishing twin, maligniteit, echoafwk
TRIDENT: TRIal by Dutch laboratories for Evaluation of Noninvasive Testing Proefimplementatie NIPT Centrum PND
Bloedafname - MUMC, Venlo, Heerlen, Veldhoven, Eindhoven, Den Bosch - 4x 10 ml EDTA bloed - bloed opsturen met aanvraag- en toestemmingsformulier - afname alleen op maandag- en dinsdagmorgen tot 12.00 - zelfde dag voor 14.00 in MUMC, Lab Cytogenetica - satelliet is verantwoordelijk voor vervoer naar MUMC
Maastricht UMC
NIPT
Centrum PND
- bloedplasma bereiding, isolatie celvrij DNA - massive parallel sequencing MUMC, duplo Radboud Nmg - data analyse, uitslag - normale uitslag in Astraia TRIDENT registratie - afwijkende/mislukte uitslag ook telefonisch Centrum PND - communicatie uitslag naar pte via Centrum PND - verwijzing naar 3e lijn voor invasieve vervolgdiagnostiek - vragenlijst Q2 - follow-up na bevalling - follow-up bij miskraam/iuvd, weefsel naar Lab Cytogenetica
Enkele beperkingen • NIPT geen diagnostische test, maar gevorderde screening Na afwijkende NIPT is een vruchtwater punctie geindiceerd • Fout-positieven onopgemerkte vanishing twin placentair (mozaiek) aneuploidie (vervolgdiagnostiek vruchtwater!) maternale deletie of duplicatie (>20 Mb) maternale maligniteit • Fout-negatieven Lage foetale fractie (hoog lichaamsgewicht/BMI, biologische variatie) Laaggradig mozaiek bij de foetus • Test-failure Technische fouten/mislukkingen van afname tot analyse, <3% NIPT niet opnieuw maar invasieve diagnostiek • Onmogelijk Geslachtsbepaling en geslachtschromosomale afwijkingen • Bijvangst whole genome methode vs targeted Aneuploidie van andere chromosomen dan 21, 18, 13. Grote deleties, duplicaties
Fractie celvrij foetaal DNA
>22.000 zwangerschappen eenling > 10 wkn zws “The vast majority of clinical maternal plasma samples greater than 10 weeks gestational age contain an adequate fetal cfDNA proportion to allow for useful clinical results.”
Laatste woorden… • • • • • • • •
Whole genome approach Alle academische centra in NL, verschillende platforms en analyse methoden Geen bepaling foetale fractie Geen geslachtsbepaling of geslachtschromosomale afwijkingen Uitslagtermijn Maastricht 3 wkn (mits op ma of di aangeleverd voor 14.00) Rapportage over chromosomen 13, 18 en 21, evt “bijvangst” Uitslag in Astraia indien normaal en via Gyn/verwijzer indien afwijkend Bevestiging: vruchtwater
Exclusiecriteria: < 18 jr Meerling zwangerschap of vanishing twin
Geen COMBINATIE TEST = Geen NIPT
