LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ
Stanovení celkového dusíku a výpočet obsahu bílkovin (metoda: Kjeldahlova)
Garant úlohy: doc. Ing. Milena Zachariášová, Ph.D
OBSAH Základní požadované znalosti .............................................................................................................. 3 Kritéria hodnocení práce ...................................................................................................................... 3 Náplň úlohy .......................................................................................................................................... 3 Časový snímek cvičení......................................................................................................................... 4 A. Stanovení celkového obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla pomocí Kjeltec systému 1002 .. 4 1. Použitelnost metody ......................................................................................................................... 5 2. Princip metody ................................................................................................................................. 5 3. Používané přístroje, zařízení, materiál a speciální sklo ................................................................... 5 4. Chemikálie a roztoky ....................................................................................................................... 5 5. Pracovní postup ................................................................................................................................ 5 5.1 Mineralizace ............................................................................................................................... 6 5.2 Destilace pomocí destilační jednotky KJELTEC 1002.............................................................. 6 5.2.1 Příprava aparatury ............................................................................................................... 6 5.2.2 Vlastní destilace vzorku ...................................................................................................... 6 5.2.3 Vypláchnutí aparatury ......................................................................................................... 7 5.2.4 Vypnutí přístroje ................................................................................................................. 7 5.3 Titrace ........................................................................................................................................ 7 5.3.1 "Slepá" titrace ..................................................................................................................... 7 5.3.2 Vlastní titrace vzorku .......................................................................................................... 8 5.4 Výpočet výsledků ....................................................................................................................... 8 B. Stanovení amoniakálního dusíku metodou podle Kjeldahla s využitím aparatury podle ParnaseWagnera ............................................................................................................................................... 8 1. Použitelnost metody ......................................................................................................................... 9 2. Princip metody ................................................................................................................................. 9 3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo ................................................................. 9 4. Chemikálie a roztoky ....................................................................................................................... 9 5. Pracovní postup ................................................................................................................................ 9 5.1 Příprava vzorku .......................................................................................................................... 9 5.2 Destilace pomocí aparatury podle Parnase-Wagnera................................................................. 9 5.3 Titrace destilátu ........................................................................................................................ 10 5.4 Výpočet výsledků ..................................................................................................................... 10
Základní požadované znalosti 1. Bílkoviny - definice pojmů hrubá, čistá a travitelná bílkovina. Princip Kjeldahlovy metody stanovení amoniakového a veškerého dusíku v potravinách (Davídek a kol.: Laboratorní příručka analýzy potravin, SNTL, 1977, str.181-183). 2. Mineralizace na mokré cestě. 3. Titrační metody: princip odměrné analýzy, základní pojmy, pravidla provádění titračních stanovení, příslušné výpočty. 4. Příprava roztoků, základní výpočty.
Kritéria hodnocení práce - prokázané teoretické znalosti - praktické provedení práce - dodržení pravidel pro práci v laboratoři (bezpečnost, pořádek, čistota) - protokol - ucelenost experimentálních údajů, výpočet výsledků a jejich diskuse
Náplň úlohy A. Stanovení celkového obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla pomocí Kjeltec systému 1002 (podle ČSN ISO 1871; adaptováno pro potřeby výuky a použití přístroje Kjeltec) B. Stanovení amoniakálního dusíku metodou podle Kjeldahla s využitím aparatury podle Parnase-Wagnera
upřesnění ke stanovení dusíku pomocí Kjeltec systému: • každý student ve dvojici provádí mineralizaci a stanovení dusíku a hrubé bílkoviny u jednoho vzorku mouky, do protokolu studenti uvádí oba výsledky • alternativně je analyzován zředěný roztok bílkovinného mineralizátu připravený pro stanovení amoniakálního dusíku v aparatuře podle Parnase-Wagnera
upřesnění ke stanovení dusíku s využitím aparatury podle Parnase-Wagnera: • každá dvojice (případně trojice) studentů pracuje samostatně (nezávisle na ostatních studentech dané pracovní skupiny) a analyzuje jeden (přidělený) vzorek • vzorek je také analyzován pomocí Kjeltec systému • do protokolu se uvádí výsledky získané v obou systémech
Časový snímek cvičení Operace Úvodní výklad a zkoušení Navážení a příprava vzorků pro mineralizaci Mineralizace Výklad k aparatuře podle Parnase-Wagnera Úloha stanovení amoniakálního dusíku Výklad k systému Kjeltec Pokračování stanovení dusíku pomocí systému Kjeltec Úklid
Přibližná spotřeba času (min) 30 min 30 min 90 - 120 min 20 min 100 min
Poznámka
probíhá po zahájení mineralizace probíhá zároveň s mineralizací
20 min 60 - 100 min 20 - 30 min
A. Stanovení celkového obsahu dusíku metodou podle Kjeldahla pomocí Kjeltec systému 1002
1. Použitelnost metody Metoda má univerzální použití pro vzorky potravin a potravinářských surovin, u nichž není obsah dusíku příliš nízký a pro vzorky neobsahující větší množství dusitanů a dusičnanů.
2. Princip metody Vzorek se mineralizuje varem v kyselině sírové za přídavku katalyzátoru. Dusíkaté látky v něm obsažené se převedou na amonné ionty (síran amonný), z nichž se po zalkalizování mineralizátu uvolní amoniak, který se po vydestilování s vodní parou stanoví titračně.
3. Používané přístroje, zařízení, materiál a speciální sklo - analytické váhy - mineralizační jednotka Tecator 2006, - stojan na mineralizační trubice (6 pozic) - mineralizační trubice (250 ml) - odsávač par s teflonovým těsněním připojený na vodní vývěvu - Tecator Exhaust DS6 - destilační jednotka Kjeltec 1002 se zásobním kanystrem na 30 % (w/w) roztok hydroxidu sodného (či draselného) dále je používáno běžné chemické sklo
4. Chemikálie a roztoky Používají se chemikálie čistoty p.a. - destilovaná voda - kyselina sírová (na mineralizaci) - koncentrovaná, prostá dusíku - směsné katalyzační tablety pro mineralizaci - KJELTABS S/3,5 (3,5 g K2SO4 + 0,0035 g Se) - hydroxid sodný nebo draselný (na uvolnění amoniaku z mineralizátu) - 30 % (w/w) roztok - Tashirův indikátor - kyselina sírová (do předlohy) - roztok o koncentraci c= 0,05 mol/l, připraven z normanalu - hydroxid sodný (na titraci) - roztok o koncentraci c= 0,1 mol/l, připraven z normanalu
5. Pracovní postup
5.1 Mineralizace Do mineralizační trubice se umístí 2 tablety pro mineralizaci. Do lodičky se naváží přibližně (s přesností na 2 desetinná místa) 1 g vzorku, který se pak pomocí 12 ml koncentrované kyseliny sírové kvantitativně převede do mineralizační trubice. Důležité upozornění: S koncentrovanou kyselinou sírovou manipulujte pouze v digestoři k tomu určené a s nasazenými gumovými rukavicemi a ochranným štítem!!! Kyselinu nejprve nalijte ze zásobní lahve do kádinky k tomu určené a z této pak přelívejte do válečku, který slouží k odměření 12 ml. Vzorek přesypte z lodičky do mineralizační trubice tak, abyste pokud možno neznečistili její stěny a lodičku pak spláchněte opatrně do mineralizační trubice pomocí kyseliny z válečku. Mineralizační trubicí se opatrně krouživým pohybem zamíchá a poté se trubice umístí do stojanu ve spalovacím bloku. Na trubici se nasadí odsávač par, pustí se vodní vývěva a nastaví se doporučená teplota spalování, t.j. 420 oC. Po dosažení nastavené teploty (cca 15 minut) se vzorek mineralizuje 40 minut. Poté se spalovací blok vypne a stojan s mineralizačními trubicemi se nechá schladnout v odděleném prostoru (cca 20 minut). Důležité upozornění: Trubice umisťuje do spalovacího bloku, vyjímá je z něj a zapíná ho POUZE ASISTENT!! Poznámka: z časových důvodů je mineralizace zkrácena - v praxi je nutné po vyčeření obsahu trubice pokračovat v mineralizaci ještě cca 60 minut, aby se zabezpečil rozklad rezistentních sloučenin (např. Lysin, Tyrosin).
5.2 Destilace pomocí destilační jednotky KJELTEC 1002 5.2.1 Příprava aparatury
(Přístroj se zapojí do sítě a stiskem zeleného tlačítka se uvede do provozu. Provede se kontrola uzavření vypouštěcího ventilu na zadní desce přístroje dole - označen "DRAIN", poté se otevře vodovodní kohoutek napojený hadicí na vstup do přístroje.) Do přístroje se umístí čistá mineralizační trubice do poloviny naplněná destilovanou vodou a jímací Erlenmayerova baňka a spustí se přední plexisklový kryt. Stlačením páčky "STEAM" na přední stěně přístroje se uvede do provozu generátor na vyvíjení vodní páry, který se ponechá v provozu cca 5 minut (tímto se odstraní eventuální zbytky chemikálií a přístroj se předehřeje). Po 5-ti minutách se vytažením páčky "STEAM" do horní polohy ukončí vývin vodní páry, přední plexisklový kryt se vysune nahoru a mineralizační trubice i Erlenmayerova baňka se vyndají z přístroje - jejich obsah se vylije do výlevky. Důležité upozornění: Mineralizační trubici vyjímejte z přístroje koženými rukavicemi - je horká!!! Toto proplachování aparatury je nutné provádět před každým vzorkem!!!
5.2.2 Vlastní destilace vzorku
Vychladlý mineralizát v mineralizační trubici se velmi opatrně zředí cca 30 ml destilované vody a umístí se do přístroje.
Důležité upozornění: Stále mějte na paměti, že manipulujete se silně koncentrovanou kyselinou sírovou, navíc budete přilévat vodu do kyseliny!!! Přídavek vody provádějte opět v digestoři s nasazenými gumovými rukavicemi a ochranným štítem!!! Pod ústí chladiče se vloží jímací titrační baňka s 25 ml kyseliny sírové o koncentraci c= 0,05 mol/l a pár kapkami Tashirova indikátoru. Podložka pod jímací baňkou se zdvihne tak, aby konec chladiče zasahoval pod hladinu. - uzavře se přední plexisklový kryt - páčkou "ALKALI" se nadávkuje 45 ml 30 % (w/w) roztoku hydroxidu sodného (toto množství bylo předem vyzkoušeno - bílá zarážka je nastavena do polohy zaručující přídavek tohoto objemu - neposunujte s ní!!!) - zapne se generátor vodní páry stáhnutím páčky "STEAM" do dolní polohy - a současně se na budíku nastaví 3,5 minuty Ukončení destilace: - po zazvonění budíku se spustí dolů podložka pod jímací baňkou, aby byl konec chladiče nad hladinou kapaliny - vypne se generátor vodní páry vysunutím páčky "STEAM" nahoru Důležité upozornění: V opačném pořadí, t.j. vypnete-li nejprve generátor vodní páry, nasaje se Vám obsah jímací baňky do chladiče!!! - zdvihne se přední plexisklový kryt - opláchne se konec chladiče destilovanou vodou do jímací baňky - vyjme se jímací baňka - je připravena pro titraci - koženými rukavicemi se sundá mineralizační trubice z gumového adaptéru a pomocí střičky se do ní opláchne dávkovací hadička, obsah trubice se pak vylije opatrně do výlevky za současného zřeďování proudem vody!!! 5.2.3 Vypláchnutí aparatury
Po skončení destilace vzorku se destilovanou vodou opláchnou a vlhkým hadříkem otřou všechny části aparatury, které přišly do styku s koncentrovaným hydroxidem či kyselinou - zvláště gumová objímka sloužící k utěsnění mineralizačních trubic. Poté se provede čištění aparatury podle postupu uvedeného v kapitole 5.2.1. Nakonec se vyjme spodní vanička, opláchne se tekoucí vodou, otře se a opět umístí do přístroje.
5.2.4 Vypnutí přístroje
Po skončení destilace všech vzorků a vypláchnutí aparatury se do přístroje umístí čistá mineralizační trubice, Erlenmayerova baňka, stáhne se přední kryt a vypne se přívod vody. Přístroj se vypne hlavním spínačem, odpojí od elektrické sítě a na zadní desce se otevře ventil s nápisem "DRAIN" - z chladiče a z vyvíječe vodní páry vyteče voda.
5.3 Titrace 5.3.1 "Slepá" titrace
Slepá titrace slouží pro vyzkoušení barevného přechodu Tashirova indikátoru. Tashirův indikátor je směsí methylenové modři s methylčervení a jeho barevný přechod je následující: kyselá oblast: fialová neutrální oblast: šedavá zásaditá oblast: zelená (S postupným přidáváním NaOH dochází ke světlání fialové barvy, v bodě ekvivalence se roztok téměř odbarví a dostane šedavý nádech, další kapka (= přetitrováno) změní barvu na zelenou.) Do titrační baňky se nadávkuje 10 ml kyseliny sírové o koncentraci c= 0,05 mol/l, pár kapek Tashirova indikátoru a přidá se cca 10 ml destilované vody. Tento roztok se titruje roztokem hydroxidu sodného o koncentraci c=0,1 mol/l. Spotřeba by měla být 10 ml.
5.3.2 Vlastní titrace vzorku
Destilát v jímací titrační baňce se titruje roztokem hydroxidu sodného o koncentraci c=0,1 mol/l. Spotřeba se zaznamená.
5.4 Výpočet výsledků Po přídavku přebytku 30 % (w/w) roztoku hydroxidu sodného k mineralizátu dojde k uvolnění amoniaku ze síranu amonného, tento je po předestilování s vodní parou zachycován v předloze s přebytkem kyseliny sírové (0,05 mol/l), kde zreaguje opět na síran amonný. Při vlastní titraci hydroxidem sodným (0,1 mol/l) jde o titraci přebytku kyseliny (zpětná titrace) - tedy kyseliny, která nezreagovala s amoniakem ze vzorku. Spotřeba NaOH (VNaOH) při titraci je tedy při daných koncentracích podle rovnice H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O ekvivalentní množství nezreagované kyseliny sírové (VK2). Pro výpočet množství dusíku ve vzorku musíme zjistit množství kyseliny, které zreagovalo s amoniakem(VKN) - musíme tedy odečíst nezreagované množství kyseliny od původního množství kyseliny v předloze (VK1): VKN = VK1 - VK2 (ml) VK2 = VNaOH
Obsah dusíku se pak vypočte podle následující úměry (vychází ze stechiometrie): 1 ml 0,05 mol/l H2SO4 ……….odpovídá…………..1,4 mg dusíku nebo 1,7 mg amoniaku Výsledek se přepočte na 100g vzorku a dále se vyjádří jako obsah "hrubé bílkoviny" ve 100 g vzorku vynásobením přepočítávacím faktorem pro daný analyzovaný materiál: Přepočítávací faktory pro výpočet "hrubé" bílkoviny: mléko, mléčné výrobky: 6,30 mouka: 5,83
B. Stanovení amoniakálního dusíku metodou podle Kjeldahla s využitím aparatury podle Parnase-Wagnera
1. Použitelnost metody Metoda je použitelná pro vzorky bílkovinných hydrolyzátů.
2. Princip metody Amoniak se ze vzorku uvolní zalkalizováním, předestiluje se s vodní parou a stanoví titračně.
3. Používané přístroje, zařízení, materiály a speciální sklo - analytické váhy - destilační aparatura podle Parnase-Wagnera dále je používáno běžné chemické sklo
4. Chemikálie a roztoky Používají se chemikálie čistoty p.a. - destilovaná voda - hydroxid sodný nebo draselný (na uvolnění amoniaku z mineralizátu) - 35 % (w/w) roztok - Tashirův indikátor - kyselina sírová (do předlohy) - roztok o koncentraci c= 0,05 mol/l, připraven z normanalu - hydroxid sodný (na titraci) - roztok o koncentraci c= 0,1 mol/l, připraven z normanalu
5. Pracovní postup 5.1 Příprava vzorku Do 50 ml odměrné baňky se odváží přesně (na 2 desetinná místa) asi 5 g bílkovinného hydrolyzátu (polévkové koření "Klasik", Sojová omáčka) a doplní se po rysku destilovanou vodou. 5.2 Destilace pomocí aparatury podle Parnase-Wagnera Aparatura se zahřeje a vypláchne destilovanou vodou. Pod konec chladiče se umístí titrační baňka s předlohou (= 25 ml 0,05 mol/l H2SO4 a pár kapek Tashirova indikátoru) tak, aby konec chladiče zasahoval pod hladinu. Do aparatury se odpipetuje 10 ml zředěného vzorku (viz kap. 5.1), po opláchnutí nálevky destilovanou vodou se přidá odměrným válcem 20 - 30 ml 35 % roztoku
NaOH (nebo KOH) a nálevka se opět opláchne destilovanou vodou. Uvolněný amoniak se destiluje s vodní parou po dobu 15 minut (od začátku probublávání vodní páry vzorkem), pak se opláchne konec chladiče destilovanou vodou do předlohy a tím je vzorek připraven k titraci. Z aparatury se odstraní zbytky vzorku a aparatura se vypláchne destilovanou vodou.
5.3 Titrace destilátu Množství nespotřebované kyseliny sírové v předloze se stanoví titrací 0,1 mol/l roztokem NaOH.
5.4 Výpočet výsledků Spotřeba NaOH (VNaOH) při titraci je při daných koncentracích podle rovnice H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O ekvivalentní množství nespotřebované kyseliny sírové (VK2). Po odečtení nespotřebovaného množství kyseliny sírové od původního množství kyseliny sírové v předloze (VK1) zjistíme množství kyseliny sírové, které zreagovalo s amoniakem ze vzorku (VKN): VKN = VK1 - VK2
(ml)
VK2 = VNaOH
Obsah dusíku se pak vypočte podle následující úměry (vychází ze stechiometrie): 1 ml 0,05 mol/l H2SO4 ……….odpovídá………….. 1,7 mg amoniaku Výsledky se vyjádří jako hmotnostní procenta amoniaku v původním neředěném vzorku, t.j. gramy amoniaku ve 100 gramech vzorku.
